Summary
L’objectif de ce manuscrit est d’examiner l’utilisation du test d’anticorps fluorescents indirects contre la rage pour la détection des anticorps IgG et IgM spécifiques de la rage.
Abstract
Le test d’anticorps fluorescents indirects (IFA) contre la rage a été mis au point pour détecter divers isotypes d’anticorps spécifiques de la rage dans les sérums ou le liquide céphalo-rachidien. Ce test fournit des résultats rapides et peut être utilisé pour détecter les anticorps antirabiques dans plusieurs scénarios différents. Le test IFA de la rage est particulièrement utile pour la détection rapide et précoce des anticorps afin d’évaluer la réponse immunitaire chez un patient qui a développé la rage. Bien que d’autres méthodes de diagnostic de la rage ante-mortem aient la priorité, ce test peut être utilisé pour démontrer l’exposition récente au virus de la rage par la détection d’anticorps. Le test IFA ne fournit pas de titre d’anticorps neutralisant le virus (VNA), mais la réponse à la prophylaxie pré-exposition (PrEP) peut être évaluée par la présence d’anticorps positifs ou négatifs. Ce test peut être utilisé dans diverses situations et peut fournir des résultats pour un certain nombre de cibles différentes. Dans cette étude, nous avons utilisé plusieurs échantillons de sérum appariés provenant de personnes ayant reçu la PrEP et démontré leur présence d’anticorps antirabiques au fil du temps à l’aide du test IFA.
Introduction
Le test d’anticorps fluorescents indirects (IFA) antirabiques est utilisé pour détecter divers isotypes d’anticorps spécifiques de la rage dans le sérum ou le liquide céphalo-rachidien. Il fait partie d’un arsenal de tests disponibles pour le suivi d’un patient ante mortem de la rage. Il est particulièrement utile pour la détection précoce des anticorps afin d’évaluer la réponse immunitaire d’un patient à l’infection par la rage. Lorsqu’il est utilisé en conjonction avec d’autres tests, les antécédents et le statut vaccinal du patient, le test IFA peut aider à déterminer l’exposition au virus de la rage ou à un vaccin1. Comme le test IFA mesure les IgM et/ou les IgG, les valeurs de l’anticorps spécifique peuvent indiquer un laps de temps approximatif à partir de l’exposition à l’antigène1. Ce test peut être utile dans les applications répertoriées ou d’autres qui n’ont pas encore été explorées.
Il existe plusieurs tests sérologiques de la rage. Le test rapide d’inhibition de la focalisation fluorescente (RFFIT), le test de neutralisation du virus par anticorps fluorescents (FAVN) ou des modifications de ceux-ci sont les principales méthodes de mesure des anticorps neutralisants du virus de la rage (ARNV)1. Cependant, ces tests ne différencient pas les anticorps IgM et IgG. Lorsque la différenciation de l’isotype de l’anticorps est importante dans la surveillance de la réponse immunitaire de la rage, les tests IFA de la rage et ELISA (test immuno-enzymatique lié à la rage) sont utilisés, mais ils ne mesurent pas les ARNV. Bien que les tests IFA et ELISA puissent être utilisés pour déterminer la présence d’anticorps spécifiques de la rage dans un échantillon, il existe certaines différences dans la façon dont ils sont exécutés. Le test IFA utilise un virus vivant cultivé en cellule comme substrat antigène, alors qu’un test ELISA typique pour la détection de la rage utilise une ou plusieurs des protéines virales. Dans un laboratoire où le virus de la rage peut être cultivé, le test IFA peut être plus facile à effectuer au lieu d’acheter ou de cultiver des protéines virales individuelles pour le test ELISA. L’objectif du test et l’information recueillie à partir des résultats de tout test sérologique de la rage doivent être pris en compte pour déterminer lequel choisir2.
Les IgM sont les premières à réagir, augmentant jusqu’à ce que l’on observe un changement de classe vers le 28e jour, moment où les IgG deviennent l’anticorps circulant prédominant3. Par conséquent, on ne s’attendrait à ce que les IgM durent une période limitée après l’exposition au virus de la rage ou la vaccination. L’analyse du sérum et du liquide céphalorachidien (LCR) peut indiquer si l’exposition a été faite par la vaccination, dans laquelle les anticorps ne seraient visibles que dans les sérums, ou par une infection virale, qui montrerait potentiellement des anticorps dans le LCR1.
Il a été établi que les anticorps antirabiques persistent pendant plusieurs années après la prophylaxie pré-exposition (PrEP)4. Le test IFA peut être un outil utile pour le démontrer à différents moments après la vaccination ou l’exposition.
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Protocol
Le protocole suivant a été approuvé pour l’utilisation éthique d’échantillons humains par le Wadsworth Center du Département de la santé de l’État de New York pour le développement de tests, numéro d’approbation du protocole #03-019.
1. Sécurité
- Enfilez un équipement de protection individuelle (EPI), au moins une protection oculaire (lunettes ou écran facial), un masque chirurgical et des gants sans latex.
- S’assurer que le personnel est vacciné contre la rage et qu’un titre de ≥0,5 UI/mL a été démontré au cours des 6 derniers mois.
2. Préparation des lames antigéniques
REMARQUE : Effectuer toutes les manipulations de virus, de LCR et de sérum dans une enceinte de sécurité biologique (ESB) en utilisant les précautions universelles.
- Préparer 20 mL de neuroblastome de souris ou de cellules BHK-21 à une concentration de 3,0 x 105 cellules/mL dans le milieu essentiel minimum d’Eagle complété par 10 % de sérum de veau fœtal (EGM) et garder au froid jusqu’à utilisation.
- Préparer le virus CVS-11 en le diluant dans de l’EGM jusqu’à une dilution de travail de 1,0 x 106,5 50 % de dose infectieuse de culture tissulaire (TCID50) par millilitre et garder au froid jusqu’au moment de l’utiliser.
NOTE : Le TCID50 est déterminé par la méthode de Reed et Muench publiée précédemment5. - Nettoyez une chambre de lame humide et des lames de microscope à puits enduites de polytétrafluoroéthylène (PTFE) avec de l’éthanol à 70 % et laissez-les sécher à l’air libre dans le BSC.
- Ajouter de l’eau distillée (dH2O) aux bandes de papier absorbant dans la chambre de la lame pour s’assurer que l’humidité reste constante tout au long de la procédure.
- À l’aide d’un crayon, étiquetez chaque lame à utiliser avec le numéro de lot, la date, le type de cellule et toute autre information d’identification requise pour l’entreposage, et placez-la dans la chambre de la lame.
REMARQUE : La plupart des marqueurs, stylos ou étiquettes ne résisteront pas à la future étape de fixation de l’acétone (étape 2.9). - Appliquer 50 μL de dilution virale sur chaque puits sur les lames de microscope à l’aide d’une pipette répétitive. Ensuite, appliquez 50 μL de dilution cellulaire sur chaque puits, en prenant soin de ne pas contaminer l’embout de la pipette avec le virus déjà présent sur le puits.
- Fermez la chambre de la glissière d’humidité et placez-la dans l’incubateur humide à 34-36 °C. Évaluer l’infectiosité cellulaire après 24 h.
REMARQUE : Effectuez les étapes 2.8 à 2.12 sur une seule diapositive. - Retirez la lame de la chambre d’humidité et aspirez soigneusement le surnageant. Lavez la lame dans un bocal Coplin rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 2 minutes, puis laissez la lame sécher à l’air libre.
- Placez la lame dans le bocal Coplin et fixez-la dans de l’acétone froide pendant au moins 1 h dans un congélateur à -20 °C homologué pour les matériaux inflammables. Effectuez toutes les procédures de versement d’acétone et de séchage à l’air dans une hotte.
- Laissez l’acétone s’évaporer et faites-la glisser pour sécher. Appliquer un conjugué antirabique à fluorescence directe (DFA) préparé selon les instructions du fabricant sur les puits de la lame et incuber pendant 30 min dans un incubateur humide à 34-36 °C.
- Lavez la lame dans des pots Coplin de PBS deux fois pendant 2 minutes chacun. Séchez la glissière à l’air libre.
- Montez une lamelle avec 0,05 M de Tris, 0,15 M de NaCl (pH 9,0) et 20 % de glycérol de montage, et lisez la lame à l’aide d’un microscope fluorescent à un grossissement de 200x pour évaluer l’infectivité. Si les cellules ne sont pas infectées à environ 50 %, répétez les étapes 2.7 à 2.12 le lendemain jusqu’à ce que l’infectiosité souhaitée soit atteinte.
REMARQUE : L’infectivité cellulaire est estimée en fonction de l’évaluation visuelle du rapport entre les cellules négatives et les cellules positives pour la rage sur le puits de lames. Les cellules négatives apparaissent de couleur rouge, tandis que les cellules positives présentent une coloration fluorescente verte. - Retirez les lames restantes de l’incubateur et de la chambre d’humidité. Aspirez soigneusement le surnageant de chaque puits, puis placez les lames dans un ou plusieurs bocaux Coplin avec PBS pendant 1 à 2 minutes. Faites sécher les lames à l’air libre pendant environ 30 minutes. Conservez les lames à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.
3. Préparation de l’échantillon
- Préparer les dilutions d’échantillons de sérum ou de LCR du patient pour les tests. Préparez le conjugué nécessaire pour obtenir une concentration de travail appropriée dilué dans du PBS avec 0,05 % de bleu Evans.
REMARQUE : Conservez le conjugué dans l’obscurité pour maintenir l’intégrité du fluorophore avant l’application
4. Procédure de l’IFA
- Retirez le nombre nécessaire de lames d’antigène préparées nécessaires pour chaque test et laissez les lames décongeler et sécher complètement.
- Placez les lames dans un ou plusieurs bocaux Coplin et fixez-les dans de l’acétone froide pendant 2 h à une nuit dans un congélateur à -20 °C approuvé pour les matériaux inflammables. Retirez les lames de l’acétone et laissez-les sécher à l’air libre.
- Placez les lames dans une boîte de chambre d’humidité à l’intérieur du BSC avec des bandes absorbantes imbibéesde 2 Opour maintenir l’humidité. Appliquer 50 μL de chaque dilution d’échantillon, échantillon témoin ou PBS dans le puits prédéterminé.
REMARQUE : Chaque lame doit contenir un nombre approprié de puits d’échantillon de patient, de témoins positifs, de témoins négatifs et de puits de contrôle de cellules PBS. - Placez la chambre coulissante fermée dans un incubateur humide à 37 °C, 5 % de CO2 . Incubez les lames pendant 30 minutes, puis retirez la chambre de la lame d’humidité de l’incubateur et placez-la dans un BSC.
- À l’aide d’un embout d’aspirateur, aspirez soigneusement le surnageant de chaque puits, en veillant à ne pas perturber la monocouche cellulaire. À l’aide d’une pipette compte-gouttes stérile, appliquez une goutte de PBS sur chaque puits.
- Répétez l’aspiration soigneuse, puis placez chaque lame dans un bocal Coplin rempli de PBS et lavez-la deux fois pendant un total de 15 minutes.
- Replacez les lames dans la boîte de la chambre d’humidité et appliquez 50 μL de conjugué d’anticorps anti-humains approprié dans chaque puits. Répétez les étapes 4.4 à 4.6.
- Laissez les lames sécher à l’air libre, montez une lamelle avec du support de montage et lisez les lames au microscope fluorescent.
5. Analyse des lames
- Classer les échantillons en fonction du profil de coloration et de l’intensité de fluorescence par rapport aux échantillons témoins positifs avec un titre élevé d’anticorps antirabiques confirmé.
- Classez les échantillons sur une échelle de négatif, 1+, 2+, 3+ et 4+, avec un résultat négatif ne montrant aucune coloration fluorescente et 4+ représentant une fluorescence de couleur pomme vert vif avec un motif de coloration similaire à celui des échantillons témoins positifs1.
REMARQUE : La couleur vert pomme ne s’applique qu’aux anticorps marqués FITC ; La couleur varie en fonction de la sélection du fluorophore. - Attribuez aux échantillons une valeur finale représentée par le facteur de dilution auquel l’échantillon affiche une teneur de 1 à 2+. Testez les échantillons à un facteur de dilution plus élevé si le point final n’est pas atteint lors de l’essai initial.
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Representative Results
Tous les échantillons de sérum ont été prélevés sur les patients à peu près au même moment après la PrEP. Les échantillons ont été testés sur cinq patients différents aux moments suivants : 2 semaines après l’inoculation finale du vaccin antirabique, 6 mois après la série de vaccins antirabiques et 18 mois après la série de vaccins antirabiques. Chaque échantillon de sérum a été dilué en série et classé en fonction de la présence d’IgM et d’IgG, comme décrit dans les étapes 5.2 et 5.3 du protocole. La valeur d’anticorps attribuée représente le facteur de dilution à partir duquel l’échantillon a atteint un grade final de 1 à 2+.
Les résultats des tests effectués à chaque moment suivant la PrEP démontrent la capacité du test à détecter différents niveaux de présence d’anticorps. Peu de temps après la vaccination initiale, des niveaux élevés d’IgM et d’IgG étaient présents dans les échantillons de patients, comme le montre la figure 1. Les zones de coloration cellulaire fluorescente vert vif indiquent la présence positive d’anticorps ; Les globules rouges sont des cellules négatives pour la rage où aucun anticorps ne peut se lier. Environ 6 mois après la vaccination, des taux significativement plus faibles d’IgM et d’IgG étaient présents dans les échantillons de patients, mais les IgM avaient presque complètement disparu. Au dernier moment, 18 mois après la vaccination, les anticorps IgM n’ont été détectés dans aucun échantillon de patient, comme le montre la figure 2 où aucune coloration des cellules fluorescentes vertes n’est observée. Cependant, les niveaux d’IgG ont persisté et sont restés similaires aux niveaux détectés au point de 6 mois après la diminution initiale du point de temps de 2 semaines. Les résultats de la détection des IgG et des IgM dans les échantillons 2 semaines après la vaccination, 6 mois après la vaccination et 18 mois après la vaccination sont répertoriés dans les tableaux 1, 2 et 3, respectivement. La figure 3 montre l’organigramme des étapes d’exécution.
Figure 1 : Coloration positive de l’IFA IgM de la rage. Le sérum du patient à une dilution de 1 :8 a montré un profil de coloration positif peu de temps après la fin de la série de vaccins PrEP. La barre d’échelle sur l’image représente 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Coloration négative des IgM IFA de la rage. Le sérum du patient à une dilution de 1 :2 n’a montré aucune coloration positive environ 18 mois après la fin de la série de vaccins PrEP. La barre d’échelle sur l’image représente 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Organigramme de l’IFA sur la rage. Organigramme montrant les étapes d’exécution des principales étapes de la procédure IFA pour faciliter la visualisation du processus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Échantillon de patient | Igm | IgG |
| PS1-1 | 1:32 | 1:512 |
| PS2-1 | 1:8 | 1:128 |
| PS3-1 | 1:16 | 1:256 |
| PS4-1 | 1:64 | 1:512 |
| PS5-1 | 1:16 | 1:128 |
Tableau 1 : Résultats 2 semaines après la vaccination. Résultats des échantillons de sérum prélevés environ 2 semaines après la fin de la série de vaccins PrEP.
| Échantillon de patient | Igm | IgG |
| PS1-2 | 1:2 | 1:128 |
| PS2-2 | 1:1 | 1:128 |
| PS3-2 | 1:1 | 1:64 |
| PS4-2 | 1:1 | 1:256 |
| PS5-2 | 1:1 | 1:32 |
Tableau 2 : Résultats 6 mois après la vaccination. Résultats des échantillons de patients prélevés environ 6 mois après la fin de la série de vaccins PrEP.
| Échantillon de patient | Igm | IgG |
| PS1-3 | Non détecté | 1:128 |
| PS2-3 | Non détecté | 1:128 |
| PS3-3 | Non détecté | 1:64 |
| PS4-3 | Non détecté | 1:64 |
| PS5-3 | Non détecté | 1:32 |
Tableau 3 : Résultats 18 mois après la vaccination. Résultats des échantillons de sérum prélevés environ 18 mois après la fin de la série de vaccins PrEP.
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Discussion
Le test IFA tire parti d’un complexe antigène-anticorps, ce qui permet à un site de marquage de visualiser les anticorps spécifiques de la rage. Les cellules de neuroblastome ou BHK sont ensemencées sur des lames de microscope à plusieurs puits recouvertes de PTFE et inoculées avec la souche de laboratoire CVS-11 du virus de la rage. Une fois que la monocouche est confluente et que les cellules atteignent l’infectivité souhaitée d’environ 50 %, les lames sont stockées jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi6.
Le sérum du patient ou LCR est appliqué sur la monocouche cellulaire infectée et incubé pour permettre aux anticorps spécifiques de la rage de se fixer à l’antigène7 du virus. À la suite d’une procédure de lavage, un anticorps anti-IgG ou IgM anti-humain marqué par fluorescence est appliqué et se lie à tout anticorps lié au virus de l’échantillon appliqué. Les anticorps marqués peuvent ensuite être visualisés au microscope à fluorescence.
Lors de la préparation de ce test, il est important de déterminer la meilleure préparation des échantillons de patients, des témoins et des conjugués. Les échantillons initiaux de patients ont été examinés à un faible facteur de dilution ou non dilués pour tester la présence d’anticorps. Des échantillons appariés ou des échantillons précédemment criblés qui présentaient un niveau élevé d’anticorps ont ensuite été dilués jusqu’au point final. Les dilutions initiales d’échantillons de patients pour le test d’IgG ont été préparées dans un diluant IFA disponible dans le commerce. Les échantillons de test d’IgM ont d’abord été préparés dans un réactif bloquant les IgG disponible dans le commerce. Des dilutions en série subséquentes pour les deux essais ont ensuite été préparées dans du PBS.
Les témoins utilisés pour le dépistage ont été obtenus auprès de receveurs connus de la PrEP contre la rage ou de personnes n’ayant aucun antécédent de vaccination contre la rage. Tous les échantillons témoins ont été testés pour la présence d’anticorps avant utilisation. Le contrôle des IgG a été obtenu à partir d’un receveur de vaccin antirabique avec un titre d’anticorps neutralisant la rage confirmé par le FAVN. L’échantillon témoin IgM positif a été prélevé sur un vacciné contre la rage environ 2 semaines après la fin de la vaccination.
L’utilisation d’un conjugué approprié est un autre aspect essentiel de la réalisation du test IFA. Le conjugué utilisé pour chaque test dépend de la cible isotype d’anticorps pour ce test. Dans ce cas, des anticorps anti-IgG humains et anti-IgM anti-humains marqués au FITC ont été utilisés. Les dilutions conjuguées d’anticorps de travail ont été déterminées avant les essais sur la base de la recommandation du fabricant.
Il y a plusieurs étapes clés dans la procédure qui assureront la réussite de l’exécution du test IFA, la plus importante étant peut-être la préparation des lames antigéniques. L’atteinte d’une infectiosité d’environ 50 % fournit des sites de liaison abondants pour les anticorps disponibles, tout en créant de la clarté lors de la lecture et du classement des échantillons. Les cellules négatives pour la rage créent un arrière-plan contrasté pour mieux visualiser les anticorps marqués. La coloration non spécifique peut également présenter un problème lors de la réalisation d’une coloration fluorescente à l’aide de matrices d’échantillons complexes, telles que le sérum. L’utilisation de réactifs d’inactivation des IgG (p. ex., Gullsorb) permet de réduire la coloration non spécifique due à l’interférence des anticorps IgG lors de l’évaluation de la présence d’IgM8. La préparation correcte des matériaux et l’incorporation de réactifs spéciaux dans la procédure aident à réduire les taches problématiques tout en préservant des résultats de haute qualité.
Une multitude de méthodes de test ont été développées qui mettent l’accent sur la détection, la quantification et l’identification des anticorps antirabiques. Chacun de ces tests offre des résultats qui peuvent être utilisés de différentes manières en fonction de l’information recherchée. Le test IFA de la rage est un outil puissant pour identifier les isotypes d’anticorps spécifiques au virus, et les résultats peuvent être prêts dans un laps de temps relativement court par rapport à d’autres méthodes de test, telles que les tests RFFIT et FAVN.
Bien que le test IFA puisse détecter les anticorps antirabiques dans un échantillon, il ne fournit pas une quantification standardisée des anticorps. Le test IFA fournit un facteur de dilution sérique à partir duquel la détection des anticorps s’arrête. En comparaison, les tests RFFIT et FAVN quantifient les capacités neutralisantes des anticorps dans un échantillon, ce qui donne un titre d’unités internationales (UI), fournissant un résultat plus détaillé et standardisé. Les résultats d’un test FAVN ou RFFIT démontrent la présence d’anticorps neutralisants, qui ont été déterminés comme étant des anticorps IgG9. Le rôle des IgM dans la neutralisation de l’activité est considéré comme limité en raison de sa structure10. Par conséquent, ces tests ne détectent pas spécifiquement la présence d’IgM.
Le type de test et son résultat peuvent être quelque peu problématiques lorsqu’on les applique à un problème spécifique. Le concept d’un niveau protecteur de protection par anticorps contre l’infection par le virus de la rage n’est plus utilisé pour évaluer la réponse immunitaire à la vaccination contre la rage. Auparavant, une réponse protectrice était définie comme ≥0,5 UI. Cependant, les publications actuelles font généralement référence à la réponse en anticorps après l’immunisation comme étant acceptable (≥0,5 UI) ou inacceptable (<0,5 UI). Comme nous l’avons mentionné, le test IFA ne fournit pas de titre d’anticorps dans l’UI et ne doit pas être utilisé pour obtenir un niveau de protection contre la rage. L’utilisation du test IFA lors de l’évaluation d’un patient qui a développé la rage peut ne pas toujours entraîner une présence positive d’anticorps en raison des variations de la réponse immunitaire tout au long de la maladie. En raison de la létalité proche de 100 % d’une infection par la rage, il est important de tenir compte du test et de la quantité d’informations que l’on peut tirer en toute sécurité de ces résultats11. Pour ces raisons, il est toujours préférable d’évaluer toutes les méthodes de test des anticorps antirabiques et de déterminer celle qui fonctionne le mieux dans un scénario donné.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants au Wadsworth Center du Département de la santé de l’État de New York d’avoir soutenu ce projet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well PTFE coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
References
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