Summary
Целью данной статьи является изучение использования теста на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству для выявления антител IgG и IgM, специфичных для бешенства.
Abstract
Тест на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству (ИФА) был разработан для выявления различных изотипов антител, специфичных для бешенства, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости. Этот тест дает быстрые результаты и может быть использован для обнаружения антител к бешенству в нескольких различных сценариях. Тест на бешенство IFA особенно полезен для быстрого и раннего выявления антител для оценки иммунного ответа у пациента, у которого развилось бешенство. Несмотря на то, что другие методы посмертной диагностики бешенства имеют приоритет, этот тест может быть использован для демонстрации недавнего контакта с вирусом бешенства путем обнаружения антител. Тест IFA не дает титра вируснейтрализующих антител (VNA), но ответ на доконтактную профилактику (ДКП) можно оценить по положительному или отрицательному наличию антител. Этот тест может быть использован в различных ситуациях и может дать результаты для ряда различных целей. В этом исследовании мы использовали несколько парных образцов сыворотки крови людей, получавших ДКП и продемонстрировавших наличие у них антител к бешенству с течением времени с помощью теста IFA.
Introduction
Тест на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству (ИФА) используется для выявления различных изотипов антител, специфичных для бешенства, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости. Это один из арсенала тестов, доступных для наблюдения за посмертным пациентом с бешенством. Это особенно полезно для раннего выявления антител для оценки иммунного ответа пациента на инфекцию бешенства. При использовании в сочетании с другими тестами, историей болезни и статусом вакцинации пациента тест IFA может помочь определить контакт с вирусом бешенства или вакциной1. Поскольку тест IFA измеряет IgM и/или IgG, значения специфических антител могут указывать на приблизительные временные рамки с момента контакта с антигеном1. Этот тест может быть полезен в перечисленных приложениях или других, которые еще не изучены.
Существует несколько серологических тестов на бешенство. Основными методами измерения нейтрализующих антител к вирусу бешенства (РВНК) являются экспресс-тест на ингибирование флуоресцентного фокуса (RFFIT), тест на нейтрализацию вируса бешенства (FAVN) или их модификации. Однако эти тесты не дифференцируют антитела IgM и IgG. Когда дифференциация изотипа антител важна для мониторинга иммунного ответа на бешенство, используются тесты на ИФА бешенства и иммуноферментный анализ на бешенство (ИФА), но они не измеряют РВНК. Несмотря на то, что тесты IFA и ELISA могут быть использованы для определения наличия антител, специфичных для бешенства, в образце существуют некоторые различия в том, как они выполняются. В тесте IFA в качестве антигенного субстрата используется живой вирус, культивируемый в клетках, в то время как типичный ИФА для выявления бешенства использует один или несколько вирусных белков. В лабораторных условиях, где вирус бешенства может быть культивирован, тест IFA может быть более простым вместо покупки или культивирования отдельных вирусных белков для ИФА. Цель тестирования и информация, полученная из результатов любого серологического анализа на бешенство, должны учитываться при принятии решения о том, какой из нихвыбрать.
IgM реагирует первым, увеличиваясь до тех пор, пока не будет наблюдаться смена класса примерно на 28-й день, после чего IgG становится преобладающим циркулирующим антителом3. Следовательно, IgM можно ожидать только в течение ограниченного периода времени после контакта с вирусом бешенства или вакцинации. Тестирование как сыворотки, так и спинномозговой жидкости (ликвора) может показать, был ли контакт через вакцинацию, при которой антитела будут видны только в сыворотке, или от вирусной инфекции, которая потенциально может показать антитела в спинномозговой жидкости1.
Установлено, что антитела к бешенству сохраняются в течение нескольких лет после доконтактной профилактики (ДКП)4. Тест IFA может быть полезным инструментом, чтобы продемонстрировать это в различные моменты времени после вакцинации или контакта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол был одобрен для этичного использования образцов на людях Центром Уодсворта Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк для разработки анализов, номер одобрения протокола #03-019.
1. Безопасность
- Наденьте средства индивидуальной защиты (СИЗ), как минимум средства защиты глаз (очки или лицевой щиток), хирургическую маску и нелатексные перчатки.
- Убедитесь, что персонал вакцинирован против бешенства и что титр ≥0,5 МЕ/мл был продемонстрирован в течение последних 6 месяцев.
2. Подготовка антигена к предметному стеклу
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все манипуляции с вирусами, спинномозговой жидкостью и сывороткой крови в кабинете биобезопасности (BSC), используя универсальные меры предосторожности.
- Приготовьте 20 мл мышиной нейробластомы или клеток BHK-21 до концентрации 3,0 x 105 клеток/мл в минимально необходимой среде Eagle с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (EGM) и храните в холоде до использования.
- Приготовьте вирус CVS-11 путем разведения в EGM до рабочего разведения 1,0 x 106,5 50% инфекционной дозы тканевой культуры (TCID50) на миллилитр и храните в холоде до готовности к использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: TCID50 определяется по методу Рида и Мюнха, опубликованному ранее5. - Очистите предметную камеру влажности и хорошо покрытые политетрафторэтиленом (ПТФЭ) предметные стекла микроскопа 70% этанолом и дайте высохнуть на воздухе в BSC.
- Добавьте дистиллированную воду (dH2O) на полоски впитывающей бумаги в камере предметного стекла, чтобы влажность оставалась постоянной на протяжении всей процедуры.
- Карандашом подпишите каждый слайд, который будет использоваться, номером партии, датой, типом ячейки и любой другой идентифицирующей информацией, необходимой для хранения, и поместите его в камеру слайдов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство маркеров, ручек или этикеток не выдержат будущего этапа фиксации ацетона (шаг 2.9). - Нанесите 50 мкл вирусного разведения в каждую лунку на предметных стеклах микроскопа с помощью повторяющейся пипетки. Затем нанесите 50 мкл клеточного разведения на каждую лунку, стараясь не загрязнить наконечник пипетки вирусом, уже находящимся на лунке.
- Закройте камеру влажности и поместите ее во влажный инкубатор при температуре 34-36 °C. Оценивают инфекционность клеток через 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 2.8-2.12 только на одном слайде. - Извлеките предметное стекло из камеры влажности и осторожно аспирируйте надосадочную жидкость. Вымойте предметное стекло в банке Coplin с фосфатным буфером (PBS) в течение 2 минут, затем дайте предметному стеколу высохнуть на воздухе.
- Поместите предметное стекло в банку Coplin и зафиксируйте предметное стекло в холодном ацетоне минимум на 1 час в морозильной камере с температурой -20 °C, разрешенной для легковоспламеняющихся материалов. Все процедуры заливки ацетоном и сушки на воздухе выполняйте в вытяжном шкафу.
- Дайте ацетону испариться и высохнуть. Конъюгат антител прямого действия против бешенства (ДФА), приготовленный в соответствии с инструкцией производителя, нанести на лунки предметного стекла и инкубировать в течение 30 мин во влажном инкубаторе 34-36 °С.
- Вымойте предметное стекло в банках Coplin PBS дважды по 2 минуты каждая. Высушите слайд на воздухе.
- Установите покровное стекло с 0,05 М Tris, 0,15 М NaCl (pH 9,0) и 20% глицериновым креплением и считывают предметное стекло с помощью флуоресцентного микроскопа при 200-кратном увеличении, чтобы оценить инфекционность. Если клетки не инфицированы примерно на 50%, повторяйте шаги 2.7-2.12 на следующий день до тех пор, пока не будет достигнута желаемая инфекционность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекционность клеток аппроксимируется на основе визуальной оценки соотношения отрицательных клеток к бешенству-положительным клеткам на предметном стекле. Отрицательные клетки имеют красный цвет, в то время как положительные клетки имеют зеленое флуоресцентное окрашивание. - Удалите оставшиеся предметные стекла из инкубатора и камеры влажности. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость из каждой лунки, затем поместите предметные стекла в банку (банки) Coplin с PBS на 1-2 минуты. Сушите предметные стекла на воздухе в течение примерно 30 минут. Храните предметные стекла при температуре -80 °C до использования.
3. Пробоподготовка
- Подготовьте разведения сыворотки крови пациента или образца спинномозговой жидкости для исследования. Приготовьте необходимый конъюгат для правильной рабочей концентрации, разбавленный в PBS 0,05% синего Эванса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед нанесением держите конъюгат в темноте, чтобы сохранить целостность флуорофора
4. Процедура IFA
- Удалите необходимое количество подготовленных антигенных стекол, необходимых для каждого анализа, и дайте предметным стеклам полностью разморозиться и высохнуть.
- Поместите предметные стекла в банку (банки) Coplin и зафиксируйте их в холодном ацетоне на срок от 2 часов до ночи в морозильной камере с температурой -20 °C, одобренной для легковоспламеняющихся материалов. Выньте предметные стекла из ацетона и дайте высохнуть на воздухе.
- Поместите предметные стекла в коробку с камерой влажности внутри BSC с впитывающими полосками, пропитанными dH2O, для поддержания влажности. Нанесите 50 мкл каждого разведения пробы, контрольного образца или PBS в предварительно определенную лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый предметный камень должен содержать соответствующее количество лунок для образцов пациента, положительный контроль, отрицательный контроль и контрольный колодец PBS. - Поместите закрытую камеру влажности во влажный инкубатор с температурой 37 °C, 5%CO2 . Инкубируйте предметные стекла в течение 30 минут, затем извлеките камеру влажности из инкубатора и поместите ее в BSC.
- Используйте наконечник аспиратора, чтобы осторожно отсасывать надосадочную жидкость из каждой лунки, следя за тем, чтобы не нарушить монослой клетки. Используйте стерильную пипетку-капельницу, чтобы нанести по одной капле PBS на каждую лунку.
- Повторите тщательную аспирацию, затем поместите каждое предметное стекло в банку Coplin, наполненную PBS, и промойте дважды в общей сложности 15 минут.
- Поместите предметные стекла обратно во влажную камеру и нанесите 50 мкл соответствующего конъюгата античеловеческих антител на каждую лунку. Повторите шаги 4.4–4.6.
- Дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе, установите защитный лист с монтажным материалом и считайте предметные стекла под флуоресцентным микроскопом.
5. Анализ слайдов
- Классифицируйте образцы на основе характера окрашивания и интенсивности флуоресценции в сравнении с положительными контрольными образцами с подтвержденным высоким титром антител к бешенству.
- Оценивайте образцы по шкале отрицательных, 1+, 2+, 3+ и 4+, при этом отрицательный результат показывает отсутствие флуоресцентного окрашивания, а 4+ представляет ярко-зеленую флуоресценцию цвета яблока с рисунком окрашивания, похожим на положительные контрольные образцы1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленый цвет яблока относится только к антителам, меченным FITC; Цвет варьируется в зависимости от выбора флуорофора. - Присвойте образцам значение конечной точки, представленное коэффициентом разбавления, при котором образец имеет степень 1-2+. Испытайте образцы с более высоким коэффициентом разбавления, если конечная точка не была достигнута при первоначальном анализе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Все образцы сыворотки крови были взяты у пациентов примерно в те же сроки после приема ДКП. Образцы были протестированы от пяти разных пациентов в следующие моменты времени: через 2 недели после последней прививки вакцины против бешенства, через 6 месяцев после серии вакцинации против бешенства и через 18 месяцев после серии вакцинации против бешенства. Каждый образец сыворотки разбавляли сериями и классифицировали на наличие IgM и IgG, как описано в шагах протокола 5.2 и 5.3. Присвоенное значение антител представляет собой коэффициент разведения, при котором образец достиг конечной точки оценки 1-2+.
Результаты тестирования в каждый момент времени после ДКП демонстрируют способность анализа выявлять различные уровни присутствия антител. Вскоре после первичной вакцинации в образцах пациентов присутствовали высокие уровни IgM и IgG, как показано на рисунке 1. Участки ярко-зеленого флуоресцентного окрашивания клеток указывают на положительное наличие антител; Эритроциты – это антирабические клетки, с которыми не могут связываться антитела. Примерно через 6 месяцев после вакцинации в образцах пациентов присутствовали значительно более низкие уровни IgM и IgG, но IgM почти полностью выпал. В последний момент времени, через 18 месяцев после вакцинации, антитела IgM не были обнаружены ни в одном образце пациента, как показано на рисунке 2, где не наблюдается окрашивание зелеными флуоресцентными клетками. Тем не менее, уровни IgG сохранялись и оставались аналогичными уровням, обнаруженным в 6-месячной временной точке, после первоначального снижения по сравнению с 2-недельной временной точкой. Результаты определения IgG и IgM в образцах, полученных через 2 недели после вакцинации, через 6 месяцев после вакцинации и через 18 месяцев после вакцинации, приведены в таблице 1, таблице 2 и таблице 3 соответственно. На рисунке 3 показана блок-схема этапов выполнения.
Рисунок 1: Бешенство IgM IFA положительное окрашивание. Сыворотка крови пациента в разведении 1:8 продемонстрировала положительную картину окрашивания вскоре после завершения курса вакцины ДКП. Масштабная линейка на изображении представляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Бешенство IgM IFA отрицательное окрашивание. Сыворотка крови пациента в разведении 1:2 не показала положительного окрашивания примерно через 18 месяцев после завершения курса вакцины ДКП. Масштабная линейка на рисунке соответствует 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Блок-схема ИФА по бешенству. Блок-схема, показывающая этапы выполнения основных этапов процедуры IFA, для визуализации процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Образец пациента | IgM | IgG |
| ПС1-1 | 1:32 | 1:512 |
| ПС2-1 | 1:8 | 1:128 |
| ПС3-1 | 1:16 | 1:256 |
| ПС4-1 | 1:64 | 1:512 |
| ПС5-1 | 1:16 | 1:128 |
Таблица 1: Результаты через 2 недели после вакцинации. Результаты взятия образцов сыворотки крови пациента примерно через 2 недели после завершения курса вакцинации ДКП.
| Образец пациента | IgM | IgG |
| ПС1-2 | 1:2 | 1:128 |
| ПС2-2 | 1:1 | 1:128 |
| ПС3-2 | 1:1 | 1:64 |
| ПС4-2 | 1:1 | 1:256 |
| ПС5-2 | 1:1 | 1:32 |
Таблица 2: Результаты через 6 месяцев после вакцинации. Результаты взятия образцов сыворотки крови пациента примерно через 6 месяцев после завершения курса вакцины ДКП.
| Образец пациента | IgM | IgG |
| ПС1-3 | Не обнаружено | 1:128 |
| ПС2-3 | Не обнаружено | 1:128 |
| ПС3-3 | Не обнаружено | 1:64 |
| ПС4-3 | Не обнаружено | 1:64 |
| ПС5-3 | Не обнаружено | 1:32 |
Таблица 3: Результаты через 18 месяцев после вакцинации. Результаты образцов сыворотки крови, взятых у пациентов примерно через 18 месяцев после завершения курса вакцинации ДКП.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В тесте IFA используется комплекс антиген-антитело, позволяющий визуализировать антитела, специфичные для бешенства. Клетки нейробластомы или BHK высевают на предметные стекла микроскопа с многолуночным покрытием из ПТФЭ и инокулируют лабораторным штаммом вируса бешенства CVS-11. После того, как монослой сливается и клетки достигают желаемой инфекционности примерно в 50%, предметные стекла хранятся до тех пор, пока они не будут готовы к использованию6.
Сыворотку пациента или ликвор наносят на монослой инфицированной клетки и инкубируют, чтобы дать возможность любым антителам, специфичным для бешенства, прикрепиться к вирусному антигену7. После процедуры промывки наносится флуоресцентно меченное античеловеческое антитело IgG или IgM, которое связывается с любым антителом, связанным с вирусом, из образца. Затем меченые антитела можно визуализировать под флуоресцентным микроскопом.
При подготовке к проведению этого анализа важно определить наилучшую подготовку образцов пациента, контрольных образцов и конъюгатов. Первоначальные образцы пациентов были отобраны при низком коэффициенте разведения или в неразбавленном виде для проверки на наличие антител. Парные образцы или ранее проверенные образцы, которые продемонстрировали высокий уровень антител, затем разбавляли до конечной точки. Первоначальные разведения образцов пациента для тестирования на IgG были приготовлены в коммерчески доступном разбавителе IFA. Образцы для тестирования IgM первоначально были приготовлены в коммерчески доступном реагенте, блокирующем IgG. Последующие серийные разведения для обоих тестов были затем приготовлены в PBS.
Контрольная группа, использованная для тестирования, была получена от известных реципиентов ДКП против бешенства или от лиц, не проходивших вакцинацию против бешенства. Все контрольные образцы перед применением были протестированы на наличие антител. Контроль IgG был получен от реципиента вакцины против бешенства с установленным титром антител, нейтрализующих бешенство, подтвержденным FAVN. IgM-положительный контрольный образец был получен от реципиента вакцины против бешенства примерно через 2 недели после завершения вакцинации.
Использование соответствующего конъюгата является еще одним важным аспектом проведения теста IFA. Конъюгат, используемый для каждого теста, зависит от мишени изотипа антител для этого анализа. В данном случае использовались коммерчески доступные меченые FITC античеловеческие IgG и античеловеческие антитела IgM. Рабочие конъюгированные разведения антител определяли перед тестированием на основании рекомендаций производителя.
Существует несколько ключевых этапов процедуры, которые обеспечат успешное выполнение теста IFA, возможно, самым важным из них является подготовка антигенного предметного стекла. Достижение примерно 50% заразности обеспечивает обильное связывание имеющихся антител, а также создает ясность при чтении и сортировке образцов. Антирабические отрицательные клетки создают контрастный фон для лучшей визуализации меченых антител. Неспецифическое окрашивание также может представлять проблему при выполнении флуоресцентного окрашивания с использованием сложных матриц образцов, таких как сыворотка. Использование инактивирующих реагентов IgG (например, Gullsorb) помогает снизить неспецифическое окрашивание из-за интерферирующих антител IgG при оценке присутствия IgM8. Правильная подготовка материалов и включение в процедуру специальных реагентов помогают уменьшить проблемное окрашивание, сохраняя при этом высококачественный результат.
Было разработано множество методов тестирования, направленных на обнаружение, количественную оценку и идентификацию антител к бешенству. Каждый из этих тестов дает результаты, которые могут быть использованы различными способами в зависимости от запрашиваемой информации. Тестирование на антирабство IFA является мощным инструментом для выявления изотипов вирус-специфических антител, и результаты могут быть готовы в течение относительно короткого периода времени по сравнению с другими методами тестирования, такими как тесты RFFIT и FAVN.
Несмотря на то, что тест IFA может обнаружить антитела к бешенству в образце, он не обеспечивает стандартизированного количественного определения антител. Тест IFA обеспечивает сывороточный фактор разбавления, при котором обнаружение антител заканчивается. Для сравнения, тесты RFFIT и FAVN количественно определяют нейтрализующую способность антител в образце, что приводит к титру международных единиц (МЕ), обеспечивая более подробный и стандартизированный результат. Результаты теста FAVN или RFFIT демонстрируют наличие нейтрализующих антител, которые были определены как антитела IgG9. Роль IgM в нейтрализующей активности понимается как ограниченная из-за его структуры10. Таким образом, эти тесты не выявляют наличие IgM.
Тип теста и его результат могут быть несколько проблематичными при применении их к конкретной задаче. Понятие защитного уровня защиты антителами против бешенственной инфекции больше не используется для оценки иммунного ответа на вакцинацию против бешенства. Ранее защитная реакция определялась как ≥0,5 МЕ. Тем не менее, в современных публикациях ответ антител после иммунизации обычно оценивается как приемлемый (≥0,5 МЕ) или неприемлемый (<0,5 МЕ). Как уже говорилось, тест IFA не дает титра антител в МЕ и не должен использоваться для определения уровня защиты от бешенства. Использование теста IFA при обследовании пациента, у которого развилось бешенство, не всегда может привести к положительному наличию антител из-за различий в иммунном ответе на протяжении всего заболевания. В связи с почти 100%-ной летальностью инфекции бешенства важно учитывать тест и то, сколько информации можно безопасно извлечь из этих результатов11. По этим причинам всегда лучше оценить все методы тестирования на антитела к бешенству и определить, какой из них лучше всего работает в том или ином сценарии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны Центру Уодсворта Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк за поддержку этого проекта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well PTFE coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
References
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).
- Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516 (2021).
- Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
- Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
- Fooks, A. R., Jackson, A. C. Rabies: scientific basis of the disease and its management. , Academic Press. (2020).
- Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
- Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
- Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
- Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).
