Summary
El objetivo de este manuscrito es examinar el uso de la prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos contra la rabia para la detección de anticuerpos IgG e IgM específicos contra la rabia.
Abstract
La prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos (IFA) contra la rabia se desarrolló para detectar varios isotipos de anticuerpos específicos contra la rabia en sueros o líquido cefalorraquídeo. Esta prueba proporciona resultados rápidos y se puede utilizar para detectar anticuerpos contra la rabia en varios escenarios diferentes. La prueba de rabia IFA es especialmente útil para la detección rápida y temprana de anticuerpos para evaluar la respuesta inmune en un paciente que ha desarrollado rabia. Aunque otros métodos para el diagnóstico de la rabia antemortem tienen prioridad, esta prueba se puede utilizar para demostrar la exposición reciente al virus de la rabia a través de la detección de anticuerpos. La prueba IFA no proporciona un título de anticuerpos neutralizantes del virus (VNA), pero la respuesta de profilaxis previa a la exposición (PrEP) puede evaluarse a través de la presencia positiva o negativa de anticuerpos. Esta prueba se puede utilizar en diversas situaciones y puede proporcionar resultados para varios objetivos diferentes. En este estudio, utilizamos varias muestras de suero pareadas de individuos que recibieron PrEP y demostramos su presencia de anticuerpos contra la rabia a lo largo del tiempo utilizando la prueba IFA.
Introduction
La prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos (IFA) contra la rabia se utiliza para detectar varios isotipos de anticuerpos específicos contra la rabia en sueros o líquido cefalorraquídeo. Forma parte de un arsenal de pruebas disponibles para el seguimiento de un paciente con rabia antemortem. Es especialmente útil para la detección temprana de anticuerpos para evaluar la respuesta inmunitaria de un paciente a la infección por rabia. Cuando se utiliza junto con otras pruebas, la historia clínica y el estado de vacunación del paciente, la prueba IFA puede ayudar a determinar la exposición al virus de la rabia o a una vacuna1. Como la prueba IFA mide IgM y/o IgG, los valores del anticuerpo específico pueden indicar un período de tiempo aproximado desde la exposición al antígeno1. Esta prueba puede ser útil en las aplicaciones enumeradas u otras aún no exploradas.
Existen varios ensayos serológicos contra la rabia. La prueba rápida de inhibición del foco fluorescente (RFFIT), la prueba de neutralización del virus de anticuerpos fluorescentes (FAVN) o las modificaciones de estas son los principales métodos para medir los anticuerpos neutralizantes del virus de la rabia (RVNA)1. Sin embargo, estas pruebas no diferencian los anticuerpos IgM e IgG. Cuando la diferenciación del isotipo de los anticuerpos es importante para monitorizar la respuesta inmunitaria de la rabia, se utilizan las pruebas de IFA antirrábica y de ensayo de inmunoabsorción enzimática de la rabia (ELISA), pero no miden los AVR. Aunque las pruebas IFA y ELISA se pueden utilizar para determinar la presencia de anticuerpos específicos contra la rabia en una muestra, existen algunas diferencias en la forma en que se ejecutan. La prueba IFA utiliza un virus vivo cultivado en células como sustrato de antígeno, mientras que un ELISA típico para la detección de la rabia utiliza una o más de las proteínas virales. En un entorno de laboratorio donde se puede cultivar el virus de la rabia, la prueba de IFA se puede realizar más fácilmente en lugar de comprar o cultivar proteínas virales individuales para el ELISA. El propósito de la prueba y la información obtenida de los resultados de cualquier ensayo serológico de rabia deben tenerse en cuenta al determinar cuál elegir2.
La IgM es la primera en responder, aumentando hasta que se observa el cambio de clase alrededor del día 28, momento en el que la IgG se convierte en el anticuerpo circulante predominante3. Por lo tanto, la IgM solo se esperaría durante un período de tiempo limitado después de la exposición al virus de la rabia o la vacunación. Las pruebas tanto en suero como en líquido cefalorraquídeo (LCR) pueden indicar si la exposición fue a través de la vacunación, en la que los anticuerpos se verían solo en los sueros, o de una infección viral, que potencialmente mostraría anticuerpos en el LCR1.
Se ha establecido que los anticuerpos antirrábicos persisten durante varios años después de la profilaxis previa a la exposición (PrEP)4. La prueba IFA puede ser una herramienta útil para demostrar esto en diferentes momentos después de la vacunación o la exposición.
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Protocol
El siguiente protocolo ha sido aprobado para el uso ético de muestras humanas por el Centro Wadsworth del Departamento de Salud del Estado de Nueva York para el desarrollo de ensayos, número de aprobación del protocolo #03-019.
1. Seguridad
- Use equipo de protección personal (EPP), protección ocular mínima (anteojos o protector facial), una mascarilla quirúrgica y guantes que no sean de látex.
- Asegúrese de que el personal esté vacunado contra la rabia y que se haya demostrado un título de ≥0.5 UI/ml en los últimos 6 meses.
2. Preparación del portaobjetos de antígeno
NOTA: Realice todas las manipulaciones de virus, LCR y suero en una cabina de bioseguridad (BSC) utilizando las precauciones universales.
- Prepare 20 ml de neuroblastoma de ratón o células BHK-21 a una concentración de 3,0 x 105 células/ml en los medios esenciales mínimos de Eagle suplementados con suero fetal bovino (EGM) al 10 % y manténgalos fríos hasta su uso.
- Prepare el virus CVS-11 diluyéndolo en EGM hasta una dilución de trabajo de 1,0 x 106,5 50 % de dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID50) por mililitro y manténgalo frío hasta que esté listo para su uso.
NOTA: El TCID50 se determina mediante el método de Reed y Muench publicado anteriormente5. - Limpie una cámara de portaobjetos de humedad y portaobjetos de pocillo recubiertos de politetrafluoroetileno (PTFE) con etanol al 70% y deje secar al aire en el BSC.
- Agregue agua destilada (dH2O) a las tiras de papel absorbente en la cámara del portaobjetos para asegurarse de que la humedad permanezca constante durante todo el procedimiento.
- Con un lápiz, etiquete cada portaobjetos que se va a utilizar con el número de lote, la fecha, el tipo de celda y cualquier otra información de identificación necesaria para el almacenamiento, y colóquelos en la cámara de portaobjetos.
NOTA: La mayoría de los marcadores, bolígrafos o etiquetas no resistirán el futuro paso de fijación de acetona (paso 2.9). - Aplique 50 μL de dilución de virus a cada pocillo de los portaobjetos del microscopio con una pipeta de repetición. A continuación, aplique 50 μL de dilución celular en cada pocillo, teniendo cuidado de no contaminar la punta de la pipeta con el virus que ya está en el pocillo.
- Cierre la cámara del portaobjetos de humedad y colóquela en la incubadora húmeda a 34-36 °C. Evaluar la infectividad celular después de 24 h.
NOTA: Realice los pasos 2.8-2.12 en una sola diapositiva. - Retire el portaobjetos de la cámara de humedad y aspire con cuidado el sobrenadante. Lave el portaobjetos en un frasco Coplin lleno de solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 2 minutos, luego deje que el portaobjetos se seque al aire.
- Coloque el portaobjetos en el frasco Coplin y fije el portaobjetos en acetona fría durante un mínimo de 1 h en un congelador de -20 °C aprobado para materiales inflamables. Realice todos los procedimientos de vertido de acetona y secado al aire en una campana extractora.
- Deja que la acetona se desprenda y se seque. Aplicar anticuerpo fluorescente directo (DFA) antirrábico preparado según las instrucciones del fabricante en los pocillos del portaobjetos e incubar durante 30 min en una incubadora húmeda a 34-36 °C.
- Lave el portaobjetos en frascos Coplin de PBS dos veces durante 2 minutos cada uno. Seque el portaobjetos al aire.
- Monte un cubreobjetos con 0,05 M de Tris, 0,15 M de NaCl (pH 9,0) y un 20% de glicerol, y lea el portaobjetos con un microscopio fluorescente con un aumento de 200x para evaluar la infectividad. Si las células no están infectadas aproximadamente en un 50%, repita los pasos 2.7-2.12 al día siguiente hasta alcanzar la infectividad deseada.
NOTA: La infectividad celular se aproxima en función de la evaluación visual de la proporción de células negativas a células positivas para la rabia en el pocillo portaobjetos. Las células negativas aparecen de color rojo, mientras que las células positivas muestran una tinción fluorescente verde. - Retire los portaobjetos restantes de la incubadora y de la cámara de humedad. Aspire con cuidado el sobrenadante de cada pocillo, luego coloque los portaobjetos en un frasco Coplin con PBS durante 1-2 minutos. Seque los portaobjetos al aire durante aproximadamente 30 minutos. Guarde los portaobjetos a -80 °C hasta que estén listos para su uso.
3. Preparación de la muestra
- Prepare las diluciones de muestras de suero o LCR del paciente para su análisis. Preparar el conjugado necesario para una concentración de trabajo adecuada diluido en PBS con azul de Evans al 0,05%.
NOTA: Mantenga el conjugado en la oscuridad para mantener la integridad del fluoróforo antes de la aplicación
4. Procedimiento IFA
- Retire el número necesario de portaobjetos de antígeno preparados necesarios para cada ensayo y deje que los portaobjetos se descongelen y se sequen por completo.
- Coloque los portaobjetos en un frasco Coplin y fije los portaobjetos en acetona fría durante 2 h a toda la noche en un congelador de -20 °C aprobado para materiales inflamables. Retire los portaobjetos de la acetona y déjelos secar al aire.
- Coloque los portaobjetos en una caja de cámara de humedad dentro del BSC con tiras absorbentes empapadas en OdH 2para mantener la humedad. Aplique 50 μL de cada dilución de muestra, muestra de control o PBS al pocillo predeterminado.
NOTA: Cada portaobjetos debe contener un número adecuado de pocillos de muestra de pacientes, pocillos de control positivo, control negativo y pocillo de control de células PBS. - Coloque la cámara de portaobjetos de humedad cerrada en una incubadora húmeda a 37 °C y 5% de CO2 . Incube los portaobjetos durante 30 minutos, luego retire la cámara de humedad de los portaobjetos de la incubadora y colóquela en un BSC.
- Utilice una punta de aspiración para aspirar cuidadosamente el sobrenadante de cada pocillo, asegurándose de no perturbar la monocapa celular. Utilice una pipeta cuentagotas estéril para aplicar una gota de PBS en cada pocillo.
- Repita la aspiración cuidadosa, luego coloque cada portaobjetos en un frasco Coplin lleno de PBS y lave dos veces durante un total de 15 minutos.
- Vuelva a colocar los portaobjetos en la caja de la cámara de humedad y aplique 50 μL de conjugado de anticuerpos antihumanos apropiado a cada pocillo. Repita los pasos 4.4 a 4.6.
- Deje que los portaobjetos se sequen al aire, monte un cubreobjetos con medios de montaje y lea los portaobjetos bajo un microscopio fluorescente.
5. Análisis de diapositivas
- Clasificar las muestras en función del patrón de tinción y la intensidad de fluorescencia en comparación con las muestras de control positivas con un título de anticuerpos antirrábicos alto confirmado.
- Califique las muestras en una escala de negativo, 1+, 2+, 3+ y 4+, con un resultado negativo que muestre que no hay tinción fluorescente y 4+ que representa una fluorescencia de color manzana verde brillante con un patrón de tinción similar al de las muestras de control positivas1.
NOTA: El color verde manzana se aplica solo a los anticuerpos marcados con FITC; El color varía dependiendo de la selección de fluoróforos. - Asigne a las muestras un valor de punto final representado por el factor de dilución en el que la muestra muestra un grado 1-2+. Pruebe las muestras con un factor de dilución más alto si no se alcanza el punto final en el ensayo inicial.
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Representative Results
Todas las muestras de suero se recolectaron de los pacientes aproximadamente en los mismos períodos de tiempo después de la PrEP. Las muestras se analizaron de cinco pacientes diferentes en los siguientes momentos: 2 semanas después de la inoculación final de la vacuna antirrábica, 6 meses después de la serie de vacunas antirrábicas y 18 meses después de la serie de vacunas antirrábicas. Cada muestra de suero se diluyó en series y se clasificó según la presencia de IgM e IgG, como se describe en los pasos 5.2 y 5.3 del protocolo. El valor de anticuerpo asignado representa el factor de dilución en el que la muestra alcanzó un grado final de 1-2+.
Los resultados de las pruebas de cada punto de tiempo después de la PrEP demuestran la capacidad del ensayo para detectar diferentes niveles de presencia de anticuerpos. Poco después de la vacunación inicial, se observaron altos niveles de IgM e IgG en las muestras de pacientes, como se observa en la Figura 1. Las áreas de tinción de células fluorescentes de color verde brillante indican la presencia de anticuerpos positivos; Los glóbulos rojos son células antirrábicas negativas a las que ningún anticuerpo puede unirse. Aproximadamente 6 meses después de la vacunación, los niveles significativamente más bajos de IgM e IgG estaban presentes en las muestras de pacientes, pero la IgM había desaparecido casi por completo. En el momento final, 18 meses después de la vacunación, no se detectaron anticuerpos IgM en ninguna muestra de pacientes, como se demuestra en la Figura 2, donde no se observa tinción de células fluorescentes verdes. Sin embargo, los niveles de IgG persistieron y se mantuvieron similares a los niveles detectados a los 6 meses después de la disminución inicial a partir de las 2 semanas. Los resultados de la detección de IgG e IgM en muestras de 2 semanas después de la vacunación, 6 meses después de la vacunación y 18 meses después de la vacunación se enumeran en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3, respectivamente. La figura 3 muestra el diagrama de flujo de las etapas de ejecución.
Figura 1: Tinción de IgM IFA positiva para rabia. El suero del paciente en una dilución de 1:8 demostró un patrón de tinción positivo poco después de completar la serie de vacunas de la PrEP. La barra de escala de la imagen representa 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Tinción de IgM IFA negativa para rabia. El suero del paciente en una dilución 1:2 no mostró tinción positiva aproximadamente 18 meses después de completar la serie de vacunas PrEP. La barra de escala de la imagen representa 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diagrama de flujo de la IFA antirrábica. Diagrama de flujo que muestra las etapas de ejecución de los pasos principales en el procedimiento IFA para ayudar en la visualización del proceso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Muestra de paciente | Igm | IgG |
| PS1-1 | 1:32 | 1:512 |
| PS2-1 | 1:8 | 1:128 |
| PS3-1 | 1:16 | 1:256 |
| PS4-1 | 1:64 | 1:512 |
| PS5-1 | 1:16 | 1:128 |
Tabla 1: Resultados 2 semanas después de la vacunación. Resultados de muestras de pacientes de muestras de suero recolectadas aproximadamente 2 semanas después de completar la serie de vacunas PrEP.
| Muestra de paciente | Igm | IgG |
| PS1-2 | 1:2 | 1:128 |
| PS2-2 | 1:1 | 1:128 |
| PS3-2 | 1:1 | 1:64 |
| PS4-2 | 1:1 | 1:256 |
| PS5-2 | 1:1 | 1:32 |
Tabla 2: Resultados 6 meses después de la vacunación. Resultados de muestras de pacientes de muestras de suero recolectadas aproximadamente 6 meses después de completar la serie de vacunas PrEP.
| Muestra de paciente | Igm | IgG |
| PS1-3 | No detectado | 1:128 |
| PS2-3 | No detectado | 1:128 |
| PS3-3 | No detectado | 1:64 |
| PS4-3 | No detectado | 1:64 |
| PS5-3 | No detectado | 1:32 |
Tabla 3: Resultados 18 meses después de la vacunación. Resultados de muestras de pacientes de muestras de suero recolectadas aproximadamente 18 meses después de completar la serie de vacunas PrEP.
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Discussion
La prueba IFA aprovecha un complejo antígeno-anticuerpo, lo que permite un sitio de marcaje para visualizar los anticuerpos específicos de la rabia. El neuroblastoma o las células BHK se siembran en portaobjetos de microscopio recubiertos de PTFE de varios pocillos y se inoculan con la cepa de laboratorio CVS-11 del virus de la rabia. Una vez que la monocapa es confluente y las células alcanzan la infectividad deseada de aproximadamente el 50%, los portaobjetos se almacenan hasta que estén listos para su uso6.
El suero o LCR del paciente se aplica a la monocapa de la célula infectada y se incuba para permitir que los anticuerpos específicos de la rabia se adhieran al antígeno del virus7. Después de un procedimiento de lavado, se aplica un anticuerpo IgG o IgM humano marcado con fluorescencia y se une a cualquier anticuerpo unido al virus de la aplicación de la muestra. Los anticuerpos marcados se pueden visualizar bajo un microscopio fluorescente.
Al prepararse para realizar este ensayo, es importante determinar la mejor preparación de las muestras de pacientes, los controles y los conjugados. Las muestras iniciales de los pacientes se analizaron con un factor de dilución bajo o sin diluir para detectar la presencia de anticuerpos. Las muestras pareadas o las muestras previamente examinadas que demostraron un alto nivel de anticuerpos se diluyeron aún más hasta el punto final. Las diluciones iniciales de las muestras de los pacientes para las pruebas de IgG se prepararon en diluyente de IFA disponible comercialmente. Las muestras de prueba de IgM se prepararon inicialmente en un reactivo de bloqueo de IgG disponible comercialmente. A continuación, se prepararon diluciones seriadas posteriores para ambas pruebas en PBS.
Los controles utilizados para las pruebas se obtuvieron de receptores conocidos de PrEP antirrábica o de personas sin antecedentes de vacunación antirrábica. Todas las muestras de control se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos antes de su uso. El control de IgG se obtuvo de un receptor de la vacuna antirrábica con un título establecido de anticuerpos neutralizantes de la rabia confirmado por la FAVN. La muestra de control positiva para IgM se obtuvo de un receptor de la vacuna antirrábica aproximadamente 2 semanas después de completar la vacunación.
El uso de un conjugado apropiado es otro aspecto vital de la realización de la prueba IFA. El conjugado utilizado para cada prueba depende del objetivo del isotipo de anticuerpo para ese ensayo. En este caso, se utilizaron anticuerpos anti-IgG humanos y anti-IgM humanos marcados con el FITC disponibles comercialmente. Las diluciones de conjugado de anticuerpos de trabajo se determinaron antes de la prueba según la recomendación del fabricante.
Hay varios pasos clave en el procedimiento que garantizarán la ejecución exitosa de la prueba IFA, quizás el más importante sea la preparación del portaobjetos de antígeno. Alcanzar aproximadamente el 50% de infectividad proporciona abundantes sitios de unión para los anticuerpos disponibles, al tiempo que crea claridad al leer y clasificar las muestras. Las células antirrábicas negativas crean un fondo contrastante para visualizar mejor los anticuerpos marcados. La tinción inespecífica también puede presentar un problema cuando se realiza la tinción fluorescente utilizando matrices de muestra complejas, como el suero. El uso de reactivos de inactivación de IgG (p. ej., Gullsorb) ayuda a reducir la tinción inespecífica debido a la interferencia de anticuerpos IgG al evaluar la presencia de IgM8. La preparación adecuada de los materiales y la incorporación de reactivos especiales en el procedimiento ayudan a disminuir las tinciones problemáticas al tiempo que preservan resultados de alta calidad.
Se han desarrollado una multitud de métodos de prueba que se centran en la detección, cuantificación e identificación de anticuerpos contra la rabia. Cada una de estas pruebas ofrece resultados que pueden ser utilizados de diversas maneras dependiendo de la información buscada. La prueba de IFA antirrábica es una herramienta poderosa para identificar isotipos de anticuerpos específicos del virus, y los resultados pueden estar listos en un período de tiempo relativamente corto en comparación con otros métodos de prueba, como las pruebas RFFIT y FAVN.
Aunque la prueba IFA puede detectar anticuerpos antirrábicos en una muestra, no proporciona una cuantificación estandarizada de los anticuerpos. La prueba IFA proporciona un factor de dilución sérica en el que finaliza la detección de anticuerpos. En comparación, las pruebas RFFIT y FAVN cuantifican la capacidad neutralizante de los anticuerpos en una muestra, lo que da como resultado un título de unidades internacionales (UI), lo que proporciona un resultado más detallado y estandarizado. Los resultados de una prueba FAVN o RFFIT demuestran la presencia de anticuerpos neutralizantes, que se han determinado como anticuerpos IgG9. Se entiende que el papel de la IgM en la actividad neutralizante es limitado debido a su estructura10. Por lo tanto, estas pruebas no detectan específicamente la presencia de IgM.
El tipo de prueba y su resultado pueden ser algo problemáticos a la hora de aplicarlos a un problema concreto. El concepto de un nivel protector de protección de anticuerpos contra la infección por el virus de la rabia ya no se utiliza para evaluar la respuesta inmunitaria a la vacunación antirrábica. Anteriormente, una respuesta protectora se definía como ≥0,5 UI. Sin embargo, las publicaciones actuales suelen referirse a la respuesta de anticuerpos después de la inmunización como aceptable (≥0,5 UI) o inaceptable (<0,5 UI). Como se ha dicho, la prueba IFA no proporciona un título de anticuerpos en IU y no debe utilizarse para obtener un nivel de protección contra la rabia. El uso de la prueba IFA mientras se evalúa a un paciente que ha desarrollado rabia no siempre da como resultado una presencia positiva de anticuerpos debido a las variaciones en la respuesta inmunitaria a lo largo de la enfermedad. Debido a la letalidad cercana al 100% de una infección por rabia, es importante tener en cuenta la prueba y cuánta información se puede derivar de forma segura de estos resultados11. Por estas razones, siempre es mejor evaluar todos los métodos de prueba de anticuerpos contra la rabia y determinar cuál funciona mejor en un escenario determinado.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Centro Wadsworth del Departamento de Salud del Estado de Nueva York por apoyar este proyecto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well PTFE coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
References
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