Summary
Formålet med dette manuskript er at undersøge anvendelsen af rabies indirekte fluorescerende antistoftest til påvisning af rabiesspecifikke IgG- og IgM-antistoffer.
Abstract
Rabies indirekte fluorescerende antistof (IFA) test blev udviklet til at detektere forskellige rabies-specifikke antistof isotyper i sera eller cerebral spinalvæske. Denne test giver hurtige resultater og kan bruges til at detektere rabiesantistoffer i flere forskellige scenarier. Rabies IFA-testen er især nyttig til hurtig og tidlig påvisning af antistoffer til evaluering af immunresponset hos en patient, der har udviklet rabies. Selv om andre metoder til antemortem rabies diagnose har forrang, denne test kan anvendes til at påvise nylig rabiesvirus eksponering gennem antistof påvisning. IFA-testen giver ikke en virusneutraliserende antistoftiter (VNA), men præeksponeringsprofylakseresponset (PrEP) kan evalueres gennem positiv eller negativ antistoftilstedeværelse. Denne test kan bruges i forskellige situationer og kan give resultater for en række forskellige mål. I denne undersøgelse brugte vi flere parrede serumprøver fra personer, der fik PrEP og demonstrerede deres rabiesantistoftilstedeværelse over tid ved hjælp af IFA-testen.
Introduction
Den rabies indirekte fluorescerende antistof (IFA) test bruges til at påvise forskellige rabies-specifikke antistof isotyper i sera eller cerebral spinalvæske. Det er en af et arsenal af tests til rådighed til overvågning af en antemortem rabies patient. Det er især nyttigt til tidlig påvisning af antistoffer til evaluering af patientens immunrespons på rabiesinfektion. Når IFA-testen bruges sammen med andre tests, sygehistorie og patientens vaccinationsstatus, kan den hjælpe med at bestemme eksponering for rabiesvirus eller en vaccine1. Da IFA-testen måler IgM og/eller IgG, kan værdierne for det specifikke antistof indikere en omtrentlig tidsramme fra eksponering for antigen1. Denne test kan være nyttig i de anførte applikationer eller andre, der endnu ikke er udforsket.
Der findes flere rabiesserologiske assays. Den hurtige fluorescerende fokushæmningstest (RFFIT), fluorescerende antistofvirusneutraliseringstest (FAVN) eller modifikationer af disse er de primære metoder til måling af rabiesvirusneutraliserende antistoffer (RVNA'er)1. Disse tests differentierer imidlertid ikke IgM- og IgG-antistoffer. Når differentiering af antistofisotype er vigtig i overvågningen af rabiesimmunresponsen, anvendes rabies IFA og rabiesenzymbundet immunosorbentassay (ELISA) test, men de måler ikke RVNA'er. Selvom IFA- og ELISA-testene kan bruges til at bestemme tilstedeværelsen af rabiesspecifikke antistoffer i en prøve, er der nogle forskelle i, hvordan de udføres. IFA-testen bruger en celledyrket levende virus som sit antigensubstrat, mens en typisk ELISA til rabiesdetektion bruger et eller flere af de virale proteiner. I et laboratorium, hvor rabiesvirus kan dyrkes, kan IFA-testen lettere udføres i stedet for at købe eller dyrke individuelle virale proteiner til ELISA. Formålet med testningen og de oplysninger, der indhentes fra resultaterne af enhver rabiesserologisk analyse, bør tages i betragtning, når det afgøres, hvilken der skal vælges2.
IgM er den første til at reagere og stiger, indtil klasseskift observeres omkring dag 28, på hvilket tidspunkt IgG bliver det dominerende cirkulerende antistof3. IgM forventes derfor kun i en begrænset periode efter eksponering for rabiesvirus eller vaccination. Test af både serum og cerebrospinalvæske (CSF) kan indikere, om eksponeringen var gennem vaccination, hvor antistoffer kun ville ses i sera eller fra en virusinfektion, som potentielt ville vise antistoffer i CSF1.
Det er blevet fastslået, at rabiesantistoffer vedvarer i flere år efter profylakse før eksponering (PrEP)4. IFA-testen kan være et nyttigt værktøj til at demonstrere dette på forskellige tidspunkter efter vaccination eller eksponering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol er blevet godkendt til etisk brug af humane prøver af New York State Department of Health Wadsworth Center til analyseudvikling, protokolgodkendelsesnummer #03-019.
1. Sikkerhed
- Don personligt beskyttelsesudstyr (PPE), som minimum øjenbeskyttelse (briller eller ansigtsskærm), en kirurgisk maske og ikke-latexhandsker.
- Sørg for, at personalet er vaccineret mod rabies, og at der er påvist en titer på ≥0,5 IE/ml inden for de seneste 6 måneder.
2. Forberedelse af antigenglas
BEMÆRK: Udfør alle virus-, CSF- og serummanipulationer i et biosikkerhedsskab (BSC) ved hjælp af universelle forholdsregler.
- Forbered 20 ml museneuroblastom eller BHK-21-celler til en koncentration på 3,0 x 105 celler / ml i Eagle's minimum essentielle medier suppleret med 10% føtalt bovint serum (EGM) og hold koldt indtil brug.
- Forbered CVS-11-virus ved at fortynde i EGM til en arbejdsfortynding på 1,0 x 106,5 50% vævskultur infektiøs dosis (TCID50) pr. milliliter og hold koldt, indtil det er klar til brug.
BEMÆRK: TCID50 bestemmes af Reed and Muench-metoden, der er offentliggjort tidligere5. - Rengør et fugtglidekammer og polytetrafluorethylen (PTFE) -belagte brøndmikroskopglas med 70% ethanol og lad det lufttørre i BSC.
- Tilsæt destilleret vand (dH2O) til strimler af absorberende papir i diaskammeret for at sikre, at fugtigheden forbliver konstant under hele proceduren.
- Brug en blyant til at mærke hvert dias, der skal bruges, med lotnummer, dato, celletype og andre identificerende oplysninger, der kræves til opbevaring, og placer dem i diaskammeret.
BEMÆRK: De fleste markører, penne eller etiketter tåler ikke det fremtidige acetonefikseringstrin (trin 2.9). - Der påføres 50 μL virusfortynding på hvert hul på mikroskopglassene med en gentagende pipette. Påfør derefter 50 μL cellefortynding på hvert hul, og pas på ikke at forurene pipettespidsen med den virus, der allerede er på brønden.
- Luk fugtglidekammeret og anbring det i den fugtige inkubator ved 34-36 °C. Vurder celleinfektiviteten efter 24 timer.
BEMÆRK: Udfør trin 2.8-2.12 på kun ét dias. - Fjern objektglasset fra fugtighedskammeret, og sug forsigtigt supernatanten ind. Vask objektglasset i en fosfatbufret saltvandsbeholder (PBS)-fyldt med Coplin i 2 minutter, og lad derefter diaset lufttørre.
- Anbring objektglasset i Coplin-glasset, og fastgør objektglasset i kold acetone i mindst 1 time i en fryser til -20 °C, der er godkendt til brændbare materialer. Udfør alle acetonehældnings- og lufttørringsprocedurer i en stinkhætte.
- Lad acetonen blinke af og lad den tørre. Der påføres konjugat mod rabies direkte fluorescerende antistof (DFA), der er fremstillet i overensstemmelse med producentens anvisninger, i hullerne i objektglasset og inkuberes i 30 minutter i en fugtig inkubator på 34-36 °C.
- Vask diaset i Coplin krukker med PBS to gange i 2 min hver. Lufttør diaset.
- Monter et dæksel med 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl (pH 9,0) og 20% glycerolmonteringsmiddel, og læs diaset ved hjælp af et fluorescerende mikroskop ved 200x forstørrelse for at vurdere infektiviteten. Hvis cellerne ikke er ca. 50% inficerede, gentages trin 2.7-2.12 den følgende dag, indtil den ønskede infektivitet er nået.
BEMÆRK: Celleinfektivitet tilnærmes baseret på visuel vurdering af forholdet mellem negative celler og rabies-positive celler på diasbrønden. Negative celler vises røde i farve, mens positive celler viser grøn fluorescerende farvning. - Fjern de resterende dias fra inkubatoren og fugtighedskammeret. Sug forsigtigt supernatanten fra hvert hul, og læg derefter diasene i en eller flere Coplin-glas med PBS i 1-2 minutter. Lufttør rutsjebanerne i ca. 30 min. Opbevar objektglassene ved -80 °C, indtil de er klar til brug.
3. Forberedelse af prøver
- Forbered fortyndinger af patientserum- eller CSF-prøver til testning. Forbered det nødvendige konjugat til en korrekt arbejdskoncentration fortyndet i PBS med 0,05% Evans blå.
BEMÆRK: Hold konjugatet i mørke for at opretholde fluoroforintegriteten inden påføring
4. IFA-proceduren
- Fjern det nødvendige antal forberedte antigenglas, der er nødvendige for hvert assay, og lad diasene optø og tørre helt.
- Anbring objektglassene i en eller flere Coplin-krukker, og fastgør objektglassene i kold acetone i mellem 2 timer og natten over i en fryser til -20 °C, der er godkendt til brændbare materialer. Fjern diasene fra acetonen og lad dem lufttørre.
- Placer gliderne i en fugtkammerboks inde i BSC med dH2O-gennemblødte absorberende strimler for at opretholde fugtigheden. Der påføres 50 μL af hver prøvefortynding, kontrolprøve eller PBS på det forudbestemte hul.
BEMÆRK: Hvert dias skal indeholde et passende antal patientprøvehuller, positiv kontrol, negativ kontrol og PBS-cellekontrolbrønd. - Anbring det lukkede fugtglidekammer i en fugtig inkubator på 37 °C, 5% CO2 . Inkuber diasene i 30 minutter, fjern derefter fugtighedsglidekammeret fra inkubatoren og læg det i en BSC.
- Brug en sugespids til forsigtigt at opsuge supernatanten fra hvert hul, så cellemonolaget ikke forstyrres. Brug en steril pipette til at påføre en dråbe PBS i hvert hul.
- Gentag omhyggelig aspiration, læg derefter hvert dias i en PBS-fyldt Coplin-krukke og vask to gange i alt 15 minutter.
- Anbring objektglassene tilbage i fugtkammerkassen, og påfør 50 μL passende antistofkonjugat på hvert hul. Gentag trin 4.4 til 4.6.
- Lad diasene lufttørre, monter en dæksel med monteringsmedier, og læs lysbillederne under fluorescerende mikroskop.
5. Diasanalyse
- Gradprøver baseret på farvningsmønster og fluorescensintensitet sammenlignet med positive kontrolprøver med bekræftet antirabiesantistoftiter.
- Bedøm prøverne på en skala fra negativ, 1+, 2+, 3+ og 4+ med et negativt resultat, der ikke viser fluorescerende farvning og 4+, der repræsenterer en lysegrøn æblefarvefluorescens med et farvningsmønster svarende til positive kontrolprøver1.
BEMÆRK: Den grønne æblefarve gælder kun for FITC-mærkede antistoffer; Farven varierer afhængigt af fluoroforvalg. - Tildel prøverne en slutpunktsværdi repræsenteret af fortyndingsfaktoren, hvor prøven viser en klasse på 1-2+. Prøverne testes ved en højere fortyndingsfaktor, hvis slutpunktet ikke nås i den indledende analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle serumprøver blev indsamlet fra patienterne på omtrent samme tidsrammer efter PrEP. Prøverne blev testet fra fem forskellige patienter på følgende tidspunkter: 2 uger efter den endelige rabiesvaccinevaccination, 6 måneder efter rabiesvaccineserien og 18 måneder efter rabiesvaccineserien. Hver serumprøve blev fortyndet i serie og klassificeret for både IgM- og IgG-tilstedeværelse som beskrevet i protokoltrin 5.2 og 5.3. Den tildelte antistofværdi repræsenterer fortyndingsfaktoren, hvor prøven nåede en slutpunktsgrad på 1-2+.
Resultaterne fra test hvert tidspunkt efter PrEP viser assayets evne til at detektere forskellige niveauer af antistoftilstedeværelse. Kort efter den første vaccination var høje niveauer af både IgM og IgG til stede i patientprøverne, som det ses i figur 1. Områder med lysegrøn fluorescerende cellefarvning indikerer positiv antistoftilstedeværelse; Røde blodlegemer er rabies-negative celler, hvor intet antistof kunne binde. Ca. 6 måneder efter vaccination var signifikant lavere niveauer af både IgM og IgG til stede i patientprøverne, men IgM var faldet næsten helt ud. På det sidste tidspunkt, 18 måneder efter vaccination, blev der ikke påvist IgM-antistoffer i nogen patientprøver, som vist i figur 2, hvor der ikke observeres farvning af grønne fluorescerende celler. Imidlertid fortsatte IgG-niveauerne og forblev svarende til de niveauer, der blev opdaget på 6 måneders tidspunktet efter det indledende fald fra 2 ugers tidspunktet. Resultaterne for påvisning af IgG og IgM i prøver fra 2 uger efter vaccination, 6 måneder efter vaccination og 18 måneder efter vaccination er anført i henholdsvis tabel 1, tabel 2 og tabel 3. Figur 3 viser rutediagrammet for udførelsesfaserne.
Figur 1: Rabies IgM IFA positiv farvning. Patientserum ved en 1:8 fortynding viste et positivt farvningsmønster kort efter afslutning af PrEP-vaccineserien. Skalabjælken på billedet repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Rabies IgM IFA negativ farvning. Patientserum ved en 1:2 fortynding viste ingen positiv farvning ca. 18 måneder efter afslutning af PrEP-vaccineserien. Skalabjælken på billedet repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: IFA-rutediagram for rabies. Rutediagram, der viser udførelsesstadier for de vigtigste trin i IFA-proceduren for at hjælpe med procesvisualisering. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Patientprøve | Igm | IgG |
| PS1-1 | 1:32 | 1:512 |
| PS2-1 | 1:8 | 1:128 |
| PS3-1 | 1:16 | 1:256 |
| PS4-1 | 1:64 | 1:512 |
| PS5-1 | 1:16 | 1:128 |
Tabel 1: Resultater 2 uger efter vaccination. Patientprøveresultater fra serumprøver indsamlet ca. 2 uger efter afslutning af PrEP-vaccineserien.
| Patientprøve | Igm | IgG |
| PS1-2 | 1:2 | 1:128 |
| PS2-2 | 1:1 | 1:128 |
| PS3-2 | 1:1 | 1:64 |
| PS4-2 | 1:1 | 1:256 |
| PS5-2 | 1:1 | 1:32 |
Tabel 2: Resultater 6 måneder efter vaccination. Patientprøveresultater fra serumprøver indsamlet ca. 6 måneder efter afslutning af PrEP-vaccineserien.
| Patientprøve | Igm | IgG |
| PS1-3 | Ikke fundet | 1:128 |
| PS2-3 | Ikke fundet | 1:128 |
| PS3-3 | Ikke fundet | 1:64 |
| PS4-3 | Ikke fundet | 1:64 |
| PS5-3 | Ikke fundet | 1:32 |
Tabel 3: Resultater 18 måneder efter vaccination. Patientprøveresultater fra serumprøver indsamlet ca. 18 måneder efter afslutning af PrEP-vaccineserien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IFA-testen udnytter et antigen-antistofkompleks, hvilket giver mulighed for et mærkningssted til at visualisere rabiesspecifikke antistoffer. Neuroblastom- eller BHK-celler podes på PTFE-belagte mikroskopglas med flere brønde og podes med rabiesviruslaboratoriestamme CVS-11. Når monolaget er sammenflydende, og cellerne når den ønskede infektivitet på ca. 50%, opbevares diasene, indtil de er klar til brug6.
Patientserum eller CSF påføres det inficerede cellemonolag og inkuberes for at tillade eventuelle rabiesspecifikke antistoffer at binde sig til virusantigen7. Efter en vaskeprocedure påføres et fluorescerende mærket anti-humant IgG- eller IgM-antistof og binder til ethvert virusbundet antistof fra prøveapplikationen. Mærkede antistoffer kan derefter visualiseres under et fluorescerende mikroskop.
Når du forbereder dig på at udføre dette assay, er det vigtigt at bestemme den bedste forberedelse af patientprøver, kontroller og konjugater. De første patientprøver blev screenet ved en lav fortyndingsfaktor eller ufortyndet for at teste for antistoftilstedeværelse. Parrede prøver eller tidligere screenede prøver, der viste et højt niveau af antistof, blev derefter yderligere fortyndet til slutpunktet. De indledende fortyndinger af patientprøver til IgG-test blev fremstillet i kommercielt tilgængeligt IFA-fortyndingsmiddel. IgM-testprøver blev oprindeligt fremstillet i et kommercielt tilgængeligt IgG-blokerende reagens. Efterfølgende serielle fortyndinger for begge test blev derefter fremstillet i PBS.
De kontroller, der blev anvendt til testning, blev opnået fra kendte modtagere af rabies PrEP eller fra personer uden tidligere rabiesvaccination. Alle kontrolprøver blev testet for antistoftilstedeværelse før brug. IgG-kontrollen blev opnået fra en rabiesvaccinemodtager med en etableret rabiesneutraliserende antistoftiter bekræftet af FAVN. Den IgM-positive kontrolprøve blev opnået fra en rabiesvaccinemodtager ca. 2 uger efter afslutning af vaccinationen.
Brugen af passende konjugat er et andet vigtigt aspekt ved udførelsen af IFA-testen. Det konjugat, der anvendes til hver test, afhænger af antistofisotypemålet for det pågældende assay. I dette tilfælde blev kommercielt tilgængelige FITC-mærkede anti-humane IgG og anti-humane IgM-antistoffer anvendt. Arbejdsantistofkonjugatfortyndinger blev bestemt før test baseret på producentens anbefaling.
Der er flere vigtige trin i proceduren, der vil sikre en vellykket udførelse af IFA-testen, måske er det vigtigste antigendiasforberedelse. At nå ca. 50% infektivitet giver rigelige bindingssteder for tilgængelige antistoffer, samtidig med at der skabes klarhed ved læsning og klassificering af prøver. De rabies-negative celler skaber en kontrasterende baggrund for at visualisere mærkede antistoffer bedre. Ikke-specifik farvning kan også udgøre et problem, når der udføres fluorescerende farvning ved hjælp af komplekse prøvematricer, såsom serum. Anvendelsen af IgG-inaktiveringsreagenser (f.eks. Gullsorb) hjælper med at skære ned på ikke-specifik farvning på grund af interfererende IgG-antistoffer ved vurdering af tilstedeværelsen af IgM8. Korrekt forberedelse af materialer og inkorporering af specielle reagenser i proceduren hjælper med at mindske problematisk farvning, samtidig med at resultaterne af høj kvalitet bevares.
Der er udviklet en lang række testmetoder, der fokuserer på påvisning, kvantificering og identifikation af rabiesantistoffer. Hver af disse tests giver resultater, der kan bruges på forskellige måder afhængigt af de søgte oplysninger. Rabies IFA-test er et kraftfuldt værktøj til identifikation af virusspecifikke antistofisotyper, og resultaterne kan være klar på relativt kort tid sammenlignet med andre testmetoder, såsom RFFIT- og FAVN-testene.
Selvom IFA-testen kan påvise rabiesantistoffer i en prøve, giver den ikke en standardiseret kvantificering af antistofferne. IFA-testen giver en serumfortyndingsfaktor, ved hvilken antistofdetektion slutter. Til sammenligning kvantificerer RFFIT- og FAVN-testene antistoffernes neutraliserende egenskaber i en prøve, hvilket resulterer i en titer af internationale enheder (IE), hvilket giver et mere detaljeret og standardiseret resultat. Resultater fra en FAVN- eller en RFFIT-test viser tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer, som er bestemt til at være IgG-antistoffer9. IgM's rolle i neutraliserende aktivitet forstås at være begrænset på grund af dens struktur10. Derfor registrerer disse tests ikke specifikt tilstedeværelsen af IgM.
Testtypen og dens resultat kan være noget problematisk, når de anvendes på et specifikt problem. Begrebet et beskyttende niveau af antistofbeskyttelse mod rabiesvirusinfektion bruges ikke længere til at evaluere immunresponset på rabiesvaccination. Tidligere blev et beskyttende respons defineret som ≥0,5 IE. Imidlertid henviser aktuelle publikationer typisk til antistofresponset efter immunisering som acceptabelt (≥0,5 IE) eller uacceptabelt (<0,5 IE). Som nævnt giver IFA-testen ikke en antistoftiter i IE og bør ikke anvendes til at udlede et niveau af beskyttelse mod rabies. Brug af IFA-testen under evaluering af en patient, der har udviklet rabies, resulterer muligvis ikke altid i en positiv antistoftilstedeværelse på grund af variationer i immunrespons gennem hele sygdommen. På grund af den næsten 100% dødelighed af en rabiesinfektion er det vigtigt at overveje testen, og hvor meget information der sikkert kan udledes af disse resultater11. Af disse grunde er det altid bedst at evaluere alle rabiesantistoftestmetoder og bestemme, hvilke der fungerer bedst i et givet scenario.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for New York State Department of Health Wadsworth Center for at støtte dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well PTFE coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
References
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).
- Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516 (2021).
- Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
- Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
- Fooks, A. R., Jackson, A. C. Rabies: scientific basis of the disease and its management. , Academic Press. (2020).
- Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
- Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
- Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
- Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).
