Summary
इस पांडुलिपि का उद्देश्य रेबीज-विशिष्ट आईजीजी और आईजीएम एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए रेबीज अप्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण के उपयोग की जांच करना है।
Abstract
रेबीज अप्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (आईएफए) परीक्षण सीरा या सेरेब्रल स्पाइनल तरल पदार्थ में विभिन्न रेबीज-विशिष्ट एंटीबॉडी आइसोटाइप का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था। यह परीक्षण तेजी से परिणाम प्रदान करता है और इसका उपयोग कई अलग-अलग परिदृश्यों में रेबीज एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। रेबीज आईएफए परीक्षण विशेष रूप से रेबीज विकसित करने वाले रोगी में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए एंटीबॉडी के त्वरित और शुरुआती पता लगाने के लिए उपयोगी है। यद्यपि एंटीमॉर्टम रेबीज निदान के लिए अन्य तरीकों को प्राथमिकता दी जाती है, इस परीक्षण का उपयोग एंटीबॉडी का पता लगाने के माध्यम से हाल ही में रेबीज वायरस के जोखिम को प्रदर्शित करने के लिए किया जा सकता है। IFA परीक्षण वायरस-न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी (VNA) टिटर प्रदान नहीं करता है, लेकिन प्री-एक्सपोज़र प्रोफिलैक्सिस (PrEP) प्रतिक्रिया का मूल्यांकन सकारात्मक या नकारात्मक एंटीबॉडी उपस्थिति के माध्यम से किया जा सकता है। इस परीक्षण का उपयोग विभिन्न स्थितियों में किया जा सकता है और कई अलग-अलग लक्ष्यों के लिए परिणाम प्रदान कर सकता है। इस अध्ययन में, हमने उन व्यक्तियों से कई युग्मित सीरम नमूनों का उपयोग किया, जिन्होंने पीईईपी प्राप्त किया और आईएफए परीक्षण का उपयोग करके समय के साथ अपनी रेबीज एंटीबॉडी उपस्थिति का प्रदर्शन किया।
Introduction
रेबीज अप्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (आईएफए) परीक्षण का उपयोग सीरा या सेरेब्रल स्पाइनल फ्लूइड में विभिन्न रेबीज-विशिष्ट एंटीबॉडी आइसोटाइप का पता लगाने के लिए किया जाता है। यह एक एंटीमॉर्टम रेबीज रोगी की निगरानी के लिए उपलब्ध परीक्षणों के एक शस्त्रागार में से एक है। यह रेबीज संक्रमण के लिए रोगी की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए एंटीबॉडी के शुरुआती पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। जब अन्य परीक्षणों, केस इतिहास और रोगी के टीकाकरण की स्थिति के संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो IFA परीक्षण रेबीज वायरस या वैक्सीन1 के संपर्क को निर्धारित करने में सहायता कर सकता है। जैसा कि IFA परीक्षण IgM और/या IgG को मापता है, विशिष्ट एंटीबॉडी के मान एंटीजन1 के संपर्क में आने से अनुमानित समय सीमा का संकेत दे सकते हैं। यह परीक्षण सूचीबद्ध अनुप्रयोगों या अभी तक खोजे नहीं गए अन्य में उपयोगी हो सकता है।
कई रेबीज सीरोलॉजिकल परख उपलब्ध हैं। रैपिड फ्लोरोसेंट फोकस निषेध परीक्षण (आरएफएफआईटी), फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी वायरस न्यूट्रलाइजेशन (एफएवीएन) परीक्षण, या इनमें से संशोधन रेबीज वायरस न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी (आरवीएनए)1को मापने के प्राथमिक तरीके हैं। हालांकि, ये परीक्षण आईजीएम और आईजीजी एंटीबॉडी में अंतर नहीं करते हैं। जब रेबीज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की निगरानी में एंटीबॉडी आइसोटाइप को अलग करना महत्वपूर्ण होता है, तो रेबीज आईएफए और रेबीज एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) परीक्षणों का उपयोग किया जाता है, लेकिन वे आरवीएनए को मापते नहीं हैं। यद्यपि IFA और ELISA परीक्षणों का उपयोग एक नमूने में रेबीज-विशिष्ट एंटीबॉडी की उपस्थिति को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन उन्हें निष्पादित करने के तरीके में कुछ अंतर हैं। आईएफए परीक्षण अपने एंटीजन सब्सट्रेट के रूप में एक सेल-सुसंस्कृत जीवित वायरस का उपयोग करता है, जबकि रेबीज का पता लगाने के लिए एक विशिष्ट एलिसा वायरल प्रोटीन में से एक या अधिक का उपयोग करता है। एक प्रयोगशाला सेटिंग में जहां रेबीज वायरस को सुसंस्कृत किया जा सकता है, एलिसा के लिए व्यक्तिगत वायरल प्रोटीन खरीदने या खेती करने के बजाय आईएफए परीक्षण अधिक आसानी से किया जा सकता है। परीक्षण का उद्देश्य और किसी भी रेबीज सीरोलॉजिकल परख के परिणामों से प्राप्त जानकारी पर विचार किया जाना चाहिए जब यह निर्धारित किया जाए किकौन सा चुनना है 2.
आईजीएम प्रतिक्रिया देने वाला पहला है, जब तक कि कक्षा स्विचिंग 28 दिन के आसपास नहीं देखी जाती है, जिस बिंदु पर आईजीजी प्रमुख परिसंचारी एंटीबॉडी3 बन जाता है। इसलिए, आईजीएम केवल रेबीज वायरस या टीकाकरण के संपर्क में आने के बाद सीमित समय के लिए अपेक्षित होगा। सीरम और मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) दोनों का परीक्षण यह संकेत दे सकता है कि क्या जोखिम टीकाकरण के माध्यम से था, जिसमें एंटीबॉडी केवल सीरा में या वायरल संक्रमण से देखा जाएगा, जो संभावित रूप से सीएसएफ1 में एंटीबॉडी दिखाएगा।
यह स्थापित किया गया है कि रेबीज एंटीबॉडी प्री-एक्सपोजर प्रोफिलैक्सिस (पीईईपी)4के बाद कई वर्षों तक बनी रहती है। आईएफए परीक्षण टीकाकरण या जोखिम के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर इसे प्रदर्शित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल परख विकास के लिए न्यूयॉर्क राज्य स्वास्थ्य Wadsworth केंद्र के न्यूयॉर्क राज्य विभाग द्वारा मानव नमूने के नैतिक उपयोग के लिए अनुमोदित किया गया है, प्रोटोकॉल अनुमोदन संख्या #03-019.
1. सुरक्षा
- व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई), न्यूनतम आंखों की सुरक्षा (चश्मा या फेस शील्ड), एक सर्जिकल मास्क और गैर-लेटेक्स दस्ताने पहनें।
- सुनिश्चित करें कि कर्मियों को रेबीज के लिए टीका लगाया गया है और पिछले 6 महीनों के भीतर ≥0.5 IU/mL का एक टिटर प्रदर्शित किया गया है।
2. एंटीजन स्लाइड तैयारी
नोट: सार्वभौमिक सावधानियों का उपयोग करके जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में सभी वायरस, सीएसएफ, और सीरम जोड़तोड़ करें।
- माउस न्यूरोब्लास्टोमा या बीएचके -21 कोशिकाओं के 20 एमएल को 3.0 x 105 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए ईगल के न्यूनतम आवश्यक मीडिया में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (ईजीएम) के साथ पूरक करें और उपयोग तक ठंडा रखें।
- ईजीएम में 1.0 x 106.5 % टिशू कल्चर संक्रामक खुराक (टीसीआईडी50) प्रति मिलीलीटर के कामकाजी कमजोर पड़ने के लिए सीवीएस -11 वायरस तैयार करें और उपयोग के लिए तैयार होने तक ठंडा रखें।
नोट: TCID50 पहले प्रकाशित रीड और म्यूनच विधि द्वारा निर्धारित किया जाता है5. - 70% इथेनॉल के साथ एक आर्द्रता स्लाइड कक्ष और पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) -लेपित अच्छी तरह से माइक्रोस्कोप स्लाइड को साफ करें और बीएससी में हवा सूखने की अनुमति दें।
- स्लाइड कक्ष में शोषक कागज के स्ट्रिप्स में आसुत जल (डीएच2ओ) जोड़ें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि आर्द्रता पूरी प्रक्रिया में स्थिर रहे।
- एक पेंसिल का उपयोग करके, प्रत्येक स्लाइड को लॉट नंबर, दिनांक, सेल प्रकार, और भंडारण के लिए आवश्यक किसी भी अन्य पहचान की जानकारी, और स्लाइड कक्ष में रखने के लिए उपयोग करने के लिए लेबल करें।
नोट: अधिकांश मार्कर, पेन या लेबल भविष्य के एसीटोन निर्धारण चरण (चरण 2.9) का सामना नहीं करेंगे। - एक दोहरा विंदुक के साथ खुर्दबीन स्लाइड पर प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए वायरस कमजोर पड़ने के 50 माइक्रोन लागू करें. फिर, प्रत्येक अच्छी तरह से सेल कमजोर पड़ने के 50 माइक्रोन लागू करें, सावधान रहें कि पहले से ही कुएं पर वायरस के साथ पिपेट टिप को दूषित न करें।
- आर्द्रता स्लाइड कक्ष बंद करें और इसे 34-36 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर में रखें। 24 घंटे के बाद सेल संक्रामकता का आकलन करें।
नोट: केवल एक स्लाइड पर 2.8-2.12 चरण निष्पादित करें। - आर्द्रता कक्ष से स्लाइड निकालें और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण. 2 मिनट के लिए एक फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) भरा कोपलिन जार में स्लाइड धो लें, तो हवा सूखी करने के लिए स्लाइड की अनुमति दें.
- कोपलिन जार में स्लाइड रखें और ज्वलनशील पदार्थों के लिए अनुमोदित -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में न्यूनतम 1 घंटे के लिए ठंडे एसीटोन में स्लाइड को ठीक करें। एक धूआं हुड में सभी एसीटोन डालने और हवा सुखाने की प्रक्रिया करें।
- एसीटोन को फ्लैश ऑफ होने दें और सूखने के लिए स्लाइड करें। रेबीज प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (डीएफए) संयुग्म स्लाइड के कुओं के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार लागू करें और एक 34-36 डिग्री सेल्सियस नम इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- प्रत्येक 2 मिनट के लिए दो बार पीबीएस के कोपलिन जार में स्लाइड धो लें. स्लाइड को हवा में सुखाएं।
- 0.05 एम Tris, 0.15 एम NaCl (पीएच 9.0), और 20% ग्लिसरॉल माउंटेंट के साथ एक coverslip माउंट, और संक्रामकता का आकलन करने के लिए 200x बढ़ाई पर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग स्लाइड पढ़ें. यदि कोशिकाएं लगभग 50% संक्रमित नहीं हैं, तो अगले दिन चरण 2.7-2.12 दोहराएं जब तक कि वांछित संक्रामकता तक नहीं पहुंच जाता।
नोट: सेल संक्रामकता नेत्रहीन स्लाइड अच्छी तरह से स्लाइड पर रेबीज पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए नकारात्मक कोशिकाओं के अनुपात का आकलन करने के आधार पर अनुमानित है। नकारात्मक कोशिकाएं लाल रंग की दिखाई देती हैं, जबकि सकारात्मक कोशिकाएं हरे फ्लोरोसेंट धुंधला दिखाई देती हैं। - इनक्यूबेटर और आर्द्रता कक्ष से शेष स्लाइड्स निकालें. ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण, तो 1-2 मिनट के लिए पीबीएस के साथ एक कोपलिन जार (ओं) में स्लाइड जगह. लगभग 30 मिनट के लिए स्लाइड सूखी हवा. उपयोग के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर करें।
3. नमूना तैयार करना
- परीक्षण के लिए रोगी सीरम या सीएसएफ नमूना कमजोर पड़ने तैयार करें। 0.05% इवांस नीले रंग के साथ पीबीएस में पतला एक उचित काम एकाग्रता के लिए आवश्यक संयुग्म तैयार करें।
नोट: आवेदन से पहले फ्लोरोफोर अखंडता को बनाए रखने के लिए संयुग्म को अंधेरे में रखें
4. आईएफए प्रक्रिया
- प्रत्येक परख के लिए आवश्यक तैयार एंटीजन स्लाइड्स की आवश्यक संख्या निकालें और स्लाइड्स को डीफ्रॉस्ट और पूरी तरह से सूखने दें।
- एक कोपलिन जार में स्लाइड प्लेस (रों) और ज्वलनशील सामग्री के लिए अनुमोदित एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रात भर के लिए 2 घंटे के लिए ठंड एसीटोन में स्लाइड फिक्स. एसीटोन से स्लाइड निकालें और हवा सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं.
- आर्द्रता बनाए रखने के लिए डीएच2ओ-लथपथ शोषक स्ट्रिप्स के साथ बीएससी के अंदर एक आर्द्रता कक्ष बॉक्स में स्लाइड रखें। प्रत्येक नमूना कमजोर पड़ने, नियंत्रण नमूना, या पीबीएस के 50 माइक्रोन को पूर्व निर्धारित अच्छी तरह से लागू करें।
नोट: प्रत्येक स्लाइड में रोगी नमूना कुओं, सकारात्मक नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण और पीबीएस सेल नियंत्रण की उचित संख्या अच्छी तरह से होनी चाहिए। - बंद आर्द्रता स्लाइड कक्ष को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 आर्द्र इनक्यूबेटर में रखें। 30 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं, तो इनक्यूबेटर से आर्द्रता स्लाइड कक्ष को हटा दें और एक बीएससी में जगह है.
- ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण महाप्राण करने के लिए एक एस्पिरेटर टिप का प्रयोग करें, सेल monolayer परेशान नहीं सुनिश्चित करने. प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस की एक बूंद लागू करने के लिए एक बाँझ ड्रॉपर विंदुक का प्रयोग करें।
- सावधान आकांक्षा दोहराएँ, तो एक पीबीएस भरा कोपलिन जार में प्रत्येक स्लाइड जगह और 15 मिनट की कुल के लिए दो बार धो लें.
- स्लाइड्स को आर्द्रता कक्ष बॉक्स में वापस रखें और प्रत्येक कुएं पर उपयुक्त एंटी-ह्यूमन एंटीबॉडी संयुग्म के 50 माइक्रोन लागू करें। 4.6 करने के लिए कदम 4.4 दोहराएँ.
- स्लाइड्स हवा सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं, बढ़ते मीडिया के साथ एक coverslip माउंट, और फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के तहत स्लाइड पढ़ें.
5. स्लाइड विश्लेषण
- उच्च एंटी-रेबीज एंटीबॉडी टिटर की पुष्टि के साथ सकारात्मक नियंत्रण नमूनों की तुलना में धुंधला पैटर्न और प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर ग्रेड नमूने।
- नकारात्मक, 1 +, 2 +, 3 +, और 4 + के पैमाने पर नमूनों को ग्रेड करें, एक नकारात्मक परिणाम के साथ कोई फ्लोरोसेंट धुंधला नहीं दिखा रहा है और 4+ सकारात्मक नियंत्रण नमूनों के समान धुंधला पैटर्न के साथ एक उज्ज्वल हरे सेब रंग प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करता है1.
नोट: हरा सेब रंग केवल FITC-लेबल एंटीबॉडी पर लागू होता है; फ्लोरोफोर चयन के आधार पर रंग भिन्न होता है। - नमूनों को कमजोर पड़ने वाले कारक द्वारा दर्शाया गया एक अंतिम बिंदु मान असाइन करें जिस पर नमूना 1-2+ ग्रेड प्रदर्शित करता है। एक उच्च कमजोर पड़ने कारक पर नमूने का परीक्षण अगर अंत बिंदु प्रारंभिक परख में तक नहीं पहुंचा है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
सभी सीरम नमूने पीईईपी के बाद लगभग एक ही समय सीमा में रोगियों से एकत्र किए गए थे। निम्नलिखित समय बिंदुओं पर पांच अलग-अलग रोगियों से नमूनों का परीक्षण किया गया: अंतिम रेबीज वैक्सीन टीकाकरण के 2 सप्ताह बाद, रेबीज वैक्सीन श्रृंखला के 6 महीने बाद और रेबीज वैक्सीन श्रृंखला के 18 महीने बाद। प्रत्येक सीरम नमूना श्रृंखला में पतला और दोनों आईजीएम और आईजीजी उपस्थिति के लिए वर्गीकृत किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल चरण 5.2 और 5.3 में वर्णित है। सौंपा गया एंटीबॉडी मान कमजोर पड़ने वाले कारक का प्रतिनिधित्व करता है जहां नमूना 1-2+ के अंतिम बिंदु ग्रेड तक पहुंच गया।
PrEP के बाद प्रत्येक समय बिंदु के परीक्षण के परिणाम एंटीबॉडी उपस्थिति के विभिन्न स्तरों का पता लगाने के लिए परख की क्षमता प्रदर्शित करते हैं। प्रारंभिक टीकाकरण के कुछ ही समय बाद, रोगी के नमूनों में आईजीएम और आईजीजी दोनों के उच्च स्तर मौजूद थे, जैसा कि चित्र 1 में देखा गया है। चमकीले हरे फ्लोरोसेंट सेल धुंधला के क्षेत्र सकारात्मक एंटीबॉडी उपस्थिति का संकेत देते हैं; लाल कोशिकाएं रेबीज-नकारात्मक कोशिकाएं हैं जहां कोई एंटीबॉडी बांध नहीं सकता है। टीकाकरण के लगभग 6 महीने बाद, रोगी के नमूनों में आईजीएम और आईजीजी दोनों के काफी कम स्तर मौजूद थे, लेकिन आईजीएम लगभग पूरी तरह से बाहर हो गया था। अंतिम समय बिंदु पर, टीकाकरण के 18 महीने बाद, आईजीएम एंटीबॉडी किसी भी रोगी के नमूनों में नहीं पाए गए, जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है जहां कोई हरा फ्लोरोसेंट सेल धुंधला नहीं देखा जाता है। हालांकि, आईजीजी का स्तर बना रहा और 2 सप्ताह के समय बिंदु से प्रारंभिक कमी के बाद 6 महीने के समय बिंदु पर पाए गए स्तरों के समान रहा। टीकाकरण के बाद 2 सप्ताह, टीकाकरण के 6 महीने बाद और टीकाकरण के 18 महीने बाद के नमूनों में आईजीजी और आईजीएम का पता लगाने के परिणाम क्रमशः तालिका 1, तालिका 2 और तालिका 3 में सूचीबद्ध हैं। चित्रा 3 निष्पादन चरणों के प्रवाह चार्ट से पता चलता है.
चित्रा 1: रेबीज आईजीएम आईएफए सकारात्मक धुंधला। 1:8 कमजोर पड़ने पर रोगी सीरम ने PrEP वैक्सीन श्रृंखला के पूरा होने के तुरंत बाद एक सकारात्मक धुंधला पैटर्न का प्रदर्शन किया। छवि पर स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: रेबीज आईजीएम आईएफए नकारात्मक धुंधला। 1:2 कमजोर पड़ने पर रोगी सीरम ने PrEP वैक्सीन श्रृंखला के पूरा होने के लगभग 18 महीने बाद कोई सकारात्मक धुंधला नहीं दिखाया। छवि पर स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: रेबीज आईएफए फ़्लोचार्ट। फ़्लोचार्ट प्रक्रिया विज़ुअलाइज़ेशन में सहायता के लिए IFA प्रक्रिया में प्रमुख चरणों के निष्पादन चरणों को दिखा रहा है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| रोगी का नमूना | आईजीएम | आईजीजी |
| पीएस 1-1 | 1:32 | 1:512 |
| पीएस 2-1 | 1:8 | 1:128 |
| पीएस 3-1 | 1:16 | 1:256 |
| पीएस 4-1 | 1:64 | 1:512 |
| पीएस5-1 | 1:16 | 1:128 |
तालिका 1: टीकाकरण के 2 सप्ताह बाद परिणाम। पीईईपी वैक्सीन श्रृंखला के पूरा होने के लगभग 2 सप्ताह बाद एकत्र किए गए सीरम नमूनों से रोगी के नमूने के परिणाम।
| रोगी का नमूना | आईजीएम | आईजीजी |
| पीएस 1-2 | 1:2 | 1:128 |
| पीएस 2-2 | 1:1 | 1:128 |
| पीएस 3-2 | 1:1 | 1:64 |
| पीएस 4-2 | 1:1 | 1:256 |
| पीएस 5-2 | 1:1 | 1:32 |
तालिका 2: टीकाकरण के 6 महीने बाद परिणाम। पीईईपी वैक्सीन श्रृंखला के पूरा होने के लगभग 6 महीने बाद एकत्र किए गए सीरम नमूनों से रोगी के नमूने के परिणाम।
| रोगी का नमूना | आईजीएम | आईजीजी |
| पीएस 1-3 | पता नहीं चला | 1:128 |
| पीएस 2-3 | पता नहीं चला | 1:128 |
| पीएस 3-3 | पता नहीं चला | 1:64 |
| पीएस 4-3 | पता नहीं चला | 1:64 |
| पीएस 5-3 | पता नहीं चला | 1:32 |
तालिका 3: टीकाकरण के 18 महीने बाद परिणाम। पीईईपी वैक्सीन श्रृंखला के पूरा होने के लगभग 18 महीने बाद एकत्र किए गए सीरम नमूनों से रोगी के नमूने के परिणाम।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
आईएफए परीक्षण एक एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स का लाभ उठाता है, जिससे रेबीज-विशिष्ट एंटीबॉडी की कल्पना करने के लिए एक लेबलिंग साइट की अनुमति मिलती है। न्यूरोब्लास्टोमा या बीएचके कोशिकाओं को बहु-अच्छी तरह से पीटीएफई-लेपित माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वरीयता दी जाती है और रेबीज वायरस लैब स्ट्रेन सीवीएस -11 के साथ टीका लगाया जाता है। एक बार मोनोलेयर संगम होता है और कोशिकाएं लगभग 50% की वांछित संक्रामकता तक पहुंच जाती हैं, स्लाइड को उपयोग के लिए तैयार होने तक संग्रहीत किया जाता है6.
रोगी सीरम या सीएसएफ संक्रमित सेल monolayer करने के लिए लागू किया जाता है और वायरस प्रतिजन7 को संलग्न करने के लिए किसी भी रेबीज-विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए अनुमति देने के लिए ऊष्मायन किया है. धोने की प्रक्रिया के बाद, एक फ्लोरोसेंटली लेबल एंटी-ह्यूमन आईजीजी या आईजीएम एंटीबॉडी लागू किया जाता है और नमूना आवेदन से किसी भी वायरस-बाउंड एंटीबॉडी को बांधता है। लेबल एंटीबॉडी तो एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना की जा सकती है.
इस परख को करने की तैयारी करते समय, रोगी के नमूनों, नियंत्रणों और संयुग्मों की सर्वोत्तम तैयारी निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। प्रारंभिक रोगी के नमूनों को कम कमजोर पड़ने वाले कारक पर जांच की गई थी या किसी भी एंटीबॉडी उपस्थिति के लिए परीक्षण करने के लिए undiluted किया गया था। युग्मित नमूने या पहले से जांच किए गए नमूने जो उच्च स्तर के एंटीबॉडी का प्रदर्शन करते थे, फिर अंत बिंदु तक पतला हो गए। आईजीजी परीक्षण के लिए प्रारंभिक रोगी नमूना कमजोर पड़ने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आईएफए मंदक में तैयार किए गए थे। आईजीएम परीक्षण नमूने शुरू में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आईजीजी अवरोधक अभिकर्मक में तैयार किए गए थे। दोनों परीक्षणों के लिए बाद के धारावाहिक कमजोर पड़ने तो पीबीएस में तैयार किए गए थे.
परीक्षण के लिए उपयोग किए जाने वाले नियंत्रण रेबीज पीईईपी के ज्ञात प्राप्तकर्ताओं या रेबीज टीकाकरण के इतिहास वाले व्यक्तियों से प्राप्त किए गए थे। उपयोग से पहले एंटीबॉडी उपस्थिति के लिए सभी नियंत्रण नमूनों का परीक्षण किया गया था। आईजीजी नियंत्रण एक रेबीज वैक्सीन प्राप्तकर्ता से प्राप्त किया गया था जिसमें एफएवीएन द्वारा पुष्टि की गई एक स्थापित रेबीज-न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी टिटर था। टीकाकरण पूरा होने के लगभग 2 सप्ताह बाद रेबीज वैक्सीन प्राप्तकर्ता से आईजीएम-पॉजिटिव नियंत्रण नमूना प्राप्त किया गया था।
उपयुक्त संयुग्म का उपयोग IFA परीक्षण करने का एक और महत्वपूर्ण पहलू है। प्रत्येक परीक्षण के लिए उपयोग किया जाने वाला संयुग्म उस परख के लिए एंटीबॉडी आइसोटाइप लक्ष्य पर निर्भर करता है। इस मामले में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध FITC-लेबल वाले एंटी-ह्यूमन IgG और एंटी-ह्यूमन IgM एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। निर्माता की सिफारिश के आधार पर परीक्षण से पहले काम करने वाले एंटीबॉडी संयुग्म कमजोर पड़ने का निर्धारण किया गया था।
प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण चरण हैं जो आईएफए परीक्षण के सफल निष्पादन को सुनिश्चित करेंगे, शायद सबसे महत्वपूर्ण एंटीजन स्लाइड तैयार करना है। लगभग 50% संक्रामकता तक पहुंचना उपलब्ध एंटीबॉडी के लिए प्रचुर मात्रा में बाध्यकारी साइटें प्रदान करता है, जबकि नमूनों को पढ़ते और ग्रेडिंग करते समय स्पष्टता भी पैदा करता है। रेबीज-नकारात्मक कोशिकाएं लेबल किए गए एंटीबॉडी को बेहतर ढंग से देखने के लिए एक विपरीत पृष्ठभूमि बनाती हैं। गैर-विशिष्ट धुंधला भी एक समस्या पेश कर सकता है जब सीरम जैसे जटिल नमूना मैट्रिक्स का उपयोग करके फ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना। आईजीजी निष्क्रियता अभिकर्मकों (जैसे, गुलसॉर्ब) का उपयोग आईजीएम8 की उपस्थिति का आकलन करते समय आईजीजी एंटीबॉडी में हस्तक्षेप करने के कारण गैर-विशिष्ट धुंधला होने में कटौती करने में मदद करता है। सामग्री की उचित तैयारी और प्रक्रिया में विशेष अभिकर्मकों को शामिल करने से उच्च गुणवत्ता वाले परिणामों को संरक्षित करते हुए समस्याग्रस्त धुंधला हो जाना कम करने में मदद मिलती है।
परीक्षण विधियों की एक भीड़ विकसित की गई है जो रेबीज एंटीबॉडी का पता लगाने, मात्रा का ठहराव और पहचान पर ध्यान केंद्रित करती है। इनमें से प्रत्येक परीक्षण ऐसे परिणाम प्रदान करता है जिनका उपयोग मांगी गई जानकारी के आधार पर विभिन्न तरीकों से किया जा सकता है। रेबीज आईएफए परीक्षण वायरस-विशिष्ट एंटीबॉडी आइसोटाइप की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, और परिणाम आरएफएफआईटी और एफएवीएन परीक्षणों जैसे अन्य परीक्षण विधियों की तुलना में अपेक्षाकृत कम समय में तैयार हो सकते हैं।
हालांकि आईएफए परीक्षण एक नमूने में रेबीज एंटीबॉडी का पता लगा सकता है, यह एंटीबॉडी का मानकीकृत परिमाणीकरण प्रदान नहीं करता है। आईएफए परीक्षण एक सीरम कमजोर पड़ने वाला कारक प्रदान करता है जिस पर एंटीबॉडी का पता लगाना समाप्त होता है। इसकी तुलना में, RFFIT और FAVN परीक्षण एक नमूने में एंटीबॉडी की बेअसर करने की क्षमताओं को निर्धारित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अंतर्राष्ट्रीय इकाइयों (IU) का एक टिटर होता है, जो अधिक विस्तृत और मानकीकृत परिणाम प्रदान करता है। FAVN या RFFIT परीक्षण के परिणाम एंटीबॉडी को बेअसर करने की उपस्थिति को प्रदर्शित करते हैं, जिन्हें IgG एंटीबॉडी9 होने के लिए निर्धारित किया गया है। गतिविधि को बेअसर करने में आईजीएम की भूमिका इसकी संरचना10 के कारण सीमित समझा जाता है। इसलिए, ये परीक्षण विशेष रूप से आईजीएम की उपस्थिति का पता नहीं लगाते हैं।
परीक्षण का प्रकार और उसका परिणाम किसी विशिष्ट समस्या पर लागू करते समय कुछ समस्याग्रस्त हो सकता है। रेबीज वायरस के संक्रमण के खिलाफ एंटीबॉडी सुरक्षा के सुरक्षात्मक स्तर की अवधारणा का उपयोग अब रेबीज टीकाकरण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए नहीं किया जाता है। पहले, एक सुरक्षात्मक प्रतिक्रिया को ≥0.5 IU के रूप में परिभाषित किया गया था। हालांकि, वर्तमान प्रकाशन आमतौर पर टीकाकरण के बाद एंटीबॉडी प्रतिक्रिया को स्वीकार्य (≥0.5 IU) या अस्वीकार्य (<0.5 IU) के रूप में संदर्भित करते हैं। जैसा कि कहा गया है, आईएफए परीक्षण आईयू में एंटीबॉडी टिटर प्रदान नहीं करता है और इसका उपयोग रेबीज के खिलाफ सुरक्षा के स्तर को प्राप्त करने के लिए नहीं किया जाना चाहिए। रेबीज विकसित करने वाले रोगी का मूल्यांकन करते समय आईएफए परीक्षण का उपयोग करने से बीमारी के दौरान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में भिन्नता के कारण हमेशा सकारात्मक एंटीबॉडी उपस्थिति नहीं हो सकती है। रेबीज संक्रमण के लगभग 100% घातकता के कारण, परीक्षण पर विचार करना महत्वपूर्ण है और इन परिणामों से कितनी जानकारी सुरक्षित रूप से प्राप्त की जा सकती है11. इन कारणों से, सभी रेबीज एंटीबॉडी परीक्षण विधियों का मूल्यांकन करना और यह निर्धारित करना हमेशा सबसे अच्छा होता है कि किसी दिए गए परिदृश्य में कौन सा सबसे अच्छा काम करता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम इस परियोजना का समर्थन करने के लिए न्यूयॉर्क स्टेट डिपार्टमेंट ऑफ हेल्थ वड्सवर्थ सेंटर के आभारी हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well PTFE coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
References
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).
- Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516 (2021).
- Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
- Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
- Fooks, A. R., Jackson, A. C. Rabies: scientific basis of the disease and its management. , Academic Press. (2020).
- Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
- Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
- Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
- Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).
