Summary
الهدف من هذه المخطوطة هو فحص استخدام اختبار الأجسام المضادة الفلورية غير المباشرة لداء للكشف عن الأجسام المضادة IgG و IgM الخاصة بداء.
Abstract
تم تطوير اختبار الأجسام المضادة الفلورية غير المباشرة لداء (IFA) للكشف عن مختلف أنماط الأجسام المضادة الخاصة بداء في الأمصال أو السائل الشوكي الدماغي. يوفر هذا الاختبار نتائج سريعة ويمكن استخدامه للكشف عن الأجسام المضادة لداء في عدة سيناريوهات مختلفة. يعد اختبار IFA لداء مفيدا بشكل خاص للكشف السريع والمبكر عن الأجسام المضادة لتقييم الاستجابة المناعية لدى المريض الذي أصيب بداء. على الرغم من أن الطرق الأخرى لتشخيص داء قبل الوفاة لها الأسبقية ، يمكن استخدام هذا الاختبار لإثبات التعرض الأخير لفيروس داء من خلال اكتشاف الأجسام المضادة. لا يوفر اختبار IFA عيار الأجسام المضادة المعادلة للفيروس (VNA) ، ولكن يمكن تقييم استجابة الوقاية قبل التعرض (PrEP) من خلال وجود الأجسام المضادة الإيجابية أو السلبية. يمكن استخدام هذا الاختبار في مواقف مختلفة ويمكن أن يوفر نتائج لعدد من الأهداف المختلفة. في هذه الدراسة ، استخدمنا العديد من عينات المصل المقترنة من الأفراد الذين تلقوا PrEP وأظهروا وجود الأجسام المضادة لداء بمرور الوقت باستخدام اختبار IFA.
Introduction
يستخدم اختبار الأجسام المضادة الفلورية غير المباشرة لداء (IFA) للكشف عن مختلف أنماط الأجسام المضادة الخاصة بداء في الأمصال أو السائل الدماغي الشوكي. وهو واحد من ترسانة من الاختبارات المتاحة لمراقبة مريض داء قبل الوفاة. من المفيد بشكل خاص للكشف المبكر عن الأجسام المضادة تقييم الاستجابة المناعية للمريض لعدوى داء. عند استخدامه بالاقتران مع اختبارات أخرى وتاريخ الحالة وحالة تطعيم المريض ، يمكن أن يساعد اختبار IFA في تحديد التعرض لفيروس داء أو اللقاح1. نظرا لأن اختبار IFA يقيس IgM و / أو IgG ، يمكن أن تشير قيم الجسم المضاد المحدد إلى إطار زمني تقريبي من التعرض للمستضد1. قد يكون هذا الاختبار مفيدا في التطبيقات المدرجة أو غيرها من التطبيقات التي لم يتم استكشافها بعد.
هناك العديد من المقايسات المصلية لداء المتاحة. اختبار تثبيط التركيز الفلوري السريع (RFFIT) ، أو اختبار تحييد فيروس الأجسام المضادة الفلورية (FAVN) ، أو تعديلات هذه هي الطرق الأساسية لقياس الأجسام المضادة المعادلة لفيروس داء (RVNAs) 1. ومع ذلك ، فإن هذه الاختبارات لا تفرق بين الأجسام المضادة IgM و IgG. عندما يكون التمييز بين النمط المتماثل للأجسام المضادة مهما في مراقبة الاستجابة المناعية لداء ، يتم استخدام اختبارات IFA لداء ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم داء (ELISA) ، لكنها لا تقيس RVNAs. على الرغم من أنه يمكن استخدام اختبارات IFA و ELISA لتحديد وجود أجسام مضادة خاصة بداء في عينة ، إلا أن هناك بعض الاختلافات في كيفية تنفيذها. يستخدم اختبار IFA فيروسا حيا مستزرعا بالخلايا كركيزة مستضد ، بينما يستخدم ELISA النموذجي للكشف عن داء واحدا أو أكثر من البروتينات الفيروسية. في بيئة معملية حيث يمكن زراعة فيروس داء ، يمكن إجراء اختبار IFA بسهولة أكبر بدلا من شراء أو زراعة بروتينات فيروسية فردية ل ELISA. يجب مراعاة الغرض من الاختبار والمعلومات التي تم الحصول عليها من نتائج أي مقايسة مصلية لداء عند تحديد أيهما تختار2.
IgM هو أول من يستجيب ، ويزداد حتى يتم ملاحظة تبديل الفصل في حوالي اليوم 28 ، وعند هذه النقطة يصبح IgG الجسم المضاد السائدالمنتشر 3. وبالتالي ، لن يتوقع IgM إلا لفترة محدودة من الوقت بعد التعرض لفيروس داء أو التطعيم. يمكن أن يشير اختبار كل من المصل والسائل النخاعي (CSF) إلى ما إذا كان التعرض من خلال التطعيم ، حيث يمكن رؤية الأجسام المضادة فقط في الأمصال ، أو من عدوى فيروسية ، والتي من المحتمل أن تظهر أجساما مضادة في السائل الدماغي الشوكي1.
لقد ثبت أن الأجسام المضادة لداء تستمر لعدة سنوات بعد العلاج الوقائي قبل التعرض (PrEP)4. يمكن أن يكون اختبار IFA أداة مفيدة لإثبات ذلك في نقاط زمنية مختلفة بعد التطعيم أو التعرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على البروتوكول التالي للاستخدام الأخلاقي للعينات البشرية من قبل مركز Wadsworth التابع لوزارة الصحة بولاية نيويورك لتطوير الفحص ، رقم الموافقة على البروتوكول # 03-019.
1. السلامة
- ارتد معدات الحماية الشخصية (PPE) ، على الأقل لحماية العين (نظارات أو درع للوجه) ، وقناع جراحي ، وقفازات غير مطاطية.
- تأكد من تطعيم الموظفين ضد داء وأنه تم إثبات عيار ≥0.5 وحدة دولية / مل خلال الأشهر ال 6 الماضية.
2. إعداد شريحة مستضد
ملاحظة: قم بإجراء جميع عمليات التلاعب بالفيروسات والسائل الدماغي الشوكي والمصل في خزانة السلامة البيولوجية (BSC) باستخدام الاحتياطات العالمية.
- قم بإعداد 20 مل من الورم الأرومي العصبي للفأر أو خلايا BHK-21 بتركيز 3.0 × 105 خلايا / مل في الحد الأدنى من الوسائط الأساسية ل Eagle مع 10٪ مصل بقري جنيني (EGM) والحفاظ على البرودة حتى الاستخدام.
- تحضير فيروس CVS-11 عن طريق التخفيف في EGM إلى تخفيف عملي قدره 1.0 × 106.5 50٪ جرعة معدية لزراعة الأنسجة (TCID50) لكل ملليلتر والحفاظ على البرودة حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
ملاحظة: يتم تحديد TCID50 بواسطة طريقة Reed and Muench المنشورة مسبقا5. - قم بتنظيف حجرة منزلقة الرطوبة وشرائح مجهر البئر المطلية بالبولي تترافلوروإيثيلين (PTFE) بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركها تجف في الهواء في BSC.
- أضف الماء المقطر (dH2O) إلى شرائح من الورق الماص في حجرة الشريحة لضمان بقاء الرطوبة ثابتة طوال العملية.
- باستخدام قلم رصاص ، قم بتسمية كل شريحة لاستخدامها برقم الدفعة والتاريخ ونوع الخلية وأي معلومات تعريف أخرى مطلوبة للتخزين ، وضعها في غرفة الشريحة.
ملاحظة: لن تتحمل معظم العلامات أو الأقلام أو الملصقات خطوة تثبيت الأسيتون المستقبلية (الخطوة 2.9). - ضع 50 ميكرولتر من تخفيف الفيروس على كل بئر على شرائح المجهر باستخدام ماصة متكررة. بعد ذلك ، ضع 50 ميكرولتر من تخفيف الخلايا على كل بئر ، مع الحرص على عدم تلويث طرف الماصة بالفيروس الموجود بالفعل على البئر.
- أغلق حجرة منزلق الرطوبة وضعها في الحاضنة الرطبة عند 34-36 درجة مئوية. تقييم عدوى الخلية بعد 24 ساعة.
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات 2.8-2.12 على شريحة واحدة فقط. - قم بإزالة الشريحة من غرفة الرطوبة واستنشاق المادة الطافية بعناية. اغسل الشريحة في وعاء كوبلين مملوء بالفوسفات (PBS) لمدة 2 دقيقة ، ثم اترك الشريحة تجف في الهواء.
- ضع الشريحة في برطمان كوبلين وقم بتثبيت الشريحة في الأسيتون البارد لمدة لا تقل عن 1 ساعة في مجمد -20 درجة مئوية معتمد للمواد القابلة للاشتعال. قم بإجراء جميع إجراءات صب الأسيتون وتجفيف الهواء في غطاء الدخان.
- اترك الأسيتون يومض وينزلق حتى يجف. ضع الأجسام المضادة الفلورية المباشرة لداء (DFA) المتقارن المحضر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة على آبار الشريحة واحتضانها لمدة 30 دقيقة في حاضنة رطبة 34-36 درجة مئوية.
- اغسل الشريحة في برطمانات كوبلين من PBS مرتين لمدة 2 دقيقة لكل منهما. جفف الشريحة بالهواء.
- قم بتركيب غطاء مع 0.05 M Tris و 0.15 M NaCl (درجة الحموضة 9.0) و 20٪ حامل الجلسرين ، واقرأ الشريحة باستخدام مجهر الفلورسنت عند تكبير 200x لتقييم العدوى. إذا لم تكن الخلايا مصابة بنسبة 50٪ تقريبا ، كرر الخطوات 2.7-2.12 في اليوم التالي حتى يتم الوصول إلى العدوى المطلوبة.
ملاحظة: يتم تقريب عدوى الخلايا بناء على التقييم البصري لنسبة الخلايا السالبة إلى الخلايا الإيجابية لداء على بئر الشريحة. تظهر الخلايا السالبة حمراء اللون ، بينما تظهر الخلايا الإيجابية تلطيخا فلوريا أخضر. - قم بإزالة الشرائح المتبقية من الحاضنة وغرفة الرطوبة. قم بشفط المادة الطافية بعناية من كل بئر ، ثم ضع الشرائح في جرة (جرات) كوبلين مع برنامج تلفزيوني لمدة 1-2 دقيقة. جفف الشرائح في الهواء لمدة 30 دقيقة تقريبا. قم بتخزين الشرائح في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
3. إعداد عينة
- تحضير مصل المريض أو تخفيفات عينة السائل الدماغي الشوكي للاختبار. قم بإعداد المرافق اللازم لتركيز العمل المناسب المخفف في برنامج تلفزيوني مع 0.05٪ إيفانز الأزرق.
ملاحظة: احتفظ بالاقتران في الظلام للحفاظ على سلامة الفلوروفور قبل التطبيق
4. إجراء IFA
- قم بإزالة العدد اللازم من شرائح المستضد المعدة اللازمة لكل فحص واترك الشرائح تذوب وتجف تماما.
- ضع الشرائح في برطمان (برطمانات) كوبلين وقم بتثبيت الشرائح في الأسيتون البارد لمدة تتراوح بين 2 ساعة إلى ليلة وضحاها في مجمد -20 درجة مئوية معتمد للمواد القابلة للاشتعال. أخرج الشرائح من الأسيتون واتركها تجف في الهواء.
- ضع الشرائح في صندوق غرفة الرطوبة داخل BSC مع شرائط ماصة مبللة ب dH2O للحفاظ على الرطوبة. ضع 50 ميكرولتر من كل تخفيف عينة أو عينة تحكم أو PBS على البئر المحدد مسبقا.
ملاحظة: يجب أن تحتوي كل شريحة على عدد مناسب من آبار عينات المرضى ، والتحكم الإيجابي ، والتحكم السلبي ، وبئر التحكم في خلايا PBS. - ضع غرفة منزلقة الرطوبة المغلقة في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 . احتضن الشرائح لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بإزالة غرفة شريحة الرطوبة من الحاضنة ووضعها في BSC.
- استخدم طرف الشافطة لشفط المادة الطافية بعناية من كل بئر ، مع ضمان عدم إزعاج الطبقة الأحادية للخلية. استخدم ماصة قطارة معقمة لتطبيق قطرة واحدة من برنامج تلفزيوني على كل بئر.
- كرر الشفط الدقيق ، ثم ضع كل شريحة في وعاء كوبلين مملوء ببرنامج تلفزيوني واغسله مرتين لمدة 15 دقيقة.
- ضع الشرائح مرة أخرى في صندوق غرفة الرطوبة وقم بتطبيق 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة المناسبة المضادة للإنسان على كل بئر. كرر الخطوات من 4.4 إلى 4.6.
- اترك الشرائح تجف في الهواء ، وقم بتركيب غطاء مع وسائط التثبيت ، واقرأ الشرائح تحت مجهر الفلورسنت.
5. تحليل الشرائح
- عينات الصف على أساس نمط التلوين وشدة مضان مقارنة مع عينات السيطرة الإيجابية مع عيار الأجسام المضادة لداء عالية مؤكدة.
- صنف العينات على مقياس سالب ، 1+ ، 2+ ، 3+ ، و 4+ ، مع نتيجة سلبية تظهر عدم وجود تلطيخ فلوري و 4+ تمثل مضان لون التفاح الأخضر الفاتح مع نمط تلطيخ مشابه لعينات التحكم الإيجابية1.
ملاحظة: ينطبق لون التفاح الأخضر فقط على الأجسام المضادة التي تحمل علامة FITC ؛ يختلف اللون حسب اختيار الفلوروفور. - قم بتعيين قيمة نقطة نهاية للعينات ممثلة بعامل التخفيف الذي تعرض فيه العينة درجة 1-2+. اختبر العينات بعامل تخفيف أعلى إذا لم يتم الوصول إلى نقطة النهاية في الفحص الأولي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم جمع جميع عينات المصل من المرضى في نفس الأطر الزمنية تقريبا بعد PrEP. تم اختبار العينات من خمسة مرضى مختلفين في النقاط الزمنية التالية: أسبوعان بعد التطعيم النهائي ضد لقاح داء ، و 6 أشهر بعد سلسلة لقاح داء ، و 18 شهرا بعد سلسلة لقاح داء. تم تخفيف كل عينة مصل في سلسلة وتصنيفها لكل من وجود IgM و IgG ، كما هو موضح في خطوتي البروتوكول 5.2 و 5.3. تمثل قيمة الجسم المضاد المخصصة عامل التخفيف حيث وصلت العينة إلى درجة نقطة النهاية من 1-2+.
تظهر نتائج الاختبار في كل نقطة زمنية بعد PrEP قدرة الفحص على اكتشاف مستويات مختلفة من وجود الأجسام المضادة. بعد فترة وجيزة من التطعيم الأولي ، كانت مستويات عالية من كل من IgM و IgG موجودة في عينات المرضى ، كما هو موضح في الشكل 1. تشير مناطق تلطيخ الخلايا الفلورية الخضراء الزاهية إلى وجود أجسام مضادة إيجابية ؛ الخلايا الحمراء هي خلايا سالبة لداء حيث لا يمكن لأي جسم مضاد أن يرتبط. بعد حوالي 6 أشهر من التطعيم ، كانت مستويات أقل بكثير من كل من IgM و IgG موجودة في عينات المرضى ، لكن IgM قد انسحبت بالكامل تقريبا. في النقطة الزمنية النهائية ، بعد 18 شهرا من التطعيم ، لم يتم اكتشاف الأجسام المضادة IgM في أي عينات من المرضى ، كما هو موضح في الشكل 2 حيث لم يلاحظ أي تلطيخ للخلايا الفلورية الخضراء. ومع ذلك ، استمرت مستويات IgG وظلت مماثلة للمستويات المكتشفة في نقطة زمنية مدتها 6 أشهر بعد الانخفاض الأولي من النقطة الزمنية 2 أسبوع. يتم سرد نتائج اكتشاف IgG و IgM في عينات من أسبوعين بعد التطعيم ، و 6 أشهر بعد التطعيم ، و 18 شهرا بعد التطعيم في الجدول 1 والجدول 2 والجدول 3 ، على التوالي. يوضح الشكل 3 المخطط الانسيابي لمراحل التنفيذ.
الشكل 1: تلطيخ داء IgM IFA الإيجابي. أظهر مصل المريض عند تخفيف 1: 8 نمط تلطيخ إيجابي بعد وقت قصير من الانتهاء من سلسلة لقاح PrEP. يمثل شريط المقياس على الصورة 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تلطيخ داء IgM IFA السلبي. لم يظهر مصل المريض عند تخفيف 1: 2 أي تلطيخ إيجابي بعد حوالي 18 شهرا من الانتهاء من سلسلة لقاح PrEP. يمثل شريط المقياس على الصورة 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: مخطط انسيابي IFA لداء. مخطط انسيابي يوضح مراحل تنفيذ الخطوات الرئيسية في إجراء IFA للمساعدة في تصور العملية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عينة المريض | الغلوبولين | IgG |
| بلاي ستيشن 1-1 | 1:32 | 1:512 |
| PS2-1 | 1:8 | 1:128 |
| PS3-1 | 1:16 | 1:256 |
| بلاي ستيشن 4-1 | 1:64 | 1:512 |
| بلاي ستيشن 5-1 | 1:16 | 1:128 |
الجدول 1: النتائج 2 أسابيع بعد التطعيم. نتائج عينة المريض من عينات المصل التي تم جمعها بعد حوالي 2 أسابيع من الانتهاء من سلسلة لقاح PrEP.
| عينة المريض | الغلوبولين | IgG |
| بلاي ستيشن 1-2 | 1:2 | 1:128 |
| بلاي ستيشن 2-2 | 1:1 | 1:128 |
| بلاي ستيشن 3-2 | 1:1 | 1:64 |
| بلاي ستيشن 4-2 | 1:1 | 1:256 |
| بلاي ستيشن 5-2 | 1:1 | 1:32 |
الجدول 2: النتائج بعد 6 أشهر من التطعيم. نتائج عينة المريض من عينات المصل التي تم جمعها بعد حوالي 6 أشهر من الانتهاء من سلسلة لقاح PrEP.
| عينة المريض | الغلوبولين | IgG |
| PS1-3 | لم يتم الكشف عنها | 1:128 |
| PS2-3 | لم يتم الكشف عنها | 1:128 |
| بلاي ستيشن 3-3 | لم يتم الكشف عنها | 1:64 |
| بلاي ستيشن 4-3 | لم يتم الكشف عنها | 1:64 |
| بلاي ستيشن 5-3 | لم يتم الكشف عنها | 1:32 |
الجدول 3: النتائج بعد 18 شهرا من التطعيم. نتائج عينة المريض من عينات المصل التي تم جمعها بعد حوالي 18 شهرا من الانتهاء من سلسلة لقاح PrEP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يستفيد اختبار IFA من مركب الأجسام المضادة للمستضد ، مما يسمح بموقع وضع العلامات لتصور الأجسام المضادة الخاصة بداء. يتم زرع خلايا الورم الأرومي العصبي أو خلايا BHK على شرائح مجهرية متعددة الآبار مغلفة ب PTFE ويتم تلقيحها بسلالة مختبر فيروس داء CVS-11. بمجرد أن تتلاقى الطبقة الأحادية وتصل الخلايا إلى العدوى المطلوبة بنسبة 50٪ تقريبا ، يتم تخزين الشرائح حتى تصبح جاهزة للاستخدام6.
يتم تطبيق مصل المريض أو السائل الدماغي الشوكي على الطبقة الأحادية للخلية المصابة ويتم تحضينه للسماح لأي أجسام مضادة خاصة بداء بالالتصاق بمستضد الفيروس7. بعد إجراء الغسيل ، يتم تطبيق جسم مضاد IgG أو IgM المسمى بالفلورسنت ويرتبط بأي جسم مضاد مرتبط بالفيروس من تطبيق العينة. يمكن بعد ذلك تصور الأجسام المضادة الموسومة تحت المجهر الفلوري.
عند التحضير لإجراء هذا الفحص ، من المهم تحديد أفضل إعداد لعينات المرضى والضوابط والاقترانات. تم فحص عينات المرضى الأولية عند عامل تخفيف منخفض أو غير مخفف لاختبار أي وجود للأجسام المضادة. ثم تم تخفيف العينات المزدوجة أو العينات التي تم فحصها مسبقا والتي أظهرت مستوى عال من الأجسام المضادة إلى نقطة النهاية. تم تحضير تخفيفات عينة المريض الأولية لاختبار IgG في مخفف IFA المتاح تجاريا. تم تحضير عينات اختبار IgM في البداية في كاشف حجب IgG متاح تجاريا. ثم تم إعداد التخفيفات التسلسلية اللاحقة لكلا الاختبارين في برنامج تلفزيوني.
تم الحصول على الضوابط المستخدمة للاختبار من متلقين معروفين لداء PrEP أو من أفراد ليس لديهم تاريخ من التطعيم ضد داء. تم اختبار جميع عينات التحكم لوجود الأجسام المضادة قبل الاستخدام. تم الحصول على عنصر التحكم في IgG من متلقي لقاح داء مع عيار الأجسام المضادة المعادل لداء الذي أكدته FAVN. تم الحصول على عينة التحكم الإيجابية IgM من متلقي لقاح داء بعد حوالي 2 أسابيع من الانتهاء من التطعيم.
يعد استخدام المرافق المناسب جانبا حيويا آخر لإجراء اختبار IFA. يعتمد المرافق المستخدم لكل اختبار على هدف النمط المتماثل للأجسام المضادة لهذا الفحص. في هذه الحالة ، تم استخدام الأجسام المضادة IgG المضادة للإنسان والأجسام المضادة IgM المضادة للإنسان المتاحة تجاريا. تم تحديد التخفيفات المترافقة للأجسام المضادة العاملة قبل الاختبار بناء على توصية الشركة المصنعة.
هناك العديد من الخطوات الرئيسية في الإجراء التي ستضمن التنفيذ الناجح لاختبار IFA ، ولعل أهمها إعداد شريحة المستضد. يوفر الوصول إلى ما يقرب من 50٪ من العدوى مواقع ربط وفيرة للأجسام المضادة المتاحة ، مع خلق الوضوح عند قراءة العينات وتصنيفها. تخلق الخلايا السلبية لداء خلفية متناقضة لتصور الأجسام المضادة المصنفة بشكل أفضل. يمكن أن يمثل التلوين غير المحدد أيضا مشكلة عند إجراء تلطيخ الفلورسنت باستخدام مصفوفات عينات معقدة ، مثل المصل. يساعد استخدام كواشف تعطيل IgG (على سبيل المثال ، Gullsorb) على تقليل التلوين غير المحدد بسبب تداخل الأجسام المضادة IgG عند تقييم وجود IgM8. يساعد الإعداد السليم للمواد ودمج الكواشف الخاصة في الإجراء على تقليل البقع الإشكالية مع الحفاظ على نتائج عالية الجودة.
تم تطوير العديد من طرق الاختبار التي تركز على اكتشاف الأجسام المضادة لداء وقياسها وتحديدها. يقدم كل اختبار من هذه الاختبارات نتائج يمكن استخدامها بطرق مختلفة اعتمادا على المعلومات المطلوبة. يعد اختبار Rabies IFA أداة قوية لتحديد الأنماط المتماثلة للأجسام المضادة الخاصة بالفيروس ، ويمكن أن تكون النتائج جاهزة في فترة زمنية قصيرة نسبيا مقارنة بطرق الاختبار الأخرى ، مثل اختبارات RFFIT و FAVN.
على الرغم من أن اختبار IFA يمكنه اكتشاف الأجسام المضادة لداء في عينة ، إلا أنه لا يوفر تقديرا كميا موحدا للأجسام المضادة. يوفر اختبار IFA عامل تخفيف المصل الذي ينتهي عنده اكتشاف الأجسام المضادة. وبالمقارنة ، تحدد اختبارات RFFIT و FAVN قدرات تحييد الأجسام المضادة في العينة ، مما يؤدي إلى عيار من الوحدات الدولية (IU) ، مما يوفر نتيجة أكثر تفصيلا وتوحيدا. تظهر نتائج اختبار FAVN أو RFFIT وجود أجسام مضادة معادلة ، والتي تم تحديدها على أنها أجسام مضادة IgG9. من المفهوم أن دور IgM في تحييد النشاط محدود بسبب هيكله10. لذلك ، لا تكتشف هذه الاختبارات على وجه التحديد وجود IgM.
يمكن أن يكون نوع الاختبار ونتيجته مشكلة إلى حد ما عند تطبيقها على مشكلة معينة. لم يعد مفهوم المستوى الوقائي لحماية الأجسام المضادة ضد عدوى فيروس داء يستخدم لتقييم الاستجابة المناعية للتطعيم ضد داء. في السابق ، تم تعريف الاستجابة الوقائية على أنها ≥0.5 وحدة دولية. ومع ذلك ، تشير المنشورات الحالية عادة إلى استجابة الأجسام المضادة بعد التمنيع على أنها مقبولة (≥0.5 وحدة دولية) أو غير مقبولة (<0.5 وحدة دولية). كما هو مذكور ، لا يوفر اختبار IFA عيارا للأجسام المضادة في IU ولا ينبغي استخدامه لاشتقاق مستوى من الحماية ضد داء. قد لا يؤدي استخدام اختبار IFA أثناء تقييم المريض الذي أصيب بداء دائما إلى وجود أجسام مضادة إيجابية بسبب الاختلافات في الاستجابة المناعية طوال فترة المرض. نظرا لفتك عدوى داء بنسبة 100٪ تقريبا ، من المهم النظر في الاختبار ومقدار المعلومات التي يمكن استخلاصها بأمان من هذه النتائج11. لهذه الأسباب ، من الأفضل دائما تقييم جميع طرق اختبار الأجسام المضادة لداء وتحديد أيها يعمل بشكل أفضل في سيناريو معين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نحن ممتنون لمركز وادزورث التابع لوزارة الصحة بولاية نيويورك لدعم هذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well PTFE coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
References
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).
- Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516 (2021).
- Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
- Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
- Fooks, A. R., Jackson, A. C. Rabies: scientific basis of the disease and its management. , Academic Press. (2020).
- Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
- Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
- Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
- Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).
