Summary
Lo scopo di questo manoscritto è quello di esaminare l'uso del test degli anticorpi fluorescenti indiretti per la rabbia per la rilevazione di anticorpi IgG e IgM specifici per la rabbia.
Abstract
Il test degli anticorpi fluorescenti indiretti (IFA) per la rabbia è stato sviluppato per rilevare vari isotipi di anticorpi anti-rabbia specifici nei sieri o nel liquido cerebrospinale. Questo test fornisce risultati rapidi e può essere utilizzato per rilevare gli anticorpi antirabbici in diversi scenari. Il test antirabbico IFA è particolarmente utile per la diagnosi rapida e precoce degli anticorpi per valutare la risposta immunitaria in un paziente che ha sviluppato la rabbia. Sebbene altri metodi per la diagnosi di rabbia ante mortem abbiano la precedenza, questo test può essere utilizzato per dimostrare la recente esposizione al virus della rabbia attraverso il rilevamento degli anticorpi. Il test IFA non fornisce un titolo anticorpale neutralizzante il virus (VNA), ma la risposta della profilassi pre-esposizione (PrEP) può essere valutata attraverso la presenza di anticorpi positivi o negativi. Questo test può essere utilizzato in varie situazioni e può fornire risultati per una serie di obiettivi diversi. In questo studio, abbiamo utilizzato diversi campioni di siero accoppiati di individui che hanno ricevuto la PrEP e abbiamo dimostrato la loro presenza di anticorpi antirabbici nel tempo utilizzando il test IFA.
Introduction
Il test degli anticorpi fluorescenti indiretti (IFA) della rabbia viene utilizzato per rilevare vari isotipi di anticorpi specifici per la rabbia nei sieri o nel liquido cerebrospinale. Fa parte di un arsenale di test disponibili per il monitoraggio di un paziente con rabbia ante mortem. È particolarmente utile per la diagnosi precoce degli anticorpi per valutare la risposta immunitaria di un paziente all'infezione da rabbia. Se utilizzato in combinazione con altri test, l'anamnesi e lo stato di vaccinazione del paziente, il test IFA può aiutare a determinare l'esposizione al virus della rabbia o a un vaccino1. Poiché il test IFA misura le IgM e/o le IgG, i valori dell'anticorpo specifico possono indicare un lasso di tempo approssimativo dall'esposizione all'antigene1. Questo test può essere utile nelle applicazioni elencate o in altre non ancora esplorate.
Sono disponibili diversi test sierologici per la rabbia. Il test rapido di inibizione della concentrazione fluorescente (RFFIT), il test di neutralizzazione del virus degli anticorpi fluorescenti (FAVN) o le modifiche di questi sono i metodi principali per misurare gli anticorpi neutralizzanti il virus della rabbia (RVNA)1. Tuttavia, questi test non differenziano gli anticorpi IgM e IgG. Quando la differenziazione dell'isotipo anticorpale è importante nel monitoraggio della risposta immunitaria della rabbia, vengono utilizzati i test IFA della rabbia e il test ELISA (Rabies Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), che però non misurano le RVNA. Sebbene i test IFA ed ELISA possano essere utilizzati per determinare la presenza di anticorpi specifici per la rabbia in un campione, ci sono alcune differenze nel modo in cui vengono eseguiti. Il test IFA utilizza un virus vivo in coltura cellulare come substrato dell'antigene, mentre un tipico test ELISA per il rilevamento della rabbia utilizza una o più proteine virali. In un ambiente di laboratorio in cui il virus della rabbia può essere coltivato, il test IFA può essere eseguito più facilmente invece di acquistare o coltivare singole proteine virali per l'ELISA. Lo scopo del test e le informazioni raccolte dai risultati di qualsiasi test sierologico della rabbia devono essere presi in considerazione quando si determina quale scegliere2.
Le IgM sono le prime a rispondere, aumentando fino a quando non si osserva il cambio di classe intorno al giorno 28, a quel punto le IgG diventano l'anticorpo circolante3 predominante. Pertanto, le IgM sarebbero previste solo per un periodo di tempo limitato dopo l'esposizione al virus della rabbia o la vaccinazione. L'analisi sia del siero che del liquido cerebrospinale (CSF) può indicare se l'esposizione è avvenuta attraverso la vaccinazione, in cui gli anticorpi sarebbero visibili solo nel siero, o da un'infezione virale, che potenzialmente mostrerebbe anticorpi nel CSF1.
È stato stabilito che gli anticorpi antirabbici persistono per diversi anni dopo la profilassi pre-esposizione (PrEP)4. Il test IFA può essere uno strumento utile per dimostrarlo in diversi momenti successivi alla vaccinazione o all'esposizione.
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Protocol
Il seguente protocollo è stato approvato per l'uso etico di campioni umani dal Wadsworth Center del Dipartimento della Salute dello Stato di New York per lo sviluppo di test, numero di approvazione del protocollo #03-019.
1. Sicurezza
- Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI), una protezione minima per gli occhi (occhiali o visiera), una mascherina chirurgica e guanti non in lattice.
- Assicurarsi che il personale sia vaccinato per la rabbia e che sia stato dimostrato un titolo di ≥0,5 UI/mL negli ultimi 6 mesi.
2. Preparazione dei vetrini antigenici
NOTA: Eseguire tutte le manipolazioni di virus, liquor e siero in una cabina di biosicurezza (BSC) utilizzando le precauzioni universali.
- Preparare 20 mL di neuroblastoma di topo o cellule BHK-21 a una concentrazione di 3,0 x 105 cellule/mL nei terreni minimi essenziali di Eagle integrati con il 10% di siero fetale bovino (EGM) e conservare al freddo fino all'uso.
- Preparare il virus CVS-11 diluendo in EGM a una diluizione di lavoro di 1,0 x 106,5 50% di dose infettiva di coltura tissutale (TCID50) per millilitro e conservare al freddo fino al momento dell'uso.
NOTA: TCID50 è determinato dal metodo Reed e Muench pubblicato in precedenza5. - Pulire una camera di controllo dell'umidità e i vetrini per microscopio rivestiti in politetrafluoroetilene (PTFE) con etanolo al 70% e lasciare asciugare all'aria nel BSC.
- Aggiungere acqua distillata (dH2O) alle strisce di carta assorbente nella camera dei vetrini per garantire che l'umidità rimanga costante durante tutta la procedura.
- Utilizzando una matita, etichettare ogni vetrino da utilizzare con il numero di lotto, la data, il tipo di cella e qualsiasi altra informazione identificativa necessaria per la conservazione e posizionarlo nella camera del vetrino.
NOTA: La maggior parte dei pennarelli, delle penne o delle etichette non resisterà alla futura fase di fissazione dell'acetone (passaggio 2.9). - Applicare 50 μL di diluizione virale su ciascun pozzetto sui vetrini del microscopio con una pipetta a ripetizione. Quindi, applicare 50 μL di diluizione cellulare su ciascun pozzetto, facendo attenzione a non contaminare il puntale della pipetta con il virus già presente nel pozzetto.
- Chiudere la camera del vetrino di umidità e posizionarla nell'incubatrice umida a 34-36 °C. Valutare l'infettività cellulare dopo 24 ore.
NOTA: Eseguire i passaggi 2.8-2.12 su una sola diapositiva. - Rimuovere il vetrino dalla camera di umidità e aspirare con cautela il surnatante. Lavare il vetrino in un barattolo Coplin riempito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 2 minuti, quindi lasciare asciugare il vetrino all'aria.
- Mettere il vetrino nel barattolo Coplin e fissarlo in acetone freddo per almeno 1 ora in un congelatore a -20 °C approvato per materiali infiammabili. Eseguire tutte le procedure di versamento e asciugatura all'aria dell'acetone in una cappa aspirante.
- Lasciare che l'acetone appaspia e scivolare ad asciugare. Applicare il coniugato anticorpo fluorescente diretto antirabbico (DFA) preparato secondo le istruzioni del produttore sui pozzetti del vetrino e incubare per 30 minuti in un'incubatrice umida a 34-36 °C.
- Lavare il vetrino in barattoli Coplin di PBS due volte per 2 minuti ciascuno. Asciugare il vetrino all'aria.
- Montare un vetrino coprioggetto con 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl (pH 9,0) e 20% di montante di glicerolo e leggere il vetrino utilizzando un microscopio fluorescente con ingrandimento 200x per valutare l'infettività. Se le cellule non sono infette per circa il 50%, ripetere i passaggi 2.7-2.12 il giorno successivo fino a raggiungere l'infettività desiderata.
NOTA: L'infettività cellulare è approssimata in base alla valutazione visiva del rapporto tra cellule negative e cellule positive alla rabbia sul pozzetto del vetrino. Le cellule negative appaiono di colore rosso, mentre le cellule positive mostrano una colorazione fluorescente verde. - Rimuovere i vetrini rimanenti dall'incubatrice e dalla camera di umidità. Aspirare con cura il surnatante da ciascun pozzetto, quindi posizionare i vetrini in uno o più barattoli Coplin con PBS per 1-2 minuti. Asciugare i vetrini all'aria per circa 30 minuti. Conservare i vetrini a -80 °C fino al momento dell'uso.
3. Preparazione del campione
- Preparare le diluizioni del campione di siero o di liquido cerebrospinale del paziente per il test. Preparare il coniugato necessario per una corretta concentrazione di lavoro diluito in PBS con blu Evans allo 0,05%.
NOTA: Tenere il coniugato al buio per mantenere l'integrità del fluoroforo prima dell'applicazione
4. Procedura IFA
- Rimuovere il numero necessario di vetrini antigenici preparati necessari per ciascun test e lasciare che i vetrini si scongelino e si asciughino completamente.
- Mettere i vetrini in uno o più barattoli Coplin e fissarli in acetone freddo per un periodo compreso tra 2 ore e una notte in un congelatore a -20 °C approvato per materiali infiammabili. Rimuovere i vetrini dall'acetone e lasciarli asciugare all'aria.
- Posizionare i vetrini in una scatola della camera di umidità all'interno del BSC con strisce assorbenti imbevute di dH2O per mantenere l'umidità. Applicare 50 μL di ciascuna diluizione del campione, campione di controllo o PBS al pozzetto predeterminato.
NOTA: Ogni vetrino deve contenere un numero appropriato di pozzetti per campioni del paziente, controllo positivo, controllo negativo e pozzetto di controllo delle cellule PBS. - Posizionare la camera chiusa del vetrino di umidità in un'incubatrice umida a 37 °C, 5% di CO2 . Incubare i vetrini per 30 minuti, quindi rimuovere la camera dei vetrini di umidità dall'incubatrice e posizionarla in un BSC.
- Utilizzare una punta di aspirazione per aspirare con cura il surnatante da ciascun pozzetto, assicurandosi di non disturbare il monostrato cellulare. Utilizzare una pipetta contagocce sterile per applicare una goccia di PBS su ciascun pozzetto.
- Ripetere l'aspirazione accurata, quindi mettere ogni vetrino in un barattolo Coplin riempito di PBS e lavare due volte per un totale di 15 minuti.
- Riposizionare i vetrini nella scatola della camera di umidità e applicare 50 μL di coniugato anticorpale anti-umano appropriato a ciascun pozzetto. Ripetere i passaggi da 4.4 a 4.6.
- Lasciare asciugare i vetrini all'aria, montare un vetrino coprioggetti con i supporti di montaggio e leggere i vetrini al microscopio a fluorescenza.
5. Analisi dei vetrini
- Classificare i campioni in base al modello di colorazione e all'intensità della fluorescenza rispetto ai campioni di controllo positivi con un titolo anticorpale antirabbico elevato confermato.
- Classificare i campioni su una scala di negativo, 1+, 2+, 3+ e 4+, con un risultato negativo che non mostra alcuna colorazione fluorescente e 4+ che rappresenta una fluorescenza di colore mela verde brillante con un modello di colorazione simile ai campioni di controllo positivo1.
NOTA: Il colore verde mela si applica solo agli anticorpi marcati con FITC; Il colore varia a seconda della selezione del fluoroforo. - Assegnare ai campioni un valore del punto finale rappresentato dal fattore di diluizione in corrispondenza del quale il campione visualizza un grado 1-2+. Testare i campioni con un fattore di diluizione più elevato se il punto finale non viene raggiunto nel saggio iniziale.
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Representative Results
Tutti i campioni di siero sono stati raccolti dai pazienti all'incirca nello stesso periodo di tempo dopo la PrEP. I campioni sono stati testati da cinque diversi pazienti nei seguenti momenti: 2 settimane dopo l'inoculazione finale del vaccino antirabbico, 6 mesi dopo la serie di vaccini antirabbici e 18 mesi dopo la serie di vaccini antirabbici. Ogni campione di siero è stato diluito in serie e classificato sia per la presenza di IgM che di IgG, come descritto nelle fasi 5.2 e 5.3 del protocollo. Il valore anticorpale assegnato rappresenta il fattore di diluizione in cui il campione ha raggiunto un grado di end point di 1-2+.
I risultati dei test effettuati in ogni momento successivo alla PrEP dimostrano la capacità del test di rilevare diversi livelli di presenza di anticorpi. Poco dopo la vaccinazione iniziale, nei campioni dei pazienti erano presenti alti livelli di IgM e IgG, come si vede nella Figura 1. Le aree di colorazione delle cellule fluorescenti di colore verde brillante indicano la presenza di anticorpi positivi; I globuli rossi sono cellule negative alla rabbia in cui nessun anticorpo potrebbe legarsi. Circa 6 mesi dopo la vaccinazione, nei campioni dei pazienti erano presenti livelli significativamente più bassi di IgM e IgG, ma le IgM erano scomparse quasi completamente. Al momento finale, 18 mesi dopo la vaccinazione, gli anticorpi IgM non sono stati rilevati in nessun campione di pazienti, come dimostrato nella Figura 2 in cui non è stata osservata alcuna colorazione a cellule fluorescenti verdi. Tuttavia, i livelli di IgG sono persistiti e sono rimasti simili ai livelli rilevati al punto temporale di 6 mesi dopo la diminuzione iniziale rispetto al punto temporale di 2 settimane. I risultati per il rilevamento di IgG e IgM nei campioni a partire da 2 settimane dopo la vaccinazione, 6 mesi dopo la vaccinazione e 18 mesi dopo la vaccinazione sono elencati rispettivamente nella Tabella 1, Tabella 2 e Tabella 3. La Figura 3 mostra il diagramma di flusso delle fasi di esecuzione.
Figura 1: Colorazione positiva per la rabbia IgM IFA. Il siero del paziente con una diluizione di 1:8 ha mostrato un pattern di colorazione positivo poco dopo il completamento della serie di vaccini PrEP. La barra della scala sull'immagine rappresenta 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Colorazione antirabbica IgM IFA negativa. Il siero del paziente con una diluizione di 1:2 non ha mostrato alcuna colorazione positiva circa 18 mesi dopo il completamento della serie di vaccini PrEP. La barra della scala sull'immagine rappresenta 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Diagramma di flusso IFA della rabbia. Diagramma di flusso che mostra le fasi di esecuzione delle fasi principali della procedura IFA per facilitare la visualizzazione del processo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Campione paziente | Igm | IgG |
| PS1-1 | 1:32 | 1:512 |
| PS2-1 | 1:8 | 1:128 |
| PS3-1 | 1:16 | 1:256 |
| PS4-1 | 1:64 | 1:512 |
| PS5-1 | 1:16 | 1:128 |
Tabella 1: Risultati 2 settimane dopo la vaccinazione. Risultati dei campioni di siero raccolti circa 2 settimane dopo il completamento della serie di vaccini PrEP.
| Campione paziente | Igm | IgG |
| PS1-2 | 1:2 | 1:128 |
| PS2-2 | 1:1 | 1:128 |
| PS3-2 | 1:1 | 1:64 |
| PS4-2 | 1:1 | 1:256 |
| PS5-2 | 1:1 | 1:32 |
Tabella 2: Risultati 6 mesi dopo la vaccinazione. Risultati dei campioni di siero raccolti circa 6 mesi dopo il completamento della serie di vaccini PrEP.
| Campione paziente | Igm | IgG |
| PS1-3 | Non rilevato | 1:128 |
| PS2-3 | Non rilevato | 1:128 |
| PS3-3 | Non rilevato | 1:64 |
| PS4-3 | Non rilevato | 1:64 |
| PS5-3 | Non rilevato | 1:32 |
Tabella 3: Risultati 18 mesi dopo la vaccinazione. Risultati dei campioni di siero raccolti circa 18 mesi dopo il completamento della serie di vaccini PrEP.
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Discussion
Il test IFA sfrutta un complesso antigene-anticorpo, consentendo a un sito di marcatura di visualizzare gli anticorpi specifici per la rabbia. Le cellule di neuroblastoma o BHK vengono seminate su vetrini da microscopio rivestiti in PTFE a più pozzetti e inoculate con il ceppo di laboratorio CVS-11 del virus della rabbia. Una volta che il monostrato è confluente e le cellule raggiungono l'infettività desiderata di circa il 50%, i vetrini vengono conservati fino al momento dell'uso6.
Il siero del paziente o il liquido cerebrospinale viene applicato al monostrato di cellule infette e incubato per consentire a eventuali anticorpi specifici per la rabbia di attaccarsi all'antigenevirale 7. A seguito di una procedura di lavaggio, viene applicato un anticorpo IgG o IgM anti-umano marcato in fluorescenza che si lega a qualsiasi anticorpo legato al virus dall'applicazione del campione. Gli anticorpi marcati possono quindi essere visualizzati al microscopio a fluorescenza.
Quando ci si prepara a eseguire questo test, è importante determinare la migliore preparazione dei campioni dei pazienti, dei controlli e dei coniugati. I campioni iniziali dei pazienti sono stati sottoposti a screening con un basso fattore di diluizione o non diluiti per verificare l'eventuale presenza di anticorpi. I campioni appaiati o i campioni precedentemente sottoposti a screening che hanno dimostrato un alto livello di anticorpi sono stati poi ulteriormente diluiti fino al punto finale. Le diluizioni iniziali del campione del paziente per il test delle IgG sono state preparate in diluente IFA disponibile in commercio. I campioni di test IgM sono stati inizialmente preparati in un reagente bloccante delle IgG disponibile in commercio. Le successive diluizioni seriali per entrambi i test sono state quindi preparate in PBS.
I controlli utilizzati per il test sono stati ottenuti da destinatari noti di PrEP antirabbica o da individui senza storia di vaccinazione antirabbica. Tutti i campioni di controllo sono stati testati per la presenza di anticorpi prima dell'uso. Il controllo IgG è stato ottenuto da un destinatario del vaccino antirabbico con un titolo anticorpale neutralizzante la rabbia confermato da FAVN. Il campione di controllo IgM-positivo è stato ottenuto da un destinatario del vaccino antirabbico circa 2 settimane dopo il completamento della vaccinazione.
L'uso di coniugati appropriati è un altro aspetto fondamentale dell'esecuzione del test IFA. Il coniugato utilizzato per ciascun test dipende dall'isotipo dell'anticorpo bersaglio per quel test. In questo caso, sono stati utilizzati gli anticorpi IgG e IgM anti-umani marcati con FITC disponibili in commercio. Le diluizioni di coniugato anticorpale di lavoro sono state determinate prima del test in base alle raccomandazioni del produttore.
Ci sono diversi passaggi chiave nella procedura che garantiranno la corretta esecuzione del test IFA, forse il più importante è la preparazione del vetrino antigenico. Il raggiungimento di circa il 50% di infettività fornisce abbondanti siti di legame per gli anticorpi disponibili, creando al contempo chiarezza durante la lettura e la classificazione dei campioni. Le cellule rabbios-negative creano uno sfondo contrastante per visualizzare meglio gli anticorpi marcati. Anche la colorazione non specifica può rappresentare un problema quando si esegue la colorazione fluorescente utilizzando matrici di campioni complesse, come il siero. L'uso di reagenti di inattivazione delle IgG (ad es. Gullsorb) aiuta a ridurre la colorazione aspecifica dovuta agli anticorpi IgG interferenti quando si valuta la presenza di IgM8. La corretta preparazione dei materiali e l'incorporazione di reagenti speciali nella procedura aiutano a ridurre le macchie problematiche preservando risultati di alta qualità.
Sono stati sviluppati una moltitudine di metodi di test che si concentrano sul rilevamento, la quantificazione e l'identificazione degli anticorpi antirabbici. Ognuno di questi test offre risultati che possono essere utilizzati in vari modi a seconda delle informazioni ricercate. Il test IFA per la rabbia è un potente strumento per identificare gli isotipi anticorpali specifici del virus e i risultati possono essere pronti in un periodo di tempo relativamente breve rispetto ad altri metodi di test, come i test RFFIT e FAVN.
Sebbene il test IFA sia in grado di rilevare gli anticorpi antirabbici in un campione, non fornisce una quantificazione standardizzata degli anticorpi. Il test IFA fornisce un fattore di diluizione sierica al quale termina la rilevazione degli anticorpi. In confronto, i test RFFIT e FAVN quantificano le capacità neutralizzanti degli anticorpi in un campione, ottenendo un titolo di unità internazionali (UI), fornendo un risultato più dettagliato e standardizzato. I risultati di un test FAVN o RFFIT dimostrano la presenza di anticorpi neutralizzanti, che sono stati determinati essere anticorpi IgG9. Il ruolo delle IgM nell'attività neutralizzante è limitato a causa della sua struttura10. Pertanto, questi test non rilevano in modo specifico la presenza di IgM.
Il tipo di test e il suo risultato possono essere alquanto problematici quando li si applica a un problema specifico. Il concetto di un livello protettivo di protezione anticorpale contro l'infezione da virus della rabbia non è più utilizzato per valutare la risposta immunitaria alla vaccinazione antirabbica. In precedenza, una risposta protettiva era definita come ≥0,5 UI. Tuttavia, le pubblicazioni attuali in genere si riferiscono alla risposta anticorpale dopo l'immunizzazione come accettabile (≥0,5 UI) o inaccettabile (<0,5 UI). Come detto, il test IFA non fornisce un titolo anticorpale nell'UI e non deve essere utilizzato per ricavare un livello di protezione contro la rabbia. L'uso del test IFA durante la valutazione di un paziente che ha sviluppato la rabbia potrebbe non sempre comportare una presenza positiva di anticorpi a causa delle variazioni nella risposta immunitaria durante la malattia. A causa della letalità quasi del 100% di un'infezione da rabbia, è importante considerare il test e quante informazioni possono essere derivate in modo sicuro da questi risultati11. Per questi motivi, è sempre meglio valutare tutti i metodi di test degli anticorpi antirabbici e determinare quale funziona meglio in un determinato scenario.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati al Wadsworth Center del Dipartimento della Salute dello Stato di New York per aver sostenuto questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well PTFE coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
References
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