Summary
Zinktransport har vist sig at være udfordrende at måle på grund af de svage årsagssammenhænge til proteinfunktionen og den lave tidsmæssige opløsning. Denne protokol beskriver en metode til overvågning med høj tidsmæssig opløsning af Zn 2+ ekstrudering fra levende celler ved anvendelse af et Zn 2+ følsomt fluorescerende farvestof, hvilket giver et direkte mål for Zn2+ efflux.
Abstract
Overgangsmetaller såsom Zn2+ ioner skal reguleres stramt på grund af deres cellulære toksicitet. Tidligere blev aktiviteten af Zn 2+ transportører målt indirekte ved at bestemme transportørens ekspressionsniveau under forskellige koncentrationer af Zn2+. Dette blev gjort ved at anvende immunhistokemi, måle mRNA i vævet eller bestemme de cellulære Zn2+ niveauer. Med udviklingen af intracellulære Zn 2+ sensorer bestemmes zinktransportørernes aktiviteter i øjeblikket primært ved at korrelere ændringer i intracellulære Zn 2+, detekteret ved hjælp af fluorescerende sonder, med ekspressionen af Zn2+ transportørerne. Men selv i dag overvåger kun få laboratorier dynamiske ændringer i intracellulær Zn2+ og bruger den til at måle aktiviteten af zinktransportører direkte. En del af problemet er, at ud af de 10 zinktransportører i ZnT-familien, bortset fra ZnT10 (transporterer mangan), er kun zinktransportør 1 (ZnT1) lokaliseret ved plasmamembranen. Derfor er det svært at forbinde transportaktiviteten med ændringer i den intracellulære Zn2+ koncentration. Denne artikel beskriver en direkte måde at bestemme zinktransportkinetikken ved hjælp af et assay baseret på et zinkspecifikt fluorescerende farvestof, FluoZin-3. Dette farvestof indlæses i pattedyrceller i sin esterform og fanges derefter i cytosolen på grund af cellulær di-esteraseaktivitet. Cellerne er fyldt med Zn 2+ ved at udnytte Zn2+ ionoforpyrithion. ZnT1-aktiviteten vurderes ud fra den lineære del af reduktionen i fluorescens efter celleudvaskningen. Fluorescensen målt ved en excitation på 470 nm og emission på 520 nm er proportional med den frie intracellulære Zn2+. Valg af celler, der udtrykker ZnT1 mærket med mCherry-fluoroforen, giver kun mulighed for overvågning af cellerne, der udtrykker transportøren. Dette assay bruges til at undersøge bidraget fra forskellige domæner af ZnT1-protein til transportmekanismen for humant ZnT1, et eukaryot transmembranprotein, der ekstruderer overskydende zink fra cellen.
Introduction
Zink er et vigtigt sporstof i cellemiljøet. Det inkorporerer en tredjedel af alle proteiner og er involveret i forskellige cellulære processer, såsom katalyse1, transkription2 og strukturelle motiver3. På trods af at de er redox-inerte, er høje zinkkoncentrationer imidlertid giftige for cellen, hvorfor ingen pattedyrsorganisme har overlevet uden tilstedeværelsen af mekanismer, der regulerer zinkhomeostase. Hos pattedyr er tre mekanismer ansvarlige for denne proces: (1) metallothioneiner, som er cytosoliske cysteinrige proteiner, der binder zink ved høj affinitet og dermed forhindrer overskydende frit cytosolisk zink4; (2) Zrt/Irt-lignende proteiner (ZIP'er), som er zinktransportører, der er ansvarlige for zinktilstrømning til cytosolen gennem plasmamembranen eller fra intracellulære organeller 4,5,6,7,8; og (3) ZnT'er, som er en pattedyrsdelmængde af den allestedsnærværende kationdiffusionsfacilitatorfamilie (CDF) og er zinktransportører, da de ekstruderer zink fra cytosolen over plasmamembranen eller ind i de intracellulære organeller 4,5,6,7,8,9. På grund af zinks betydning for cellulær metabolisme er det vigtigt at forstå cellulær zinkdynamik.
Tidligere metoder til vurdering af zinkdynamik var afhængige af at vurdere ekspressionsniveauerne af mRNA under forskellige zinkbetingelser ved at korrelere dem med cellulære zinkmålinger af faste væv eller celler10,11,12. Disse metoder omfatter kemisk detektion og immunohistokemisk farvning. Disse metoder giver imidlertid kun indirekte mål og bestemmer således kun en offline korrelation mellem intracellulær zinkkoncentration og ekspressionen af zinktransportører. Derfor kan disse metoder ikke udlede nogen parametre, der kræver høj tidsmæssig opløsning.
En mere direkte måling af Zn2+ transport bruger radioaktive isotoper af zink13. Denne metode er afhængig af måling af radioaktivt mærket Zn2+ for at overvåge zinktransport og dens kinetik. På grund af zinks betydning for cellulær homeostase regulerer flere cellulære processer imidlertid intracellulær zinkkoncentration. Blandt disse er ekstracellulær binding og flere transportsystemer, der arbejder sammen for at opretholde tæt kontrol af intracellulære Zn2+ niveauer. Kombinationen af disse processer skaber betydelig baggrundsstøj, hvilket gør det vanskeligt at teste individuelle zinkrelaterede transportfunktioner.
Denne artikel demonstrerer en metode til direkte overvågning af zinktransporthastigheden ved at måle den intracellulære frie zinkkoncentration ved hjælp af et zinkspecifikt fluorescerende farvestof, FluoZin-3. Farvestoffet har høj specificitet for Zn2+ og lidt interferens fra andre divalente kationer, såsom calcium. Derudover kommer den i sin esterform ind i cellerne ved ikke-ionisk diffusion og fanges derefter på grund af aktiviteten af intracellulær di-esterase. Således er dets fluorescens primært korreleret med den frie cytosoliske zinkkoncentration. Disse eksperimenter blev udført for at studere struktur-funktionsforholdet mellem zinktransportør 1 (ZnT1), et medlem af ZnT-familien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celletransfektion
- Dyrkning HEK293T celler i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 1x penicillin/streptomycin (se materialetabel) i en befugtet inkubator ved 37 °C/5% CO2 indtil sammenløb på en 10 cm plade (8,8 x 106 celler i alt).
- Der anbringes et 13 mm dæksel i hvert hul på en plade med 12 huller. Fortynd 0,44 x 106 trypsiniserede celler fra trin 1,1 i 12 ml komplet DMEM. Bland godt ved at pipettere op og ned tre til fem gange. Fyld hvert hul med 1 ml af den blandede opløsning. Voks i en befugtet inkubator ved 37 °C/5% CO2 natten over.
- Udskift hele DMEM i hvert hul med 1 ml serumfrit DMEM (se materialetabellen) i hvert hul. 12-brøndspladen sættes tilbage i den befugtede inkubator som i trin 1.1.
- For hver transfektionsbrønd fortyndes 1 μg pAAV2-plasmid indeholdende proteinet af interesse mærket med mCherry fluorescerende protein (supplerende fil 1) i 100 μL serumfrit DMEM i et 1,5 ml rør.
- Tilsæt 3 μg polyethyleneimin (PEI, se materialetabel) til 100 μL serumfri DMEM pr. transfektion, med hver transfektion i et andet 1,5 ml rør. Plasmid: PEI-forholdet skal være 1: 3 (μg: μg).
- Vortex begge rør fra trin 1.4 og trin 1.5 i 10 s, og lad hvile ved stuetemperatur i mindst 5 minutter.
- Bland en del (100 μL pr. Hul) af DNA-opløsningen fra trin 1.4 med en del (100 μL pr. Hul) af PEI-opløsningen fra trin 1.5. Vortex den endelige opløsning i 10 s, og lad den hvile ved stuetemperatur i mindst 20 minutter og i op til 6 timer.
- Tag 12-brøndpladen fra inkubatoren. Den endelige opløsning hvirvel fra trin 1.7 og tilsættes 200 μL til hvert af hullerne i 12-brøndpladen fra trin 1.3. 12-brøndpladen sættes tilbage i den befugtede inkubator (trin 1.1).
- Efter 3 timer udskiftes mediet i hvert hul med 1 ml komplet DMEM. 12-brøndspladen sættes tilbage i den befugtede inkubator som i trin 1.1.
- Efter 2 dage tages den transfekterede cellekultur fra 37 ° C / 5% CO2 -inkubatoren og placeres på et omvendt fluorescensmikroskop ved hjælp af 10x forstørrelse.
- Brug mikroskopets fokushjul til at fokusere på cellerne, mens du bruger brightfield-lys.
- Skift til de fluorescerende mCherry-excitationsbølgelængder (587 nm) og emissionsbølgelængder (610 nm), og sluk for lysstyrkelyset. Kontroller cellernes fluorescens for at bekræfte ekspressionen af ZnT1 mCherry.
- Forbered farvestofpåfyldningsopløsningen.
- Der udtages en prøve på 4 μL zinkspecifikt fluorescerende farvestof (se materialetabellen) i acetoxymethylesterform, opløst i DMSO (1 μg/μL), fra en lysbeskyttet stamme, der opbevares i en fryser til -20 °C. Denne form tillader farvestoffet at komme ind i cellen gennem plasmamembranen ved simpel diffusion.
- Der tilsættes 4 μL 10% plulonsyre (eller 2 μL 20% plulonsyre, se materialetabel) til prøven fra trin 1.13.1. Bland opløsningen godt ved at pipettere op og ned tre gange, og tilsæt derefter alle 8 μL til et 1,5 ml rør.
- Fra trin 1.13.2 tilsættes 750 μL Ringers opløsning (tilberedt internt, se materialetabel) suppleret med 1 mg/ml (~0,1%) bovint serumalbumin til røret fra trin 1.13.2 og hvirvelstrømmen kraftigt. Tilsæt yderligere 750 μL af den samme opløsning og hvirvel igen for at sikre maksimal blanding.
- Der tilsættes 750 μL af den endelige opløsning fra trin 1.13.3 til to huller i en ny 6-brønds kulturplade. Dæk med aluminiumsfolie.
BEMÆRK: For at undgå blegning er 6-brøndspladen altid dækket med aluminiumsfolie fra dette trin. - Brug en fin pincet til at tage op til fire replikate dæksedler fra den transfekterede cellekulturplade og placere dem i den første fyldte brønd (op til fire dias pr. Brønd) på den nye 6-brøndplade fra trin 1.14. Gentag denne proces for den anden fyldte brønd.
BEMÆRK: Alle dæksedler i samme fyldte brønd skal være i samme stand. Hver brønd kan dog indeholde forskellige forhold. - Dæk med aluminiumsfolie, og ryst forsigtigt i 15-20 min.
- Fjern farvestofpåfyldningsopløsningen, og erstat den med en ny vaskeopløsning af Ringer's plus albumin, som anvendt i trin 1.13.3. Dæk med aluminiumsfolie. Lad ryste igen i 20 min. Dette tillader spaltning af AM-esteren af de intracellulære esteraser.
2. Mikroskop forberedelse
- Arranger de nødvendige værktøjer (se materialetabel) som nævnt: et omvendt fluorescensmikroskop, der er i stand til at detektere GFP og mCherry-fluoroforer, et perfusionssystem, der gør det muligt at skifte mellem mindst to opløsninger, et sugesystem og et perfusionskammer.
- Tænd mikroskopet, dets lyskilde og kameraet. Tænd sugesystemet.
- Vask perfusionssystemet. Det første kammer vaskes med Ringers opløsning og det andet kammer med Ringers opløsning indeholdende 7 μM zinkopløsning suppleret med 7 μM pyrithion (zinkionofor, se materialetabel). For at undgå luftbobler eller huller skal du efterlade lidt væske i hvert kammer.
BEMÆRK: Da begge beholdere er forbundet til det samme rør, der er tilsluttet perfusionskammeret, skal du altid sørge for, at det delte segment vaskes med Ringers opløsning. - Luk vandhanerne, og fyld de relevante kamre med Ringers opløsning og Ringers zinkopløsning som i trin 2.3.
3. Forberedelse af prøver
- Tag perfusionskammeret, og placer det med den smalle side af rillen opad.
BEMÆRK: Rillen er et hul i midten af perfusionskammeret. Det giver perfusionsvæsken adgang til cellerne. Den ene side af rillen er smal, og den modsatte side er bred. - Påfør en forseglende silikone (se materialetabel) omkring rillen. Rengør eventuel tætningssilikone fra rillen ved hjælp af en pipettespids.
BEMÆRK: Sørg for, at der er nok silikoneforsegling omkring rillen til at forsegle en 22 mm dæksel. - Brug en fin pincet til at tage et dæksel fra vaskeopløsningen og læg det oven på rillen med cellerne nedad. På denne måde vil cellerne blive udsat for opløsningen, der perfuserer rillen under eksperimentet.
- Placer en 22 mm dæksel oven på 13 mm dæksel, og stram den med pincetten. Pas på ikke at knække dækslerne.
- Vend kammeret, og tryk på det for at frigive alle de tilstedeværende væsker. Fyld rillen med 100 μL af Ringers vaskeopløsning, og tryk igen for at sikre, at der ikke er lækage.
BEMÆRK: Hvis der opdages en lækage, skal du anvende et tætningsmiddel på lækagestedet og teste igen. - Monter perfusionskammeret på platformen, og fastgør det. Placer perfusions- og sugerørene for at tillade perfusion over cellerne i rillen.
- Skift perfusionshastigheden til ca. 2 ml/min, og tænd for perfusionen af ringerens opløsning. Sørg for, at perfusionssystemet fungerer uden lækage eller spild.
4. Forberedelse af måling
- Åbn billedbehandlingssoftwaren (se materialetabellen) ved at dobbeltklikke på ikonet. Log ind med de relevante legitimationsoplysninger. Vælg det tilsluttede kamera, og tryk på OK.
- Indstil mikroskopforstørrelsen til 10x ved hjælp af knappen på venstre side af mikroskopet.
- Hvis du vælger direkte visning og bruger joysticket, skal du flytte platformen for at fokusere på cellerne i rillen.
- Mens perfusionen er tændt, skal du slukke for lysene og ændre bølgelængden til mCherry ved at trykke på den dedikerede knap i grænsefladen. Juster fokus ved hjælp af mikroskopets fokushjul.
- Når mikroskopet er fokuseret på cellerne, skal du flytte platformen ved hjælp af joysticket for at tillade valg af de passende celleplastre.
BEMÆRK: Et egnet område betragtes som et område med mindst 10 celler til et investeringsafkast og et tomt område til baggrund. - Vælg rullemenuen Slå investeringsafkast til/fra , og vælg Tegn cirkulære investeringsafkast.
- Tegn ROI'er for celleklynger med de mCherry-ekspressive celler (angiver ekspressionen af ZnT1).
- Fra den samme værktøjslinje som trin 4.6 skal du klikke på knappen Slå baggrunds-ROI'er til / fra og justere placeringen og størrelsen af baggrunds-ROI til et område uden celler overhovedet.
- Kontroller med mCherry- og EGFP-bølgelængderne for at sikre, at der ikke er celler i det valgte baggrunds-ROI.
BEMÆRK: Bølgelængderne blev justeret, så mCherry brugte en excitationsbølgelængde på 520 nm og en emissionsbølgelængde på 610 nm, og EGFP brugte en excitationsbølgelængde på 470 nm og en emissionsbølgelængde på 520 nm.
- Kontroller med mCherry- og EGFP-bølgelængderne for at sikre, at der ikke er celler i det valgte baggrunds-ROI.
- Vælg underfanen Bølgelængde (λ). Marker afkrydsningsfeltet, og sørg for, at GFP-bølgelængden er til stede og dens afkrydsningsfelt markeret. Hvis ikke, skal du tilføje og markere det.
- Vælg underfanen Varighed . Definer måleintervallet som hver 5. s, og skift antallet af intervaller, så det passer til eksperimentets varighed.
- I afsnittet Fokus på mikroskoppanelet under okularet skal du klikke på knappen Til for at aktivere det perfekte fokussystem (PFS).
- Brug PFS-fokushjulet til at justere fokus. I softwaregrænsefladen, Under ND-erhvervelse, skal du sikre dig, at PFS er markeret.
- Klik på Kør nu.
5. Eksperimentel procedure
- Start med en 90 s baseline periodemåling ved hjælp af Ringers opløsningsperfusion.
- Når basisperioden slutter, skal du slukke for Ringers opløsningsperfusion og derefter tænde for Ringers zinkopløsningsperfusion. Marker omskiftningen af løsningen ved at klikke på det røde flag nederst til højre på hovedgrænsefladepanelet. En stigning i fluorescens forventes at forekomme.
- Når fluorescensstigningen begynder at mætte, skal du skifte tilbage til perfusion med Ringers opløsning. Sluk for Ringers zinkopløsningsperfusion, og tænd derefter Ringers opløsningsperfusion.
- Vent, indtil eksperimenttiden udløber. Et mærkbart, men støt fald i fluorescens forventes, hvis ZnT1 fungerer korrekt.
6. Eksport af data
- For at eksportere dataene med baseline subtraktion skal du trykke på knappen Subtraher Baseline og se ændringerne i vinduet "ND-erhvervelse".
- Klik på knappen Eksporter i softwaregrænsefladen i vinduet "ND-erhvervelse". Et Excel-dataark åbnes. Gem på det ønskede sted.
7. Analyse af data
- For hvert investeringsafkast skal du oprette en gennemsnitlig baseline fluorescens fra de første 90-100 s.
- Angiv fluorescensen beregnet for hvert investeringsafkast som en procentdel af baggrunden for det pågældende investeringsafkast.
- Opret et rækkegennemsnit af alle investeringsafkastene, og afbild resultatet som et linjediagram. Dette skaber et gennemsnit af alle ROI'er som en funktion af tiden.
- Brug lineærtilpasningsfunktionen til at vælge starthastigheden for faldet i fluorescens efter vask med Ringers opløsning. Ligningens hældningsværdi korrelerer med transporthastigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZnT1 er en zinktransportør fra pattedyr placeret på celleplasmamembranen13. Det er medlem af kationdiffusionsfacilitatoren (CDF) proteinfamilien, der ekstruderer zink fra cytosolen til den ekstracellulære millieu14. ZnT1 har en to-domæne arkitektur: transmembrandomænet, som transporterer ionerne over membranen, og et C-terminal domæne14. I modsætning til andre kendte CDF-proteiner har ZnT1 et udvidet ustruktureret C-terminaldomæne (USCTD). USCTD's rolle er i øjeblikket ukendt. Vi brugte protokollen ovenfor til at sammenligne ZnT1 WT med ZnT1 uden USCTD for at vurdere dets involvering i zinktransportaktivitet.
HEK 293T-celler blev transfekteret med pAAV2-plasmidet indeholdende enten ZnT1 WT eller ZnT1 uden den ustrukturerede C-terminal (ΔUSCTD) og testede transportaktivitetshastigheden som beskrevet ovenfor. Supplerende figur 1 viser, at begge versioner af ZnT1 udtrykker og lokaliserer til plasmamembranen uden problemer. Figur 1 viser de typiske resultater for et eksempel på et sådant eksperiment. En stigning i fluorescens er resultatet af en stigning i den intracellulære Zn 2+ koncentration, mens et fald er et resultat af aktiviteten af ZnT1, der transporterer Zn2+ over cellemembranen (individuelle grafer, inklusive standardfejl, findes i supplerende figur 2 og supplerende figur 3). Det fremgår af denne figur, at ZnT1 WT har en glattere fluorescenskurve end mutanten. Dette er imidlertid ikke en iboende differentierende funktion, men er relateret til variabilitet i de cellulære reaktioner på zinkbelastning, som er blevet observeret i tidligere eksperimenter. Figur 2 viser et boksplot, der opsummerer resultaterne fra 15-17 sådanne eksperimenter. Det fremgår klart af figuren, at ΔUSCTD udviser en større spredning af transportrater sammenlignet med WT. Selvom dette kan tilskrives den tidligere nævnte cellulære responsvariabilitet, kan det også indikere en funktionel forskel. For eksempel kan det betyde, at ZnT1 USCTD-segmentet er en modulator af transporthastigheden. Det er klart, at der ikke er nogen synlig forskel mellem Zn2+ ekstruderingsaktiviteterne i WT og ΔUSCTD. Baseret på den statistiske analyse blev dataene normalt ikke distribueret (WT-datasæt, Shapiro-Wilk-test15, statistik = 0,72404, p-værdi = 0,0004), så to ikke-parametriske stikprøvetest blev brugt til sammenligninger mellem datasættene. Resultaterne viste, at der ikke var nogen statistisk forskel mellem transporthastighederne (Mann-Whitney16 U-test: U = 132, Z = 0,15105, Asymp. Sandsynlighed>|U| = 0,87994; Kolmogorov-Smirnov17 test: D = 0,27059, Z = 0,76384, Præcis prob>|D|= 0,5161).
På grund af de betydelige energiske omkostninger ved at skabe den ustrukturerede udvidelse (~ 80 aminosyrer) er det rimeligt at antage, at dette domæne tjener en cellulær funktion. Imidlertid er en cellulær funktion, der er knyttet til dette domæne, endnu ikke blevet identificeret. Dette domæne er unikt for ZnT1 og findes ikke i andre medlemmer af ZnT-familien. Som sådan kan det skyldes, at ZnT1 i modsætning til andre ZnT'er er placeret ved plasmamembranen, mens bortset fra ZnT10 udtrykkes alle andre medlemmer i interne organeller.
De rå data og efterfølgende grafer vist her er baseret på 5 s intervalmålinger af fluorescensen forårsaget af det zinkfølsomme farvestof. Det betyder, at der på relativt kort tid (minutter) kan genereres en visualisering af tidsafhængig zinktransport med høj tidsmæssig opløsning. Analysen bør omfatte en normalisering af baselineperioden, da farvestoffet lægges i cellerne før zinkbelastning og kan have indledende intracellulær fluorescens forårsaget af en lille mængde frit zink. Derudover bliver zinkfarvestoffet kun fluorescerende aktivt efter spaltning af den intracellulære esterase. Derfor anbefales det at give nogen tid til, at deesterificeringsprocessen forekommer for det meste af farvestoffet for at undgå uregelmæssige fluorescensmønstre forårsaget af farvestofesterspaltning under hele eksperimentet.
Figur 1: Zn2+ ekstruderingsaktiviteter af WT og ΔUSCTD ved hjælp af zinktransportassayet. X-aksen er tiden i sekunder. Y-aksen er fluorescensændringen udtrykt i procent af baseline. Linjegraferne er fluorescensændringen som funktion af tiden. Dataene er gennemsnitlige over >10 ROI'er. Individuelle grafer med standardfejl er vist i supplerende figur 2 og supplerende figur 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Sammenligning af aktiviteterne i ZnT1 WT og ΔUSCTD afbildet som et boksplot. Hvert datapunkt repræsenterer et enkelt eksperiment. Den sorte linje angiver medianscoren. Den hule firkantede boks angiver den gennemsnitlige score. Y-aksen angiver ændringen i baseline-procenten pr. sekund. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: HEK 293T-celler transfekteret med (A) ZnT1 WT eller (B) ZnT1 ΔUSCTD stimuleret i mCherry-excitationen (520 nm) og emissionsbølgelængderne (610 nm). I begge tilfælde er der ekspression og membranlokalisering af ZnT1-varianten. Mikroskopets forstørrelse er 20x. Eksponeringstiden er 100 ms. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: ZnT1 WTZn 2+ transportaktivitet med standardfejlen visualiseret. X-aksen er tiden i sekunder. Y-aksen er den procentvise fluorescensændring fra baseline-fluorescensen. Den sorte linje er den gennemsnitlige fluorescensændring. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: ZnT1 ΔUSCTD Zn2+ transportaktivitet med standardfejlen visualiseret. X-aksen er tiden i sekunder. Y-aksen er den procentvise fluorescensændring fra baseline-fluorescensen. Den røde linje er den gennemsnitlige fluorescensændring. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: pAAV2 plasmidsekvens. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovenfor beskrevne metode muliggør direkte måling af den intracellulære zinkkoncentration med høj tidsopløsning. Sammenlignet med andre metoder kan denne metode, der involverer overvågning af ændringer i intracellulær Zn2+, reducere baggrundsstøj betydeligt. Derudover eliminerer farvestoffets selektivitet for zink potentielle krydsinteraktioner med andre metalkationer18,19. Endelig muliggør dets mangel på øjeblikkelig cytotoksicitet test af levende cellulære processer19.
Denne metode har dog visse begrænsninger. For det første kan detektering af intracellulær dynamik være relativt mere udfordrende med denne protokol, da farvestoffet, der anvendes i denne metode, er designet til at blive fanget i cellen, men ikke kan rettes mod regioner eller specifikke processer. Andre fluorescerende farvestoffer kan rettes mod et bestemt område i cellerne, men har desværre et meget lavere dynamisk område20. For det andet forårsager eksponeringen af farvestoffet for lys et fald i fluorescens på grund af blegning, hvilket begrænser tiden for udsættelse for lys og følgelig det aktive vindue til kørsel af eksperimentet. For det tredje er farvestofbelastningen i denne protokol besværlig og tidskrævende sammenlignet med brug af andre farvestoffer, især genetisk kodede farvestoffer21. Endelig, selv efter spaltning af estere, lækker farvestoffet, hvilket fører til en Zn 2+-uafhængig reduktion i fluorescens22.
Der bør tages flere skridt for at sikre eksperimentets succes. For det første, da transfektion kan være ujævnt fordelt, skal de valgte celler indeholde proteinet af interesse. For at undgå farvestofblegning er det vigtigt at holde de indlæste celler beskyttet mod lys. Når eksperimentet køres, skal perfusionshastigheden være tilstrækkelig til at fuldføre eksperimentet uden at forårsage frigørelse af cellerne fra dæksedlen. I tilfælde af flere kørsler anbefales det at holde de samme reservoirer til Ringers opløsning og Ringers zinkopløsning. Farvestofbelastningstiden og vasketiden kan justeres i henhold til indledende eksperimenter. Zinkbelastning i cellerne via perfusion med pyrithion kan tage fra 1 min til 5 min, som vurderet ved at overvåge Zn2+-induceret fluorescens med tiden.
På trods af disse vanskeligheder giver denne metode os for første gang mulighed for at studere dynamikken i Zn2+ ekstruderingsprocessen. Det forenkler processen og skaber en direkte måde at bedre etablere årsagssammenhænge sammenlignet med de tidligere metoder23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Raz Zarivach er støttet af Israel Science Foundation (bevilling nr. 163/22). Tomer Eli Ben Yosef og Arie Moran er støttet af Israel Science Foundation (bevilling nr. 2047/20). Vi vil gerne takke Daniel Gitler og hans gruppe på Ben-Gurion University for deres samarbejde, støtte og ekspertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Sigma Aldrich | 31665 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d, Findley, S. d Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M.
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
