Summary
Sinktransport har vist seg utfordrende å måle på grunn av de svake årsakssammenhengene til proteinfunksjon og den lave temporale oppløsningen. Denne protokollen beskriver en metode for overvåking, med høy temporal oppløsning, Zn 2+ ekstrudering fra levende celler ved å benytte et Zn 2+ sensitivt fluorescerende fargestoff, og gir dermed et direkte mål på Zn2+ utstrømning.
Abstract
Overgangsmetaller som Zn2+-ioner må reguleres tett på grunn av deres cellulære toksisitet. Tidligere ble aktiviteten til Zn 2+-transportører målt indirekte ved å bestemme ekspresjonsnivået til transportøren under forskjellige konsentrasjoner av Zn2+. Dette ble gjort ved å bruke immunhistokjemi, måle mRNA i vevet, eller bestemme de cellulære Zn2+ nivåene. Med utviklingen av intracellulære Zn 2+-sensorer bestemmes sinktransportørers aktiviteter for tiden primært ved å korrelere endringer i intracellulær Zn 2+, detektert ved hjelp av fluorescerende prober, med uttrykket av Zn2+-transportørene. Men selv i dag er det bare noen få laboratorier som overvåker dynamiske endringer i intracellulær Zn2+ og bruker den til å måle aktiviteten til sinktransportører direkte. En del av problemet er at av de 10 sinktransportørene i ZnT-familien, bortsett fra ZnT10 (transporterer mangan), er bare sinktransportør 1 (ZnT1) lokalisert ved plasmamembranen. Derfor er det vanskelig å knytte transportaktiviteten til endringer i den intracellulære Zn2+-konsentrasjonen. Denne artikkelen beskriver en direkte måte å bestemme sinktransportkinetikken ved hjelp av en analyse basert på et sinkspesifikt fluorescerende fargestoff, FluoZin-3. Dette fargestoffet lastes inn i pattedyrceller i sin esterform og fanges deretter i cytosolen på grunn av cellulær di-esteraseaktivitet. Cellene er lastet med Zn 2+ ved å bruke Zn2+ ionoforpyrition. ZnT1-aktiviteten vurderes ut fra den lineære delen av reduksjonen i fluorescens etter celleutvaskingen. Fluorescensen målt ved en eksitasjon på 470 nm og utslipp på 520 nm er proporsjonal med den frie intracellulære Zn2+. Ved å velge cellene som uttrykker ZnT1 merket med mCherry-fluoroforen, kan du bare overvåke cellene som uttrykker transportøren. Denne analysen brukes til å undersøke bidraget fra forskjellige domener av ZnT1-protein til transportmekanismen til humant ZnT1, et eukaryot transmembranprotein som ekstruderer overflødig sink fra cellen.
Introduction
Sink er et viktig sporelement i det cellulære miljøet. Den inneholder en tredjedel av alle proteiner og er involvert i forskjellige cellulære prosesser, som katalyse1, transkripsjon2 og strukturelle motiver3. Til tross for at de er redoks-inerte, er høye sinkkonsentrasjoner giftige for cellen, og derfor har ingen pattedyrsorganisme overlevd uten tilstedeværelse av mekanismer som regulerer sinkhomeostase. Hos pattedyr er tre mekanismer ansvarlige for denne prosessen: (1) metallothioneiner, som er cytosoliske cysteinrike proteiner som binder sink med høy affinitet, og dermed forhindrer overflødig fri cytosolisk sink4; (2) Zrt / Irt-lignende proteiner (ZIP), som er sinktransportører som er ansvarlige for sinkinnstrømning i cytosolen gjennom plasmamembranen eller fra intracellulære organeller 4,5,6,7,8; og (3) ZnTs, som er en pattedyrundergruppe av den allestedsnærværende kationdiffusjonsfasilitatorfamilien (CDF) og er sinktransportører, da de ekstruderer sink fra cytosolen over plasmamembranen eller inn i de intracellulære organellene 4,5,6,7,8,9. På grunn av sinkens betydning for cellulær metabolisme, er det viktig å forstå cellulær sinkdynamikk.
Tidligere metoder for å vurdere sinkdynamikk var avhengig av å vurdere ekspresjonsnivåene av mRNA under forskjellige sinkforhold ved å korrelere dem med cellulære sinkmålinger av faste vev eller celler10,11,12. Disse metodene inkluderer kjemisk deteksjon og immunhistokjemifarging. Imidlertid gir disse metodene bare indirekte tiltak og bestemmer dermed bare en offline korrelasjon mellom intracellulær sinkkonsentrasjon og ekspresjonen av sinktransportører. Følgelig kan disse metodene ikke utlede noen parametere som krever høy temporal oppløsning.
En mer direkte måling av Zn2+ -transport bruker radioaktive isotoper av sink13. Denne metoden er avhengig av måling av radiomerket Zn2+ for å overvåke sinktransport og kinetikk. På grunn av sinkens betydning for cellulær homeostase regulerer imidlertid flere cellulære prosesser intracellulær sinkkonsentrasjon. Blant disse er ekstracellulær binding og flere transportsystemer som fungerer sammen for å opprettholde tett kontroll over intracellulære Zn2+ nivåer. Kombinasjonen av disse prosessene skaper betydelig bakgrunnsstøy, noe som gjør det vanskelig å teste individuelle sinkrelaterte transportfunksjoner.
Denne artikkelen demonstrerer en metode for direkte overvåking av sinktransporthastigheten ved å måle den intracellulære konsentrasjonen av fritt sink ved bruk av et sinkspesifikt fluorescerende fargestoff, FluoZin-3. Fargestoffet har høy spesifisitet for Zn2+ og liten interferens fra andre divalente kationer, som kalsium. I tillegg, i sin esterform, kommer den inn i cellene ved ikke-ionisk diffusjon og blir deretter fanget på grunn av aktiviteten til intracellulær di-esterase. Dermed er dens fluorescens korrelert primært med den frie cytosoliske sinkkonsentrasjonen. Disse eksperimentene ble utført for å studere struktur-funksjonsforholdet mellom sinktransportør 1 (ZnT1), et medlem av ZnT-familien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell transfeksjon
- Dyrkning HEK293T celler i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% føtal bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 1x penicillin / streptomycin (se materialtabell) i en fuktet inkubator ved 37 ° C / 5% CO2 til sammenløp på en 10 cm plate (8,8 x 106 totale celler).
- Plasser en 13 mm dekkslipp i hver av brønnene på en 12-brønnsplate. Fortynn 0,44 x 106 trypsiniserte celler fra trinn 1,1 i 12 ml komplett DMEM. Bland godt ved å pipettere opp og ned tre til fem ganger. Fyll hver brønn med 1 ml av den blandede oppløsningen. Dyrk i en fuktet inkubator ved 37 °C/5 % CO2 over natten.
- Erstatt hele DMEM i hver brønn med 1 ml serumfri DMEM (se materialfortegnelse) i hver brønn. Sett 12-brønnsplaten tilbake til den fuktede inkubatoren som i trinn 1.1.
- For hver transfeksjonsbrønn fortynnes 1 μg pAAV2-plasmid som inneholder proteinet av interesse merket med mKirsebærfluorescerende protein (tilleggsfil 1) i 100 mikroliter serumfritt DMEM i et 1,5 ml rør.
- Tilsett 3 μg polyetylenimin (PEI, se materialtabell) til 100 mikroliter serumfri DMEM per transfeksjon, med hver transfeksjon i et annet 1,5 ml rør. Plasmid:PEI-forholdet skal være 1:3 (μg:μg).
- Virv begge rørene fra trinn 1.4 og trinn 1.5 i 10 s, og la hvile i romtemperatur i minst 5 minutter.
- Bland en del (100 μL per brønn) av DNA-løsningen fra trinn 1.4 med en del (100 μL per brønn) av PEI-løsningen fra trinn 1.5. Vortex den endelige løsningen i 10 s, og la den hvile i romtemperatur i minst 20 minutter og i opptil 6 timer.
- Ta 12-brønnplaten fra inkubatoren. Vortex den endelige løsningen fra trinn 1.7, og tilsett 200 μL til hver av brønnene i 12-brønnsplaten fra trinn 1.3. Sett 12-brønnsplaten tilbake til den fuktede inkubatoren (trinn 1.1).
- Etter 3 timer, bytt ut mediet i hver brønn med 1 ml komplett DMEM. Sett 12-brønnsplaten tilbake til den fuktede inkubatoren som i trinn 1.1.
- Etter 2 dager, ta den transfekterte cellekulturen fra 37 ° C / 5% CO2 -inkubatoren, og legg den på et omvendt fluorescensmikroskop ved bruk av 10x forstørrelse.
- Bruk mikroskopfokushjulet til å fokusere på cellene mens du bruker lysfelt.
- Bytt til fluorescerende mCherry-eksitasjon (587 nm) og emisjon (610 nm) bølgelengder, og slå av lyspunktlyset. Sjekk for fluorescensen av cellene for å bekrefte uttrykket av ZnT1 mCherry.
- Forbered fargestoffbelastningsløsningen.
- Ta en alikot med 4 μL sinkspesifikt fluorescerende fargestoff (se materialtabellen) i sin acetoksymetyl (AM) esterform, oppløst i DMSO (1 μg / μL), fra et lysbeskyttet lager lagret i en -20 ° C fryser. Dette skjemaet tillater fargestoffet å komme inn i cellen gjennom plasmamembranen ved enkel diffusjon.
- Tilsett 4 μL 10 % pluronsyre (eller 2 μL 20 % pluronsyre, se materialfortegnelse) til alikoten fra trinn 1.13.1. Bland oppløsningen godt ved å pipettere opp og ned tre ganger, og tilsett deretter alle 8 μL til et 1,5 ml rør.
- Tilsett 750 μL Ringers løsning (utarbeidet internt, se materialfortegnelse for sammensetning) supplert med 1 mg/ml (~0,1 %) bovint serumalbumin til røret fra trinn 1.13.2, og virvel kraftig. Tilsett ytterligere 750 μL av samme løsning, og virvel igjen for å sikre maksimal blanding.
- Legg 750 μL av den endelige løsningen fra trinn 1.13.3 til to brønner i en ny 6-brønns kulturplate. Dekk til med aluminiumsfolie.
NOTAT: For å unngå bleking er 6-brønnsplaten alltid dekket med aluminiumsfolie fra dette trinnet. - Bruk en fin pinsett, ta opptil fire replikere deksel fra den transfekterte cellekulturplaten, og plasser dem i den første fylte brønnen (opptil fire lysbilder per brønn) på den nye 6-brønnsplaten fra trinn 1.14. Gjenta denne prosessen for den andre fylte brønnen.
MERK: Alle dekksedler i samme fylte brønn må være av samme tilstand. Imidlertid kan hver brønn inneholde forskjellige forhold. - Dekk til med aluminiumsfolie, og rist forsiktig i 15-20 min.
- Fjern fargestoffbelastningsløsningen, og erstatt den med en ny vaskeløsning av Ringers pluss albumin, som brukt i trinn 1.13.3. Dekk til med aluminiumsfolie. La riste igjen i 20 min. Dette tillater spaltning av AM-esteren av de intracellulære esterasene.
2. Forberedelse av mikroskop
- Ordne de nødvendige verktøyene (se materialfortegnelse) som nevnt: et invertert fluorescensmikroskop som er i stand til å oppdage GFP og mCherry-fluoroforer, et perfusjonssystem som gjør det mulig å bytte mellom minst to løsninger, et sugesystem og et perfusjonskammer.
- Slå på mikroskopet, lyskilden og kameraet. Slå på sugesystemet.
- Vask perfusjonssystemet. Vask det første kammeret med Ringers løsning og det andre kammeret med Ringers oppløsning inneholdende 7 μM sinkoppløsning tilsatt 7 μM pyrition (sinkionofor, se Materialliste). For å unngå luftbobler eller hull, la det være litt væske i hvert kammer.
MERK: Siden begge beholderne er koblet til samme rør som er hektet på perfusjonskammeret, må du alltid sørge for at det delte segmentet vaskes med Ringers løsning. - Lukk kranene, og fyll de aktuelle kamrene med Ringers løsning og Ringers sinkløsning, som i trinn 2.3.
3. Forberedelse av prøver
- Ta perfusjonskammeret, og plasser det med den smale siden av sporet vendt oppover.
MERK: Sporet er et hull i midten av perfusjonskammeret. Det tillater perfusjonsvæsken tilgang til cellene. Den ene siden av sporet er smal, og motsatt side er bred. - Påfør en tetningssilikon (se Materialfortegnelse) rundt sporet. Rengjør eventuell tetningssilikon fra sporet med en pipettespiss.
MERK: Forsikre deg om at det er nok silikonforsegling rundt sporet til å forsegle et 22 mm deksel. - Bruk en fin pinsett, ta en dekkslip fra vaskeoppløsningen, og legg den på toppen av sporet med cellene vendt ned. På denne måten vil cellene bli utsatt for løsningen perfusing sporet under forsøket.
- Plasser en 22 mm dekkslip på toppen av 13 mm dekselet, og stram den med pinsetten. Pass på at du ikke knekker dekslene.
- Vend kammeret, og trykk på det for å frigjøre alle nåværende væsker. Fyll sporet med 100 μL av Ringers vaskeløsning, og trykk igjen for å sikre at det ikke lekker.
MERK: Hvis det oppdages lekkasje, må du påføre et tetningsmiddel på lekkasjestedet og teste på nytt. - Monter perfusjonskammeret på plattformen, og fest det. Plasser perfusjons- og sugerørene for å tillate perfusjon over cellene i sporet.
- Endre perfusjonshastigheten til ca. 2 ml/min, og slå på perfusjonen av Ringetoneroppløsningen. Forsikre deg om at perfusjonssystemet fungerer uten lekkasje eller spillover.
4. Forberedelse av måling
- Åpne bildebehandlingsprogramvaren (se Materialfortegnelse) ved å dobbeltklikke på ikonet. Logg inn med relevant legitimasjon. Velg det tilkoblede kameraet, og trykk på OK.
- Sett mikroskopforstørrelsen til 10x ved hjelp av knappen på venstre side av mikroskopet.
- Når du velger live view og bruker joysticken, flytter du plattformen for å fokusere på cellene i sporet.
- Mens perfusjonen er på, slå av lysene og endre bølgelengden til mCherry ved å trykke på den dedikerte knappen i grensesnittet. Juster fokus ved hjelp av mikroskopets fokushjul.
- Når mikroskopet er fokusert på cellene, flytt plattformen ved hjelp av joysticken for å tillate valg av passende cellepatcher.
MERK: Et egnet område regnes som et område med minst 10 celler for avkastning og et tomt område for bakgrunn. - Velg rullegardinmenyen Slå avkastningen på/av , og velg Tegn sirkulære avkastninger.
- Tegn avkastning på celleklynger med mCherry-uttrykkende celler (indikerer uttrykket av ZnT1).
- Fra samme verktøylinje som trinn 4.6, klikk på knappen Slå bakgrunnsavkastningen på/av, og juster plasseringen og størrelsen på bakgrunnsavkastningen til et område uten celler i det hele tatt.
- Sjekk med mCherry- og EGFP-bølgelengdene for å sikre at ingen celler er i den valgte bakgrunnsavkastningen.
MERK: Bølgelengdene ble justert slik at mCherry brukte en eksitasjonsbølgelengde på 520 nm og en utslippsbølgelengde på 610 nm og EGFP brukte en eksitasjonsbølgelengde på 470 nm og en utslippsbølgelengde på 520 nm.
- Sjekk med mCherry- og EGFP-bølgelengdene for å sikre at ingen celler er i den valgte bakgrunnsavkastningen.
- Velg underkategorien Bølgelengde (λ). Merk av i avmerkingsboksen, og sørg for at GFP-bølgelengden er til stede og avkrysningsruten merket. Hvis ikke, legg til og merk det.
- Velg underfanen Varighet . Definer måleintervallet som hvert 5. sekund, og endre antall intervaller slik at det passer til eksperimentets varighet.
- I Fokus-delen på mikroskoppanelet under okularet, klikk på På-knappen for å aktivere det perfekte fokussystemet (PFS).
- Bruk PFS-fokushjulet til å justere fokus. I programvaregrensesnittet, under ND Acquisition, sørg for at PFS på er krysset av.
- Klikk på Kjør nå.
5. Eksperimentell prosedyre
- Start med en 90 s basisperiodemåling ved hjelp av Ringers løsningsperfusjon.
- Etter at basisperioden er avsluttet, slå av perfusjonen i Ringer-oppløsningen, og slå deretter på perfusjonen i Ringers sinkløsning. Merk av løsningen ved å klikke på det røde flagget nederst til høyre på hovedgrensesnittpanelet. En økning i fluorescens forventes å vises.
- Når fluorescensstigningen begynner å mettes, skift tilbake til perfusjon med Ringers løsning. Slå av perfusjonen i Ringer-sinkløsningen, og slå deretter på perfusjonen i Ringer-løsningen.
- Vent til eksperimenttiden utløper. En merkbar, men jevn reduksjon i fluorescens forventes hvis ZnT1 fungerer som den skal.
6. Eksport av data
- For å eksportere dataene med baseline subtraksjon, trykk på Subtrahere Baseline-knappen , og se endringene i "ND acquisition window".
- Klikk på Eksporter-knappen i programvaregrensesnittet i "ND-anskaffelsesvinduet". Et Excel-dataark åpnes. Lagre på ønsket sted.
7. Dataanalyse
- For hver avkastning, opprett en gjennomsnittlig baseline fluorescens fra de første 90-100 s.
- Uttrykk fluorescensen beregnet for hver avkastning som en prosentandel av bakgrunnen for avkastningen.
- Opprett et radgjennomsnitt av alle avkastningene, og tegn resultatet som et linjediagram. Dette skaper et gjennomsnitt av alle avkastningene som en funksjon av tid.
- Bruk funksjonen for lineær tilpasning til å velge starthastigheten for reduksjonen i fluorescens etter vask med Ringers løsning. Stigningsverdien av ligningen korrelerer med transporthastigheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZnT1 er en pattedyrsinktransportør som ligger på celleplasmamembranen13. Det er medlem av kationdiffusjonsfasilitatoren (CDF) proteinfamilien som ekstruderer sink fra cytosol til ekstracellulær millieu14. ZnT1 har en to-domenearkitektur: transmembrandomenet, som transporterer ionene over membranen, og et C-terminalt domene14. I motsetning til andre kjente CDF-proteiner har ZnT1 et utvidet ustrukturert C-terminalt domene (USCTD). Rollen til USCTD er foreløpig ukjent. Vi brukte protokollen ovenfor for å sammenligne ZnT1 WT med ZnT1 uten USCTD for å vurdere sitt engasjement i sinktransportaktivitet.
HEK 293T-celler ble transfektert med pAAV2-plasmidet inneholdende enten ZnT1 WT eller ZnT1 uten ustrukturert C-terminal (ΔUSCTD) og testet transportaktivitetsraten som beskrevet ovenfor. Tilleggsfigur 1 viser at begge versjoner av ZnT1 uttrykker og lokaliserer til plasmamembranen uten problemer. Figur 1 viser typiske resultater for et eksempel på et slikt eksperiment. En økning i fluorescens er et resultat av en økning i den intracellulære Zn 2+-konsentrasjonen, mens en reduksjon er et resultat av aktiviteten til ZnT1 som transporterer Zn2+ over cellemembranen (individuelle grafer, inkludert standardfeil, finnes i tilleggsfigur 2 og tilleggsfigur 3). Det fremgår av denne figuren at ZnT1 WT har en jevnere fluorescenskurve enn mutanten. Dette er imidlertid ikke en iboende differensierende funksjon, men er relatert til variabilitet i cellulære responser på sinkbelastning, som har blitt observert i tidligere eksperimenter. Figur 2 viser et boksplott som oppsummerer resultatene fra 15-17 slike eksperimenter. Fra figuren er det klart at ΔUSCTD presenterer en bredere spredning av transportrater sammenlignet med WT. Selv om dette kan tilskrives den cellulære responsvariabiliteten som tidligere er nevnt, kan det også indikere en funksjonell forskjell. For eksempel kan det innebære at ZnT1 USCTD-segmentet er en modulator av transporthastigheten. Det er tydelig at det ikke er noen synlig forskjell mellom ekstruderingsaktivitetene til Zn2+ til WT og ΔUSCTD. Basert på den statistiske analysen var dataene ikke normalfordelt (WT-datasett, Shapiro-Wilk test15, statistikk = 0,72404, p-verdi = 0,0004), så to ikke-parametriske prøver ble brukt til sammenligninger mellom datasettene. Resultatene viste at det ikke var statistisk forskjell mellom transportratene (Mann-Whitney16 U-test: U = 132, Z = 0,15105, Asymp. Prob>|U| = 0,87994; Kolmogorov-Smirnov17 test: D = 0,27059, Z = 0,76384, eksakt prob>|D|= 0,5161).
På grunn av den betydelige energiske kostnaden ved å skape den ustrukturerte utvidelsen (~ 80 aminosyrer), er det rimelig å anta at dette domenet tjener en cellulær funksjon. En mobilfunksjon knyttet til dette domenet har imidlertid ikke blitt identifisert så langt. Dette domenet er unikt for ZnT1 og finnes ikke i noen andre medlemmer av ZnT-familien. Som sådan kan det skyldes det faktum at, i motsetning til andre ZnTs, er ZnT1 lokalisert ved plasmamembranen, mens bortsett fra ZnT10, uttrykkes alle andre medlemmer i indre organeller.
Rådataene og påfølgende grafer vist her er basert på 5 s intervallmålinger av fluorescensen forårsaket av det sinkfølsomme fargestoffet. Dette betyr at i løpet av en relativt kort tidsramme (minutter) kan en visualisering av tidsavhengig sinktransport genereres med høy temporal oppløsning. Analysen bør inkludere en normalisering av baselineperioden siden fargestoffet lastes inn i cellene før sinkbelastning og kan ha innledende intracellulær fluorescens forårsaket av en liten mengde fritt sink. I tillegg blir sinkfargen bare fluorescerende aktiv etter spaltning av den intracellulære esterase. Derfor anbefales det å gi litt tid til de-esterifiseringsprosessen oppstår for det meste av fargestoffet for å unngå uregelmessige fluorescensmønstre forårsaket av fargestoffspalting gjennom hele forsøket.
Figur 1: Zn2+ ekstruderingsaktiviteter av WT og ΔUSCTD ved bruk av sinktransportanalysen. X-aksen er tiden i sekunder. Y-aksen er fluorescensendringen uttrykt som en prosentandel av baseline. Linjegrafene er fluorescensendringen som en funksjon av tid. Dataene er i gjennomsnitt over >10 avkastning. Enkeltgrafer med standardfeil er vist i tilleggsfigur 2 og tilleggsfigur 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sammenligning av aktivitetene til ZnT1 WT og ΔUSCTD avbildet som et boksplott. Hvert datapunkt representerer ett enkelt eksperiment. Den svarte linjen angir medianskåren. Den hule firkantede boksen indikerer gjennomsnittlig poengsum. Y-aksen angir endringen i grunnlinjeprosent per sekund. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: HEK 293T-celler transfeksjonert med (A) ZnT1 WT eller (B) ZnT1 ΔUSCTD stimulert i mKirsebæreksitasjon (520 nm) og emisjon (610 nm) bølgelengder. I begge tilfeller er det ekspresjon og membranlokalisering av ZnT1-varianten. Mikroskopforstørrelsen er 20x. Eksponeringstiden er 100 ms. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: ZnT1 WT Zn2+ transporteringsaktivitet med standardfeilen visualisert. X-aksen er tiden i sekunder. Y-aksen er den prosentvise fluorescensendringen fra baseline fluorescens. Den svarte linjen er den gjennomsnittlige fluorescensendringen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: ZnT1 ΔUSCTD Zn2+ transporteringsaktivitet med standardfeilen visualisert. X-aksen er tiden i sekunder. Y-aksen er den prosentvise fluorescensendringen fra baseline fluorescens. Den røde linjen er den gjennomsnittlige fluorescensendringen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: pAAV2 plasmidsekvens. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovenfor beskrevne metoden tillater direkte måling av den intracellulære sinkkonsentrasjonen med høy temporal oppløsning. Sammenlignet med andre metoder, kan denne metoden som involverer overvåking av endringer i intracellulær Zn2+ redusere bakgrunnsstøy betydelig. I tillegg eliminerer fargestoffets selektivitet for sink potensielle kryssinteraksjoner med andre metallkationer18,19. Endelig muliggjør mangelen på umiddelbar cytotoksisitet testing av levende cellulære prosesser19.
Denne metoden har imidlertid visse begrensninger. For det første kan detektering av intracellulær dynamikk være relativt mer utfordrende med denne protokollen, siden fargestoffet som brukes i denne metoden er designet for å bli fanget i cellen, men kan ikke rettes til regioner eller spesifikke prosesser. Andre fluorescerende fargestoffer kan rettes mot et bestemt område i cellene, men har dessverre et mye lavere dynamisk område20. For det andre forårsaker fargestoffets eksponering for lys en reduksjon i fluorescens på grunn av bleking, noe som begrenser eksponeringstiden for lys og følgelig det aktive vinduet for å kjøre eksperimentet. For det tredje er fargestoffbelastningen i denne protokollen tungvint og tidkrevende sammenlignet med bruk av andre fargestoffer, spesielt genetisk kodede fargestoffer21. Til slutt, selv etter å ha spaltet estere, lekker fargestoffet, noe som fører til en Zn 2+-uavhengig reduksjon i fluorescens22.
Flere skritt bør tas for å sikre eksperimentets suksess. For det første, siden transfeksjon kan være ulikt fordelt, bør de valgte cellene inneholde proteinet av interesse. For å unngå fargebleking er det viktig å holde de lastede cellene beskyttet mot lys. Når forsøket kjøres, bør perfusjonshastigheten være tilstrekkelig til å fullføre forsøket uten å forårsake løsrivelse av cellene fra dekselet. Ved flere kjøringer anbefales det å beholde de samme reservoarene for Ringers løsning og Ringers sinkløsning. Fargestoffets lastetid og vasketid kan justeres i henhold til innledende eksperimenter. Sinkbelastning inn i cellene via perfusjon med pyrition kan ta fra 1 min til 5 min, vurdert ved å overvåke Zn2+-indusert fluorescens med tiden.
Til tross for disse vanskelighetene tillater denne metoden oss for første gang å studere dynamikken i Zn2+ ekstruderingsprosessen. Det forenkler prosessen og skaper en direkte måte å bedre etablere årsakssammenhenger sammenlignet med de tidligere metodene23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Raz Zarivach er støttet av Israel Science Foundation (grant no. 163/22). Tomer Eli Ben Yosef og Arie Moran er støttet av Israel Science Foundation (stipend nr. 2047/20). Vi vil gjerne takke Daniel Gitler og hans gruppe ved Ben-Gurion University for deres samarbeid, støtte og ekspertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Sigma Aldrich | 31665 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d, Findley, S. d Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M.
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
