Summary
Транспорт цинка оказалось сложно измерить из-за слабых причинно-следственных связей с функцией белка и низкого временного разрешения. В этом протоколе описывается метод мониторинга с высоким временным разрешением экструзии Zn 2+ из живых клеток с использованием чувствительного флуоресцентного красителя Zn 2+, что обеспечивает прямое измерение оттока Zn2+.
Abstract
Переходные металлы, такие как ионы Zn2+, должны жестко регулироваться из-за их клеточной токсичности. Ранее активность транспортеров Zn 2+ измерялась косвенно путем определения уровня экспрессии транспортера при различных концентрациях Zn2+. Это было сделано с помощью иммуногистохимии, измерения мРНК в ткани или определения клеточного уровня Zn2+. С развитием внутриклеточных сенсоров Zn 2+ активность транспортеров цинка в настоящее время в основном определяется путем корреляции изменений внутриклеточного Zn 2+, обнаруженных с помощью флуоресцентных зондов, с экспрессией транспортеров Zn2+. Тем не менее, даже сегодня лишь немногие лаборатории отслеживают динамические изменения внутриклеточного Zn2+ и используют его для измерения активности переносчиков цинка. Частично проблема заключается в том, что из 10 переносчиков цинка семейства ZnT, за исключением ZnT10 (переносит марганец), только транспортер цинка 1 (ZnT1) локализован на плазматической мембране. Поэтому связать транспортную активность с изменениями внутриклеточной концентрации Zn2+ сложно. В данной статье описан прямой способ определения кинетики переноса цинка с помощью анализа на основе цинк-специфического флуоресцентного красителя FluoZin-3. Этот краситель загружается в клетки млекопитающих в эфирной форме, а затем захватывается в цитозоле из-за клеточной активности диэстеразы. Клетки загружаются Zn 2+ с помощью пиритиона ионофора Zn2+. Активность ZnT1 оценивают по линейной части снижения флуоресценции после вымывания клеток. Флуоресценция, измеренная при возбуждении 470 нм и излучении 520 нм, пропорциональна свободному внутриклеточному Zn2+. Выбор клеток, экспрессирующих ZnT1, помеченных флуорофором mCherry, позволяет контролировать только клетки, экспрессирующие транспортер. Этот анализ используется для изучения вклада различных доменов белка ZnT1 в транспортный механизм человеческого ZnT1, эукариотического трансмембранного белка, который выдавливает избыток цинка из клетки.
Introduction
Цинк является важным микроэлементом в клеточной среде. Он включает в себя одну треть всех белков и участвует в различных клеточных процессах, таких как катализ1, транскрипция2 и структурные мотивы3. Однако, несмотря на окислительно-восстановительную инертность, высокие концентрации цинка токсичны для клетки, поэтому ни один организм млекопитающих не выжил без наличия механизмов, регулирующих гомеостаз цинка. У млекопитающих за этот процесс ответственны три механизма: (1) металлотионеины, которые представляют собой цитозольные белки, богатые цистеином, которые связывают цинк с высоким сродством, тем самым предотвращая избыток свободного цитозольного цинка4; (2) Zrt/Irt-подобные белки (ZIP), которые являются транспортерами цинка, ответственными за приток цинка в цитозоль через плазматическую мембрану или из внутриклеточных органелл 4,5,6,7,8; и (3) ZnT, которые являются подмножеством млекопитающих семейства фасилитаторов диффузии катионов (CDF) и являются переносчиками цинка, поскольку они выдавливают цинк из цитозоля через плазматическую мембрану или во внутриклеточные органеллы 4,5,6,7,8,9. Из-за важности цинка для клеточного метаболизма жизненно важно понимать клеточную динамику цинка.
Предыдущие методы оценки динамики цинка основывались на оценке уровней экспрессии мРНК в различных условиях цинка путем корреляции их с клеточными измерениями цинка в фиксированных тканях или клетках10,11,12. Эти методы включают химическое обнаружение и иммуногистохимическое окрашивание. Однако эти методы дают лишь косвенные измерения и, таким образом, определяют только оффлайн корреляцию между внутриклеточной концентрацией цинка и экспрессией переносчиков цинка. Следовательно, эти методы не могут вывести какие-либо параметры, требующие высокого временного разрешения.
Для более прямого измерения переноса Zn2+ используются радиоактивные изотопыцинка-13. Этот метод основан на измерении радиоактивно меченного Zn2+ для мониторинга переноса цинка и его кинетики. Однако из-за важности цинка для клеточного гомеостаза множественные клеточные процессы регулируют внутриклеточную концентрацию цинка. Среди них внеклеточное связывание и несколько транспортных систем, которые работают вместе, чтобы поддерживать жесткий контроль внутриклеточных уровней Zn2+ . Сочетание этих процессов создает значительный фоновый шум, что затрудняет тестирование отдельных транспортных функций, связанных с цинком.
В данной статье демонстрируется метод прямого контроля скорости переноса цинка путем измерения внутриклеточной концентрации свободного цинка с использованием цинк-специфического флуоресцентного красителя FluoZin-3. Краситель обладает высокой специфичностью к Zn2+ и незначительным вмешательством со стороны других двухвалентных катионов, таких как кальций. Кроме того, в эфирной форме он проникает в клетки путем неионогенной диффузии, а затем улавливается за счет активности внутриклеточной диэстеразы. Таким образом, его флуоресценция коррелирует в первую очередь с концентрацией свободного цитозольного цинка. Эти эксперименты были проведены для изучения структурно-функциональной взаимосвязи переносчика цинка 1 (ZnT1), члена семейства ZnT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Трансфекция клеток
- Культивирование клеток HEK293T в модифицированной среде Eagle (DMEM) компании Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глютамина и 1x пенициллина/стрептомицина (см. таблицу материалов) во увлажненном инкубаторе при 37 °C/5% CO2 до слияния на 10-сантиметровой пластине (всего 8,8 x 106 клеток).
- Поместите по одному 13-миллиметровому покровному стеклу в каждое из лунок 12-луночной пластины. Развести 0,44 x 106 трипсинизированных клеток из стадии 1,1 в 12 мл полного DMEM. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз три-пять раз. Наполните каждую лунку 1 мл смешанного раствора. Выращивать в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C/5%CO2 в течение ночи.
- Замените полный DMEM в каждой лунке на 1 мл DMEM без сыворотки (см. Таблицу материалов) в каждой лунке. Верните 12-луночную пластину в увлажненный инкубатор, как показано на шаге 1.1.
- Для каждой лунки для трансфекции разводят 1 мкг плазмиды pAAV2, содержащей интересующий белок, помеченный флуоресцентным белком mCherry (Дополнительный файл 1), в 100 мкл безсывороточного DMEM в пробирке объемом 1,5 мл.
- Добавьте 3 мкг полиэтиленимина (PEI, см. таблицу материалов) к 100 мкл безсывороточного DMEM на трансфекцию, при этом каждая трансфекция помещается в отдельную пробирку объемом 1,5 мл. Соотношение плазмида и ПЭИ должно составлять 1:3 (мкг:мкг).
- Встряхните обе пробирки из шагов 1,4 и 1,5 в течение 10 с и оставьте отдыхать при комнатной температуре не менее 5 минут.
- Смешайте одну часть (100 мкл на лунку) раствора ДНК из стадии 1.4 с одной частью (100 мкл на лунку) раствора PEI из стадии 1.5. Готовый раствор перемешайте в течение 10 с и оставьте его отдыхать при комнатной температуре не менее чем на 20 мин и на срок до 6 ч.
- Возьмите 12-луночную тарелку из инкубатора. Встряхните окончательный раствор из шага 1.7 и добавьте по 200 мкл в каждую из лунок в 12-луночной планшете из шага 1.3. Верните 12-луночную пластину в увлажненный инкубатор (шаг 1.1).
- Через 3 ч замените среду в каждой лунке на 1 мл полного DMEM. Верните 12-луночную пластину в увлажненный инкубатор, как показано на шаге 1.1.
- Через 2 дня возьмите трансфицированную клеточную культуру из инкубатора 37 °C/5% CO2 и поместите ее на инвертированный флуоресцентный микроскоп с 10-кратным увеличением.
- Используя колесо фокусировки микроскопа, сфокусируйтесь на клетках, используя яркопольный свет.
- Переключитесь на длины волн возбуждения флуоресцентного mCherry (587 нм) и излучения (610 нм) и выключите свет в светлом поле. Проверьте флуоресценцию клеток, чтобы подтвердить экспрессию ZnT1 mCherry.
- Приготовьте загрузочный раствор красителя.
- Возьмите аликвоту 4 мкл цинк-специфического флуоресцентного красителя (см. таблицу материалов) в форме сложного эфира ацетоксиметилового (АМ), растворенного в ДМСО (1 мкг/мкл), из защищенного от света запаса, хранящегося в морозильной камере при температуре −20 °C. Такая форма позволяет красителю проникать в клетку через плазматическую мембрану путем простой диффузии.
- Добавьте 4 мкл 10% плуроновой кислоты (или 2 мкл 20% плуроновой кислоты, см. таблицу материалов) к аликвоте из шага 1.13.1. Хорошо перемешайте раствор, пипетируя вверх и вниз три раза, а затем добавьте все 8 мкл в пробирку объемом 1,5 мл.
- Добавьте в пробирку 750 мкл раствора Рингера (приготовленного на месте, см. Таблицу материалов для ознакомления с составом) с добавлением 1 мг/мл (~0,1%) бычьего сывороточного альбумина в пробирку, начиная со стадии 1.13.2, и энергично встряхивайте. Добавьте еще 750 мкл того же раствора и снова перемешайте, чтобы обеспечить максимальное перемешивание.
- Добавьте 750 мкл готового раствора, начиная со стадии 1.13.3, в две лунки в новой 6-луночной планшете для культивирования. Накройте алюминиевой фольгой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать отбеливания, 6-луночная пластина всегда покрывается алюминиевой фольгой. - С помощью тонкого пинцета возьмите до четырех реплицированных покровных стекол из трансфицированной планшета клеточной культуры и поместите их в первую заполненную лунку (до четырех предметных стекол на лунку) новой 6-луночной планшета, начиная с шага 1.14. Повторите этот процесс для второй заполненной лунки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все покровные стекла в одном и том же заполненном колодце должны быть из одного и того же состояния. Однако каждая скважина может содержать разные условия. - Накройте алюминиевой фольгой и аккуратно встряхивайте в течение 15-20 минут.
- Извлеките раствор для загрузки красителя и замените его новым моющим раствором Ringer's plus albumin, как это было использовано на шаге 1.13.3. Накройте алюминиевой фольгой. Снова встряхните на 20 минут. Это позволяет расщеплять эфир АМ внутриклеточными эстеразами.
2. Подготовка микроскопа
- Расставьте необходимые инструменты (см. таблицу материалов), как уже упоминалось: инвертированный флуоресцентный микроскоп, способный обнаруживать флуорофоры GFP и mCherry, перфузионную систему, позволяющую переключаться как минимум между двумя растворами, систему аспирации и перфузионную камеру.
- Включите микроскоп, его источник света и камеру. Включите систему всасывания.
- Промойте перфузионную систему. Первую камеру промывают раствором Рингера, а вторую камеру раствором Рингера, содержащим 7 мкМ раствора цинка с добавлением 7 мкМ пиритиона (ионофор цинка, см. таблицу материалов). Чтобы избежать пузырьков воздуха или зазоров, оставьте немного жидкости в каждой камере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку оба контейнера подключены к одной и той же трубке, подключенной к перфузионной камере, всегда следите за тем, чтобы общий сегмент промывался раствором Рингера. - Закройте краны и заполните соответствующие камеры раствором Рингера и раствором цинка Рингера, как показано на шаге 2.3.
3. Пробоподготовка
- Возьмите перфузионную камеру и поместите ее узкой стороной канавки вверх.
ПРИМЕЧАНИЕ: Канавка представляет собой отверстие в середине перфузионной камеры. Он обеспечивает доступ перфузионной жидкости к клеткам. Одна сторона канавки узкая, а противоположная – широкая. - Нанесите уплотнительный силикон (см. Таблицу материалов) вокруг канавки. Очистите канавку уплотнительным силиконом с помощью наконечника пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вокруг канавки достаточно силиконового уплотнения для герметизации 22-миллиметрового покровного стекла. - С помощью тонкого пинцета возьмите покровный листок от моющего раствора и положите его поверх канавки ячейками вниз. Таким образом, клетки будут подвергаться воздействию раствора, перфузирующего канавку во время эксперимента.
- Поместите 22-миллиметровый покровный щиток поверх 13-миллиметрового покровного стекла и затяните его с помощью пинцета. Следите за тем, чтобы не растрескать покровные стекла.
- Переверните камеру и нажмите на нее, чтобы выпустить все присутствующие жидкости. Заполните канавку 100 мкл моющего раствора Ringer и снова прижмите, чтобы убедиться в отсутствии утечки.
ПРИМЕЧАНИЕ: При обнаружении утечки нанесите герметизирующее средство на место утечки и повторите тестирование. - Установите перфузионную камеру на платформу и закрепите ее. Поместите перфузионную и аспирационную трубки так, чтобы обеспечить перфузию над клетками в канавке.
- Измените скорость перфузии примерно на 2 мл/мин и включите перфузию раствора Рингера. Убедитесь, что перфузионная система работает без утечек или перетеканий.
4. Подготовка к измерениям
- Откройте программное обеспечение для работы с изображениями (см. Таблицу материалов), дважды щелкнув по значку. Войдите в систему, используя соответствующие учетные данные. Выберите подключенную камеру и нажмите кнопку ОК.
- Установите увеличение микроскопа на 10x с помощью кнопки с левой стороны микроскопа.
- Выбрав просмотр в реальном времени и используя джойстик, переместите платформу, чтобы сфокусироваться на ячейках в канавке.
- Пока перфузия включена, выключите свет и измените длину волны на mCherry, нажав специальную кнопку в интерфейсе. Отрегулируйте фокусировку с помощью колеса фокусировки микроскопа.
- После того, как микроскоп будет сфокусирован на клетках, переместите платформу с помощью джойстика, чтобы выбрать соответствующие участки клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящей областью считается область с не менее чем 10 ячейками для ROI и пустой областью для фона. - Выберите ниспадающее меню Включить или выключить рентабельность инвестиций и выберите Нарисовать циклические ROI.
- Нарисуйте ROI клеточных кластеров с клетками, экспрессирующими mCherry (указывает на экспрессию ZnT1).
- На той же панели инструментов, что и на шаге 4.6, нажмите кнопку Включить/выключить фоновую рентабельность инвестиций и настройте местоположение и размер фоновой рентабельности инвестиций в соответствии с областью, в которой вообще нет ячеек.
- Проверьте длины волн mCherry и EGFP, чтобы убедиться, что ни одна ячейка не находится в выбранном фоновом ROI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длины волн были скорректированы таким образом, что mCherry использовал длину волны возбуждения 520 нм и длину волны излучения 610 нм, а EGFP использовал длину волны возбуждения 470 нм и длину волны излучения 520 нм.
- Проверьте длины волн mCherry и EGFP, чтобы убедиться, что ни одна ячейка не находится в выбранном фоновом ROI.
- Выберите вложенную вкладку Длина волны (λ). Отметьте этот флажок и убедитесь, что длина волны GFP присутствует, а флажок отмечен. Если нет, добавьте и отметьте его.
- Выберите вложенную вкладку Длительность . Определите интервал измерения каждые 5 секунд и измените количество интервалов в соответствии с продолжительностью эксперимента.
- В разделе «Фокусировка» на панели микроскопа под окуляром нажмите кнопку «Вкл.», чтобы включить систему идеальной фокусировки (PFS).
- С помощью колеса фокусировки PFS отрегулируйте фокусировку. В программном интерфейсе в разделе ND Acquisition убедитесь, что установлен флажок PFS on .
- Нажмите «Выполнить сейчас».
5. Методика проведения эксперимента
- Начните с измерения базового периода 90 с с использованием перфузии раствора Рингера.
- После окончания базового периода отключите перфузию раствора Рингера, а затем включите перфузию раствором цинка Рингера. Отметьте переключение решения, нажав на красный флажок в правом нижнем углу главной панели интерфейса. Ожидается рост флуоресценции.
- Как только повышение флуоресценции начнет насыщаться, перейдите обратно к перфузии раствором Рингера. Отключите перфузию раствора цинка Ringer, а затем включите перфузию раствора Ringer.
- Подождите, пока не истечет время эксперимента. Заметное, но устойчивое снижение флуоресценции ожидается, если ZnT1 работает должным образом.
6. Экспорт данных
- Чтобы экспортировать данные с вычитанием базовой линии, нажмите кнопку Вычесть базовую линию и просмотрите изменения в «Окне сбора ND».
- Нажмите на кнопку «Экспорт» в интерфейсе программы в « Окне сбора ND». Откроется таблица Excel. Сохраните в нужном месте.
7. Анализ данных
- Для каждого ROI создайте среднюю базовую флуоресценцию за первые 90–100 секунд.
- Выразите флуоресценцию, рассчитанную для каждого ROI, в процентах от фона для этой ROI.
- Создайте среднее арифметическое по всем ROI и постройте результат в виде линейного графика. При этом создается среднее значение всех ROI в зависимости от времени.
- Используя функцию линейной аппроксимации, выберите начальную скорость снижения флуоресценции после промывки раствором Рингера. Величина уклона уравнения коррелирует со скоростью транспортировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZnT1 представляет собой транспортер цинка млекопитающих, расположенный на плазматической мембранеклетки 13. Он является членом семейства белков фасилитатора катионной диффузии (CDF), который выдавливает цинк из цитозоля во внеклеточный миллиу14. ZnT1 имеет двухдоменную архитектуру: трансмембранный домен, который транспортирует ионы через мембрану, и С-концевой домен14. В отличие от других известных белков CDF, ZnT1 имеет расширенный неструктурированный С-концевой домен (USCTD). Роль USCTD в настоящее время неизвестна. Мы использовали приведенный выше протокол для сравнения ZnT1 WT с ZnT1 без USCTD, чтобы оценить его участие в транспортной активности цинка.
Клетки HEK 293T трансфицировали плазмидой pAAV2, содержащей ZnT1 WT или ZnT1 без неструктурированного С-терминала (ΔUSCTD), и проверяли скорость транспортной активности, как описано выше. На дополнительном рисунке 1 показано, что обе версии ZnT1 экспрессируются и локализуются на плазматической мембране без каких-либо проблем. На рисунке 1 показаны типичные результаты для примера такого эксперимента. Увеличение флуоресценции является результатом увеличения внутриклеточной концентрации Zn 2+, в то время как снижение является результатом активности ZnT1, транспортирующего Zn2+ через клеточную мембрану (отдельные графики, включая стандартные ошибки, можно найти на дополнительном рисунке 2 и дополнительном рисунке 3). Из этого рисунка видно, что ZnT1 WT имеет более гладкую кривую флуоресценции, чем мутант. Однако это не является врожденной дифференцирующей особенностью, а связано с вариабельностью клеточных реакций на нагрузку цинком, которая наблюдалась в предыдущих экспериментах. На рисунке 2 показана ящичковая диаграмма, обобщающая результаты 15-17 таких экспериментов. Из рисунка видно, что ΔUSCTD представляет собой более широкий разброс транспортных тарифов по сравнению с WT. Хотя это может быть связано с вариабельностью клеточного ответа, упомянутой ранее, это также может указывать на функциональное различие. Например, это может означать, что сегмент ZnT1 USCTD является модулятором скорости переноса. Очевидно, что нет видимой разницы между экструзионной активностью Zn2+ WT и ΔUSCTD. На основании статистического анализа данные не были нормально распределены (набор данных WT, критерий Шапиро-Уилка15, статистика = 0,72404, значение p = 0,0004), поэтому для сравнения наборов данных использовались два выборочных непараметрических теста. Результаты показали, что статистической разницы между скоростями переноса не было (критерий Манна-Уитни16 U: U = 132, Z = 0,15105, Asymp. Вероятно>|U| = 0,87994; Критерий Колмогорова-Смирнова17: D = 0.27059, Z = 0.76384, точная вероятность>|D|= 0,5161).
Из-за значительных энергетических затрат на создание неструктурированного расширения (~80 аминокислот) разумно предположить, что этот домен выполняет клеточную функцию. Однако клеточная функция, связанная с этим доменом, до сих пор не была идентифицирована. Этот домен уникален для ZnT1 и не встречается ни у одного другого представителя семейства ZnT. Таким образом, это может быть связано с тем, что, в отличие от других ZnT, ZnT1 расположен на плазматической мембране, в то время как все остальные члены, кроме ZnT10, экспрессируются во внутренних органеллах.
Исходные данные и последующие графики, показанные здесь, основаны на 5-секундных измерениях флуоресценции, вызванной чувствительным к цинку красителем. Это означает, что за относительно короткий промежуток времени (минуты) можно получить визуализацию нестационарного переноса цинка с высоким временным разрешением. Анализ должен включать нормализацию исходного периода, поскольку краситель загружается в клетки до загрузки цинком и может иметь начальную внутриклеточную флуоресценцию, вызванную небольшим количеством свободного цинка. Кроме того, цинковый краситель становится флуоресцентно активным только после расщепления внутриклеточной эстеразой. Поэтому рекомендуется подождать некоторое время для процесса деэтерификации для большей части красителя, чтобы избежать нерегулярных паттернов флуоресценции, вызванных расщеплением эфира красителя на протяжении всего эксперимента.
Рисунок 1: Экструзионная активность Zn2+ WT и ΔUSCTD с использованием анализа переноса цинка. Ось X — это время в секундах. Ось Y — это изменение флуоресценции, выраженное в процентах от базовой линии. Линейные графики показывают изменение флуоресценции в зависимости от времени. Данные усредняются по >10 ROI. Отдельные графики со стандартной ошибкой показаны на дополнительном рисунке 2 и дополнительном рисунке 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сравнение активности ZnT1 WT и ΔUSCTD, изображенного в виде ящичковой диаграммы. Каждая точка данных представляет один эксперимент. Черной линией обозначен средний балл. Полая квадратная рамка показывает среднюю оценку. Ось Y показывает изменение базовой линии в процентах в секунду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Клетки HEK 293T, трансфицированные (A) ZnT1 WT или (B) ZnT1 ΔUSCTD, стимулированные в волнах возбуждения mCherry (520 нм) и эмиссии (610 нм). В обоих случаях наблюдается экспрессия и мембранная локализация варианта ZnT1. Увеличение микроскопа составляет 20 крат. Время экспозиции составляет 100 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Транспортная активность ZnT1 WT Zn2+ с визуализированной стандартной ошибкой. Ось X — это время в секундах. Ось Y представляет собой процентное изменение флуоресценции по сравнению с исходной флуоресценцией. Черная линия – это среднее изменение флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Транспортная активность ZnT1 ΔUSCTD Zn2+ с визуализированной стандартной ошибкой. Ось X — это время в секундах. Ось Y представляет собой процентное изменение флуоресценции по сравнению с исходной флуоресценцией. Красная линия – это среднее изменение флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 1: плазмидная последовательность pAAV2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный выше метод позволяет проводить прямое измерение внутриклеточной концентрации цинка с высоким временным разрешением. По сравнению с другими методами, этот метод, включающий мониторинг изменений внутриклеточного уровня Zn2+, может существенно снизить фоновый шум. Кроме того, селективность красителя по цинку исключает потенциальные перекрестные взаимодействия с другими катионами металлов18,19. Наконец, отсутствие у него немедленной цитотоксичности позволяет тестировать живые клеточные процессы19.
Однако этот метод имеет определенные ограничения. Во-первых, обнаружение внутриклеточной динамики может быть относительно сложной задачей с помощью этого протокола, поскольку краситель, используемый в этом методе, предназначен для захвата в клетке, но не может быть направлен на определенные области или процессы. Другие флуоресцентные красители могут быть направлены на определенную область в клетках, но, к сожалению, имеют гораздо меньший динамический диапазон20. Во-вторых, воздействие света на краситель вызывает снижение флуоресценции из-за обесцвечивания, что ограничивает время воздействия света и, следовательно, активное окно для проведения эксперимента. В-третьих, загрузка красителя в этом протоколе является громоздкой и трудоемкой по сравнению с использованием других красителей, особенно генетически кодируемых красителей21. Наконец, даже после расщепления сложных эфиров краситель вытекает, что приводит к Zn 2+-независимому снижению флуоресценции22.
Для успешного проведения эксперимента необходимо предпринять несколько шагов. Во-первых, поскольку трансфекция может быть распределена неравномерно, выбранные клетки должны содержать интересующий нас белок. Чтобы избежать обесцвечивания красителя, важно защищать загруженные клетки от света. При проведении эксперимента скорость перфузии должна быть достаточной для завершения эксперимента, не вызывая отслоения клеток от покровного стекла. В случае нескольких прогонов рекомендуется использовать одни и те же резервуары для раствора Рингера и цинкового раствора Рингера. Время загрузки красителя и время стирки могут быть скорректированы в соответствии с первоначальными экспериментами. Загрузка цинка в клетки через перфузию пиритионом может занимать от 1 до 5 минут, что оценивается путем мониторинга Zn2+-индуцированной флуоресценции с течением времени.
Несмотря на эти трудности, данный метод позволяет впервые изучить динамику процесса экструзии Zn2+. Это упрощает процесс и создает прямой путь к лучшему установлению причинно-следственных связей по сравнению с предыдущими методами23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Raz Zarivach поддерживается Израильским научным фондом (грант No 163/22). Томер Эли Бен Йосеф и Ари Моран получают поддержку Израильского научного фонда (грант No 2047/20). Мы хотели бы поблагодарить Даниэля Гитлера и его группу в Университете Бен-Гуриона за сотрудничество, поддержку и экспертизу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Sigma Aldrich | 31665 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d, Findley, S. d Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M.
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
