Summary
El transporte de zinc ha demostrado ser difícil de medir debido a los débiles vínculos causales con la función de las proteínas y la baja resolución temporal. Este protocolo describe un método para monitorear, con alta resolución temporal, la extrusión de Zn 2+ de células vivas mediante la utilización de un colorante fluorescente sensible al Zn 2+, proporcionando así una medida directa del flujo de Zn2+.
Abstract
Los metales de transición, como los iones Zn2+, deben estar estrictamente regulados debido a su toxicidad celular. Anteriormente, la actividad de los transportadores de Zn 2+ se medía indirectamente determinando el nivel de expresión del transportador bajo diferentes concentraciones de Zn2+. Esto se hizo mediante la utilización de inmunohistoquímica, la medición del ARNm en el tejido o la determinación de los niveles celulares de Zn2+. Con el desarrollo de sensores intracelulares de Zn 2+, las actividades de los transportadores de zinc están actualmente determinadas principalmente por la correlación de los cambios en el Zn 2+ intracelular, detectados mediante sondas fluorescentes, con la expresión de los transportadores de Zn2+. Sin embargo, incluso hoy en día, solo unos pocos laboratorios monitorean los cambios dinámicos en el Zn2+ intracelular y lo utilizan para medir directamente la actividad de los transportadores de zinc. Parte del problema es que de los 10 transportadores de zinc de la familia ZnT, a excepción del ZnT10 (transporta manganeso), solo el transportador de zinc 1 (ZnT1) se localiza en la membrana plasmática. Por lo tanto, es difícil vincular la actividad de transporte a los cambios en la concentración intracelular de Zn2+. Este artículo describe una forma directa de determinar la cinética de transporte de zinc utilizando un ensayo basado en un colorante fluorescente específico de zinc, FluoZin-3. Este colorante se carga en las células de mamíferos en su forma de éster y luego queda atrapado en el citosol debido a la actividad de la diesterasa celular. Las células se cargan con Zn 2+ utilizando el ionóforo Zn2+ piritiona. La actividad de ZnT1 se evalúa a partir de la parte lineal de la reducción de la fluorescencia después del lavado celular. La fluorescencia medida a una excitación de 470 nm y una emisión de 520 nm es proporcional al Zn2+ intracelular libre. La selección de las células que expresan ZnT1 marcadas con el fluoróforo mCherry permite monitorizar solo las células que expresan el transportador. Este ensayo se utiliza para investigar la contribución de diferentes dominios de la proteína ZnT1 al mecanismo de transporte de ZnT1 humano, una proteína transmembrana eucariota que extruye el exceso de zinc de la célula.
Introduction
El zinc es un oligoelemento esencial en el medio celular. Incorpora un tercio de todas las proteínas y participa en diversos procesos celulares, como la catálisis1, la transcripción2 y los motivos estructurales3. Sin embargo, a pesar de ser redox-inerte, las altas concentraciones de zinc son tóxicas para la célula, por lo que ningún organismo mamífero ha sobrevivido sin la presencia de mecanismos que regulen la homeostasis del zinc. En los mamíferos, tres mecanismos son responsables de este proceso: (1) metalotioneínas, que son proteínas citosólicas ricas en cisteína que se unen al zinc con una alta afinidad, evitando así el exceso de zinc citosólico libre4; (2) proteínas similares a Zrt/Irt (ZIP), que son transportadores de zinc responsables de la entrada de zinc en el citosol a través de la membrana plasmática o de orgánulos intracelulares 4,5,6,7,8; y (3) ZnTs, que son un subconjunto de mamíferos de la familia de facilitadores de difusión catiónica ubicua (CDF) y son transportadores de zinc, ya que extruyen zinc desde el citosol a través de la membrana plasmática o hacia los orgánulos intracelulares 4,5,6,7,8,9. Debido a la importancia del zinc para el metabolismo celular, es vital comprender la dinámica celular del zinc.
Los métodos anteriores para evaluar la dinámica del zinc dependían de la evaluación de los niveles de expresión de ARNm en diferentes condiciones de zinc correlacionándolos con las mediciones de zinc celular de tejidos o células fijas10,11,12. Estos métodos incluyen la detección química y la tinción inmunohistoquímica. Sin embargo, estos métodos solo producen medidas indirectas y, por lo tanto, solo determinan una correlación fuera de línea entre la concentración intracelular de zinc y la expresión de los transportadores de zinc. En consecuencia, estos métodos no pueden inferir ningún parámetro que requiera una alta resolución temporal.
Una medición más directa del transporte de Zn2+ utiliza isótopos radiactivos de zinc13. Este método se basa en la medición de Zn2+ radiomarcado para monitorear el transporte de zinc y su cinética. Sin embargo, debido a la importancia del zinc para la homeostasis celular, múltiples procesos celulares regulan la concentración intracelular de zinc. Entre ellos se encuentran la unión extracelular y varios sistemas de transporte que trabajan en conjunto para mantener un control estricto de los niveles intracelulares de Zn2+ . La combinación de estos procesos crea un ruido de fondo considerable, lo que dificulta la comprobación de las funciones de transporte individuales relacionadas con el zinc.
Este artículo demuestra un método para monitorear directamente la tasa de transporte de zinc mediante la medición de la concentración de zinc libre intracelular utilizando un colorante fluorescente específico de zinc, FluoZin-3. El colorante tiene una alta especificidad para Zn2+ y poca interferencia de otros cationes divalentes, como el calcio. Además, en su forma de éster, entra en las células por difusión no iónica y luego queda atrapado debido a la actividad de la diesterasa intracelular. Por lo tanto, su fluorescencia se correlaciona principalmente con la concentración de zinc citosólico libre. Estos experimentos se llevaron a cabo para estudiar la relación estructura-función del transportador de zinc 1 (ZnT1), un miembro de la familia ZnT.
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Protocol
1. Transfección celular
- Cultivo HEK293T células en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, 2 mM de L-glutamina y 1x penicilina/estreptomicina (ver Tabla de Materiales) en una incubadora humidificada a 37 °C/5% CO2 hasta la confluencia en una placa de 10 cm (8,8 x 106 células totales).
- Coloque un cubreobjetos de 13 mm en cada uno de los pocillos de una placa de 12 pocillos. Diluir 0,44 x 106 células tripsinizadas del paso 1,1 en 12 ml de DMEM completo. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces. Llene cada pocillo con 1 ml de la solución mezclada. Cultivar en una incubadora humidificada a 37 °C/5% deCO2 durante la noche.
- Reemplace el DMEM completo en cada pocillo con 1 ml de DMEM sin suero (consulte la Tabla de materiales) en cada pocillo. Regrese la placa de 12 pocillos a la incubadora humidificada como en el paso 1.1.
- Para cada pocillo de transfección, diluir 1 μg de plásmido pAAV2 que contenga la proteína de interés marcada con proteína fluorescente mCherry (Archivo suplementario 1) en 100 μL de DMEM sin suero en un tubo de 1,5 mL.
- Agregue 3 μg de polietileneimina (PEI, consulte la tabla de materiales) a 100 μl de DMEM sin suero por transfección, con cada transfección en un tubo diferente de 1,5 ml. La relación plásmido:PEI debe ser de 1:3 (μg:μg).
- Agitar ambos tubos desde el paso 1.4 y el paso 1.5 durante 10 s, y dejar reposar a temperatura ambiente durante al menos 5 min.
- Mezcle una parte (100 μL por pocillo) de la solución de ADN del paso 1.4 con una parte (100 μL por pocillo) de la solución de PEI del paso 1.5. Agitar la solución final durante 10 s y dejarla reposar a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos y hasta 6 h.
- Tome la placa de 12 pocillos de la incubadora. Agite la solución final del paso 1.7 y agregue 200 μL a cada uno de los pocillos en la placa de 12 pocillos del paso 1.3. Regrese la placa de 12 pocillos a la incubadora humidificada (paso 1.1).
- Después de 3 h, reemplace el medio en cada pocillo con 1 mL de DMEM completo. Regrese la placa de 12 pocillos a la incubadora humidificada como en el paso 1.1.
- Después de 2 días, tome el cultivo celular transfectado de la incubadora de 37 °C/5% de CO2 y colóquelo en un microscopio de fluorescencia invertida con un aumento de 10x.
- Usando la rueda de enfoque del microscopio, enfoque las células mientras usa luz de campo claro.
- Cambie a las longitudes de onda fluorescentes de excitación mCherry (587 nm) y emisión (610 nm) y apague la luz de campo claro. Compruebe la fluorescencia de las células para confirmar la expresión de ZnT1 mCherry.
- Prepare la solución de carga de tinte.
- Tome una alícuota de 4 μL de colorante fluorescente específico de zinc (ver Tabla de Materiales) en su forma de éster de acetoximetilo (AM), disuelto en DMSO (1 μg/μL), de un caldo protegido a la luz almacenado en un congelador a -20 °C. Esta forma permite que el colorante entre en la célula a través de la membrana plasmática por difusión simple.
- Añadir 4 μl de ácido plurónico al 10% (o 2 μl de ácido plurónico al 20%, véase la tabla de materiales) a la alícuota del paso 1.13.1. Mezcle bien la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres veces, y luego agregue los 8 μL a un tubo de 1,5 mL.
- Añadir 750 μL de solución de Ringer (preparada internamente, ver Tabla de Materiales para la composición) suplementada con 1 mg/mL (~0,1%) de albúmina sérica bovina al tubo a partir del paso 1.13.2, y vórtice vigorosamente. Agregue otros 750 μL de la misma solución y vuelva a vórtice para garantizar la máxima mezcla.
- Agregue 750 μL de la solución final del paso 1.13.3 a dos pocillos en una nueva placa de cultivo de 6 pocillos. Cubra con papel de aluminio.
NOTA: Para evitar el blanqueamiento, la placa de 6 pocillos siempre está cubierta con papel de aluminio a partir de este paso. - Con una pinza fina, tome hasta cuatro cubreobjetos replicados de la placa de cultivo celular transfectada y colóquelos en el primer pocillo lleno (hasta cuatro portaobjetos por pocillo) de la nueva placa de 6 pocillos del paso 1.14. Repita este proceso para el segundo pocillo lleno.
NOTA: Todos los cubreobjetos en el mismo pocillo lleno deben ser de la misma condición. Sin embargo, cada pozo puede contener condiciones diferentes. - Cubra con papel de aluminio y agite suavemente durante 15-20 min.
- Retire la solución de carga de tinte y reemplácela con una nueva solución de lavado de albúmina de Ringer, como se usa en el paso 1.13.3. Cubra con papel de aluminio. Dejar agitar de nuevo durante 20 min. Esto permite la escisión del éster AM por las esterasas intracelulares.
2. Preparación del microscopio
- Disponer las herramientas necesarias (ver Tabla de Materiales) como se mencionó: un microscopio de fluorescencia invertida capaz de detectar fluoróforos GFP y mCherry, un sistema de perfusión que permita cambiar entre al menos dos soluciones, un sistema de succión y una cámara de perfusión.
- Encienda el microscopio, su fuente de luz y la cámara. Encienda el sistema de succión.
- Lave el sistema de perfusión. Lavar la primera cámara con la solución de Ringer y la segunda cámara con la solución de Ringer que contiene 7 μM de solución de zinc suplementada con 7 μM de piritionato (ionóforo de zinc, ver Tabla de Materiales). Para evitar burbujas de aire o huecos, deje un poco de líquido en cada cámara.
NOTA: Dado que ambos recipientes están conectados al mismo tubo conectado a la cámara de perfusión, asegúrese siempre de lavar el segmento compartido con la solución de Ringer. - Cierre los grifos y llene las cámaras apropiadas con la solución de Ringer y la solución de zinc de Ringer, como en el paso 2.3.
3. Preparación de la muestra
- Tome la cámara de perfusión y colóquela con el lado estrecho de la ranura hacia arriba.
NOTA: La ranura es un orificio en el medio de la cámara de perfusión. Permite el acceso del líquido de perfusión a las células. Un lado de la ranura es estrecho y el lado opuesto es ancho. - Aplique una silicona de sellado (consulte la Tabla de materiales) alrededor de la ranura. Limpie la silicona de sellado de la ranura con una punta de pipeta.
NOTA: Asegúrese de que haya suficiente sello de silicona alrededor de la ranura para sellar un cubreobjetos de 22 mm. - Con una pinza fina, tome un cubreobjetos de la solución de lavado y colóquelo encima de la ranura con las celdas hacia abajo. De esta manera, las células estarán expuestas a la solución que perfunde el surco durante el experimento.
- Coloque un cubreobjetos de 22 mm encima del cubreobjetos de 13 mm y apriételo con la pinza. Tenga cuidado de no romper los cubreobjetos.
- Dale la vuelta a la cámara y presiona sobre ella para liberar todos los líquidos presentes. Llene la ranura con 100 μL de solución de lavado de Ringer y presione nuevamente para asegurarse de que no haya fugas.
NOTA: Si se detecta una fuga, aplique un agente sellador en el sitio de la fuga y vuelva a realizar la prueba. - Monte la cámara de perfusión en la plataforma y asegúrela. Coloque los tubos de perfusión y succión para permitir la perfusión sobre las células en la ranura.
- Cambie la velocidad de perfusión a aproximadamente 2 ml/min y encienda la perfusión de la solución de Ringer. Asegúrese de que el sistema de perfusión funcione sin fugas ni derrames.
4. Preparación de la medición
- Abra el software de imágenes (consulte Tabla de materiales) haciendo doble clic en el icono. Inicie sesión con las credenciales pertinentes. Elija la cámara conectada y presione Aceptar.
- Ajuste el aumento del microscopio a 10x usando el botón en el lado izquierdo del microscopio.
- Al elegir la visualización en directo y utilizar el joystick, mueva la plataforma para enfocar las celdas de la ranura.
- Mientras la perfusión está encendida, apague las luces y cambie la longitud de onda a mCherry presionando el botón dedicado en la interfaz. Ajuste el enfoque con la rueda de enfoque del microscopio.
- Una vez que el microscopio esté enfocado en las células, mueva la plataforma con el joystick para permitir la selección de los parches celulares apropiados.
NOTA: Un área adecuada se considera un área con al menos 10 celdas para un ROI y un área vacía para el fondo. - Seleccione el menú desplegable Activar/desactivar ROI y elija Dibujar ROI circulares.
- Dibuje ROI de grupos de células con las células que expresan mCherry (indica la expresión de ZnT1).
- En la misma barra de herramientas que el paso 4.6, haga clic en el botón Activar/desactivar el ROI de fondo y ajuste la ubicación y el tamaño del ROI de fondo a un área sin celdas.
- Verifique con las longitudes de onda mCherry y EGFP para asegurarse de que no haya celdas en el ROI de fondo seleccionado.
NOTA: Las longitudes de onda se ajustaron de modo que mCherry utilizara una longitud de onda de excitación de 520 nm y una longitud de onda de emisión de 610 nm y EGFP utilizara una longitud de onda de excitación de 470 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm.
- Verifique con las longitudes de onda mCherry y EGFP para asegurarse de que no haya celdas en el ROI de fondo seleccionado.
- Seleccione la subpestaña Longitud de onda (λ). Marque su casilla de verificación y asegúrese de que la longitud de onda GFP esté presente y su casilla de verificación marcada. Si no es así, agréguelo y márquelo.
- Seleccione la subpestaña Duración . Defina el intervalo de medición cada 5 s y cambie el número de intervalos para adaptarlo a la duración del experimento.
- En la sección Enfoque en el panel del microscopio debajo del ocular, haga clic en el botón Activado para habilitar el sistema de enfoque perfecto (PFS).
- Con la rueda de enfoque PFS, ajuste el enfoque. En la interfaz del software, en ND Acquisition, asegúrese de que PFS activado esté marcado.
- Haga clic en Ejecutar ahora.
5. Procedimiento experimental
- Comience con una medición del período de referencia de 90 s utilizando la perfusión en solución de Ringer.
- Una vez finalizado el período de referencia, apague la perfusión de la solución del Ringer y, a continuación, active la perfusión de la solución de zinc del Ringer. Marque el cambio de la solución haciendo clic en la bandera roja en la parte inferior derecha del panel de interfaz principal. Se espera que aparezca un aumento de la fluorescencia.
- Una vez que el aumento de la fluorescencia comience a saturarse, vuelva a la perfusión con la solución de Ringer. Apague la perfusión de la solución de zinc del Ringer y, a continuación, encienda la perfusión de la solución del Ringer.
- Espere hasta que expire el tiempo del experimento. Se espera una disminución notable pero constante de la fluorescencia si el ZnT1 funciona correctamente.
6. Exportación de datos
- Para exportar los datos con la resta de línea base, presione el botón Restar línea base y vea los cambios en la "ventana de adquisición ND".
- Haga clic en el botón Exportar en la interfaz del software en la "ventana de adquisición ND". Se abrirá una hoja de datos de Excel. Guarde en la ubicación deseada.
7. Análisis de datos
- Para cada ROI, cree una fluorescencia de referencia promedio de los primeros 90-100 s.
- Exprese la fluorescencia calculada para cada ROI como un porcentaje del fondo para ese ROI.
- Cree un promedio de filas de todos los ROI y represente el resultado como un gráfico de líneas. Esto crea un promedio de todos los ROI en función del tiempo.
- Utilizando la función de ajuste lineal, seleccione la tasa inicial para la disminución de la fluorescencia después del lavado con la solución de Ringer. El valor de la pendiente de la ecuación se correlaciona con la velocidad de transporte.
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Representative Results
El ZnT1 es un transportador de zinc de mamíferos localizado en la membrana plasmática celular13. Es un miembro de la familia de proteínas facilitadoras de difusión catiónica (CDF) que extruyen zinc desde el citosol hasta el medio extracelular14. ZnT1 tiene una arquitectura de dos dominios: el dominio transmembrana, que transporta los iones a través de la membrana, y un dominio C-terminal14. A diferencia de otras proteínas CDF conocidas, ZnT1 tiene un dominio C-terminal no estructurado extendido (USCTD). Actualmente se desconoce el papel de la USCTD. Utilizamos el protocolo anterior para comparar el ZnT1 WT con el ZnT1 sin la USCTD para evaluar su participación en la actividad de transporte de zinc.
Las células HEK 293T se transfectaron con el plásmido pAAV2 que contenía ZnT1 WT o ZnT1 sin el terminal C no estructurado (ΔUSCTD) y se probó la tasa de actividad de transporte como se describió anteriormente. La Figura 1 suplementaria muestra que ambas versiones de ZnT1 se expresan y localizan en la membrana plasmática sin ningún problema. La Figura 1 muestra los resultados típicos de un ejemplo de un experimento de este tipo. Un aumento en la fluorescencia es el resultado de un aumento en la concentración intracelular de Zn 2+, mientras que una disminución es el resultado de la actividad del ZnT1 transportando Zn2+ a través de la membrana celular (los gráficos individuales, incluidos los errores estándar, se encuentran en la Figura Suplementaria 2 y la Figura Suplementaria 3). Es evidente a partir de esta figura que ZnT1 WT tiene una curva de fluorescencia más suave que el mutante. Sin embargo, esta no es una característica diferenciadora inherente, sino que está relacionada con la variabilidad en las respuestas celulares a la carga de zinc, que se ha observado en experimentos anteriores. La Figura 2 muestra un diagrama de caja que resume los resultados de 15-17 experimentos de este tipo. A partir de la figura, queda claro que la ΔUSCTD presenta una mayor variedad de tarifas de transporte en comparación con la WT. Si bien esto se puede atribuir a la variabilidad de la respuesta celular mencionada anteriormente, también podría indicar una diferencia funcional. Por ejemplo, puede implicar que el segmento ZnT1 USCTD es un modulador de la velocidad de transporte. Claramente, no hay diferencia visible entre las actividades de extrusión de Zn2+ de WT y ΔUSCTD. Con base en el análisis estadístico, los datos no se distribuyeron normalmente (conjunto de datos WT, prueba de Shapiro-Wilk15, estadístico = 0,72404, valor de p = 0,0004), por lo que se utilizaron dos pruebas no paramétricas de muestra para las comparaciones entre los conjuntos de datos. Los resultados mostraron que no hubo diferencia estadística entre las tasas de transporte (prueba U de Mann-Whitney16: U = 132, Z = 0,15105, Asymp. Prob>|U| = 0,87994; Prueba de Kolmogorov-Smirnov17: D = 0.27059, Z = 0.76384, Probabilidad exacta>|D|= 0,5161).
Debido al costo energético sustancial de crear la extensión no estructurada (~ 80 aminoácidos), es razonable suponer que este dominio cumple una función celular. Sin embargo, hasta el momento no se ha identificado una función celular vinculada a este dominio. Este dominio es exclusivo de ZnT1 y no se encuentra en ningún otro miembro de la familia ZnT. Como tal, puede deberse al hecho de que, a diferencia de otros ZnTs, el ZnT1 se encuentra en la membrana plasmática, mientras que, a excepción del ZnT10, todos los demás miembros se expresan en orgánulos internos.
Los datos brutos y los gráficos posteriores que se muestran aquí se basan en mediciones de intervalos de 5 s de la fluorescencia causada por el colorante sensible al zinc. Esto significa que en un período de tiempo relativamente corto (minutos), se puede generar una visualización del transporte de zinc dependiente del tiempo con una alta resolución temporal. El análisis debe incluir una normalización del período basal, ya que el colorante se carga en las células antes de la carga de zinc y puede tener fluorescencia intracelular inicial causada por una pequeña cantidad de zinc libre. Además, el colorante de zinc solo se vuelve fluorescentemente activo después de la escisión por la esterasa intracelular. Por lo tanto, se recomienda dejar pasar algún tiempo para que se produzca el proceso de desesterificación de la mayor parte del colorante con el fin de evitar patrones de fluorescencia irregulares causados por la escisión del éster del colorante a lo largo del experimento.
Figura 1: Actividades de extrusión de Zn2+ de WT y ΔUSCTD utilizando el ensayo de transporte de zinc. El eje x es el tiempo en segundos. El eje Y es el cambio de fluorescencia expresado como porcentaje de la línea de base. Los gráficos de líneas son el cambio de fluorescencia en función del tiempo. Los datos se promedian a lo largo de >10 ROI. Los gráficos individuales con error estándar se muestran en la Figura Suplementaria 2 y en la Figura Suplementaria 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Comparación de las actividades de ZnT1 WT y ΔUSCTD representadas como un diagrama de caja. Cada punto de datos representa un único experimento. La línea negra indica la puntuación mediana. El cuadro cuadrado hueco indica la puntuación media. El eje Y indica el cambio en el porcentaje de referencia por segundo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Células HEK 293T transfectadas con (A) ZnT1 WT o (B) ZnT1 ΔUSCTD estimuladas en las longitudes de onda de excitación mCherry (520 nm) y emisión (610 nm). En ambos casos, hay expresión y localización en la membrana de la variante ZnT1. El aumento del microscopio es de 20x. El tiempo de exposición es de 100 ms. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 2: Actividad de transporte de ZnT1 WT Zn2+ con el error estándar visualizado. El eje x es el tiempo en segundos. El eje Y es el porcentaje de cambio de fluorescencia con respecto a la fluorescencia basal. La línea negra es el cambio de fluorescencia medio. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 3: Actividad de transporte de ZnT1 ΔUSCTD Zn2+ con el error estándar visualizado. El eje x es el tiempo en segundos. El eje Y es el porcentaje de cambio de fluorescencia con respecto a la fluorescencia basal. La línea roja es el cambio de fluorescencia media. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 1: secuencia de plásmido pAAV2. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El método descrito anteriormente permite la medición directa de la concentración intracelular de zinc con alta resolución temporal. En comparación con otros métodos, este método que implica la monitorización de los cambios en el Zn2+ intracelular puede disminuir sustancialmente el ruido de fondo. Además, la selectividad del colorante para el zinc elimina las posibles interacciones cruzadas con otros cationes metálicos18,19. Por último, su falta de citotoxicidad inmediata permite el ensayo de procesos celulares vivos19.
Sin embargo, este método tiene ciertas limitaciones. En primer lugar, la detección de la dinámica intracelular puede ser relativamente más difícil con este protocolo, ya que el colorante utilizado en este método está diseñado para quedar atrapado en la célula, pero no puede dirigirse a regiones o procesos específicos. Otros colorantes fluorescentes pueden dirigirse a un área específica de las células, pero, desafortunadamente, tienen un rango dinámico mucho más bajo20. En segundo lugar, la exposición del colorante a la luz provoca una disminución de la fluorescencia debido al blanqueamiento, lo que restringe el tiempo de exposición a la luz y, en consecuencia, la ventana activa para ejecutar el experimento. En tercer lugar, la carga de colorantes en este protocolo es engorrosa y requiere mucho tiempo en comparación con el uso de otros colorantes, especialmente los colorantes codificados genéticamente21. Finalmente, incluso después de escindir los ésteres, el colorante se filtra, lo que lleva a una reducción independiente del Zn 2+ en la fluorescencia22.
Se deben seguir varios pasos para garantizar el éxito del experimento. En primer lugar, dado que la transfección puede distribuirse de manera desigual, las células seleccionadas deben contener la proteína de interés. Para evitar el blanqueamiento del tinte, es importante mantener las células cargadas protegidas de la luz. Al ejecutar el experimento, la tasa de perfusión debe ser suficiente para completar el experimento sin causar el desprendimiento de las células del cubreobjetos. En el caso de varias corridas, se recomienda mantener los mismos depósitos para la solución de Ringer y la solución de zinc de Ringer. El tiempo de carga del tinte y el tiempo de lavado se pueden ajustar de acuerdo con los experimentos iniciales. La carga de zinc en las células a través de la perfusión con piritionato puede tardar de 1 min a 5 min, según se evalúa mediante el monitoreo de la fluorescencia inducida por Zn2+ con el tiempo.
A pesar de estas dificultades, este método nos permite, por primera vez, estudiar la dinámica del proceso de extrusión de Zn2+. Simplifica el proceso y crea una forma directa de establecer mejor los vínculos causales en comparación con los métodos anteriores23,24.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Raz Zarivach cuenta con el apoyo de la Fundación de Ciencias de Israel (subvención nº 163/22). Tomer Eli Ben Yosef y Arie Moran cuentan con el apoyo de la Fundación de Ciencias de Israel (subvención n.º 2047/20). Nos gustaría agradecer a Daniel Gitler y a su grupo de la Universidad Ben-Gurion por su cooperación, apoyo y experiencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Sigma Aldrich | 31665 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
References
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