Summary
Çinko taşınmasının, protein fonksiyonuna zayıf nedensel bağlantılar ve düşük zamansal çözünürlük nedeniyle ölçülmesinin zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, Zn 2 + duyarlı bir floresan boya kullanarak canlı hücrelerden Zn2 + ekstrüzyonunu yüksek zamansal çözünürlükle izlemek için bir yöntemi açıklar, böylece doğrudan bir Zn2 + akışı ölçümü sağlar.
Abstract
Zn2+ iyonları gibi geçiş metalleri, hücresel toksisiteleri nedeniyle sıkı bir şekilde düzenlenmelidir. Daha önce, Zn2+ taşıyıcılarının aktivitesi, farklı Zn2+ konsantrasyonları altında taşıyıcının ekspresyon seviyesi belirlenerek dolaylı olarak ölçülüyordu. Bu, immünohistokimya kullanılarak, dokudaki mRNA'yı ölçerek veya hücresel Zn2+ seviyelerini belirleyerek yapıldı. Hücre içi Zn2+ sensörlerinin geliştirilmesiyle, çinko taşıyıcıların aktiviteleri şu anda esas olarak, floresan problar kullanılarak tespit edilen hücre içi Zn 2 + 'daki değişikliklerin Zn2 + taşıyıcılarının ekspresyonu ile ilişkilendirilmesiyle belirlenmektedir. Bununla birlikte, bugün bile, sadece birkaç laboratuvar hücre içi Zn2 + 'daki dinamik değişiklikleri izlemekte ve bunu çinko taşıyıcılarının aktivitesini doğrudan ölçmek için kullanmaktadır. Sorunun bir kısmı, ZnT ailesinin 10 çinko taşıyıcısından, ZnT10 (manganez taşır) hariç, plazma zarında sadece çinko taşıyıcı 1'in (ZnT1) lokalize olmasıdır. Bu nedenle, taşıma aktivitesini hücre içiZn2+ konsantrasyonundaki değişikliklere bağlamak zordur. Bu makale, çinkoya özgü bir floresan boya olan FluoZin-3'e dayalı bir tahlil kullanarak çinko taşıma kinetiğini belirlemenin doğrudan bir yolunu açıklamaktadır. Bu boya, ester formunda memeli hücrelerine yüklenir ve daha sonra hücresel diesteraz aktivitesi nedeniyle sitozolde tutulur. Hücreler, Zn2+ iyonofor pirityonu kullanılarak Zn2+ ile yüklenir. ZnT1 aktivitesi, hücre yıkamasını takiben floresanstaki azalmanın doğrusal kısmından değerlendirilir. 470 nm'lik bir uyarılmada ve 520 nm'lik bir emisyonda ölçülen floresan, serbest hücre içi Zn2+ ile orantılıdır. mCherry florofor ile etiketlenmiş ZnT1'i eksprese eden hücrelerin seçilmesi, yalnızca taşıyıcıyı eksprese eden hücrelerin izlenmesine izin verir. Bu test, ZnT1 proteininin farklı alanlarının, hücreden fazla çinko ekstrüde eden ökaryotik bir transmembran proteini olan insan ZnT1'in taşıma mekanizmasına katkısını araştırmak için kullanılır.
Introduction
Çinko, hücresel ortamda önemli bir eser elementtir. Tüm proteinlerin üçte birini içerir ve kataliz1, transkripsiyon2 ve yapısal motifler3 gibi çeşitli hücresel süreçlerde yer alır. Bununla birlikte, redoks-inert olmasına rağmen, yüksek çinko konsantrasyonları hücre için toksiktir, bu nedenle çinko homeostazını düzenleyen mekanizmaların varlığı olmadan hiçbir memeli organizması hayatta kalmamıştır. Memelilerde bu süreçten üç mekanizma sorumludur: (1) çinkoyu yüksek afinitede bağlayan sitozolik sistein açısından zengin proteinler olan metallotiyoninler, böylece aşırı serbest sitozolik çinko4; (2) Plazma zarı yoluyla veyahücre içi organellerden 4,5,6,7,8 sitozole çinko akışından sorumlu çinko taşıyıcıları olan Zrt/Irt benzeri proteinler (ZIP'ler); ve (3) Her yerde bulunan katyon difüzyon kolaylaştırıcı (CDF) ailesinin memeli bir alt kümesi olan ve çinkoyu sitozolden plazma zarı boyunca veya hücre içi organellere 4,5,6,7,8,9 ekstrüde ettikleri için çinko taşıyıcıları olan ZnT'ler. Çinkonun hücresel metabolizma için önemi nedeniyle, hücresel çinko dinamiklerini anlamak hayati önem taşır.
Çinko dinamiklerini değerlendirmeye yönelik önceki yöntemler, farklı çinko koşulları altında mRNA'nın ekspresyon düzeylerinin, sabit dokuların veya hücrelerin hücresel çinko ölçümleri ile ilişkilendirilerek değerlendirilmesine dayanıyordu10,11,12. Bu yöntemler arasında kimyasal tespit ve immünohistokimya boyama yer alır. Bununla birlikte, bu yöntemler yalnızca dolaylı ölçümler sağlar ve bu nedenle, hücre içi çinko konsantrasyonu ile çinko taşıyıcılarının ekspresyonu arasında yalnızca çevrimdışı bir korelasyon belirler. Sonuç olarak, bu yöntemler yüksek zamansal çözünürlük gerektiren herhangi bir parametreyi çıkaramaz.
Zn2+ taşınmasının daha doğrudan bir ölçümü, çinko13'ün radyoaktif izotoplarını kullanır. Bu yöntem, çinko taşınmasını ve kinetiğini izlemek için radyoaktif işaretli Zn2 + ölçümüne dayanır. Bununla birlikte, çinkonun hücresel homeostaz için önemi nedeniyle, çoklu hücresel süreçler hücre içi çinko konsantrasyonunu düzenler. Bunlar arasında hücre dışı bağlanma ve hücre içi Zn2+ seviyelerinin sıkı kontrolünü sağlamak için uyum içinde çalışan çeşitli taşıma sistemleri vardır. Bu işlemlerin kombinasyonu, çinko ile ilgili bireysel taşıma işlevlerinin test edilmesini zorlaştıran önemli bir arka plan gürültüsü oluşturur.
Bu makale, çinkoya özgü bir floresan boya olan FluoZin-3 kullanılarak hücre içi serbest çinko konsantrasyonunu ölçerek çinko taşıma hızını doğrudan izlemek için bir yöntemi göstermektedir. Boya, Zn2+ için yüksek özgüllüğe ve kalsiyum gibi diğer iki değerlikli katyonlardan çok az etkileşime sahiptir. Ek olarak, ester formunda, iyonik olmayan difüzyon yoluyla hücrelere girer ve daha sonra hücre içi di-esterazın aktivitesi nedeniyle tutulur. Bu nedenle, floresansı esas olarak serbest sitozolik çinko konsantrasyonu ile ilişkilidir. Bu deneyler, ZnT ailesinin bir üyesi olan çinko taşıyıcı 1'in (ZnT1) yapı-fonksiyon ilişkisini incelemek için yapılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre transfeksiyonu
- Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle besiortamındaki (DMEM) kültür HEK293T hücreleri, 37 ° C/% 5 CO 2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 10 cm'lik bir plaka (8.8 x 106 toplam hücre) üzerinde birleşene kadar% 10 fetal sığır serumu (FBS),2 mM L-glutamin ve 1x penisilin / streptomisin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- 12 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna bir adet 13 mm'lik lamel yerleştirin. 0.44 x 106 tripsinizli hücreyi 1.1 adımından 12 mL tam DMEM'de seyreltin. Üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Her kuyucuğu 1 mL karışık çözelti ile doldurun. Nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca 37 °C/%5CO2'de büyütün.
- Her kuyucuktaki tam DMEM'i, her kuyucukta 1 mL serumsuz DMEM ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile değiştirin. 12 oyuklu plakayı adım 1.1'deki gibi nemlendirilmiş inkübatöre geri koyun.
- Her transfeksiyon kuyusu için, 1.5 mL'lik bir tüpte 100 μL serumsuz DMEM içinde mCherry floresan proteini (Ek Dosya 1) ile etiketlenmiş ilgilenilen proteini içeren 1 μg pAAV2 plazmidini seyreltin.
- Transfeksiyon başına 100 μL serumsuz DMEM'e 3 μg polietilenimin (PEI, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, her transfeksiyon farklı bir 1.5 mL tüpte. Plazmid:PEI oranı 1:3 (μg:μg) olmalıdır.
- Her iki tüpü de adım 1.4 ve adım 1.5'ten 10 saniye boyunca vorteksleyin ve oda sıcaklığında en az 5 dakika dinlenmeye bırakın.
- Adım 1.4'teki DNA çözeltisinin bir kısmını (oyuk başına 100 μL), adım 1.5'teki PEI çözeltisinin bir kısmı (oyuk başına 100 μL) ile karıştırın. Nihai çözeltiyi 10 saniye vorteksleyin ve oda sıcaklığında en az 20 dakika ve 6 saate kadar dinlenmeye bırakın.
- 12 oyuklu plakayı inkübatörden alın. Nihai çözeltiyi adım 1.7'den vorteksleyin ve adım 1.3'ten itibaren 12 oyuklu plakadaki kuyucukların her birine 200 μL ekleyin. 12 oyuklu plakayı nemlendirilmiş inkübatöre geri koyun (adım 1.1).
- 3 saat sonra, her bir kuyucuktaki ortamı 1 mL tam DMEM ile değiştirin. 12 oyuklu plakayı adım 1.1'deki gibi nemlendirilmiş inkübatöre geri koyun.
- 2 gün sonra, transfekte edilmiş hücre kültürünü 37 °C /% 5 CO2 inkübatörden alın ve 10x büyütme kullanarak ters çevrilmiş bir floresan mikroskobuna yerleştirin.
- Mikroskop odak tekerleğini kullanarak, parlak alan ışığını kullanırken hücrelere odaklanın.
- Floresan mCherry uyarma (587 nm) ve emisyon (610 nm) dalga boylarına geçin ve parlak alan ışığını kapatın. ZnT1 mCherry ekspresyonunu doğrulamak için hücrelerin floresansını kontrol edin.
- Boya yükleme çözeltisini hazırlayın.
- -20 °C'lik bir dondurucuda saklanan ışık korumalı bir stoktan, DMSO (1 μg/μL) içinde çözünmüş asetoksimetil () ester formunda 4 μL çinkoya özgü floresan boyanın (Malzeme Tablosuna bakınız) bir alikotunu alın. Bu form, boyanın basit difüzyonla plazma zarından hücreye girmesine izin verir.
- Adım 1.13.1'deki alikot'a 4 μL %10 pluronik asit (veya 2 μL %20 pluronik asit, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Çözeltiyi üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve ardından 8 μL'nin tamamını 1,5 mL'lik bir tüpe ekleyin.
- Adım 1.13.2'den tüpe 1 mg / mL (~% 0.1) sığır serum albümini ile takviye edilmiş 750 μL Ringer çözeltisi (evde hazırlanmış, bileşim için Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve kuvvetlice girdap yapın. Aynı çözeltiden 750 μL daha ekleyin ve maksimum karıştırmayı sağlamak için tekrar vorteksleyin.
- Adım 1.13.3'ten itibaren 750 μL nihai çözeltiyi yeni bir 6 oyuklu kültür plakasındaki iki oyuğa ekleyin. Alüminyum folyo ile kaplayın.
NOT: Ağartmayı önlemek için, 6 oyuklu plaka bu adımdan itibaren her zaman alüminyum folyo ile kaplanır. - İnce bir cımbız kullanarak, transfekte edilmiş hücre kültürü plakasından dört adede kadar çoğaltılmış lamel alın ve bunları adım 1.14'ten itibaren yeni 6 oyuklu plakanın ilk doldurulmuş kuyucuğuna (oyuk başına dört slayta kadar) yerleştirin. İkinci doldurulmuş kuyu için bu işlemi tekrarlayın.
NOT: Aynı doldurulmuş kuyudaki tüm lameller aynı durumda olmalıdır. Bununla birlikte, her kuyu farklı koşullar içerebilir. - Alüminyum folyo ile örtün ve 15-20 dakika hafifçe çalkalayın.
- Boya yükleme solüsyonunu çıkarın ve adım 1.13.3'te kullanıldığı gibi yeni bir Ringer plus albümin yıkama solüsyonu ile değiştirin. Alüminyum folyo ile kaplayın. 20 dakika tekrar sallanmaya bırakın. Bu, esterinin hücre içi esterazlar tarafından bölünmesine izin verir.
2. Mikroskop hazırlığı
- Gerekli araçları (Malzeme Tablosuna bakınız) belirtildiği gibi düzenleyin: GFP ve mCherry floroforlarını tespit edebilen ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu, en az iki çözelti arasında geçiş yapmaya izin veren bir perfüzyon sistemi, bir emme sistemi ve bir perfüzyon odası.
- Mikroskobu, ışık kaynağını ve kamerayı açın. Emme sistemini açın.
- Perfüzyon sistemini yıkayın. İlk hazneyi Ringer solüsyonu ile ve ikinci hazneyi 7 μM pirityon (çinko iyonofor, bkz. Malzeme Tablosu) ile takviye edilmiş 7 μM çinko solüsyonu içeren Ringer solüsyonu ile yıkayın. Hava kabarcıklarını veya boşlukları önlemek için, her bölmede biraz sıvı bırakın.
NOT: Her iki kap da perfüzyon odasına bağlı aynı tüpe bağlı olduğundan, paylaşılan segmentin her zaman Ringer solüsyonu ile yıkandığından emin olun. - Muslukları kapatın ve uygun hazneleri adım 2.3'teki gibi Ringer solüsyonu ve Ringer çinko solüsyonu ile doldurun.
3. Numune hazırlama
- Perfüzyon odasını alın ve oluğun dar tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
NOT: Oluk, perfüzyon odasının ortasındaki bir deliktir. Perfüzyon sıvısının hücrelere ulaşmasını sağlar. Oluğun bir tarafı dar, karşı tarafı geniştir. - Oluğun etrafına bir sızdırmazlık silikonu uygulayın (Malzeme Tablosuna bakın). Bir pipet ucu kullanarak oluktaki sızdırmazlık silikonunu temizleyin.
NOT: 22 mm'lik bir lamel sızdırmaz hale getirmek için oluğun etrafında yeterli silikon conta olduğundan emin olun. - İnce bir cımbız kullanarak, yıkama solüsyonundan bir lamel alın ve hücreler aşağı bakacak şekilde oluğun üzerine yerleştirin. Bu şekilde, hücreler deney sırasında oluğu perfüze eden çözeltiye maruz bırakılacaktır.
- 13 mm'lik lamellerin üzerine 22 mm'lik bir lamel yerleştirin ve cımbızı kullanarak sıkın. Lamelleri kırmamaya dikkat edin.
- Hazneyi çevirin ve mevcut tüm sıvıları serbest bırakmak için üzerine bastırın. Oluğu 100 μL Ringer yıkama solüsyonu ile doldurun ve sızıntı olmaması için tekrar bastırın.
NOT: Bir sızıntı tespit edilirse, sızıntı yerine bir sızdırmazlık maddesi uygulayın ve tekrar test edin. - Perfüzyon odasını platforma monte edin ve sabitleyin. Perfüzyon ve emme borularını, oluktaki hücreler üzerinde perfüzyona izin verecek şekilde yerleştirin.
- Perfüzyon hızını yaklaşık 2 mL / dak olarak değiştirin ve Ringer çözeltisinin perfüzyonunu açın. Perfüzyon sisteminin sızıntı veya dökülme olmadan çalıştığından emin olun.
4. Ölçüm hazırlığı
- Simgeye çift tıklayarak görüntüleme yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakın). İlgili kimlik bilgileriyle oturum açın. Takılı kamerayı seçin ve Tamam'a basın.
- Mikroskobun sol tarafındaki düğmeyi kullanarak mikroskop büyütmesini 10x'e ayarlayın.
- Canlı görüntüyü seçerek ve joystick'i kullanarak, oluktaki hücrelere odaklanmak için platformu hareket ettirin.
- Perfüzyon açıkken ışıkları kapatın ve arayüzdeki özel düğmeye basarak dalga boyunu mCherry olarak değiştirin. Mikroskop odak tekerleğini kullanarak odağı ayarlayın.
- Mikroskop hücrelere odaklandıktan sonra, uygun hücre yamalarının seçilmesine izin vermek için joystick'i kullanarak platformu hareket ettirin.
NOT: Uygun bir alan, ROI için en az 10 hücreli ve arka plan için boş bir alan içeren bir alan olarak kabul edilir. - ROI'leri Aç/Kapat açılır menüsünü seçin ve Döngüsel ROI'ler Çiz'i seçin.
- mCherry ifade eden hücrelerle hücre kümelerinin ROI'lerini çizin (ZnT1'in ekspresyonunu gösterir).
- Adım 4.6 ile aynı araç çubuğundan, Arka plan ROI'lerini Aç/Kapat düğmesini tıklayın ve arka plan ROI'sinin konumunu ve boyutunu hiç hücre olmayan bir alana ayarlayın.
- Seçilen arka plan ROI'sinde hiçbir hücre olmadığından emin olmak için mCherry ve EGFP dalga boylarını kontrol edin.
NOT: Dalga boyları, mCherry'nin 520 nm'lik bir uyarma dalga boyu ve 610 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullandığı ve EGFP'nin 470 nm'lik bir uyarma dalga boyu ve 520 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullandığı şekilde ayarlandı.
- Seçilen arka plan ROI'sinde hiçbir hücre olmadığından emin olmak için mCherry ve EGFP dalga boylarını kontrol edin.
- Dalga boyu (λ) alt sekmesini seçin. Onay kutusunu işaretleyin ve GFP dalga boyunun mevcut olduğundan ve onay kutusunun işaretli olduğundan emin olun. Değilse, ekleyin ve işaretleyin.
- Süre alt sekmesini seçin. Ölçüm aralığını her 5 saniyede bir olarak tanımlayın ve aralık sayısını deneme süresine uyacak şekilde değiştirin.
- Göz merceğinin altındaki mikroskop panelindeki Odak bölümünde, mükemmel odak sistemini (PFS) etkinleştirmek için Açık düğmesine tıklayın.
- PFS odak tekerleğini kullanarak odağı ayarlayın. Yazılım arayüzünde, ND Alımı altında, PFS'nin açık olduğundan emin olun.
- Şimdi çalıştır'a tıklayın.
5. Deneysel prosedür
- Ringer'in çözelti perfüzyonunu kullanarak 90 s'lik bir başlangıç periyodu ölçümü ile başlayın.
- Başlangıç süresi sona erdikten sonra, Ringer'ın çözelti perfüzyonunu kapatın ve ardından Ringer'ın çinko çözeltisi perfüzyonunu açın. Ana arayüz panelinin sağ alt köşesindeki kırmızı bayrağa tıklayarak çözümün geçişini işaretleyin. Floresanda bir artışın ortaya çıkması bekleniyor.
- Floresan artışı doymaya başladığında, Ringer solüsyonu ile perfüzyona geri dönün. Ringer'ın çinko çözeltisi perfüzyonunu kapatın ve ardından Ringer'ın çözelti perfüzyonunu açın.
- Deneme süresi dolana kadar bekleyin. ZnT1 düzgün çalışıyorsa, floresanda gözle görülür ancak sabit bir azalma beklenir.
6. Veri dışa aktarma
- Verileri taban çizgisi çıkarma ile dışa aktarmak için, Taban Çizgisini Çıkar düğmesine basın ve değişiklikleri "ND alma penceresinde" görüntüleyin.
- "ND edinme penceresindeki" yazılım arayüzündeki Dışa Aktar düğmesine tıklayın. Bir excel veri sayfası açılacaktır. İstediğiniz konuma kaydedin.
7. Veri analizi
- Her ROI için, ilk 90-100 sn arasında ortalama bir temel floresan oluşturun.
- Her bir ROI için hesaplanan floresansı, o ROI için arka planın yüzdesi olarak ifade edin.
- Tüm ROI'lerin satır ortalamasını oluşturun ve sonucu bir çizgi grafik olarak çizin. Bu, zamanın bir fonksiyonu olarak tüm ROI'lerin ortalamasını oluşturur.
- Doğrusal uyum işlevini kullanarak, Ringer solüsyonu ile yıkamayı takiben floresanstaki azalma için başlangıç oranını seçin. Denklemin eğim değeri, taşıma hızı ile ilişkilidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZnT1, hücre plazma zarı13 üzerinde bulunan bir memeli çinko taşıyıcısıdır. Çinkoyu sitozolden hücre dışı milieu14'e ekstrüde eden katyon difüzyon kolaylaştırıcı (CDF) protein ailesinin bir üyesidir. ZnT1 iki alanlı bir mimariye sahiptir: iyonları zar boyunca taşıyan transmembran alanı ve bir C-terminal alanı14. Bilinen diğer CDF proteinlerinden farklı olarak, ZnT1 genişletilmiş yapılandırılmamış bir C-terminal alanına (USCTD) sahiptir. USCTD'nin rolü şu anda bilinmemektedir. Çinko taşıma aktivitesine katılımını değerlendirmek için USCTD olmadan ZnT1 WT ile ZnT1'i karşılaştırmak için yukarıdaki protokolü kullandık.
HEK 293T hücreleri, yapılandırılmamış C-terminali (ΔUSCTD) olmadan ZnT1 WT veya ZnT1 içeren pAAV2 plazmidi ile transfekte edildi ve yukarıda tarif edildiği gibi taşıma aktivite oranını test etti. Ek Şekil 1, ZnT1'in her iki versiyonunun da plazma zarına herhangi bir sorun olmadan eksprese ettiğini ve lokalize olduğunu göstermektedir. Şekil 1, böyle bir deneyin bir örneği için tipik sonuçları göstermektedir. Floresanstaki bir artış, hücre içi Zn 2 + konsantrasyonundaki bir artışın sonucudur, bir azalma ise ZnT1'in Zn 2+ hücre zarı boyunca taşınan aktivitesinin bir sonucudur (standart hatalar da dahil olmak üzere bireysel grafikler Ek Şekil2 ve Ek Şekil 3'te bulunur). Bu şekilden, ZnT1 WT'nin mutanttan daha yumuşak bir floresan eğrisine sahip olduğu açıktır. Bununla birlikte, bu doğal bir ayırt edici özellik değildir, ancak önceki deneylerde gözlemlenen çinko yüküne hücresel tepkilerdeki değişkenlik ile ilgilidir. Şekil 2, bu tür 15-17 deneyin sonuçlarını özetleyen bir kutu grafiğini göstermektedir. Şekilden, ΔUSCTD'nin WT'ye kıyasla daha geniş bir taşıma oranı dağılımı sunduğu açıktır. Bu, daha önce bahsedilen hücresel yanıt değişkenliğine atfedilebilirken, aynı zamanda işlevsel bir farklılığa da işaret edebilir. Örneğin, ZnT1 USCTD segmentinin taşıma hızının bir modülatörü olduğu anlamına gelebilir. Açıkçası, WT ve ΔUSCTD'nin Zn2+ ekstrüzyon aktiviteleri arasında gözle görülür bir fark yoktur. İstatistiksel analize dayalı olarak, veriler normal dağılım göstermemiştir (WT veri seti, Shapiro-Wilk testi15, istatistik = 0.72404, p değeri = 0.0004), bu nedenle veri kümeleri arasındaki karşılaştırmalar için iki örneklem parametrik olmayan test kullanılmıştır. Sonuçlar, taşıma oranları arasında istatistiksel olarak fark olmadığını göstermiştir (Mann-Whitney16 U testi: U=132, Z=0.15105, Asymp. Prob>|U| = 0.87994; Kolmogorov-Smirnov17 testi: D = 0.27059, Z = 0.76384, Tam Prob>|D|= 0.5161).
Yapılandırılmamış uzantıyı (~ 80 amino asit) yaratmanın önemli enerji maliyeti nedeniyle, bu alanın hücresel bir işleve hizmet ettiğini varsaymak mantıklıdır. Bununla birlikte, bu alana bağlı bir hücresel işlev şu ana kadar tanımlanmamıştır. Bu etki alanı ZnT1'e özgüdür ve ZnT ailesinin diğer üyelerinde bulunmaz. Bu nedenle, diğer ZnT'lerden farklı olarak, ZnT1'in plazma zarında yer alması, ZnT10 hariç diğer tüm üyelerin iç organellerde ifade edilmesinden kaynaklanıyor olabilir.
Burada gösterilen ham veriler ve sonraki grafikler, çinkoya duyarlı boyanın neden olduğu floresansın 5 sn aralıklı ölçümlerine dayanmaktadır. Bu, nispeten kısa bir zaman diliminde (dakika), zamana bağlı çinko taşınmasının yüksek zamansal çözünürlükle görselleştirilebileceği anlamına gelir. Boya, çinko yüklemesinden önce hücrelere yüklendiğinden ve az miktarda serbest çinkonun neden olduğu ilk hücre içi floresansına sahip olabileceğinden, analiz bir başlangıç dönemi normalizasyonunu içermelidir. Ek olarak, çinko boyası sadece hücre içi esteraz tarafından bölündükten sonra floresan olarak aktif hale gelir. Bu nedenle, deney boyunca boya ester bölünmesinin neden olduğu düzensiz floresan desenlerini önlemek için boyanın çoğu için deesterifikasyon işleminin gerçekleşmesi için biraz zaman tanınması önerilir.
Şekil 1: Çinko taşıma tahlili kullanılarak WT ve ΔUSCTD'nin Zn2+ ekstrüzyon aktiviteleri. X ekseni saniye cinsinden zamandır. Y ekseni, taban çizgisinin yüzdesi olarak ifade edilen floresan değişimidir. Çizgi grafikler, zamanın bir fonksiyonu olarak floresan değişimidir. Verilerin ortalaması >10 ROI üzerinden alınır. Standart hataya sahip bireysel grafikler Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3'te gösterilmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir kutu grafiği olarak gösterilen ZnT1 WT ve ΔUSCTD aktivitelerinin karşılaştırılması. Her veri noktası tek bir denemeyi temsil eder. Siyah çizgi medyan puanı gösterir. İçi boş kare kutu ortalama puanı gösterir. Y ekseni, saniyedeki taban çizgisi yüzdesindeki değişimi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: mCherry uyarma (520 nm) ve emisyon (610 nm) dalga boylarında uyarılan (A) ZnT1 WT veya (B) ZnT1 ΔUSCTD ile transfekte edilen HEK 293T hücreleri. Her iki durumda da, ZnT1 varyantının ekspresyonu ve membran lokalizasyonu vardır. Mikroskop büyütme oranı 20x'tir. Pozlama süresi 100 ms'dir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: ZnT1 WT Zn2+ taşıma aktivitesi standart hata ile görselleştirilmiştir. X ekseni saniye cinsinden zamandır. Y ekseni, temel floresanstan yüzde floresan değişimidir. Siyah çizgi, ortalama floresan değişimidir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: ZnT1 ΔUSCTD Zn2+ taşıma aktivitesi standart hata ile görselleştirilmiştir. X ekseni saniye cinsinden zamandır. Y ekseni, temel floresanstan yüzde floresan değişimidir. Kırmızı çizgi, ortalama floresan değişimidir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: pAAV2 plazmit dizisi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda tarif edilen yöntem, hücre içi çinko konsantrasyonunun yüksek zamansal çözünürlükle doğrudan ölçülmesine izin verir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, hücre içi Zn2+'daki değişikliklerin izlenmesini içeren bu yöntem, arka plan gürültüsünü önemli ölçüde azaltabilir. Ek olarak, boyanın çinko için seçiciliği, diğer metal katyonlarla potansiyel çapraz etkileşimleriortadan kaldırır 18,19. Son olarak, anında sitotoksisite eksikliği, canlı hücresel süreçlerin test edilmesini sağlar19.
Ancak, bu yöntemin belirli sınırlamaları vardır. İlk olarak, bu protokolle hücre içi dinamikleri tespit etmek nispeten daha zor olabilir, çünkü bu yöntemde kullanılan boya hücre içinde hapsedilmek üzere tasarlanmıştır, ancak bölgelere veya belirli işlemlere yönlendirilemez. Diğer floresan boyalar hücrelerde belirli bir alana yönlendirilebilir, ancak ne yazık ki çok daha düşük bir dinamik aralığasahiptir 20. İkincisi, boyanın ışığa maruz kalması, ağartma nedeniyle floresanda bir azalmaya neden olur, bu da ışığa maruz kalma süresini ve sonuç olarak deneyi çalıştırmak için aktif pencereyi kısıtlar. Üçüncüsü, bu protokoldeki boya yüklemesi, diğer boyaların, özellikle genetik olarak kodlanmış boyaların kullanılmasıyla karşılaştırıldığında hantal ve zaman alıcıdır21. Son olarak, esterleri parçaladıktan sonra bile, boya sızar ve floresan22'de Zn2 + 'dan bağımsız bir azalmaya yol açar.
Deneyin başarılı olmasını sağlamak için birkaç adım atılmalıdır. İlk olarak, transfeksiyon eşit olmayan bir şekilde dağılabileceğinden, seçilen hücreler ilgilenilen proteini içermelidir. Boya ağarmasını önlemek için, yüklü hücrelerin ışıktan korunması önemlidir. Deneyi çalıştırırken, perfüzyon hızı, hücrelerin lamelden ayrılmasına neden olmadan deneyi tamamlamak için yeterli olmalıdır. Birden fazla çalışma durumunda, Ringer çözeltisi ve Ringer çinko çözeltisi için aynı rezervuarların tutulması önerilir. Boya yükleme süresi ve yıkama süresi ilk deneylere göre ayarlanabilir. Pirityon ile perfüzyon yoluyla hücrelere çinko yüklenmesi, Zn2+ ile indüklenen floresansın zamanla izlenmesiyle değerlendirildiği gibi 1 dakika ila 5 dakika arasında sürebilir.
Bu zorluklara rağmen, bu yöntem ilk kez Zn2+ ekstrüzyon işleminin dinamiklerini incelememize izin veriyor. Süreci basitleştirir ve önceki yöntemlere kıyasla nedensel bağlantıları daha iyi kurmanın doğrudan bir yolunu oluşturur23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Raz Zarivach, İsrail Bilim Vakfı tarafından desteklenmektedir (hibe no. 163/22). Tomer, Eli Ben Yosef ve Arie Moran, İsrail Bilim Vakfı tarafından desteklenmektedir (hibe no. 2047/20). Daniel Gitler ve Ben-Gurion Üniversitesi'ndeki grubuna işbirlikleri, destekleri ve uzmanlıkları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Sigma Aldrich | 31665 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d, Findley, S. d Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M.
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
