Summary
ثبت أن نقل الزنك يمثل صعوبة في القياس بسبب ضعف الروابط السببية لوظيفة البروتين والدقة الزمنية المنخفضة. يصف هذا البروتوكول طريقة للمراقبة ، بدقة زمنية عالية ، قذف Zn 2+ من الخلايا الحية باستخدام صبغة فلورية حساسة ل Zn 2+ ، وبالتالي توفير قياس مباشر لتدفق Zn2+.
Abstract
يجب تنظيم المعادن الانتقالية مثل أيونات Zn2+ بإحكام بسبب سميتها الخلوية. في السابق ، تم قياس نشاط ناقلات Zn 2+ بشكل غير مباشر عن طريق تحديد مستوى تعبير الناقل تحت تركيزات مختلفة من Zn2+. تم ذلك عن طريق استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، أو قياس mRNA في الأنسجة ، أو تحديد مستويات Zn2+ الخلوية. مع تطور مستشعرات Zn 2+ داخل الخلايا ، يتم تحديد أنشطة ناقلات الزنك حاليا بشكل أساسي من خلال ربط التغييرات في Zn 2+ داخل الخلايا ، والتي تم اكتشافها باستخدام مجسات الفلورسنت ، مع التعبير عن ناقلات Zn2+. ومع ذلك ، حتى اليوم ، هناك عدد قليل فقط من المختبرات التي تراقب التغيرات الديناميكية في Zn2+ داخل الخلايا وتستخدمها لقياس نشاط ناقلات الزنك مباشرة. جزء من المشكلة هو أنه من بين 10 ناقلات الزنك من عائلة ZnT ، باستثناء ZnT10 (ينقل المنغنيز) ، يتم توطين ناقل الزنك 1 (ZnT1) فقط في غشاء البلازما. لذلك ، من الصعب ربط نشاط النقل بالتغيرات في تركيز Zn2+ داخل الخلايا. توضح هذه المقالة طريقة مباشرة لتحديد حركية نقل الزنك باستخدام مقايسة تعتمد على صبغة فلورية خاصة بالزنك ، FluoZin-3. يتم تحميل هذه الصبغة في خلايا الثدييات في شكل استر ثم يتم احتجازها في السيتوسول بسبب نشاط ثنائي الإستراز الخلوي. يتم تحميل الخلايا ب Zn 2+ باستخدام بيريثيون الأيونوفور Zn2+. يتم تقييم نشاط ZnT1 من الجزء الخطي من الانخفاض في التألق بعد غسل الخلية. يتناسب التألق المقاس عند إثارة 470 نانومتر وانبعاث 520 نانومتر مع Zn2+ الحر داخل الخلايا. يسمح اختيار الخلايا التي تعبر عن ZnT1 الموسومة بفلوروفور mCherry بمراقبة الخلايا التي تعبر عن الناقل فقط. يستخدم هذا الفحص للتحقيق في مساهمة المجالات المختلفة لبروتين ZnT1 في آلية نقل ZnT1 البشري ، وهو بروتين عبر غشاء حقيقي النواة يقذف الزنك الزائد من الخلية.
Introduction
الزنك هو عنصر تتبع أساسي في الوسط الخلوي. وهو يشتمل على ثلث جميع البروتينات ويشارك في عمليات خلوية مختلفة ، مثل الحفز1 والنسخ2 والزخارف الهيكلية3. ومع ذلك ، على الرغم من كونها خاملة الأكسدة والاختزال ، فإن تركيزات الزنك العالية سامة للخلية ، وهذا هو السبب في عدم بقاء أي كائن حي في الثدييات دون وجود آليات تنظم توازن الزنك. في الثدييات ، هناك ثلاث آليات مسؤولة عن هذه العملية: (1) ميتالوثيونين ، وهي بروتينات غنية بالسيستين الخلوي تربط الزنك بتقارب عال ، وبالتالي تمنع الزنك الخلوي الحرالزائد 4 ؛ (2) البروتينات الشبيهة ب Zrt / IRT (ZIPs) ، وهي ناقلات الزنك المسؤولة عن تدفق الزنك إلى السيتوسول من خلال غشاء البلازما أو من العضيات داخل الخلايا4،5،6،7،8 ؛ و (3) ZnTs ، وهي مجموعة فرعية من الثدييات من عائلة ميسر الانتشار الكاتيوني في كل مكان (CDF) وهي ناقلات الزنك ، لأنها تقذف الزنك من السيتوسول عبر غشاء البلازما أو إلى العضيات داخل الخلايا4،5،6،7،8،9. نظرا لأهمية الزنك في التمثيل الغذائي الخلوي ، من الضروري فهم ديناميكيات الزنك الخلوية.
اعتمدت الطرق السابقة لتقييم ديناميكيات الزنك على تقييم مستويات التعبير عن mRNA في ظل ظروف الزنك المختلفة من خلال ربطها بقياسات الزنك الخلوية للأنسجة أو الخلايا الثابتة10،11،12. وتشمل هذه الطرق الكشف الكيميائي وتلطيخ الكيمياء المناعية. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لا تسفر إلا عن مقاييس غير مباشرة ، وبالتالي ، تحدد فقط وجود علاقة غير متصلة بالإنترنت بين تركيز الزنك داخل الخلايا والتعبير عن ناقلات الزنك. وبالتالي ، لا يمكن لهذه الطرق استنتاج أي معلمات تتطلب دقة زمنية عالية.
يستخدم القياس المباشر لنقل Zn2+ النظائر المشعة للزنك13. تعتمد هذه الطريقة على قياس Zn2+ المشع لمراقبة انتقال الزنك وحركيته. ومع ذلك، نظرا لأهمية الزنك في الاتزان الخلوي، تنظم العمليات الخلوية المتعددة تركيز الزنك داخل الخلايا. من بينها الربط خارج الخلية والعديد من أنظمة النقل التي تعمل بشكل متضافر للحفاظ على رقابة صارمة على مستويات Zn2+ داخل الخلايا. يؤدي الجمع بين هذه العمليات إلى حدوث ضوضاء كبيرة في الخلفية ، مما يجعل من الصعب اختبار وظائف النقل الفردية المتعلقة بالزنك.
توضح هذه المقالة طريقة لمراقبة معدل نقل الزنك مباشرة عن طريق قياس تركيز الزنك الحر داخل الخلايا باستخدام صبغة فلورية خاصة بالزنك ، FluoZin-3. تتميز الصبغة بخصوصية عالية ل Zn2+ وتداخل قليل من الكاتيونات ثنائية التكافؤ الأخرى ، مثل الكالسيوم. بالإضافة إلى ذلك ، في شكل استر ، يدخل الخلايا عن طريق الانتشار غير الأيوني ثم يتم احتجازه بسبب نشاط ثنائي الإستراز داخل الخلايا. وبالتالي ، يرتبط مضانه في المقام الأول مع تركيز الزنك الخلوي الحر. أجريت هذه التجارب لدراسة العلاقة بين البنية والوظيفة لناقل الزنك 1 (ZnT1) ، وهو عضو في عائلة ZnT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. نقل الخلايا
- HEK293T الخلايا المستنبتة في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، و 2 mM L-glutamine ، و 1x البنسلين / الستربتومايسين (انظر جدول المواد) في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO2 حتى التقائه على صفيحة 10 سم (8.8 × 106 خلايا إجمالية).
- ضع غطاء واحد 13 مم في كل بئر من آبار صفيحة 12 بئرا. تمييع 0.44 × 106 خلايا تربسين من الخطوة 1.1 في 12 مل من DMEM الكامل. تخلط جيدا عن طريق سحب اللأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات. املأ كل بئر ب 1 مل من المحلول المختلط. تنمو في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
- استبدل DMEM الكامل في كل بئر ب 1 مل من DMEM الخالي من المصل (انظر جدول المواد) في كل بئر. أعد اللوحة المكونة من 12 بئرا إلى الحاضنة المرطب كما في الخطوة 1.1.
- لكل بئر نقل ، قم بتخفيف 1 ميكروغرام من بلازميد pAAV2 الذي يحتوي على البروتين محل الاهتمام الموسوم ببروتين الفلورسنت mCherry (الملف التكميلي 1) في 100 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل في أنبوب 1.5 مل.
- أضف 3 ميكروغرام من البولي إيثيلين (PEI ، انظر جدول المواد) إلى 100 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل لكل عملية نقل ، مع كل نقل في أنبوب مختلف سعة 1.5 مل. يجب أن تكون نسبة البلازميد: PEI 1: 3 (μg: μg).
- دوامة كلا الأنبوبين من الخطوة 1.4 والخطوة 1.5 لمدة 10 ثوان ، واتركيها ترتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على الأقل.
- امزج جزءا واحدا (100 ميكرولتر لكل بئر) من محلول الحمض النووي من الخطوة 1.4 مع جزء واحد (100 ميكرولتر لكل بئر) من محلول PEI من الخطوة 1.5. دوامة الحل النهائي لمدة 10 ثوان ، واتركه يرتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على الأقل ولمدة تصل إلى 6 ساعات.
- خذ لوحة 12 بئرا من الحاضنة. دوامة الحل النهائي من الخطوة 1.7 ، وإضافة 200 ميكرولتر إلى كل من الآبار في لوحة 12 بئر من الخطوة 1.3. أعد اللوحة المكونة من 12 بئرا إلى الحاضنة المرطب (الخطوة 1.1).
- بعد 3 ساعات ، استبدل الوسط في كل بئر ب 1 مل من DMEM الكامل. أعد اللوحة المكونة من 12 بئرا إلى الحاضنة المرطب كما في الخطوة 1.1.
- بعد يومين ، خذ مزرعة الخلايا المنقولة من حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ CO2 ، وضعها على مجهر مضان مقلوب باستخدام تكبير 10x.
- باستخدام عجلة التركيز المجهرية ، ركز على الخلايا أثناء استخدام ضوء برايتفيلد.
- قم بالتبديل إلى الأطوال الموجية للإثارة الفلورية mCherry (587 نانومتر) والانبعاثات (610 نانومتر) ، وأطفئ ضوء برايتفيلد. تحقق من مضان الخلايا لتأكيد تعبير ZnT1 mCherry.
- تحضير محلول تحميل الصبغة.
- خذ حصة من 4 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت الخاصة بالزنك (انظر جدول المواد) في شكل إستر أسيتوكسي ميثيل (AM) ، مذاب في DMSO (1 ميكروغرام / ميكرولتر) ، من مخزون محمي من الضوء مخزن في مجمد -20 درجة مئوية. يسمح هذا النموذج للصبغة بدخول الخلية عبر غشاء البلازما عن طريق الانتشار البسيط.
- أضف 4 ميكرولتر من حمض البلورونيك 10٪ (أو 2 ميكرولتر من حمض البلورونيك 20٪ ، انظر جدول المواد) إلى القسمة من الخطوة 1.13.1. امزج المحلول جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ثلاث مرات ، ثم أضف كل 8 ميكرولتر إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
- أضف 750 ميكرولتر من محلول رينغر (المحضر داخليا ، انظر جدول المواد للتركيب) المكمل ب 1 مجم / مل (~ 0.1٪) من ألبومين مصل الأبقار إلى الأنبوب من الخطوة 1.13.2 ، والدوامة بقوة. أضف 750 ميكرولتر أخرى من نفس المحلول ، ودوامة مرة أخرى لضمان أقصى قدر من الخلط.
- أضف 750 ميكرولتر من المحلول النهائي من الخطوة 1.13.3 إلى بئرين في لوحة استزراع جديدة مكونة من 6 آبار. مع تغطية رقائق الألومنيوم.
ملاحظة: لتجنب التبييض ، يتم دائما تغطية اللوحة المكونة من 6 آبار بورق الألمنيوم من هذه الخطوة. - باستخدام ملقط ناعم ، خذ ما يصل إلى أربع أغطية مكررة من لوحة زراعة الخلايا المنقولة ، وضعها في أول بئر مملوء (حتى أربع شرائح لكل بئر) من اللوحة الجديدة المكونة من 6 آبار من الخطوة 1.14. كرر هذه العملية للبئر الثانية المملوءة.
ملاحظة: يجب أن تكون جميع أغطية الأغطية في نفس البئر المملوءة من نفس الحالة. ومع ذلك ، يمكن أن يحتوي كل بئر على ظروف مختلفة. - يغطى بورق الألمنيوم ويهز برفق لمدة 15-20 دقيقة.
- قم بإزالة محلول تحميل الصبغة واستبدله بمحلول غسيل جديد من ألبومين Ringer's plus ، كما هو مستخدم في الخطوة 1.13.3. مع تغطية رقائق الألومنيوم. اتركيه ليهز مرة أخرى لمدة 20 دقيقة. هذا يسمح بانقسام إستر AM بواسطة الإسترازات داخل الخلايا.
2. إعداد المجهر
- رتب الأدوات اللازمة (انظر جدول المواد) كما ذكرنا: مجهر مضان مقلوب قادر على اكتشاف GFP و mCherry fluorophores ، ونظام نضح يسمح بالتبديل بين محلولين على الأقل ، ونظام شفط ، وغرفة تروية.
- قم بتشغيل المجهر ومصدر الضوء والكاميرا. قم بتشغيل نظام الشفط.
- اغسل نظام التروية. اغسل الحجرة الأولى بمحلول رينغر والغرفة الثانية بمحلول رينغر الذي يحتوي على محلول زنك 7 ميكرومتر مكمل ببيريثيون 7 ميكرومتر (أيونوفور الزنك ، انظر جدول المواد). لتجنب فقاعات الهواء أو الفجوات ، اترك بعض السوائل في كل غرفة.
ملاحظة: نظرا لأن كلتا الحاويتين متصلتان بنفس الأنبوب المتصل بغرفة التروية ، تأكد دائما من غسل الجزء المشترك بمحلول Ringer. - أغلق الصنابير ، واملأ الغرف المناسبة بمحلول Ringer ومحلول الزنك من Ringer ، كما في الخطوة 2.3.
3. إعداد عينة
- خذ غرفة التروية ، وضعها مع الجانب الضيق من الأخدود متجها لأعلى.
ملاحظة: الأخدود عبارة عن ثقب في منتصف غرفة التروية. يسمح لسائل التروية بالوصول إلى الخلايا. جانب واحد من الأخدود ضيق ، والجانب الآخر واسع. - ضع سيليكون مانع للتسرب (انظر جدول المواد) حول الأخدود. نظف أي سيليكون مانع للتسرب من الأخدود باستخدام طرف ماصة.
ملاحظة: تأكد من وجود ختم سيليكون كاف حول الأخدود لإغلاق غطاء 22 مم. - باستخدام ملقط ناعم ، خذ غطاء من محلول الغسيل ، وضعه أعلى الأخدود مع توجيه الخلايا لأسفل. بهذه الطريقة، ستتعرض الخلايا للمحلول الذي يثقب الأخدود أثناء التجربة.
- ضع غطاء 22 مم فوق غطاء الغطاء مقاس 13 مم ، وقم بإحكام ربطه باستخدام الملقط. احرص على عدم تكسير الغطاء.
- اقلب الحجرة واضغط عليها لتحرير جميع السوائل الموجودة. املأ الأخدود ب 100 ميكرولتر من محلول غسيل Ringer ، واضغط مرة أخرى لضمان عدم حدوث تسرب.
ملاحظة: إذا تم اكتشاف تسرب ، فقم بتطبيق عامل مانع للتسرب في موقع التسرب ، وأعد الاختبار. - قم بتركيب حجرة التروية على المنصة وتأمينها. ضع أنابيب التروية والشفط للسماح بالتروية فوق الخلايا الموجودة في الأخدود.
- قم بتغيير معدل التروية إلى حوالي 2 مل / دقيقة ، وقم بتشغيل تروية محلول رينجر. تأكد من أن نظام التروية يعمل بدون تسرب أو امتداد.
4. إعداد القياس
- افتح برنامج التصوير (انظر جدول المواد) بالنقر المزدوج على الرمز. قم بتسجيل الدخول باستخدام بيانات الاعتماد ذات الصلة. اختر الكاميرا المرفقة، واضغط على موافق.
- اضبط تكبير المجهر على 10x باستخدام الزر الموجود على الجانب الأيسر من المجهر.
- عند اختيار العرض المباشر واستخدام عصا التحكم ، حرك النظام الأساسي للتركيز على الخلايا الموجودة في الأخدود.
- أثناء تشغيل التروية ، أطفئ الأنوار وقم بتغيير الطول الموجي إلى mCherry بالضغط على الزر المخصص في الواجهة. اضبط التركيز باستخدام عجلة التركيز المجهرية.
- بمجرد تركيز المجهر على الخلايا ، حرك المنصة باستخدام عصا التحكم للسماح باختيار بقع الخلايا المناسبة.
ملاحظة: تعتبر المنطقة المناسبة منطقة بها 10 خلايا على الأقل لعائد الاستثمار ومنطقة فارغة للخلفية. - حدد القائمة المنسدلة تشغيل /إيقاف تشغيل عائد الاستثمار ، واختر رسم عائد استثمار دائري.
- ارسم عائد استثمار لمجموعات الخلايا باستخدام الخلايا المعبرة عن mCherry (يشير إلى تعبير ZnT1).
- من شريط الأدوات نفسه مثل الخطوة 4.6 ، انقر فوق الزر تشغيل / إيقاف تشغيل عائد الاستثمار في الخلفية ، واضبط موقع وحجم عائد الاستثمار في الخلفية على منطقة لا تحتوي على خلايا على الإطلاق.
- تحقق من الأطوال الموجية mCherry و EGFP للتأكد من عدم وجود خلايا في عائد الاستثمار المحدد في الخلفية.
ملاحظة: تم تعديل الأطوال الموجية بحيث استخدم mCherry طولا موجيا للإثارة يبلغ 520 نانومتر وطولا موجيا للانبعاث يبلغ 610 نانومتر واستخدم EGFP طولا موجيا للإثارة يبلغ 470 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 520 نانومتر.
- تحقق من الأطوال الموجية mCherry و EGFP للتأكد من عدم وجود خلايا في عائد الاستثمار المحدد في الخلفية.
- حدد علامة التبويب الفرعية الطول الموجي (λ ). حدد خانة الاختيار الخاصة به ، وتأكد من وجود الطول الموجي ل GFP ووضع علامة على خانة الاختيار الخاصة به. إذا لم يكن كذلك ، قم بإضافته ووضع علامة عليه.
- حدد علامة التبويب الفرعية المدة . حدد الفاصل الزمني للقياس على أنه كل 5 ثوان ، وقم بتغيير عدد الفواصل الزمنية لتناسب مدة التجربة.
- في قسم التركيز على لوحة المجهر أسفل العدسة ، انقر فوق الزر تشغيل لتمكين نظام التركيز المثالي (PFS).
- باستخدام عجلة التركيز PFS ، اضبط التركيز. في واجهة البرنامج ، ضمن الاستحواذ على ND ، تأكد من وضع علامة على PFS .
- انقر فوق تشغيل الآن.
5. الإجراء التجريبي
- ابدأ بقياس فترة خط الأساس 90 ثانية باستخدام نضح محلول رينغر.
- بعد انتهاء فترة خط الأساس، قم بإيقاف تشغيل نضح محلول رينغر، ثم قم بتشغيل نضح محلول الزنك الخاص ب Ringer. حدد تبديل الحل بالنقر فوق العلم الأحمر في أسفل يمين لوحة الواجهة الرئيسية. من المتوقع أن يظهر ارتفاع في التألق.
- بمجرد أن يبدأ ارتفاع التألق في التشبع ، قم بالتغيير مرة أخرى إلى التروية باستخدام محلول رينجر. قم بإيقاف تشغيل نضح محلول الزنك في Ringer ، ثم قم بتشغيل نضح محلول Ringer.
- انتظر حتى انتهاء وقت التجربة. من المتوقع حدوث انخفاض ملحوظ وثابت في التألق إذا كان ZnT1 يعمل بشكل صحيح.
6. تصدير البيانات
- لتصدير البيانات باستخدام طرح خط الأساس ، اضغط على الزر طرح خط الأساس ، واعرض التغييرات في "نافذة اكتساب ND".
- انقر فوق الزر تصدير في واجهة البرنامج في "نافذة اكتساب ND". سيتم فتح ورقة بيانات Excel. حفظ في الموقع المطلوب.
7. تحليل البيانات
- لكل عائد استثمار ، قم بإنشاء متوسط مضان خط الأساس من أول 90-100 ثانية.
- عبر عن التألق المحسوب لكل عائد استثمار كنسبة مئوية من خلفية عائد الاستثمار هذا.
- قم بإنشاء متوسط صف لجميع عائد الاستثمار ، وارسم النتيجة كرسم بياني خطي. هذا يخلق متوسط جميع عائد الاستثمار كدالة للوقت.
- باستخدام وظيفة الملاءمة الخطية، حدد المعدل الأولي للانخفاض في التألق بعد الغسيل بمحلول رينغر. ترتبط قيمة ميل المعادلة بمعدل النقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZnT1 هو ناقل زنك للثدييات يقع على غشاء بلازما الخلية13. وهو عضو في عائلة بروتين ميسر الانتشار الكاتيوني (CDF) الذي يقذف الزنك من السيتوسول إلى ميليو14 خارج الخلية. يحتوي ZnT1 على بنية ذات مجالين: المجال عبر الغشاء ، الذي ينقل الأيونات عبر الغشاء ، والمجال الطرفي C14. على عكس بروتينات CDF المعروفة الأخرى ، يحتوي ZnT1 على مجال C-terminal غير منظم ممتد (USCTD). دور USCTD غير معروف حاليا. استخدمنا البروتوكول أعلاه لمقارنة ZnT1 WT ب ZnT1 بدون USCTD لتقييم مشاركته في نشاط نقل الزنك.
تم نقل خلايا HEK 293T باستخدام بلازميد pAAV2 الذي يحتوي إما على ZnT1 WT أو ZnT1 بدون الطرف C غير المنظم (ΔUSCTD) واختبر معدل نشاط النقل كما هو موضح أعلاه. يوضح الشكل التكميلي 1 أن كلا الإصدارين من ZnT1 يعبران عن غشاء البلازما ويحددانه دون أي مشاكل. يوضح الشكل 1 النتائج النموذجية لمثال على مثل هذه التجربة. الزيادة في التألق هي نتيجة لزيادة تركيز Zn 2+ داخل الخلايا ، في حين أن الانخفاض هو نتيجة لنشاط ZnT1 الذي ينقل Zn2+ عبر غشاء الخلية (توجد الرسوم البيانية الفردية ، بما في ذلك الأخطاء القياسية ، في الشكل التكميلي 2 والشكل التكميلي 3). يتضح من هذا الشكل أن ZnT1 WT لديه منحنى مضان أكثر سلاسة من المتحول. ومع ذلك ، هذه ليست سمة مميزة متأصلة ولكنها مرتبطة بالتباين في الاستجابات الخلوية لحمل الزنك ، والذي لوحظ في التجارب السابقة. يوضح الشكل 2 مخططا صندوقيا يلخص نتائج 15-17 تجربة من هذا القبيل. من الشكل ، من الواضح أن ΔUSCTD يقدم انتشارا أوسع لأسعار النقل مقارنة ب WT. في حين أن هذا يمكن أن يعزى إلى تباين الاستجابة الخلوية المذكورة سابقا ، إلا أنه قد يشير أيضا إلى اختلاف وظيفي. على سبيل المثال ، قد يعني ذلك أن مقطع ZnT1 USCTD هو معدل لمعدل النقل. من الواضح أنه لا يوجد فرق واضح بين أنشطة بثق الزنك2+ ل WT و ΔUSCTD. بناء على التحليل الإحصائي ، لم يتم توزيع البيانات بشكل طبيعي (مجموعة بيانات WT ، اختبار Shapiro-Wilk15 ، إحصائي = 0.72404 ، قيمة p = 0.0004) ، لذلك تم استخدام اختبارين غير معلميين للمقارنة بين مجموعات البيانات. أظهرت النتائج أنه لا يوجد فرق إحصائي بين معدلات النقل (اختبار Mann-Whitney16 U: U = 132 ، Z = 0.15105 ، Asymp. >|U| = 0.87994; اختبار كولموغوروفسميرنوف 17: D = 0.27059 ، Z = 0.76384 ، الاحتمال الدقيق > |D|= 0.5161).
نظرا للتكلفة النشطة الكبيرة لإنشاء الامتداد غير المنظم (~ 80 من الأحماض الأمينية) ، فمن المعقول افتراض أن هذا المجال يخدم وظيفة خلوية. ومع ذلك ، لم يتم تحديد وظيفة خلوية مرتبطة بهذا المجال حتى الآن. هذا النطاق فريد ل ZnT1 ولا يوجد في أي أفراد آخرين من عائلة ZnT. على هذا النحو ، قد يكون ذلك بسبب حقيقة أنه ، على عكس ZnTTs الأخرى ، يقع ZnT1 في غشاء البلازما ، بينما باستثناء ZnT10 ، يتم التعبير عن جميع الأعضاء الأخرى في عضيات داخلية.
تستند البيانات الأولية والرسوم البيانية اللاحقة الموضحة هنا إلى قياسات فاصلة مدتها 5 ثوان للتألق الناجم عن الصبغة الحساسة للزنك. هذا يعني أنه في إطار زمني قصير نسبيا (دقائق) ، يمكن إنشاء تصور لانتقال الزنك المعتمد على الوقت بدقة زمنية عالية. يجب أن يتضمن التحليل تطبيع فترة خط الأساس حيث يتم تحميل الصبغة في الخلايا قبل تحميل الزنك وقد يكون لها مضان أولي داخل الخلايا ناتج عن كمية صغيرة من الزنك الحر. بالإضافة إلى ذلك ، تصبح صبغة الزنك نشطة بشكل فلوري فقط بعد الانقسام بواسطة الإستراز داخل الخلايا. لذلك ، يوصى بإتاحة بعض الوقت لعملية إزالة الأسترة لمعظم الصبغة لتجنب أنماط التألق غير المنتظمة الناتجة عن انشقاق إستر الصبغة طوال التجربة.
الشكل 1: أنشطة بثق الزنك2+ ل WT و ΔUSCTD باستخدام مقايسة نقل الزنك. المحور السيني هو الوقت بالثواني. المحور ص هو التغير الفلوري المعبر عنه كنسبة مئوية من خط الأساس. الرسوم البيانية الخطية هي التغير الفلوري كدالة للوقت. يبلغ متوسط البيانات أكثر من >10 عائد استثمار. الرسوم البيانية الفردية مع الخطأ المعياري موضحة في الشكل التكميلي 2 والشكل التكميلي 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقارنة بين أنشطة ZnT1 WT و ΔUSCTD المصورة على شكل مخطط صندوقي. تمثل كل نقطة بيانات تجربة واحدة. يشير الخط الأسود إلى متوسط الدرجات. يشير المربع المجوف إلى متوسط الدرجات. يشير المحور ص إلى التغير في النسبة المئوية الأساسية في الثانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: خلايا HEK 293T المنقولة ب (A) ZnT1 WT أو (B) ZnT1 ΔUSCTD المحفزة في الأطوال الموجية mCherry (520 نانومتر) والانبعاث (610 نانومتر). في كلتا الحالتين ، هناك تعبير وتوطين غشاء لمتغير ZnT1. تكبير المجهر هو 20x. مدة التعرض 100 مللي ثانية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: ZnT1 WT Zn2+ نقل النشاط مع تصور الخطأ القياسي. المحور السيني هو الوقت بالثواني. المحور ص هو النسبة المئوية للتغير الفلوري من مضان خط الأساس. الخط الأسود هو متوسط التغير الفلوري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: ZnT1 ΔUSCTD Zn2+ نشاط النقل مع تصور الخطأ القياسي. المحور السيني هو الوقت بالثواني. المحور ص هو النسبة المئوية للتغير الفلوري من مضان خط الأساس. الخط الأحمر هو متوسط التغير الفلوري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 1: تسلسل البلازميد pAAV2. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تسمح الطريقة الموصوفة أعلاه بالقياس المباشر لتركيز الزنك داخل الخلايا بدقة زمنية عالية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، يمكن لهذه الطريقة التي تتضمن مراقبة التغييرات في Zn2+ داخل الخلايا أن تقلل بشكل كبير من ضوضاء الخلفية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن انتقائية الصبغة للزنك تقضي على التفاعلات المتقاطعة المحتملة مع الكاتيونات المعدنية الأخرى18,19. أخيرا ، يتيح افتقارها إلى السمية الخلوية الفورية اختبار العمليات الخلوية الحية19.
ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها قيود معينة. أولا ، يمكن أن يكون اكتشاف الديناميكيات داخل الخلايا أكثر صعوبة نسبيا مع هذا البروتوكول ، نظرا لأن الصبغة المستخدمة في هذه الطريقة مصممة لتكون محاصرة في الخلية ولكن لا يمكن توجيهها إلى مناطق أو عمليات محددة. يمكن توجيه الأصباغ الفلورية الأخرى إلى منطقة معينة في الخلايا ، ولكن لسوء الحظ ، لها نطاق ديناميكي أقل بكثير20. ثانيا ، يؤدي تعرض الصبغة للضوء إلى انخفاض في التألق بسبب التبييض ، مما يحد من وقت التعرض للضوء ، وبالتالي النافذة النشطة لإجراء التجربة. ثالثا ، يعد تحميل الصبغة في هذا البروتوكول مرهقا ويستغرق وقتا طويلا عند مقارنته باستخدام الأصباغ الأخرى ، وخاصة الأصباغ المشفرة وراثيا21. أخيرا ، حتى بعد شق الإسترات ، تتسرب الصبغة ، مما يؤدي إلى انخفاض مستقل عن الزنك 2+ في التألق22.
يجب اتخاذ عدة خطوات لضمان نجاح التجربة. أولا ، نظرا لأنه يمكن توزيع النقل بشكل غير متساو ، يجب أن تحتوي الخلايا المختارة على البروتين محل الاهتمام. لتجنب تبييض الصبغة ، من المهم الحفاظ على الخلايا المحملة محمية من الضوء. عند إجراء التجربة ، يجب أن يكون معدل التروية كافيا لإكمال التجربة دون التسبب في انفصال الخلايا عن الغطاء. في حالة التشغيل المتعدد ، يوصى بالاحتفاظ بنفس الخزانات لمحلول Ringer ومحلول الزنك من Ringer. يمكن تعديل وقت تحميل الصبغة ووقت الغسيل وفقا للتجارب الأولية. يمكن أن يستغرق تحميل الزنك في الخلايا عن طريق التروية مع البيريثيون من 1 دقيقة إلى 5 دقائق ، كما تم تقييمه من خلال مراقبة التألق الناجم عن الزنك2+ مع مرور الوقت.
على الرغم من هذه الصعوبات ، تسمح لنا هذه الطريقة ، لأول مرة ، بدراسة ديناميكيات عملية بثق Zn2+. إنه يبسط العملية ويخلق طريقة مباشرة لإنشاء روابط سببية بشكل أفضل مقارنة بالطرق السابقة23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
راز زاريفاخ مدعوم من صندوق العلوم الإسرائيلي (منحة رقم 163/22). يتم دعم تومر إيلي بن يوسف وآري موران من قبل مؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة رقم 2047/20). نود أن نشكر دانيال جيتلر ومجموعته في جامعة بن غوريون على تعاونهم ودعمهم وخبرتهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Sigma Aldrich | 31665 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d, Findley, S. d Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M.
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
