Summary
由于与蛋白质功能的因果关系较弱且时间分辨率低，锌转运已被证明具有挑战性。该协议描述了一种通过使用Zn 2 +敏感荧光染料以高时间分辨率监测活细胞中Zn 2 +挤出的方法，从而提供Zn2 +外排的直接测量。
Abstract
过渡金属（如Zn2+离子）由于其细胞毒性而必须受到严格调控。以前，通过测定不同浓度Zn2+下转运蛋白的表达水平来间接测量Zn2+转运蛋白的活性。这是通过利用免疫组化、测量组织中的 mRNA 或确定细胞 Zn2+ 水平来完成的。随着细胞内Zn 2+传感器的发展，锌转运蛋白的活性目前主要通过关联使用荧光探针检测的细胞内Zn 2+的变化与Zn2+转运蛋白的表达来确定。然而，即使在今天，也只有少数实验室监测细胞内Zn2+的动态变化，并用它来直接测量锌转运蛋白的活性。部分问题在于，在ZnT家族的10种锌转运蛋白中，除了ZnT10（转运锰）外，只有锌转运蛋白1（ZnT1）位于质膜上。因此，将转运活性与细胞内Zn2+浓度的变化联系起来是很困难的。本文介绍了一种使用基于锌特异性荧光染料 FluoZin-3 的测定法确定锌传输动力学的直接方法。这种染料以酯的形式加载到哺乳动物细胞中，然后由于细胞二酯酶活性而被困在胞质溶胶中。细胞利用锌2+ 离子载体吡硫酮加载锌 2+。ZnT1活性从细胞洗脱后荧光减少的线性部分评估。在 470 nm 激发和 520 nm 发射下测量的荧光与游离细胞内 Zn2+ 成正比。选择用mCherry荧光基团标记的表达ZnT1的细胞可以仅监测表达转运蛋白的细胞。该测定用于研究 ZnT1 蛋白的不同结构域对人 ZnT1 转运机制的贡献，ZnT1 是一种从细胞中挤出过量锌的真核跨膜蛋白。
Introduction
锌是细胞环境中必需的微量元素。它包含所有蛋白质的三分之一，并参与各种细胞过程，例如催化1、转录2 和结构基序3。然而，尽管是氧化还原惰性的，但高浓度的锌对细胞有毒，这就是为什么没有哺乳动物生物体在没有调节锌稳态的机制的情况下生存的原因。在哺乳动物中，有三种机制负责这一过程：（1）金属硫蛋白，它是富含胞质半胱氨酸的蛋白质，以高亲和力结合锌，从而防止过量的游离胞质锌4;（2） Zrt/Irrt 样蛋白 （ZIP），它们是锌转运蛋白，负责锌通过质膜或细胞内细胞器流入胞质溶胶 4,5,6,7,8;（3） ZnTs，是无处不在的阳离子扩散促进剂 （CDF） 家族的哺乳动物亚群，是锌转运蛋白，因为它们将锌从胞质溶胶挤出穿过质膜或进入细胞内细胞器4,5,6,7,8,9。由于锌对细胞代谢的重要性，了解细胞锌动力学至关重要。
以前评估锌动力学的方法依赖于通过将mRNA与固定组织或细胞的细胞锌测量值相关联来评估不同锌条件下mRNA的表达水平10,11,12。这些方法包括化学检测和免疫组化染色。然而，这些方法只能产生间接测量，因此只能确定细胞内锌浓度与锌转运蛋白表达之间的离线相关性。因此，这些方法无法推断任何需要高时间分辨率的参数。
锌2+ 输运的更直接测量使用锌13的放射性同位素。该方法依赖于放射性标记Zn2+ 的测量来监测锌的传输及其动力学。然而，由于锌对细胞稳态的重要性，多个细胞过程调节细胞内锌浓度。其中包括细胞外结合和几种协同工作以维持细胞内 Zn2+ 水平的严格控制的运输系统。这些过程的结合会产生相当大的背景噪声，这使得测试单个与锌相关的传递函数变得困难。
本文展示了一种通过使用锌特异性荧光染料 FluoZin-3 测量细胞内游离锌浓度来直接监测锌转运速率的方法。该染料对Zn2+ 具有高度特异性，并且几乎不受其他二价阳离子（如钙）的干扰。此外，以酯的形式，它通过非离子扩散进入细胞，然后由于细胞内二酯酶的活性而被捕获。因此，其荧光主要与游离胞质锌浓度相关。这些实验旨在研究锌转运蛋白1（ZnT1）的结构-功能关系，ZnT1是ZnT家族的成员。
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Protocol
1. 细胞转染
- 在补充有10%胎牛血清（FBS），2mM L-谷氨酰胺和1x青霉素/链霉素（参见 材料表）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞在37°C / 5%CO2 的湿润培养箱中培养，直到汇合在10cm平板上（8.8×106 个细胞）。
- 将一个 13 mm 盖玻片放入 12 孔板的每个孔中。在 12 mL 完全 DMEM 中稀释步骤 1.1 中的 0.44 x10 6 个胰蛋白酶消化细胞。通过上下移液三到五次充分混合。用 1 mL 混合溶液填充每个孔。在37°C / 5%CO2 的潮湿培养箱中生长过夜。
- 用每个孔中 1 mL 无血清 DMEM（参见 材料表）替换每个孔中的完整 DMEM。如步骤1.1所示，将12孔板放回加湿的培养箱中。
- 对于每个转染孔，在 1.5 mL 试管中的 100 μL 无血清 DMEM 中稀释 1 μg 含有用 mCherry 荧光蛋白标记的目标蛋白（补充文件 1）的 pAAV2 质粒。
- 每次转染将 3 μg 聚乙烯亚胺（PEI，参见 材料表）加入 100 μL 无血清 DMEM 中，每次转染在不同的 1.5 mL 试管中。质粒：PEI比例应为1：3（μg：μg）。
- 将步骤1.4和步骤1.5中的两个管涡旋10秒，并在室温下静置至少5分钟。
- 将步骤1.4中的一份（每孔100μL）DNA溶液与步骤1.5中的一份（每孔100μL）PEI溶液混合。涡旋最终溶液10秒，并在室温下静置至少20分钟，最多6小时。
- 从培养箱中取出 12 孔板。涡旋步骤1.7的最终溶液，并向步骤1.3的12孔板中的每个孔中加入200μL。将 12 孔板放回加湿培养箱（步骤 1.1）。
- 3 小时后，用 1 mL 完全 DMEM 替换每个孔中的培养基。如步骤1.1所示，将12孔板放回加湿的培养箱中。
- 2天后，从37°C / 5%CO2 培养箱中取出转染的细胞培养物，并使用10倍放大倍率将其置于倒置荧光显微镜上。
- 使用显微镜对焦轮，在使用明场光的同时聚焦在细胞上。
- 切换到荧光 mCherry 激发 （587 nm） 和发射 （610 nm） 波长，并关闭明场光。检查细胞的荧光以确认ZnT1 mCherry的表达。
- 准备染料上样液。
- 从储存在-20°C冰箱中的避光原液中取出4μL锌特异性荧光染料（参见 材料表）的乙酰氧基甲基（AM）酯形式的等分试样，溶解在DMSO（1μg/ μL）中。这种形式允许染料通过简单的扩散通过质膜进入细胞。
- 将 4 μL 10% 普鲁酸（或 2 μL 20% 普鲁酸，参见 材料表）加入步骤 1.13.1 的等分试样中。通过上下移液 3 次充分混合溶液，然后将所有 8 μL 加入 1.5 mL 试管中。
- 从步骤1.13.2开始，向试管中加入补充有1mg / mL（~0.1%）牛血清白蛋白的750μL林格氏溶液（内部制备，参见 成分表 ），并剧烈涡旋。再加入 750 μL 相同的溶液，再次涡旋以确保最大混合。
- 将步骤 1.13.3 中的 750 μL 最终溶液加入新的 6 孔培养板中的两个孔中。用铝箔盖住。
注意：为避免漂白，从此步骤开始，6孔板始终用铝箔覆盖。 - 使用细镊子，从转染的细胞培养板中取出最多四个重复的盖玻片，并将它们置于步骤1.14中新的6孔板的第一个填充孔中（每孔最多四个载玻片）。对第二个填充孔重复此过程。
注意：同一填充孔中的所有盖玻片必须来自相同的条件。但是，每个井可以包含不同的条件。 - 盖上铝箔，轻轻摇晃15-20分钟。
- 除去染料上样液，并用新的林格氏加白蛋白洗涤液代替，如步骤1.13.3所示。用铝箔盖住。再次摇晃 20 分钟。这允许细胞内酯酶裂解AM酯。
2. 显微镜准备
- 如前所述安排必要的工具（参见 材料表）：能够检测 GFP 和 mCherry 荧光团的倒置荧光显微镜、允许在至少两种溶液之间切换的灌注系统、抽吸系统和灌注室。
- 打开显微镜、显微镜的光源和相机。打开抽吸系统。
- 清洗灌注系统。用林格氏溶液洗涤第一个腔室，用含有7μM锌溶液的林格氏溶液洗涤第二个腔室，该溶液补充有7μM吡啶硫酮（锌离子载体，参见 材料表）。为避免气泡或间隙，请在每个腔室中留出一些液体。
注意：由于两个容器都连接到连接到灌注室的同一根管子上，因此请始终确保用林格溶液洗涤共享段。 - 关闭水龙头，并用林格溶液和林格锌溶液填充适当的腔室，如步骤2.3所示。
3. 样品制备
- 取灌注室，将其放置，凹槽的窄边朝上。
注意：凹槽是灌注室中间的一个孔。它允许灌注液进入细胞。凹槽的一侧较窄，另一侧较宽。 - 在凹槽周围涂上密封硅胶（参见 材料表）。使用移液器吸头清洁凹槽中的任何密封硅胶。
注意： 确保凹槽周围有足够的硅胶密封件来密封 22 毫米的盖玻片。 - 使用细镊子，从洗涤液中取出盖玻片，并将其放在凹槽顶部，细胞朝下。这样，细胞将在实验过程中暴露于灌注凹槽的溶液中。
- 将 22 毫米盖玻片放在 13 毫米盖玻片的顶部，然后使用镊子拧紧。注意不要使盖玻片破裂。
- 翻转腔室，然后按压它以释放所有存在的液体。用 100 μL 林格氏洗涤液填充凹槽，然后再次按压以确保无泄漏。
注意： 如果检测到泄漏，请在泄漏部位涂抹密封剂，然后重新测试。 - 将灌注室安装到平台上，并将其固定。放置灌注管和抽吸管，使灌注在凹槽中的细胞上。
- 将灌注速率更改为约 2 mL/min，然后打开林格氏溶液的灌注。确保灌注系统在没有泄漏或溢出的情况下工作。
4. 测量准备
- 双击图标打开成像软件（参见 材料表）。使用相关凭据登录。选择连接的相机，然后按 确定。
- 使用显微镜左侧的按钮将显微镜放大倍率设置为10倍。
- 选择实时取景并使用操纵杆，移动平台以聚焦于凹槽中的单元格。
- 灌注打开时，关闭灯，按下界面中的专用按钮将波长更改为 mCherry。使用显微镜对焦轮调整焦距。
- 显微镜聚焦在细胞上后，使用操纵杆移动平台以选择合适的细胞贴片。
注意：合适的区域被认为是具有至少 10 个单元格的区域（用于 ROI）和空白区域（用于背景）。 - 选择打开/关闭 ROI 下拉菜单，然后选择绘制圆形 ROI。
- 用表达mCherry的细胞绘制细胞簇的ROI（指示ZnT1的表达）。
- 在与步骤 4.6 相同的工具栏中，单击“ 打开/关闭背景 ROI” 按钮，然后将背景 ROI 的位置和大小调整为完全没有单元格的区域。
- 检查 mCherry 和 EGFP 波长，以确保所选背景 ROI 中没有细胞。
注意：调整波长，使mCherry使用520 nm的激发波长和610 nm的发射波长，EGFP使用470 nm的激发波长和520 nm的发射波长。
- 检查 mCherry 和 EGFP 波长，以确保所选背景 ROI 中没有细胞。
- 选择 波长 （λ） 子选项卡。标记其复选框，并确保存在 GFP 波长并标记其复选框。如果没有，请添加并标记它。
- 选择 “持续时间 ”子选项卡。将测量间隔定义为每 5 秒一次，并更改间隔数以适应实验持续时间。
- 在目镜下方显微镜面板上的“对焦”部分，单击“打开”按钮以启用完美对焦系统 （PFS）。
- 使用 PFS 对焦轮调整对焦。在软件界面中，在 ND 采集下，确保勾选 PFS on 。
- 单击“ 立即运行”。
5.实验步骤
- 首先使用 Ringer 溶液灌注进行 90 秒基线期测量。
- 基线期结束后，关闭林格氏溶液灌注，然后打开林格氏锌溶液灌注。通过单击主界面面板右下角的红旗来标记解决方案的切换。预计会出现荧光的上升。
- 一旦荧光上升开始饱和，就用林格氏溶液变回灌注。关闭林格氏锌溶液灌注，然后打开林格氏溶液灌注。
- 等到实验时间到期。如果 ZnT1 工作正常，预计荧光会明显而稳定地下降。
6. 数据导出
- 要导出带有基线减法的数据，请按减 去基线 按钮，然后在“ND采集窗口”中查看更改。
- 单击“ND 采集窗口”软件界面中的 “导出 ”按钮。将打开一个 excel 数据表。保存到所需位置。
7. 数据分析
- 对于每个 ROI，从前 90-100 秒创建平均基线荧光。
- 将为每个 ROI 计算的荧光表示为该 ROI 的背景百分比。
- 创建所有 ROI 的行平均值，并将结果绘制为折线图。这将创建所有 ROI 的平均值作为时间的函数。
- 使用线性拟合功能，选择用林格氏溶液洗涤后荧光降低的初始速率。方程的斜率值与传输速率相关。
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Representative Results
ZnT1 是一种哺乳动物锌转运蛋白，位于细胞质膜上13。它是阳离子扩散促进剂 （CDF） 蛋白家族的成员，可将锌从胞质溶胶挤出到细胞外毫14。ZnT1 具有双结构域结构：跨膜结构域（跨膜结构域）和 C 端结构域14。与其他已知的 CDF 蛋白不同，ZnT1 具有扩展的非结构化 C 末端结构域 （USCTD）。USCTD的作用目前尚不清楚。我们使用上述方案将ZnT1 WT与没有USCTD的ZnT1进行比较，以评估其参与锌转运活动。
HEK 293T 细胞转染含有 ZnT1、WT 或 ZnT1 的 pAAV2 质粒，不含非结构化 C 末端 （ΔUSCTD），并测试如上所述的转运活性率。补充图 1 显示，两种版本的 ZnT1 表达并定位于质膜，没有任何问题。图 1 描述了此类实验示例的典型结果。荧光的增加是细胞内Zn 2+浓度增加的结果，而荧光的减少是ZnT1跨细胞膜转运Zn2+的活性的结果（包括标准误差的单个图表，见补充图2和补充图3）。从该图可以明显看出，ZnT1 WT的荧光曲线比突变体更平滑。然而，这不是一个固有的区分特征，而是与细胞对锌负荷反应的可变性有关，这在以前的实验中已经观察到。图 2 显示了一个箱形图，总结了 15-17 个此类实验的结果。从图中可以清楚地看出，与WT相比，ΔUSCTD的传输速率分布更广。虽然这可以归因于前面提到的细胞反应变异性，但它也可能表明功能差异。例如，它可能意味着ZnT1 USCTD段是传输速率的调制器。显然，WT和ΔUSCTD的Zn2+挤压活性之间没有明显的差异。根据统计分析，数据呈非正态分布（WT数据集，Shapiro-Wilk检验15，统计量=0.72404，p值=0.0004），因此采用两个样本非参数检验进行数据集间比较。结果显示，转运率间无统计学差异（Mann-Whitney16 U检验：U = 132，Z = 0.15105，渐近。概率>|U|= 0.87994;Kolmogorov-Smirnov17 检验：D = 0.27059，Z = 0.76384，确切概率>|D|= 0.5161）。
由于创建非结构化延伸（~80 个氨基酸）的巨大能量成本，可以合理地假设该结构域具有细胞功能。然而，到目前为止，尚未发现与该结构域相关的细胞功能。该结构域是 ZnT1 独有的，在 ZnT 家族的任何其他成员中都找不到。因此，这可能是由于与其他 ZnT 不同，ZnT1 位于质膜上，而除 ZnT10 外，所有其他成员都在内部细胞器中表达。
此处显示的原始数据和后续图表基于锌敏染料引起的荧光的 5 秒间隔测量。这意味着在相对较短的时间范围内（几分钟），可以生成具有高时间分辨率的瞬态锌传递的可视化。分析应包括基线期归一化，因为染料在锌加载之前加载到细胞中，并且可能具有由少量游离锌引起的初始细胞内荧光。此外，锌染料只有在细胞内酯酶裂解后才具有荧光活性。因此，建议留出一些时间让大多数染料发生脱酯化过程，以避免在整个实验过程中染料酯裂解引起的不规则荧光图案。
图 1：使用锌传递测定法测定 WT 和 ΔUSCTD 的 Zn2+ 挤压活性。 x 轴是以秒为单位的时间。y 轴是荧光变化，以基线的百分比表示。折线图是荧光随时间的变化。数据平均超过 >10 个 ROI。具有标准误差的单个图形显示在 补充图 2 和 补充图 3 中。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：ZnT1 WT 和 ΔUSCTD 活性的比较，以箱形图表示。每个数据点代表一个实验。黑线表示中位数分数。空心方框表示平均分数。y 轴表示每秒基线百分比的变化。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1：用 （A） ZnT1 WT 或 （B） ZnT1 ΔUSCTD 转染的 HEK 293T 细胞，在 mCherry 激发 （520 nm） 和发射 （610 nm） 波长下刺激 。在这两种情况下，都存在 ZnT1 变体的表达和膜定位。显微镜放大倍率为20倍。曝光时间为 100 毫秒。 请点击此处下载此文件。
补充图2：ZnT1 WT Zn2+ 转运活性，标准误差可视化。 x 轴是以秒为单位的时间。y 轴是荧光相对于基线荧光的百分比变化。黑线是平均荧光变化。 请点击这里下载此文件。
补充图3：ZnT1 ΔUSCTD Zn2+ 转运活性，标准误差可视化。 x 轴是以秒为单位的时间。y 轴是荧光相对于基线荧光的百分比变化。红线是平均荧光变化。 请点击这里下载此文件。
补充文件1：pAAV2质粒序列。请点击这里下载此文件。
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Discussion
上述方法允许以高时间分辨率直接测量细胞内锌浓度。与其他方法相比，这种涉及监测细胞内Zn2+变化的方法可以显着降低背景噪声。此外，染料对锌的选择性消除了与其他金属阳离子的潜在交叉相互作用18,19。最后，它没有直接的细胞毒性，可以测试活细胞过程19。
但是，这种方法有一定的局限性。首先，使用该协议检测细胞内动力学可能相对更具挑战性，因为该方法中使用的染料被设计为被困在细胞中，但不能定向到区域或特定过程。其他荧光染料可以定向到细胞中的特定区域，但不幸的是，其动态范围要低得多20。其次，染料暴露在光下会导致漂白导致荧光降低，从而限制了暴露在光下的时间，从而限制了运行实验的有效窗口。第三，与使用其他染料相比，该协议中的染料加载繁琐且耗时，尤其是遗传编码染料21。最后，即使在裂解酯后，染料也会泄漏，导致荧光22 中不依赖 Zn2+ 的还原。
应采取几个步骤来确保实验成功。首先，由于转染可能分布不均，因此所选细胞应包含目标蛋白。为避免染料漂白，重要的是要保护上样的细胞免受光线照射。运行实验时，灌注速率应足以完成实验，而不会导致细胞从盖玻片上分离。在多次运行的情况下，建议为林格溶液和林格锌溶液保留相同的储液槽。染料加载时间和洗涤时间可根据初始实验进行调整。 通过 用吡啶硫酮灌注将锌加载到细胞中可能需要 1 分钟至 5 分钟，通过监测 Zn2+ 诱导的荧光随时间进行评估。
尽管存在这些困难，但这种方法使我们能够首次研究Zn2+挤压过程的动力学。与以前的方法相比，它简化了过程并创造了一种直接的方法，以更好地建立因果关系23,24。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
Raz Zarivach 得到了以色列科学基金会的支持（资助号：163/22）。Tomer Eli Ben Yosef 和 Arie Moran 得到了以色列科学基金会的支持（资助号：2047/20）。我们要感谢丹尼尔·吉特勒（Daniel Gitler）及其在本古里安大学（Ben-Gurion University）的团队的合作、支持和专业知识。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Sigma Aldrich | 31665 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
References
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