Summary
Il trasporto dello zinco si è dimostrato difficile da misurare a causa dei deboli legami causali con la funzione proteica e della bassa risoluzione temporale. Questo protocollo descrive un metodo per monitorare, con alta risoluzione temporale, l'estrusione di Zn 2+ da cellule viventi utilizzando un colorante fluorescente sensibile allo Zn 2+, fornendo così una misura diretta dell'efflusso di Zn2+.
Abstract
I metalli di transizione come gli ioni Zn2+ devono essere strettamente regolamentati a causa della loro tossicità cellulare. In precedenza, l'attività dei trasportatori di Zn 2+ veniva misurata indirettamente determinando il livello di espressione del trasportatore sotto diverse concentrazioni di Zn2+. Ciò è stato fatto utilizzando l'immunoistochimica, misurando l'mRNA nel tessuto o determinando i livelli cellulari di Zn2+. Con lo sviluppo di sensori intracellulari di Zn 2+, le attività dei trasportatori di zinco sono attualmente determinate principalmente correlando i cambiamenti intracellulari di Zn 2+, rilevati utilizzando sonde fluorescenti, con l'espressione dei trasportatori di Zn2+. Tuttavia, ancora oggi, solo pochi laboratori monitorano i cambiamenti dinamici nello Zn2+ intracellulare e lo utilizzano per misurare direttamente l'attività dei trasportatori di zinco. Parte del problema è che dei 10 trasportatori di zinco della famiglia ZnT, ad eccezione di ZnT10 (trasporta manganese), solo il trasportatore di zinco 1 (ZnT1) è localizzato sulla membrana plasmatica. Pertanto, è difficile collegare l'attività di trasporto ai cambiamenti nella concentrazione intracellulare di Zn2+. Questo articolo descrive un modo diretto per determinare la cinetica di trasporto dello zinco utilizzando un saggio basato su un colorante fluorescente specifico per lo zinco, FluoZin-3. Questo colorante viene caricato nelle cellule di mammifero nella sua forma estere e quindi intrappolato nel citosol a causa dell'attività della diesterasi cellulare. Le cellule sono caricate con Zn 2+ utilizzando lo ionoforo Zn2+ piritione. L'attività di ZnT1 è valutata dalla parte lineare della riduzione della fluorescenza a seguito del washout cellulare. La fluorescenza misurata ad un'eccitazione di 470 nm e un'emissione di 520 nm è proporzionale allo Zn2+ intracellulare libero. La selezione delle cellule che esprimono ZnT1 marcate con il fluoroforo mCherry consente di monitorare solo le cellule che esprimono il trasportatore. Questo saggio viene utilizzato per studiare il contributo di diversi domini della proteina ZnT1 al meccanismo di trasporto della ZnT1 umana, una proteina eucariotica transmembrana che estrude lo zinco in eccesso dalla cellula.
Introduction
Lo zinco è un oligoelemento essenziale nell'ambiente cellulare. Incorpora un terzo di tutte le proteine ed è coinvolto in vari processi cellulari, come la catalisi1, la trascrizione2 e i motivi strutturali3. Tuttavia, nonostante sia redox-inerte, alte concentrazioni di zinco sono tossiche per la cellula, motivo per cui nessun organismo di mammifero è sopravvissuto senza la presenza di meccanismi che regolano l'omeostasi dello zinco. Nei mammiferi, tre meccanismi sono responsabili di questo processo: (1) metallotioneine, che sono proteine citosoliche ricche di cisteina che legano lo zinco ad un'elevata affinità, prevenendo così l'eccesso di zinco citosolico libero4; (2) Proteine Zrt/Irt-like (ZIPs), che sono trasportatori di zinco responsabili dell'afflusso di zinco nel citosol attraverso la membrana plasmatica o dagli organelli intracellulari 4,5,6,7,8; e (3) ZnT, che sono un sottoinsieme di mammiferi della famiglia dei facilitatori di diffusione cationica ubiquitaria (CDF) e sono trasportatori di zinco, in quanto estrudono lo zinco dal citosol attraverso la membrana plasmatica o negli organelli intracellulari 4,5,6,7,8,9. A causa dell'importanza dello zinco per il metabolismo cellulare, è fondamentale comprendere le dinamiche cellulari dello zinco.
I metodi precedenti per valutare la dinamica dello zinco dipendevano dalla valutazione dei livelli di espressione dell'mRNA in diverse condizioni di zinco, correlandoli con le misurazioni cellulari dello zinco di tessuti o cellule fisse10,11,12. Questi metodi includono il rilevamento chimico e la colorazione immunoistochimica. Tuttavia, questi metodi forniscono solo misure indirette e, quindi, determinano solo una correlazione offline tra la concentrazione intracellulare di zinco e l'espressione dei trasportatori di zinco. Di conseguenza, questi metodi non possono dedurre alcun parametro che richieda un'elevata risoluzione temporale.
Una misurazione più diretta del trasporto di Zn2+ utilizza isotopi radioattivi dello zinco13. Questo metodo si basa sulla misurazione dello Zn2+ radiomarcato per monitorare il trasporto dello zinco e la sua cinetica. Tuttavia, a causa dell'importanza dello zinco per l'omeostasi cellulare, molteplici processi cellulari regolano la concentrazione intracellulare di zinco. Tra questi ci sono il legame extracellulare e diversi sistemi di trasporto che lavorano di concerto per mantenere uno stretto controllo dei livelli intracellulari di Zn2+ . La combinazione di questi processi crea un notevole rumore di fondo, che rende difficile testare le singole funzioni di trasporto legate allo zinco.
Questo articolo illustra un metodo per monitorare direttamente la velocità di trasporto dello zinco misurando la concentrazione intracellulare di zinco libero utilizzando un colorante fluorescente specifico per lo zinco, FluoZin-3. Il colorante ha un'elevata specificità per Zn2+ e poca interferenza da altri cationi bivalenti, come il calcio. Inoltre, nella sua forma estere, entra nelle cellule per diffusione non ionica e viene quindi intrappolato a causa dell'attività della diesterasi intracellulare. Pertanto, la sua fluorescenza è correlata principalmente con la concentrazione di zinco citosolico libero. Questi esperimenti sono stati condotti per studiare la relazione struttura-funzione del trasportatore di zinco 1 (ZnT1), un membro della famiglia ZnT.
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Protocol
1. Trasfezione cellulare
- Coltura di cellule HEK293T in terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di L-glutammina e 1x penicillina/streptomicina (vedi Tabella dei materiali) in un incubatore umidificato a 37 °C/5% CO2 fino alla confluenza su una piastra di 10 cm (8,8 x 106 cellule totali).
- Posizionare un vetrino coprioggetto da 13 mm in ciascuno dei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti. Diluire 0,44 x 106 cellule tripsinizzate del passaggio 1,1 in 12 mL di DMEM completo. Mescolare bene pipettando su e giù da tre a cinque volte. Riempire ogni pozzetto con 1 mL della soluzione miscelata. Coltiva in un'incubatrice umidificata a 37 °C/5% di CO2 per una notte.
- Sostituire il DMEM completo in ciascun pozzetto con 1 mL di DMEM senza siero (vedere la tabella dei materiali) in ciascun pozzetto. Rimettere la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore umidificato come al punto 1.1.
- Per ogni pozzetto di trasfezione, diluire 1 μg di plasmide pAAV2 contenente la proteina di interesse marcata con la proteina fluorescente mCherry (File supplementare 1) in 100 μL di DMEM esente da siero in una provetta da 1,5 mL.
- Aggiungere 3 μg di polietilenimmina (PEI, vedere la tabella dei materiali) a 100 μL di DMEM esente da siero per trasfezione, ad ogni trasfezione in una diversa provetta da 1,5 mL. Il rapporto plasmide:PEI dovrebbe essere 1:3 (μg:μg).
- Agitare entrambi i tubi dal punto 1.4 e dal punto 1.5 per 10 s e lasciare riposare a temperatura ambiente per almeno 5 min.
- Miscelare una parte (100 μL per pozzetto) della soluzione di DNA della fase 1.4 con una parte (100 μL per pozzetto) della soluzione di PEI della fase 1.5. Agitare la soluzione finale per 10 s e lasciarla riposare a temperatura ambiente per almeno 20 min e per un massimo di 6 h.
- Prendere la piastra a 12 pozzetti dall'incubatrice. Eseguire il vortice della soluzione finale dal passaggio 1.7 e aggiungere 200 μL a ciascuno dei pozzetti nella piastra a 12 pozzetti dal passaggio 1.3. Rimettere la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore umidificato (passaggio 1.1).
- Dopo 3 ore, sostituire il terreno in ciascun pozzetto con 1 mL di DMEM completo. Rimettere la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore umidificato come al punto 1.1.
- Dopo 2 giorni, prelevare la coltura cellulare trasfettata dall'incubatore a 37 °C/5% di CO2 e posizionarla su un microscopio a fluorescenza invertito utilizzando un ingrandimento 10x.
- Utilizzando la rotella di messa a fuoco del microscopio, mettere a fuoco le cellule mentre si utilizza la luce in campo chiaro.
- Passare alle lunghezze d'onda di eccitazione fluorescente mCherry (587 nm) ed emissione (610 nm) e spegnere la luce in campo chiaro. Verificare la fluorescenza delle cellule per confermare l'espressione di ZnT1 mCherry.
- Preparare la soluzione di caricamento del colorante.
- Prelevare un'aliquota di 4 μL di colorante fluorescente zinco-specifico (vedere Tabella dei materiali) nella sua forma estere di acetossimetile (AM), disciolto in DMSO (1 μg/μL), da una carta protetta dalla luce conservata in un congelatore a −20 °C. Questa forma consente al colorante di entrare nella cellula attraverso la membrana plasmatica per semplice diffusione.
- Aggiungere 4 μL di acido pluronico al 10% (o 2 μL di acido pluronico al 20%, vedere la tabella dei materiali) all'aliquota del passaggio 1.13.1. Mescolare bene la soluzione pipettando su e giù tre volte, quindi aggiungere tutti gli 8 μL in una provetta da 1,5 mL.
- Aggiungere 750 μL di soluzione di Ringer (preparata internamente, vedere la tabella dei materiali per la composizione) integrata con 1 mg/mL (~0,1%) di albumina sierica bovina nella provetta dal passaggio 1.13.2 e vorticare vigorosamente. Aggiungere altri 750 μL della stessa soluzione e vorticare di nuovo per garantire la massima miscelazione.
- Aggiungere 750 μL della soluzione finale del passaggio 1.13.3 a due pozzetti in una nuova piastra di coltura a 6 pozzetti. Coprire con un foglio di alluminio.
NOTA: Per evitare lo sbiancamento, la piastra a 6 pozzetti viene sempre coperta con un foglio di alluminio da questo passaggio. - Utilizzando una pinzetta fine, prelevare fino a quattro vetrini coprioggetti replicati dalla piastra di coltura cellulare trasfettata e posizionarli nel primo pozzetto riempito (fino a quattro vetrini per pozzetto) della nuova piastra a 6 pozzetti del passaggio 1.14. Ripeti questo processo per il secondo pozzetto riempito.
NOTA: Tutti i vetrini coprioggetti nello stesso pozzetto riempito devono essere nelle stesse condizioni. Tuttavia, ogni pozzo può contenere condizioni diverse. - Coprire con un foglio di alluminio e agitare delicatamente per 15-20 minuti.
- Rimuovere la soluzione di caricamento del colorante e sostituirla con una nuova soluzione di lavaggio di Ringer's più albumina, come utilizzato nel passaggio 1.13.3. Coprire con un foglio di alluminio. Lasciare agitare nuovamente per 20 min. Ciò consente la scissione dell'estere AM da parte delle esterasi intracellulari.
2. Preparazione del microscopio
- Disporre gli strumenti necessari (vedi Tabella dei Materiali) come detto: un microscopio a fluorescenza invertita in grado di rilevare i fluorofori GFP e mCherry, un sistema di perfusione che consenta di passare tra almeno due soluzioni, un sistema di aspirazione e una camera di perfusione.
- Accendere il microscopio, la sua fonte di luce e la fotocamera. Accendere il sistema di aspirazione.
- Lavare il sistema di perfusione. Lavare la prima camera con la soluzione di Ringer e la seconda camera con la soluzione di Ringer contenente una soluzione di zinco di 7 μM integrata con 7 μM di piritione (ionoforo di zinco, vedere la tabella dei materiali). Per evitare bolle d'aria o spazi vuoti, lasciare un po' di liquido in ogni camera.
NOTA: Poiché entrambi i contenitori sono collegati allo stesso tubo agganciato alla camera di perfusione, assicurarsi sempre che il segmento condiviso sia lavato con la soluzione di Ringer. - Chiudere i rubinetti e riempire le camere appropriate con la soluzione di Ringer e la soluzione di zinco di Ringer, come al punto 2.3.
3. Preparazione del campione
- Prendi la camera di perfusione e posizionala con il lato stretto della scanalatura rivolto verso l'alto.
NOTA: La scanalatura è un foro al centro della camera di perfusione. Permette al fluido di perfusione di accedere alle cellule. Un lato della scanalatura è stretto e il lato opposto è largo. - Applicare un silicone sigillante (vedere la tabella dei materiali) attorno alla scanalatura. Pulire il silicone sigillante dalla scanalatura utilizzando un puntale per pipetta.
NOTA: Assicurarsi che ci sia una guarnizione in silicone sufficiente attorno alla scanalatura per sigillare un vetrino coprioggetti da 22 mm. - Usando una pinzetta fine, prendi un vetrino coprioggetti dalla soluzione di lavaggio e posizionalo sopra la scanalatura con le celle rivolte verso il basso. In questo modo, le cellule saranno esposte alla soluzione che perfonde il solco durante l'esperimento.
- Posizionare un vetrino coprioggetto da 22 mm sopra il vetrino coprioggetto da 13 mm e serrarlo con la pinzetta. Fare attenzione a non rompere i vetrini coprioggetti.
- Capovolgere la camera e premere su di essa per rilasciare tutti i liquidi presenti. Riempire la scanalatura con 100 μL di soluzione di lavaggio Ringer e premere nuovamente per assicurarsi che non vi siano perdite.
NOTA: Se viene rilevata una perdita, applicare un sigillante nel sito della perdita e ripetere il test. - Montare la camera di perfusione sulla piattaforma e fissarla. Posizionare i tubi di perfusione e di aspirazione per consentire la perfusione sulle cellule nella scanalatura.
- Modificare la velocità di perfusione a circa 2 mL/min e attivare la perfusione della soluzione di Ringer. Assicurarsi che il sistema di perfusione funzioni senza perdite o fuoriuscite.
4. Preparazione della misurazione
- Aprire il software di imaging (vedere Tabella dei materiali) facendo doppio clic sull'icona. Accedi con le relative credenziali. Scegli la fotocamera collegata e premi Ok.
- Impostare l'ingrandimento del microscopio su 10x utilizzando il pulsante sul lato sinistro del microscopio.
- Scegliendo la visualizzazione live e utilizzando il joystick, sposta la piattaforma per concentrarti sulle celle nel solco.
- Mentre la perfusione è attiva, spegni le luci e cambia la lunghezza d'onda in mCherry premendo il pulsante dedicato nell'interfaccia. Regolare la messa a fuoco utilizzando la rotella di messa a fuoco del microscopio.
- Una volta che il microscopio è focalizzato sulle cellule, spostare la piattaforma utilizzando il joystick per consentire la selezione dei cerotti cellulari appropriati.
NOTA: un'area adatta è considerata un'area con almeno 10 celle per un ROI e un'area vuota per lo sfondo. - Seleziona il menu a discesa Attiva/disattiva ROI e scegli Disegna ROI circolari.
- Disegna le ROI dei cluster di cellule con le cellule che esprimono mCherry (indica l'espressione di ZnT1).
- Dalla stessa barra degli strumenti del passaggio 4.6, fare clic sul pulsante Attiva/disattiva ROI in background e regolare la posizione e le dimensioni della ROI in background su un'area senza celle.
- Verificare con le lunghezze d'onda mCherry ed EGFP per assicurarsi che non vi siano celle nel ROI di fondo selezionato.
NOTA: Le lunghezze d'onda sono state regolate in modo che mCherry utilizzasse una lunghezza d'onda di eccitazione di 520 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 610 nm e EGFP utilizzasse una lunghezza d'onda di eccitazione di 470 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 520 nm.
- Verificare con le lunghezze d'onda mCherry ed EGFP per assicurarsi che non vi siano celle nel ROI di fondo selezionato.
- Selezionare la sottoscheda Lunghezza d'onda (λ). Selezionare la casella di controllo e assicurarsi che la lunghezza d'onda GFP sia presente e che la casella di controllo sia contrassegnata. In caso contrario, aggiungilo e contrassegnalo.
- Selezionare la sottoscheda Durata . Definire l'intervallo di misurazione ogni 5 s e modificare il numero di intervalli in base alla durata dell'esperimento.
- Nella sezione Messa a fuoco del pannello del microscopio sotto l'oculare, fare clic sul pulsante On per abilitare il sistema di messa a fuoco perfetta (PFS).
- Utilizzando la rotella di messa a fuoco PFS, regolare la messa a fuoco. Nell'interfaccia del software, in ND Acquisition, verificare che PFS on sia selezionato.
- Fare clic su Esegui ora.
5. Procedura sperimentale
- Iniziare con una misurazione del periodo di base di 90 s utilizzando la perfusione della soluzione di Ringer.
- Al termine del periodo di riferimento, disattivare la perfusione della soluzione di Ringer, quindi attivare la perfusione della soluzione di zinco di Ringer. Contrassegnare il passaggio della soluzione facendo clic sulla bandiera rossa in basso a destra nel pannello principale dell'interfaccia. Si prevede un aumento della fluorescenza.
- Una volta che l'aumento della fluorescenza inizia a saturarsi, tornare alla perfusione con la soluzione di Ringer. Disattivare la perfusione della soluzione di zinco della suoneria, quindi attivare la perfusione della soluzione della suoneria.
- Attendere la scadenza del tempo dell'esperimento. Ci si aspetta una notevole ma costante diminuzione della fluorescenza se lo ZnT1 funziona correttamente.
6. Esportazione dei dati
- Per esportare i dati con la sottrazione della linea di base, premere il pulsante Sottrai linea di base e visualizzare le modifiche nella "finestra di acquisizione ND".
- Fare clic sul pulsante Esporta nell'interfaccia del software nella "finestra di acquisizione ND". Si aprirà un foglio dati excel. Salvare nella posizione desiderata.
7. Analisi dei dati
- Per ogni ROI, creare una fluorescenza di base media dai primi 90-100 s.
- Esprimere la fluorescenza calcolata per ogni ROI come percentuale dello sfondo per tale ROI.
- Crea una media di righe di tutti i ROI e traccia il risultato come grafico a linee. Questo crea una media di tutti i ROI in funzione del tempo.
- Utilizzando la funzione di adattamento lineare, selezionare il tasso iniziale per la diminuzione della fluorescenza dopo il lavaggio con la soluzione di Ringer. Il valore della pendenza dell'equazione è correlato alla velocità di trasporto.
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Representative Results
ZnT1 è un trasportatore di zinco dei mammiferi situato sulla membrana plasmatica cellulare13. È un membro della famiglia delle proteine facilitatore della diffusione cationica (CDF) che estrude lo zinco dal citosol al millieu14 extracellulare. ZnT1 ha un'architettura a due domini: il dominio transmembrana, che trasporta gli ioni attraverso la membrana, e un dominio C-terminale14. A differenza di altre proteine CDF conosciute, ZnT1 ha un dominio C-terminale non strutturato esteso (USCTD). Il ruolo dell'USCTD è attualmente sconosciuto. Abbiamo utilizzato il protocollo di cui sopra per confrontare ZnT1 WT con ZnT1 senza l'USCTD per valutare il suo coinvolgimento nell'attività di trasporto dello zinco.
Le cellule HEK 293T sono state trasfettate con il plasmide pAAV2 contenente ZnT1 WT o ZnT1 senza il C-terminale non strutturato (ΔUSCTD) e hanno testato la velocità di attività di trasporto come descritto sopra. La Figura 1 supplementare mostra che entrambe le versioni di ZnT1 si esprimono e si localizzano sulla membrana plasmatica senza problemi. La Figura 1 illustra i risultati tipici di un esempio di tale esperimento. Un aumento della fluorescenza è il risultato di un aumento della concentrazione intracellulare di Zn 2+, mentre una diminuzione è il risultato dell'attività di ZnT1 che trasporta Zn2+ attraverso la membrana cellulare (i singoli grafici, inclusi gli errori standard, si trovano nella Figura 2 supplementare e nella Figura 3 supplementare). È evidente da questa figura che ZnT1 WT ha una curva di fluorescenza più liscia rispetto al mutante. Tuttavia, questa non è una caratteristica differenziante intrinseca, ma è correlata alla variabilità nelle risposte cellulari al carico di zinco, che è stata osservata in esperimenti precedenti. La Figura 2 mostra un box plot che riassume i risultati di 15-17 esperimenti di questo tipo. Dalla figura, è chiaro che ΔUSCTD presenta una più ampia diffusione delle velocità di trasporto rispetto a WT. Sebbene ciò possa essere attribuito alla variabilità della risposta cellulare menzionata in precedenza, potrebbe anche indicare una differenza funzionale. Ad esempio, può implicare che il segmento ZnT1 USCTD sia un modulatore della velocità di trasporto. Chiaramente, non c'è alcuna differenza visibile tra le attività di estrusione di Zn2+ di WT e ΔUSCTD. Sulla base dell'analisi statistica, i dati non erano normalmente distribuiti (set di dati WT, test di Shapiro-Wilk15, statistica = 0,72404, valore p = 0,0004), quindi sono stati utilizzati due test non parametrici campione per i confronti tra i set di dati. I risultati hanno mostrato che non c'era alcuna differenza statistica tra i tassi di trasporto (test Mann-Whitney16 U: U = 132, Z = 0,15105, Asymp. Prob>|U| = 0,87994; Test di Kolmogorov-Smirnov17: D = 0.27059, Z = 0.76384, Esatto Prob>|D|= 0,5161).
A causa del notevole costo energetico della creazione dell'estensione non strutturata (~80 amminoacidi), è ragionevole supporre che questo dominio svolga una funzione cellulare. Tuttavia, finora non è stata identificata una funzione cellulare legata a questo dominio. Questo dominio è univoco per ZnT1 e non si trova in nessun altro membro della famiglia ZnT. In quanto tale, può essere dovuto al fatto che, a differenza di altri ZnT, ZnT1 si trova sulla membrana plasmatica, mentre ad eccezione di ZnT10, tutti gli altri membri sono espressi in organelli interni.
I dati grezzi e i grafici successivi mostrati qui si basano su misurazioni a intervalli di 5 s della fluorescenza causata dal colorante sensibile allo zinco. Ciò significa che in un lasso di tempo relativamente breve (minuti), è possibile generare una visualizzazione del trasporto di zinco dipendente dal tempo con un'elevata risoluzione temporale. L'analisi dovrebbe includere una normalizzazione del periodo basale poiché il colorante viene caricato nelle cellule prima del carico di zinco e può avere una fluorescenza intracellulare iniziale causata da una piccola quantità di zinco libero. Inoltre, il colorante di zinco diventa fluorescente attivo solo dopo la scissione da parte dell'esterasi intracellulare. Pertanto, si consiglia di concedere un po' di tempo affinché si verifichi il processo di deesterificazione per la maggior parte del colorante al fine di evitare modelli di fluorescenza irregolari causati dalla scissione dell'estere del colorante durante l'esperimento.
Figura 1: Attività di estrusione di Zn2+ di WT e ΔUSCTD utilizzando il saggio di trasporto dello zinco. L'asse x è il tempo in secondi. L'asse y è la variazione di fluorescenza espressa come percentuale della linea di base. I grafici a linee sono la variazione di fluorescenza in funzione del tempo. I dati sono in media su >10 ROI. I singoli grafici con errore standard sono mostrati nella Figura 2 supplementare e nella Figura 3 supplementare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Confronto delle attività di ZnT1 WT e ΔUSCTD rappresentate come box plot. Ogni punto dati rappresenta un singolo esperimento. La linea nera indica il punteggio mediano. La casella quadrata vuota indica il punteggio medio. L'asse y indica la variazione della percentuale di base al secondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 1 supplementare: Cellule HEK 293T trasfettate con (A) ZnT1 WT o (B) ZnT1 ΔUSCTD stimolate nelle lunghezze d'onda di eccitazione (520 nm) ed emissione (610 nm) di mCherry. In entrambi i casi, c'è espressione e localizzazione di membrana della variante ZnT1. L'ingrandimento del microscopio è di 20x. Il tempo di esposizione è di 100 ms. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura 2 supplementare: Attività di trasporto ZnT1 WT Zn2+ con l'errore standard visualizzato. L'asse x è il tempo in secondi. L'asse y è la variazione percentuale di fluorescenza rispetto alla fluorescenza basale. La linea nera è la variazione media della fluorescenza. Fare clic qui per scaricare il file.
Figura 3 supplementare: Attività di trasporto ZnT1 ΔUSCTD Zn2+ con l'errore standard visualizzato. L'asse x è il tempo in secondi. L'asse y è la variazione percentuale di fluorescenza rispetto alla fluorescenza basale. La linea rossa è la variazione media della fluorescenza. Fare clic qui per scaricare il file.
File supplementare 1: sequenza plasmidica pAAV2. Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
Il metodo sopra descritto consente la misurazione diretta della concentrazione intracellulare di zinco con un'elevata risoluzione temporale. Rispetto ad altri metodi, questo metodo che prevede il monitoraggio dei cambiamenti nello Zn2+ intracellulare può ridurre sostanzialmente il rumore di fondo. Inoltre, la selettività del colorante per lo zinco elimina le potenziali interazioni incrociate con altri cationi metallici18,19. Infine, la sua mancanza di citotossicità immediata consente di testare i processi cellulari vivi19.
Tuttavia, questo metodo presenta alcune limitazioni. In primo luogo, rilevare le dinamiche intracellulari può essere relativamente più impegnativo con questo protocollo, poiché il colorante utilizzato in questo metodo è progettato per essere intrappolato nella cellula ma non può essere diretto verso regioni o processi specifici. Altri coloranti fluorescenti possono essere diretti verso un'area specifica delle cellule ma, sfortunatamente, hanno una gamma dinamica molto più bassa20. In secondo luogo, l'esposizione del colorante alla luce provoca una diminuzione della fluorescenza a causa dello sbiancamento, che limita il tempo di esposizione alla luce e, di conseguenza, la finestra attiva per l'esecuzione dell'esperimento. In terzo luogo, il caricamento del colorante in questo protocollo è ingombrante e richiede molto tempo rispetto all'uso di altri coloranti, in particolare coloranti geneticamente codificati21. Infine, anche dopo aver scisso gli esteri, il colorante fuoriesce, portando a una riduzione indipendente da Zn 2+ della fluorescenza22.
Dovrebbero essere prese diverse misure per garantire il successo dell'esperimento. In primo luogo, poiché la trasfezione può essere distribuita in modo disuguale, le cellule selezionate dovrebbero contenere la proteina di interesse. Per evitare lo sbiancamento del colorante, è importante mantenere le celle caricate protette dalla luce. Durante l'esecuzione dell'esperimento, la velocità di perfusione dovrebbe essere sufficiente per completare l'esperimento senza causare il distacco delle cellule dal vetrino coprioggetto. In caso di più corse, si consiglia di mantenere gli stessi serbatoi per la soluzione di Ringer e la soluzione di zinco di Ringer. Il tempo di caricamento del colorante e il tempo di lavaggio possono essere regolati in base agli esperimenti iniziali. Il caricamento di zinco nelle cellule tramite perfusione con piritione può richiedere da 1 a 5 minuti, come valutato monitorando la fluorescenza indotta da Zn2+ nel tempo.
Nonostante queste difficoltà, questo metodo ci permette, per la prima volta, di studiare la dinamica del processo di estrusione di Zn2+. Semplifica il processo e crea un modo diretto per stabilire meglio i nessi causali rispetto ai metodi precedenti23,24.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Raz Zarivach è sostenuto dalla Israel Science Foundation (sovvenzione n. 163/22). Tomer Eli Ben Yosef e Arie Moran sono sostenuti dalla Israel Science Foundation (sovvenzione n. 2047/20). Vorremmo ringraziare Daniel Gitler e il suo gruppo all'Università Ben-Gurion per la loro collaborazione, supporto e competenza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Sigma Aldrich | 31665 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
References
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