Summary
아연 수송은 단백질 기능에 대한 인과 관계가 약하고 시간적 분해능이 낮기 때문에 측정하기 어려운 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 Zn 2+ 민감한 형광 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 높은 시간 분해능으로 Zn 2+ 압출을 모니터링하여 Zn2+ 유출을 직접 측정하는 방법을 설명합니다.
Abstract
Zn2+ 이온과 같은 전이 금속은 세포 독성으로 인해 엄격하게 조절되어야 합니다. 이전에는, Zn2+ 수송체의 활성은Zn2+의 상이한 농도 하에서 수송체의 발현 수준을 결정함으로써 간접적으로 측정되었다. 이는 면역조직화학을 이용하거나, 조직 내 mRNA를 측정하거나, 세포 Zn2+ 수준을 측정하여 수행되었습니다. 세포 내 Zn 2+ 센서의 개발로 아연 수송체의 활성은 현재 형광 프로브를 사용하여 검출된 세포 내 Zn 2+의 변화와 Zn2+ 수송체의 발현을 연관시킴으로써 주로 결정됩니다. 그러나 오늘날에도 세포 내 Zn2+의 동적 변화를 모니터링하고 이를 사용하여 아연 수송체의 활성을 직접 측정하는 실험실은 소수에 불과합니다. 문제의 일부는 ZnT10(망간 수송)을 제외한 ZnT 계열의 10개 아연 수송체 중 아연 수송체 1(ZnT1)만 원형질막에 국한되어 있다는 것입니다. 따라서 수송 활성을 세포 내 Zn2+ 농도의 변화와 연결하는 것은 어렵습니다. 이 글에서는 아연 특이적 형광 염료인 FluoZin-3을 기반으로 하는 분석을 사용하여 아연 수송 역학을 측정하는 직접적인 방법을 설명합니다. 이 염료는 에스테르 형태로 포유류 세포에 로드된 다음 세포 디에스테라제 활성으로 인해 세포질에 갇히게 됩니다. 세포는 Zn 2+ ionophore pyrithione을 사용하여 Zn2+로 로드됩니다. ZnT1 활성은 세포 세척 후 형광 감소의 선형 부분에서 평가됩니다. 470nm의 여기와 520nm의 방출에서 측정된 형광은 유리 세포 내 Zn2+에 비례합니다. mCherry 형광단으로 태그된 ZnT1을 발현하는 세포를 선택하면 수송체를 발현하는 세포만 모니터링할 수 있습니다. 이 분석법은 세포에서 과잉 아연을 압출하는 진핵 세포막 관통 단백질인 인간 ZnT1의 수송 메커니즘에 대한 ZnT1 단백질의 다양한 영역의 기여도를 조사하는 데 사용됩니다.
Introduction
아연은 세포 환경에서 필수적인 미량 원소입니다. 그것은 모든 단백질의 1/3을 포함하며 촉매작용 1, 전사2 및 구조 모티프3와 같은 다양한 세포 과정에 관여합니다. 그러나 산화 환원 불활성임에도 불구하고 높은 아연 농도는 세포에 독성이 있기 때문에 아연 항상성을 조절하는 메커니즘이 없으면 포유류 유기체가 생존하지 못했습니다. 포유류에서는 세 가지 메커니즘이 이 과정을 담당합니다: (1) 높은 친화력으로 아연과 결합하여 과도한 유리 세포질 아연을 방지하는 세포질 시스테인이 풍부한 단백질인 메탈로티오닌4; (2) Zrt/Irt 유사 단백질(ZIP)은 원형질막 또는 세포 내 소기관을 통해 세포질로 아연 유입을 담당하는 아연 수송체입니다 4,5,6,7,8; (3) ZnT는 유비쿼터스 양이온 확산 촉진제(CDF) 계열의 포유류 하위 집합이며 세포질에서 원형질막을 가로질러 또는 세포 내 소기관으로 아연을 압출할 때 아연 수송체입니다(4,5,6,7,8,9). 세포 대사에 대한 아연의 중요성으로 인해 세포 아연의 역학을 이해하는 것이 중요합니다.
아연 역학을 평가하는 이전 방법은 고정 조직 또는 세포의 세포 아연 측정과 상관 관계를 맺어 다양한 아연 조건에서 mRNA의 발현 수준을 평가하는 데 의존했습니다10,11,12. 이러한 방법에는 화학적 검출 및 면역조직화학 염색이 포함됩니다. 그러나 이러한 방법은 간접적인 측정만 수행하므로 세포 내 아연 농도와 아연 수송체의 발현 사이의 오프라인 상관관계만 결정합니다. 따라서 이러한 방법은 높은 시간 분해능이 필요한 매개 변수를 유추할 수 없습니다.
Zn2+ 수송에 대한 보다 직접적인 측정은 아연13의 방사성 동위원소를 사용합니다. 이 방법은 아연 수송 및 그 반응 속도를 모니터링하기 위해 방사성 표지된 Zn2+ 의 측정에 의존합니다. 그러나 세포 항상성에 대한 아연의 중요성으로 인해 여러 세포 과정이 세포 내 아연 농도를 조절합니다. 이 중에는 세포 외 결합과 세포 내 Zn2+ 수준의 엄격한 제어를 유지하기 위해 함께 작동하는 여러 수송 시스템이 있습니다. 이러한 공정의 조합은 상당한 배경 소음을 발생시켜 개별 아연 관련 수송 기능을 테스트하기 어렵게 만듭니다.
이 기사에서는 아연 특이적 형광 염료인 FluoZin-3을 사용하여 세포 내 유리 아연 농도를 측정하여 아연 수송 속도를 직접 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 염료는 Zn2+ 에 대한 특이성이 높고 칼슘과 같은 다른 2가 양이온의 간섭이 거의 없습니다. 또한 에스테르 형태에서는 비이온성 확산에 의해 세포에 들어간 다음 세포 내 디에스테라아제의 활성으로 인해 갇히게 됩니다. 따라서 형광은 주로 유리 세포질 아연 농도와 관련이 있습니다. 이 실험은 ZnT 계열의 구성원인 아연 수송체 1(ZnT1)의 구조-기능 관계를 연구하기 위해 수행되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 세포 transfection
- 10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민 및 1x 페니실린/스트렙토마이신( 재료 표 참조)이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 세포를 37°C/5%CO2 의 가습 인큐베이터에서 10cm 플레이트(8.8 x 10 총6 개 세포)에 합류할 때까지 HEK293T배양합니다.
- 13웰 플레이트의 각 웰에 12mm 커버슬립을 하나씩 놓습니다. 1.1단계의 0.44 x 106 트립신 세포를 12mL의 완전한 DMEM에 희석합니다. 피펫팅을 3-5회 위아래로 하여 잘 섞습니다. 각 웰에 1mL의 혼합 용액을 채웁니다. 37 °C / 5 % CO2 의 가습 인큐베이터에서 밤새 성장합니다.
- 각 웰의 전체 DMEM을 각 웰의 1mL의 무혈청 DMEM( 재료 표 참조)으로 교체합니다. 12웰 플레이트를 1.1단계와 같이 가습 인큐베이터로 되돌립니다.
- 각 transfection well에 대해 mCherry 형광 단백질(보충 파일 1)로 태그된 관심 단백질을 포함하는 pAAV2 플라스미드 1μg을 1.5mL 튜브에 있는 100μL의 무혈청 DMEM에 희석합니다.
- transfection당 3μg의 폴리에틸렌이민(PEI, 재료 표 참조)을 100μL의 무혈청 DMEM에 추가하고, 각 transfection을 다른 1.5mL 튜브에 넣습니다. 플라스미드:PEI 비율은 1:3 (μg:μg)이어야 합니다.
- 1.4단계와 1.5단계에서 두 튜브를 10초 동안 소용돌이치고 실온에서 최소 5분 동안 그대로 둡니다.
- 1.4단계의 DNA 용액 1부(웰당 100μL)와 1.5단계의 PEI 용액 1부(웰당 100μL)를 혼합합니다. 최종 용액을 10초 동안 소용돌이치고 실온에서 최소 20분, 최대 6시간 동안 그대로 둡니다.
- 인큐베이터에서 12웰 플레이트를 꺼냅니다. 1.7 단계의 최종 용액을 소용돌이 치고, 1.3 단계의 12 웰 플레이트의 각 웰에 200 μL를 추가합니다. 12웰 플레이트를 가습 인큐베이터로 되돌립니다(1.1단계).
- 3시간 후 각 웰의 배지를 1mL의 완전한 DMEM으로 교체합니다. 12웰 플레이트를 1.1단계와 같이 가습 인큐베이터로 되돌립니다.
- 2일 후 37°C/5%CO2 인큐베이터에서 형질주입된 세포 배양을 10배 배율로 도립 형광 현미경에 놓습니다.
- 현미경 초점 휠을 사용하여 명시야광을 사용하면서 세포에 초점을 맞춥니다.
- 형광 mCherry 여기(587nm) 및 방출(610nm) 파장으로 전환하고 명시야광을 끕니다. ZnT1 mCherry의 발현을 확인하기 위해 세포의 형광을 확인합니다.
- 염료 로딩 용액을 준비합니다.
- −20 °C 냉동고에 보관된 차광 스톡에서 DMSO(1 μg/μL)에 용해된 아세톡시메틸(AM) 에스테르 형태의 아연 특이적 형광 염료 4μL( 재료 표 참조)의 부분 표본을 채취합니다. 이 형태는 염료가 단순 확산을 통해 원형질막을 통해 세포로 들어갈 수 있도록 합니다.
- 4 μL의 10% 플루론산(또는 2μL의 20% 플루론산, 재료 표 참조)을 단계 1.13.1의 부분 표본에 추가합니다. 피펫팅을 위아래로 세 번 하여 용액을 잘 섞은 다음 8μL를 모두 1.5mL 튜브에 넣습니다.
- 1.13.2단계에서 1mg/mL(~0.1%)의 소 혈청 알부민이 보충된 750μL의 링거 용액(사내 준비, 조성은 재료 표 참조)을 튜브에 넣고 세게 소용돌이칩니다. 동일한 용액 750 μL를 더 추가하고 다시 와류하여 최대 혼합을 보장합니다.
- 1.13.3단계의 최종 용액 750μL를 새로운 6웰 배양 플레이트의 두 웰에 추가합니다. 알루미늄 호일로 덮으십시오.
알림: 표백을 방지하기 위해 6웰 플레이트는 항상 이 단계에서 알루미늄 호일로 덮여 있습니다. - 미세한 핀셋을 사용하여 transfection된 세포 배양 플레이트에서 최대 4개의 복제 커버슬립을 가져와서 1.14단계에서 새로운 6웰 플레이트의 첫 번째 채워진 웰(웰당 최대 4개의 슬라이드)에 놓습니다. 두 번째로 채워진 웰에 대해 이 과정을 반복합니다.
알림: 동일한 충전 우물의 모든 커버슬립은 동일한 상태여야 합니다. 그러나 각 우물에는 서로 다른 조건이 포함될 수 있습니다. - 알루미늄 호일로 덮고 15-20분 동안 부드럽게 흔듭니다.
- 염료 로딩 용액을 제거하고 1.13.3단계에서 사용한 대로 Ringer's plus 알부민의 새 세척 용액으로 교체합니다. 알루미늄 호일로 덮으십시오. 20분 동안 다시 흔들어 줍니다. 이것은 세포 내 에스테라아제에 의한 AM 에스테르의 절단을 허용합니다.
2. 현미경 준비
- GFP 및 mCherry 형광단을 검출할 수 있는 도립 형광 현미경, 최소 두 개의 용액 사이를 전환할 수 있는 관류 시스템, 흡입 시스템 및 관류 챔버 등 필요한 도구( 재료 표 참조)를 준비합니다.
- 현미경, 현미경 광원 및 카메라를 켭니다. 흡입 시스템을 켭니다.
- 관류 시스템을 세척하십시오. 첫 번째 챔버를 Ringer 용액으로 세척하고 두 번째 챔버를 7μM 피리티온(아연 이온단, 재료 표 참조)이 보충된 7μM 아연 용액을 포함하는 Ringer 용액으로 세척합니다. 기포나 틈을 방지하려면 각 챔버에 약간의 액체를 남겨 두십시오.
알림: 두 용기 모두 관류 챔버에 연결된 동일한 튜브에 연결되어 있으므로 항상 공유 세그먼트가 Ringer 용액으로 세척되었는지 확인하십시오. - 탭을 닫고 2.3단계에서와 같이 적절한 챔버를 Ringer의 용액과 Ringer의 아연 용액으로 채웁니다.
3. 샘플 준비
- 관류 챔버를 가져 와서 홈의 좁은면이 위를 향하도록 놓습니다.
알림: 홈은 관류 챔버 중간에 있는 구멍입니다. 관류액이 세포에 접근할 수 있습니다. 홈의 한쪽은 좁고 반대쪽은 넓습니다. - 홈 주위에 밀봉 실리콘( 재료 표 참조)을 바릅니다. 피펫 팁을 사용하여 홈에서 밀봉 실리콘을 청소합니다.
알림: 홈 주위에 22mm 커버슬립을 밀봉하기에 충분한 실리콘 씰이 있는지 확인하십시오. - 미세한 핀셋을 사용하여 세척액에서 커버슬립을 꺼내 셀이 아래를 향하도록 홈 위에 놓습니다. 이렇게 하면 세포가 실험 중에 홈을 관류하는 용액에 노출됩니다.
- 22mm 커버슬립 위에 13mm 커버슬립을 놓고 핀셋을 사용하여 조입니다. 커버슬립이 깨지지 않도록 주의하십시오.
- 챔버를 뒤집고 눌러 현재의 모든 액체를 방출합니다. 홈에 100μL의 링거 세척액을 채우고 누출이 없도록 다시 누릅니다.
알림: 누출이 감지되면 누출 부위에 밀봉제를 도포하고 다시 테스트하십시오. - 관류 챔버를 플랫폼에 장착하고 고정합니다. 관류 및 흡입 튜브를 배치하여 홈의 세포 위에 관류를 허용합니다.
- 관류 속도를 약 2mL/분으로 변경하고 링거 용액의 관류를 켭니다. 관류 시스템이 누출이나 유출 없이 작동하는지 확인하십시오.
4. 측정 준비
- 아이콘을 두 번 클릭하여 이미징 소프트웨어( 재료 표 참조)를 엽니다. 관련 자격 증명으로 로그인합니다. 부착된 카메라를 선택하고 OK를 누릅니다.
- 현미경 왼쪽에 있는 버튼을 사용하여 현미경 배율을 10배로 설정합니다.
- 라이브 뷰를 선택하고 조이스틱을 사용하여 플랫폼을 이동하여 홈의 셀에 초점을 맞춥니다.
- 관류가 켜져 있는 동안 조명을 끄고 인터페이스의 전용 버튼을 눌러 파장을 mCherry로 변경합니다. 현미경 초점 휠을 사용하여 초점을 조정합니다.
- 현미경이 세포에 초점을 맞추면 조이스틱을 사용하여 플랫폼을 움직여 적절한 세포 패치를 선택할 수 있습니다.
참고: 적합한 영역은 ROI를 위한 최소 10개의 셀과 배경을 위한 빈 영역이 있는 영역으로 간주됩니다. - ROI 켜기/끄기(Turn ROIs On/Off) 드롭다운 메뉴를 선택하고 순환 ROI 그리기(Draw Circular ROIs)를 선택합니다.
- mCherry 발현 세포를 사용하여 세포 클러스터의 ROI를 그립니다(ZnT1의 발현을 나타냄).
- 4.6단계와 동일한 도구 모음에서 배경 ROI 켜기/끄기 버튼을 클릭하고 배경 ROI 의 위치와 크기를 셀이 전혀 없는 영역으로 조정합니다.
- mCherry 및 EGFP 파장을 확인하여 선택한 배경 ROI에 세포가 없는지 확인합니다.
참고: mCherry는 520nm의 여기 파장과 610nm의 방출 파장을 사용하고 EGFP는 470nm의 여기 파장과 520nm의 방출 파장을 사용하도록 파장을 조정했습니다.
- mCherry 및 EGFP 파장을 확인하여 선택한 배경 ROI에 세포가 없는지 확인합니다.
- 파장(λ) 하위 탭을 선택합니다. 확인란을 선택하고 GFP 파장이 있고 확인란이 표시되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 추가하고 표시하십시오.
- 기간 하위 탭을 선택합니다. 측정 구간을 5초마다로 정의하고, 실험 기간에 맞게 구간 수를 변경합니다.
- 접안렌즈 아래 현미경 패널의 초점 섹션에서 켜기 버튼을 클릭하여 완벽한 초점 시스템(PFS)을 활성화합니다.
- PFS 초점 휠을 사용하여 초점을 조정합니다. 소프트웨어 인터페이스의 ND Acquisition( ND 획득)에서 PFS on(PFS 켜기) 이 선택되어 있는지 확인합니다.
- Run now(지금 실행)를 클릭합니다.
5. 실험 절차
- Ringer의 용액 관류를 사용하여 90초 기준 주기 측정으로 시작합니다.
- 기준선 기간이 끝나면 Ringer's solution perfusion을 끈 다음 Ringer's zinc solution perfusion을 켭니다. 기본 인터페이스 패널의 오른쪽 하단에 있는 빨간색 플래그를 클릭하여 솔루션 전환을 표시합니다. 형광의 상승이 나타날 것으로 예상됩니다.
- 형광 상승이 포화되기 시작하면 Ringer의 용액을 사용하여 관류로 다시 변경합니다. Ringer의 아연 용액 관류를 끈 다음 Ringer의 용액 관류를 켭니다.
- 실험 시간이 만료될 때까지 기다립니다. ZnT1이 제대로 작동하는 경우 형광이 눈에 띄지만 꾸준히 감소할 것으로 예상됩니다.
6. 데이터 내보내기
- 기준선 빼기로 데이터를 내보내려면 기준선 빼기 버튼을 누르고 "ND 획득 창"에서 변경 사항을 확인합니다.
- "ND acquisition window"의 소프트웨어 인터페이스에서 Export 버튼을 클릭합니다. Excel 데이터시트가 열립니다. 원하는 위치에 저장합니다.
7. 데이터 분석
- 각 ROI에 대해 처음 90-100초의 평균 기준 형광을 생성합니다.
- 각 ROI에 대해 계산된 형광을 해당 ROI에 대한 배경의 백분율로 표현합니다.
- 모든 ROI의 행 평균을 만들고 결과를 선 그래프로 플로팅합니다. 이렇게 하면 모든 ROI의 평균이 시간 함수로 생성됩니다.
- 선형 맞춤 기능을 사용하여 Ringer의 용액으로 세척한 후 형광 감소에 대한 초기 속도를 선택합니다. 방정식의 기울기 값은 전송 속도와 상관 관계가 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZnT1은 세포 원형질막(13) 상에 위치한 포유류 아연 수송체이다. 이는 세포질에서 세포외 밀리유(extracellular millieu)로 아연을 압출하는 양이온 확산 촉진제(cation diffusion facilitator, CDF) 단백질군의 일원이다14. ZnT1은 막을 가로질러 이온을 운반하는 막관통 도메인과 C-말단 도메인(14)의 두 가지 영역 아키텍처를 가지고 있습니다. 다른 알려진 CDF 단백질과 달리 ZnT1은 확장된 비구조화 C-말단 도메인(USCTD)을 가지고 있습니다. USCTD의 역할은 현재 알려져 있지 않습니다. 위의 프로토콜을 사용하여 ZnT1 WT를 USCTD 없이 ZnT1과 비교하여 아연 수송 활성에 대한 관여를 평가했습니다.
HEK 293T 세포는 구조화되지 않은 C-말단(ΔUSCTD) 없이 ZnT1 WT 또는 ZnT1 중 하나를 함유하는 pAAV2 플라스미드로 transfection하고, 상술한 바와 같이 수송 활성률을 시험하였다. 보충 그림 1은 ZnT1의 두 버전 모두 문제 없이 원형질막에 발현되고 국소화됨을 보여줍니다. 그림 1은 이러한 실험의 예에 대한 일반적인 결과를 보여줍니다. 형광의 증가는 세포 내 Zn 2+ 농도의 증가의 결과인 반면, 감소는 세포막을 가로질러 Zn2+를 운반하는 ZnT1의 활성의 결과입니다(표준 오류를 포함한 개별 그래프는 보충 그림 2 및 보충 그림 3에서 찾을 수 있음). 이 그림에서 ZnT1 WT가 돌연변이보다 더 부드러운 형광 곡선을 가지고 있음이 분명합니다. 그러나 이것은 고유한 차별화 특징이 아니라 이전 실험에서 관찰된 아연 부하에 대한 세포 반응의 가변성과 관련이 있습니다. 그림 2는 15-17개의 실험 결과를 요약한 상자 그림을 보여줍니다. 그림에서 ΔUSCTD는 WT에 비해 더 넓은 운송 속도 확산을 나타낸다는 것이 분명합니다. 이는 앞서 언급한 세포 반응 가변성에 기인할 수 있지만 기능적 차이를 나타낼 수도 있습니다. 예를 들어, ZnT1 USCTD 세그먼트가 전송 속도의 변조기임을 암시할 수 있다. 분명히, WT와 ΔUSCTD의 Zn2+ 압출 활성 사이에는 눈에 띄는 차이가 없습니다. 통계 분석에 따르면 데이터가 정규 분포를 따르지 않았으므로(WT 데이터 세트, Shapiro-Wilk 검정15, 통계량 = 0.72404, p 값 = 0.0004) 데이터 세트 간의 비교를 위해 두 개의 표본 비모수 검정을 사용했습니다. 그 결과 수송 속도 간에 통계적 차이가 없음을 보여주었습니다(Mann-Whitney16 U 검정: U = 132, Z = 0.15105, Asymp. 확률>|유| = 0.87994; 콜모고로프-스미르노프17 검정: D = 0.27059, Z = 0.76384, 정확한 확률>|D|= 0.5161)입니다.
구조화되지 않은 확장(~80개의 아미노산)을 생성하는 데 상당한 에너지 비용이 들기 때문에 이 도메인이 세포 기능을 수행한다고 가정하는 것이 합리적입니다. 그러나, 이 도메인과 연결된 셀룰러 기능은 아직까지 확인되지 않았다. 이 도메인은 ZnT1에 고유하며 ZnT 제품군의 다른 구성원에서는 찾을 수 없습니다. 따라서 다른 ZnT와 달리 ZnT1은 원형질막에 위치하는 반면 ZnT10을 제외한 다른 모든 구성원은 내부 소기관에서 발현되기 때문일 수 있습니다.
여기에 표시된 원시 데이터 및 후속 그래프는 아연에 민감한 염료로 인한 형광의 5초 간격 측정을 기반으로 합니다. 이는 비교적 짧은 시간 프레임(분)에 시간에 따른 아연 수송의 시각화를 높은 시간 분해능으로 생성할 수 있음을 의미합니다. 염료가 아연 로딩 전에 세포에 로드되고 소량의 유리 아연으로 인한 초기 세포 내 형광이 있을 수 있기 때문에 분석에는 기준선 기간 정규화가 포함되어야 합니다. 또한, 아연 염료는 세포 내 에스테라아제에 의한 절단 후에만 형광 활성이 됩니다. 따라서 실험 전반에 걸쳐 염료 에스테르 절단으로 인한 불규칙한 형광 패턴을 피하기 위해 대부분의 염료에 대해 탈에스테르화 공정이 발생하는 데 약간의 시간을 허용하는 것이 좋습니다.
그림 1: 아연 수송 분석을 사용한 WT 및 ΔUSCTD의 Zn2+ 압출 활성. x축은 초 단위의 시간입니다. y축은 기준선의 백분율로 표현된 형광 변화입니다. 선 그래프는 시간의 함수로 나타낸 형광 변화입니다. 데이터는 >10 ROI에 대한 평균입니다. 표준 오차가 있는 개별 그래프는 보충 그림 2 및 보충 그림 3에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 상자 그림으로 표시된 ZnT1 WT 및 ΔUSCTD의 활성 비교. 각 데이터 포인트는 단일 실험을 나타냅니다. 검은색 선은 중간 점수를 나타냅니다. 속이 빈 사각형 상자는 평균 점수를 나타냅니다. y축은 초당 기준선 백분율의 변화를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: mCherry 여기(520nm) 및 방출(610nm) 파장에서 자극된 (A) ZnT1 WT 또는 (B) ZnT1 ΔUSCTD로 형질주입된 HEK 293T 세포. 두 경우 모두 ZnT1 변이체의 발현 및 막 국소화가 있습니다. 현미경 배율은 20배입니다. 노출 시간은 100ms입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 표준 오류가 시각화된 ZnT1 WT Zn2+ 운송 활동. x축은 초 단위의 시간입니다. y축은 기준선 형광에서 형광 변화의 백분율입니다. 검은색 선은 평균 형광 변화입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 표준 오차가 시각화된 ZnT1 ΔUSCTD Zn2+ 운송 활동. x축은 초 단위의 시간입니다. y축은 기준선 형광에서 형광 변화의 백분율입니다. 빨간색 선은 평균 형광 변화입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: pAAV2 플라스미드 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
상술한 방법은 높은 시간적 분해능으로 세포내 아연 농도를 직접 측정할 수 있게 한다. 다른 방법과 비교하여, 세포 내Zn2+의 변화를 모니터링하는 이 방법은 배경 소음을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 또한, 아연에 대한 염료의 선택성은 다른 금속 양이온과의 잠재적인 교차 상호작용을 제거한다(18,19). 마지막으로, 즉각적인 세포 독성이 없기 때문에 살아있는 세포 과정의 테스트를 가능하게합니다 19.
그러나 이 방법에는 특정 제한 사항이 있습니다. 첫째, 이 방법에 사용된 염료는 세포에 갇히도록 설계되었지만 영역이나 특정 프로세스로 유도할 수 없기 때문에 이 프로토콜을 사용하면 세포 내 역학을 검출하는 것이 상대적으로 더 어려울 수 있습니다. 다른 형광 염료는 세포 내의 특정 영역으로 유도될 수 있지만, 불행히도 훨씬 더 낮은 동적 범위(20)를 갖는다. 둘째, 염료를 빛에 노출시키면 표백으로 인한 형광 감소가 발생하여 빛에 노출되는 시간이 제한되고 결과적으로 실험을 실행하기 위한 활성 창이 제한됩니다. 셋째, 이 프로토콜에서의 염료 로딩은 다른 염료, 특히 유전적으로 인코딩된 염료를 사용하는 것과 비교할 때 번거롭고 시간이 많이 걸린다21. 마지막으로, 에스테르를 절단한 후에도 염료가 누출되어 형광22에서 Zn2+ 독립적 감소를 초래합니다.
실험의 성공을 보장하기 위해 몇 가지 단계를 수행해야 합니다. 첫째, transfection이 불균등하게 분포될 수 있기 때문에 선택된 세포는 관심 단백질을 포함해야 합니다. 염료 표백을 방지하려면 로드된 셀을 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 실험을 실행할 때 관류율은 커버슬립에서 세포가 분리되지 않고 실험을 완료하기에 충분해야 합니다. 여러 번 실행하는 경우 Ringer의 용액과 Ringer의 아연 용액에 대해 동일한 저장소를 유지하는 것이 좋습니다. 염료 로딩 시간과 세척 시간은 초기 실험에 따라 조정할 수 있습니다. 피리티온을 사용한 관류 를 통해 세포에 아연을 로딩하는 데 1분에서 5분이 소요될 수 있으며, 이는 시간에 따른 Zn2+ 유도 형광을 모니터링하여 평가한 결과입니다.
이러한 어려움에도 불구하고 이 방법을 통해 처음으로 Zn2+ 압출 공정의 역학을 연구할 수 있습니다. 그것은 프로세스를 단순화하고 이전 방법23,24에 비해 인과 관계를 더 잘 설정할 수 있는 직접적인 방법을 만듭니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
Raz Zarivach는 이스라엘 과학 재단(보조금 번호 163/22)의 지원을 받습니다. 토머 엘리 벤 요세프(Tomer Eli Ben Yosef)와 아리 모란(Arie Moran)은 이스라엘 과학 재단(Israel Science Foundation, 보조금 번호 2047/20)의 지원을 받고 있습니다. 벤구리온 대학교의 Daniel Gitler와 그의 그룹의 협력, 지원 및 전문 지식에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Sigma Aldrich | 31665 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d, Findley, S. d Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M.
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
