Summary
O transporte de zinco tem se mostrado desafiador de mensurar devido às fracas ligações causais com a função proteica e à baixa resolução temporal. Este protocolo descreve um método para monitorar, com alta resolução temporal, a extrusão de Zn 2+ de células vivas utilizando um corante fluorescente sensível a Zn 2+, fornecendo assim uma medida direta do efluxo de Zn2+.
Abstract
Metais de transição como íons Zn2+ devem ser fortemente regulados devido à sua toxicidade celular. Anteriormente, a atividade dos transportadores de Zn 2+ era medida indiretamente, determinando-se o nível de expressão do transportador sob diferentes concentrações de Zn2+. Isso foi feito utilizando imunohistoquímica, medindo o RNAm no tecido ou determinando os níveis celulares de Zn2+. Com o desenvolvimento dos sensores intracelulares de Zn 2+, as atividades dos transportadores de zinco são atualmente determinadas principalmente pela correlação de alterações no Zn 2+ intracelular, detectadas usando sondas fluorescentes, com a expressão dos transportadores de Zn2+. No entanto, ainda hoje, apenas alguns laboratórios monitoram mudanças dinâmicas no Zn2+ intracelular e o utilizam para medir a atividade de transportadores de zinco diretamente. Parte do problema é que dos 10 transportadores de zinco da família ZnT, com exceção do ZnT10 (transporta manganês), apenas o transportador de zinco 1 (ZnT1) está localizado na membrana plasmática. Portanto, relacionar a atividade de transporte a mudanças na concentração intracelular de Zn2+ é difícil. Este artigo descreve uma maneira direta de determinar a cinética de transporte de zinco usando um ensaio baseado em um corante fluorescente específico de zinco, FluoZin-3. Este corante é carregado em células de mamíferos em sua forma de éster e, em seguida, aprisionado no citosol devido à atividade celular de di-esterase. As células são carregadas com Zn 2+ utilizando a piritionato ionóforo Zn2+. A atividade do ZnT1 é avaliada a partir da parte linear da redução da fluorescência após o washout celular. A fluorescência medida em uma excitação de 470 nm e emissão de 520 nm é proporcional ao Zn2+ intracelular livre. A seleção das células que expressam ZnT1 marcadas com o fluoróforo mCherry permite monitorar apenas as células que expressam o transportador. Este ensaio é usado para investigar a contribuição de diferentes domínios da proteína ZnT1 para o mecanismo de transporte de ZnT1 humano, uma proteína transmembrana eucariótica que extrai o excesso de zinco da célula.
Introduction
O zinco é um oligoelemento essencial no meio celular. Incorpora um terço de todas as proteínas e está envolvido em vários processos celulares, como catálise1, transcrição2 e motivos estruturais3. No entanto, apesar de ser inerte redox, altas concentrações de zinco são tóxicas para a célula, razão pela qual nenhum organismo mamífero sobreviveu sem a presença de mecanismos que regulam a homeostase do zinco. Em mamíferos, três mecanismos são responsáveis por esse processo: (1) metalotioneínas, que são proteínas citosólicas ricas em cisteína que se ligam ao zinco em alta afinidade, prevenindo o excesso de zinco citosólico livre4; (2) proteínas Zrt/Irt-like (ZIPs), transportadores de zinco responsáveis pelo influxo de zinco para o citosol através da membrana plasmática ou de organelas intracelulares 4,5,6,7,8; e (3) ZnTs, que são um subconjunto de mamíferos da família dos facilitadores de difusão catiônica (CDF) ubíquas e são transportadores de zinco, pois extrudem zinco do citosol através da membrana plasmática ou para as organelas intracelulares 4,5,6,7,8,9. Devido à importância do zinco para o metabolismo celular, é vital entender a dinâmica do zinco celular.
Métodos prévios para avaliar a dinâmica do zinco dependiam da avaliação dos níveis de expressão do RNAm sob diferentes condições de zinco, correlacionando-os com as medidas celulares de zinco de tecidos ou células fixas10,11,12. Esses métodos incluem detecção química e coloração imunohistoquímica. No entanto, esses métodos produzem apenas medidas indiretas e, portanto, determinam apenas uma correlação offline entre a concentração intracelular de zinco e a expressão de transportadores de zinco. Consequentemente, esses métodos não podem inferir nenhum parâmetro que exija alta resolução temporal.
Uma medida mais direta do transporte de Zn2+ utiliza isótopos radioativos de zinco13. Este método baseia-se na medição de Zn2+ radiomarcado para monitorar o transporte de zinco e sua cinética. No entanto, devido à importância do zinco na homeostase celular, múltiplos processos celulares regulam a concentração intracelular de zinco. Entre eles estão a ligação extracelular e vários sistemas de transporte que trabalham em conjunto para manter um controle rigoroso dos níveis intracelulares de Zn2+ . A combinação desses processos cria um ruído de fundo considerável, o que dificulta o teste de funções individuais de transporte relacionadas ao zinco.
Este artigo demonstra um método para monitorar diretamente a taxa de transporte de zinco medindo a concentração intracelular de zinco livre usando um corante fluorescente específico para zinco, FluoZin-3. O corante tem alta especificidade para Zn2+ e pouca interferência de outros cátions divalentes, como o cálcio. Além disso, em sua forma de éster, ele entra nas células por difusão não iônica e é então aprisionado devido à atividade da diesterase intracelular. Assim, sua fluorescência é correlacionada primariamente com a concentração citosólica livre de zinco. Estes experimentos foram conduzidos para estudar a relação estrutura-função do transportador de zinco 1 (ZnT1), um membro da família ZnT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transfecção celular
- Cultura HEK293T células em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina e 1x penicilina/estreptomicina (ver Tabela de Materiais) em estufa umidificada a 37 °C/5% CO2 até a confluência em uma placa de 10 cm (8,8 x 106 células totais).
- Coloque uma lamínula de 13 mm em cada um dos poços de uma placa de 12 poços. Diluir 0,44 x 106 células tripsinizadas da etapa 1,1 em 12 mL de DMEM completo. Misture bem pipetando para cima e para baixo de três a cinco vezes. Encha cada poço com 1 ml da solução misturada. Crescer em uma incubadora umidificada a 37 °C/5% CO2 durante a noite.
- Substitua o DMEM completo em cada poço por 1 mL de DMEM sem soro (ver Tabela de Materiais) em cada poço. Devolver a placa de 12 poços à incubadora humidificada como no passo 1.1.
- Para cada poço de transfecção, diluir 1 μg de plasmídeo pAAV2 contendo a proteína de interesse marcada com proteína fluorescente mCherry (Arquivo Suplementar 1) em 100 μL de DMEM livre de soro em um tubo de 1,5 mL.
- Adicionar 3 μg de polietilenoimina (PEI, ver Tabela de Materiais) a 100 μL de DMEM sem soro por transfecção, com cada transfecção em um tubo diferente de 1,5 mL. A relação plasmídeo:PEI deve ser de 1:3 (μg:μg).
- Vórtice ambos os tubos do passo 1.4 e do passo 1.5 por 10 s, e deixe descansar em temperatura ambiente por pelo menos 5 min.
- Misturar uma parte (100 μL por poço) da solução de ADN do passo 1.4 com uma parte (100 μL por poço) da solução de PEI do passo 1.5. Vórtice a solução final por 10 s, e deixe-a descansar em temperatura ambiente por pelo menos 20 min e por até 6 h.
- Pegue a placa de 12 poços da incubadora. Vórtice a solução final do passo 1.7 e adicionar 200 μL a cada um dos poços da placa de 12 poços a partir do passo 1.3. Devolver a placa de 12 poços à incubadora humidificada (passo 1.1).
- Após 3 h, substituir o meio em cada poço por 1 mL de DMEM completo. Devolver a placa de 12 poços à incubadora humidificada como no passo 1.1.
- Após 2 dias, retirar a cultura celular transfectada da incubadora a 37 °C/5% CO2 e colocá-la em microscópio de fluorescência invertida com aumento de 10x.
- Usando a roda de foco do microscópio, concentre-se nas células enquanto usa luz de campo brilhante.
- Alterne para os comprimentos de onda de excitação fluorescente mCherry (587 nm) e emissão (610 nm) e desligue a luz de campo brilhante. Verifique a fluorescência das células para confirmar a expressão de ZnT1 mCherry.
- Prepare a solução de carregamento do corante.
- Tome uma alíquota de 4 μL de corante fluorescente específico para zinco (ver Tabela de Materiais) na sua forma de éster de acetóximetilo (AM), dissolvido em DMSO (1 μg/μL), a partir de um material protegido contra a luz armazenado num congelador de -20 °C. Esta forma permite que o corante entre na célula através da membrana plasmática por difusão simples.
- Adicionar 4 μL de ácido plurónico a 10% (ou 2 μL de ácido plurónico a 20%, ver Tabela de Materiais) à alíquota do passo 1.13.1. Misture bem a solução pipetando para cima e para baixo três vezes e, em seguida, adicione todos os 8 μL a um tubo de 1,5 mL.
- Adicionar 750 μL de solução de Ringer (preparada internamente, ver Tabela de materiais para composição) suplementada com 1 mg/mL (~0,1%) de albumina de soro bovino ao tubo a partir da etapa 1.13.2 e vórtice vigorosamente. Adicione mais 750 μL da mesma solução e volte a agitar para garantir a máxima mistura.
- Adicionar 750 μL da solução final do passo 1.13.3 a dois poços numa nova placa de cultura de 6 poços. Cubra com papel alumínio.
OBS: Para evitar o clareamento, a placa de 6 poços é sempre coberta com papel alumínio a partir desta etapa. - Usando um tweezer fino, pegue até quatro folhas de cobertura replicadas da placa de cultura de células transfectada e coloque-as no primeiro poço cheio (até quatro lâminas por poço) da nova placa de 6 poços a partir da etapa 1.14. Repita esse processo para o segundo bem preenchido.
OBS: Todas as tampas do mesmo poço preenchido devem ser do mesmo estado. No entanto, cada poço pode conter condições diferentes. - Cubra com papel alumínio e agite suavemente por 15-20 min.
- Retire a solução de carga do corante e substitua-a por uma nova solução de lavagem de Ringer mais albumina, conforme utilizado no passo 1.13.3. Cubra com papel alumínio. Deixe agitar novamente por 20 min. Isso permite a clivagem do éster de AM pelas esterases intracelulares.
2. Preparação do microscópio
- Organize as ferramentas necessárias (ver Tabela de Materiais) conforme mencionado: um microscópio de fluorescência invertido capaz de detectar fluoróforos de GFP e mCherry, um sistema de perfusão que permite alternar entre pelo menos duas soluções, um sistema de sucção e uma câmara de perfusão.
- Ligue o microscópio, sua fonte de luz e a câmera. Ligue o sistema de sucção.
- Lave o sistema de perfusão. Lavar a primeira câmara com solução de Ringer e a segunda câmara com solução de Ringer contendo 7 μM de solução de zinco suplementada com 7 μM de piritionato (ionóforo de zinco, ver Tabela de Materiais). Para evitar bolhas de ar ou lacunas, deixe um pouco de líquido em cada câmara.
NOTA: Como ambos os recipientes estão conectados ao mesmo tubo acoplado à câmara de perfusão, certifique-se sempre de que o segmento compartilhado seja lavado com a solução de Ringer. - Feche as torneiras e encha as câmaras apropriadas com solução de Ringer e solução de zinco de Ringer, como no passo 2.3.
3. Preparo da amostra
- Pegue a câmara de perfusão e coloque-a com o lado estreito do sulco voltado para cima.
NOTA: O sulco é um orifício no meio da câmara de perfusão. Permite o acesso do fluido de perfusão às células. Um lado do sulco é estreito e o lado oposto é largo. - Aplique um silicone de vedação (consulte Tabela de Materiais) ao redor do sulco. Limpe qualquer silicone de vedação do sulco usando uma ponta de pipeta.
NOTA: Certifique-se de que há vedação de silicone suficiente ao redor do sulco para selar uma tampa de 22 mm. - Usando um tweezer fino, pegue uma tampa da solução de lavagem e coloque-a em cima do sulco com as células voltadas para baixo. Desta forma, as células serão expostas à solução perfundindo o sulco durante o experimento.
- Coloque uma lamínula de 22 mm sobre a lamínula de 13 mm e aperte-a usando o tweezer. Tome cuidado para não rachar as tampas.
- Vire a câmara e pressione-a para liberar todos os líquidos presentes. Preencha o sulco com 100 μL da solução de lavagem de Ringer e pressione novamente para garantir que não haja vazamentos.
NOTA: Se for detectado um vazamento, aplique um agente de vedação no local do vazamento e teste novamente. - Monte a câmara de perfusão na plataforma e fixe-a. Coloque os tubos de perfusão e sucção para permitir a perfusão sobre as células no sulco.
- Alterar a velocidade de perfusão para aproximadamente 2 mL/min e ligar a perfusão da solução de Ringer. Verifique se o sistema de perfusão está funcionando sem vazamento ou transbordamento.
4. Preparação da medição
- Abra o software de imagem (consulte Tabela de Materiais) clicando duas vezes no ícone. Faça login com as credenciais relevantes. Escolha a câmera conectada e pressione Ok.
- Ajuste a ampliação do microscópio para 10x usando o botão no lado esquerdo do microscópio.
- Escolhendo a visualização ao vivo e usando o joystick, mova a plataforma para se concentrar nas células no sulco.
- Enquanto a perfusão estiver ligada, apague as luzes e altere o comprimento de onda para mCherry pressionando o botão dedicado na interface. Ajuste o foco usando a roda de foco do microscópio.
- Uma vez que o microscópio está focado nas células, mova a plataforma usando o joystick para permitir a seleção dos adesivos celulares apropriados.
NOTA: Uma área adequada é considerada uma área com pelo menos 10 células para uma ROI e uma área vazia para plano de fundo. - Selecione o menu suspenso Ativar/desativar ROIs e escolha Desenhar ROIs circulares.
- Desenhe ROIs de agrupamentos de células com as células que expressam mCherry (indica a expressão de ZnT1).
- Na mesma barra de ferramentas da etapa 4.6, clique no botão Ativar/desativar ROIs em segundo plano e ajuste o local e o tamanho do ROI em segundo plano para uma área sem células.
- Verifique com os comprimentos de onda mCherry e EGFP para garantir que nenhuma célula esteja no ROI em segundo plano selecionado.
NOTA: Os comprimentos de onda foram ajustados de modo que o mCherry usou um comprimento de onda de excitação de 520 nm e um comprimento de onda de emissão de 610 nm e o EGFP usou um comprimento de onda de excitação de 470 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm.
- Verifique com os comprimentos de onda mCherry e EGFP para garantir que nenhuma célula esteja no ROI em segundo plano selecionado.
- Selecione a subguia Comprimento de onda (λ). Marque sua caixa de seleção e verifique se o comprimento de onda GFP está presente e sua caixa de seleção marcada. Caso contrário, adicione e marque.
- Selecione a subguia Duração . Defina o intervalo de medição como a cada 5 s e altere o número de intervalos para se adequar à duração do experimento.
- Na seção Foco no painel do microscópio abaixo da ocular, clique no botão Ligado para ativar o sistema de foco perfeito (PFS).
- Usando a roda de foco PFS, ajuste o foco. Na interface do software, em ND Acquisition, verifique se o PFS está marcado.
- Clique em Executar agora.
5. Procedimento experimental
- Comece com uma medição do período basal de 90 s usando a perfusão da solução de Ringer.
- Após o término do período basal, desligue a perfusão da solução de Ringer e, em seguida, ligue a perfusão da solução de zinco de Ringer. Marque a troca da solução clicando na bandeira vermelha no canto inferior direito do painel de interface principal. Espera-se que apareça um aumento na fluorescência.
- Uma vez que a elevação da fluorescência começa a saturar, mude de volta para a perfusão com a solução de Ringer. Desligue a perfusão da solução de zinco de Ringer e, em seguida, ligue a perfusão da solução de Ringer.
- Aguarde até que o tempo de experimento expire. Uma diminuição notável e constante na fluorescência é esperada se o ZnT1 estiver funcionando corretamente.
6. Exportação de dados
- Para exportar os dados com a subtração da linha de base, pressione o botão Subtrair Linha de Base e exiba as alterações na "janela de aquisição ND".
- Clique no botão Exportar na interface do software na "janela de aquisição ND". Uma folha de dados do Excel será aberta. Salve no local desejado.
7. Análise dos dados
- Para cada ROI, crie uma fluorescência de linha de base média dos primeiros 90-100 s.
- Expresse a fluorescência calculada para cada ROI como uma porcentagem do plano de fundo para essa ROI.
- Crie uma média de linhas de todas as ROIs e plote o resultado como um gráfico de linhas. Isso cria uma média de todos os ROIs em função do tempo.
- Usando a função de ajuste linear, selecione a taxa inicial para a diminuição da fluorescência após a lavagem com solução de Ringer. O valor da inclinação da equação correlaciona-se com a taxa de transporte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O ZnT1 é um transportador de zinco de mamíferos localizado na membrana plasmática celular13. É um membro da família de proteínas facilitadoras de difusão catiônica (CDF) que extrusa zinco do citosol para o milieu extracelular14. O ZnT1 tem uma arquitetura de dois domínios: o domínio transmembrana, que transporta os íons através da membrana, e um domínio C-terminal14. Ao contrário de outras proteínas CDF conhecidas, ZnT1 tem um domínio C-terminal não estruturado estendido (USCTD). O papel da USCTD é atualmente desconhecido. Utilizamos o protocolo acima para comparar ZnT1 WT com ZnT1 sem o USCTD para avaliar seu envolvimento na atividade de transporte de zinco.
Células HEK 293T foram transfectadas com o plasmídeo pAAV2 contendo ZnT1 WT ou ZnT1 sem o C-terminal não estruturado (ΔUSCTD) e testadas a taxa de atividade de transporte conforme descrito acima. A Figura 1 suplementar mostra que ambas as versões do ZnT1 expressam e se localizam na membrana plasmática sem problemas. A Figura 1 mostra os resultados típicos de um exemplo de tal experimento. Um aumento na fluorescência é o resultado de um aumento na concentração intracelular de Zn 2+, enquanto uma diminuição é resultado da atividade do ZnT1 transportando Zn 2+ através da membrana celular (gráficos individuais, incluindo erros padrão, são encontrados na Figura Suplementar 2 e na Figura Suplementar 3). É evidente a partir desta figura que ZnT1 WT tem uma curva de fluorescência mais suave do que o mutante. No entanto, essa não é uma característica diferenciadora inerente, mas está relacionada à variabilidade nas respostas celulares à carga de zinco, que foi observada em experimentos anteriores. A Figura 2 mostra um box plot resumindo os resultados de 15 a 17 desses experimentos. A partir da figura, fica claro que o ΔUSCTD apresenta uma maior dispersão das taxas de transporte em comparação com o WT. Embora isso possa ser atribuído à variabilidade da resposta celular mencionada anteriormente, também pode indicar uma diferença funcional. Por exemplo, isso pode implicar que o segmento ZnT1 USCTD é um modulador da taxa de transporte. Claramente, não há diferença visível entre as atividades de extrusão de Zn2+ de WT e ΔUSCTD. Com base na análise estatística, os dados não apresentaram distribuição normal (conjunto de dados WT, teste de Shapiro-Wilk15, estatística = 0,72404, valor de p = 0,0004), de modo que dois testes não paramétricos amostrais foram utilizados para comparações entre os conjuntos de dados. Os resultados mostraram que não houve diferença estatística entre as taxas de transporte (teste Mann-Whitney16 U: U = 132, Z = 0,15105, Asymp. Prob>|U| = 0,87994; Teste de Kolmogorov-Smirnov17: D = 0,27059, Z = 0,76384, Prob>|D|= 0,5161).
Devido ao custo energético substancial de criar a extensão não estruturada (~80 aminoácidos), é razoável supor que este domínio serve a uma função celular. No entanto, uma função celular ligada a esse domínio não foi identificada até o momento. Este domínio é exclusivo do ZnT1 e não é encontrado em nenhum outro membro da família ZnT. Como tal, pode ser devido ao fato de que, ao contrário de outros ZnTs, o ZnT1 está localizado na membrana plasmática, enquanto que, com exceção do ZnT10, todos os outros membros são expressos em organelas internas.
Os dados brutos e gráficos subsequentes mostrados aqui são baseados em medidas de intervalo de 5 s da fluorescência causada pelo corante sensível ao zinco. Isso significa que, em um período de tempo relativamente curto (minutos), uma visualização do transporte de zinco dependente do tempo pode ser gerada com alta resolução temporal. A análise deve incluir uma normalização do período basal, uma vez que o corante é carregado nas células antes da carga de zinco e pode ter fluorescência intracelular inicial causada por uma pequena quantidade de zinco livre. Além disso, o corante zinco só se torna fluorescentemente ativo após a clivagem pela esterase intracelular. Portanto, recomenda-se dar algum tempo para que o processo de desesterificação ocorra para a maior parte do corante, a fim de evitar padrões irregulares de fluorescência causados pela clivagem do éster do corante durante todo o experimento.
Figura 1: Atividades de extrusão de Zn2+ de WT e ΔUSCTD usando o ensaio de transporte de zinco. O eixo x é o tempo em segundos. O eixo y é a mudança de fluorescência expressa como uma porcentagem da linha de base. Os gráficos de linha são a mudança de fluorescência em função do tempo. Os dados são em média acima de >10 ROIs. Os gráficos individuais com erro padrão são mostrados na Figura 2 Suplementar e na Figura 3 Suplementar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comparação das atividades de ZnT1 WT e ΔUSCTD representadas como um box plot. Cada ponto de dados representa um único experimento. A linha preta indica a pontuação mediana. A caixa quadrada oca indica o escore médio. O eixo y indica a mudança na porcentagem da linha de base por segundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Células HEK 293T transfectadas com (A) ZnT1 WT ou (B) ZnT1 ΔUSCTD estimuladas nos comprimentos de onda de excitação (520 nm) e emissão (610 nm) de mCherry. Em ambos os casos, há expressão e localização da membrana da variante ZnT1. A ampliação do microscópio é de 20x. O tempo de exposição é de 100 ms. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 2: ZnT1 WT Zn2+ atividade de transporte com o erro padrão visualizado. O eixo x é o tempo em segundos. O eixo y é a mudança percentual de fluorescência em relação à fluorescência basal. A linha preta é a mudança média de fluorescência. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 3: ZnT1 ΔUSCTD Zn2+ atividade de transporte com o erro padrão visualizado. O eixo x é o tempo em segundos. O eixo y é a mudança percentual de fluorescência em relação à fluorescência basal. A linha vermelha é a mudança média de fluorescência. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 1: sequência plasmidial pAAV2. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O método descrito acima permite a medida direta da concentração intracelular de zinco com alta resolução temporal. Comparado a outros métodos, este método envolvendo o monitoramento de mudanças no Zn2+ intracelular pode diminuir substancialmente o ruído de fundo. Além disso, a seletividade do corante para o zinco elimina potenciais interações cruzadas com outros cátions metálicos18,19. Finalmente, sua ausência de citotoxicidade imediata possibilita a realização de testes de processos celularesvivos 19.
No entanto, este método tem certas limitações. Primeiro, detectar a dinâmica intracelular pode ser relativamente mais desafiador com esse protocolo, uma vez que o corante usado neste método é projetado para ser aprisionado na célula, mas não pode ser direcionado para regiões ou processos específicos. Outros corantes fluorescentes podem ser direcionados para uma área específica das células, mas, infelizmente, têm uma faixa dinâmica muito menor20. Segundo, a exposição do corante à luz provoca uma diminuição da fluorescência devido ao clareamento, o que restringe o tempo de exposição à luz e, consequentemente, a janela ativa para a execução do experimento. Terceiro, a carga de corantes nesse protocolo é pesada e demorada quando comparada ao uso de outros corantes, especialmente corantes codificados geneticamente21. Finalmente, mesmo após a clivagem dos ésteres, o corante vaza, levando a uma redução independente de Zn 2+ na fluorescência22.
Várias medidas devem ser tomadas para garantir o sucesso do experimento. Primeiro, como a transfecção pode ser distribuída de forma desigual, as células selecionadas devem conter a proteína de interesse. Para evitar o clareamento de corantes, é importante manter as células carregadas protegidas da luz. Durante a execução do experimento, a taxa de perfusão deve ser suficiente para completar o experimento sem causar o descolamento das células da lamínula. No caso de múltiplas corridas, recomenda-se manter os mesmos reservatórios para a solução de Ringer e a solução de zinco de Ringer. O tempo de carregamento do corante e o tempo de lavagem podem ser ajustados de acordo com os experimentos iniciais. A carga de zinco nas células via perfusão com piritionato pode levar de 1 min a 5 min, como avaliado pelo monitoramento da fluorescência induzida por Zn2+ ao longo do tempo.
Apesar dessas dificuldades, este método nos permite, pela primeira vez, estudar a dinâmica do processo de extrusão de Zn2+. Simplifica o processo e cria uma maneira direta de estabelecer melhor nexos causais em comparação com os métodos anteriores23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Raz Zarivach é apoiado pela Israel Science Foundation (processo nº 163/22). Tomer Eli Ben Yosef e Arie Moran são apoiados pela Israel Science Foundation (bolsa nº 2047/20). Gostaríamos de agradecer a Daniel Gitler e seu grupo na Universidade Ben-Gurion por sua cooperação, apoio e experiência.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Sigma Aldrich | 31665 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d, Findley, S. d Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M.
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
