Summary
Zinktransport har visat sig vara utmanande att mäta på grund av de svaga orsakssambanden till proteinets funktion och den låga tidsupplösningen. Detta protokoll beskriver en metod för övervakning, med hög tidsupplösning, Zn 2+ extrudering från levande celler genom att använda ett Zn 2+ känsligt fluorescerande färgämne, vilket ger ett direkt mått på Zn2+ utflöde.
Abstract
Övergångsmetaller som Zn2+-joner måste regleras noggrant på grund av deras cellulära toxicitet. Tidigare mättes aktiviteten hos Zn 2+-transportörer indirekt genom att bestämma transportörens uttrycksnivå under olika koncentrationer av Zn2+. Detta gjordes genom att använda immunhistokemi, mäta mRNA i vävnaden eller bestämma de cellulära Zn2+-nivåerna. Med utvecklingen av intracellulära Zn 2+-sensorer bestäms zinktransportörernas aktiviteter för närvarande främst genom att korrelera förändringar i intracellulära Zn 2+, detekterade med fluorescerande sonder, med uttrycket av Zn 2+-transportörerna. Men även idag är det bara ett fåtal laboratorier som övervakar dynamiska förändringar i intracellulärt Zn2+ och använder det för att mäta aktiviteten hos zinktransportörer direkt. En del av problemet är att av de 10 zinktransportörerna i ZnT-familjen, med undantag för ZnT10 (transporterar mangan), är endast zinktransportör 1 (ZnT1) lokaliserad vid plasmamembranet. Därför är det svårt att koppla transportaktiviteten till förändringar i den intracellulära Zn2+-koncentrationen. Den här artikeln beskriver ett direkt sätt att bestämma zinktransportkinetiken med hjälp av en analys baserad på ett zinkspecifikt fluorescerande färgämne, FluoZin-3. Detta färgämne laddas in i däggdjursceller i sin esterform och fångas sedan i cytosolen på grund av cellulär di-esterasaktivitet. Cellerna laddas med Zn 2+ genom att använda Zn2+ jonoforpyrition. ZnT1-aktiviteten bedöms från den linjära delen av minskningen av fluorescensen efter cellurlakningen. Fluorescensen uppmätt vid en excitation på 470 nm och emission på 520 nm är proportionell mot det fria intracellulära Zn2+. Genom att välja de celler som uttrycker ZnT1 märkta med mCherry-fluoroforen kan endast de celler som uttrycker transportören övervakas. Denna analys används för att undersöka bidraget från olika domäner av ZnT1-protein till transportmekanismen för humant ZnT1, ett eukaryot transmembranprotein som extruderar överskott av zink från cellen.
Introduction
Zink är ett viktigt spårämne i cellmiljön. Den innehåller en tredjedel av alla proteiner och är involverad i olika cellulära processer, såsom katalys1, transkription2 och strukturella motiv3. Men trots att de är redox-inerta är höga zinkkoncentrationer giftiga för cellen, vilket är anledningen till att ingen däggdjursorganism har överlevt utan närvaron av mekanismer som reglerar zinkhomeostas. Hos däggdjur är tre mekanismer ansvariga för denna process: (1) metallothioneiner, som är cytosoliska cysteinrika proteiner som binder zink vid hög affinitet, vilket förhindrar överskott av fritt cytosoliskt zink4; (2) Zrt/Irt-liknande proteiner (ZIP), som är zinktransportörer som ansvarar för zinkinflöde till cytosolen genom plasmamembranet eller från intracellulära organeller 4,5,6,7,8. och (3) ZnTs, som är en undergrupp av däggdjur i den allestädes närvarande katjondiffusionsfacilitatorfamiljen (CDF) och är zinktransportörer, eftersom de extruderar zink från cytosolen över plasmamembranet eller in i de intracellulära organellerna 4,5,6,7,8,9. På grund av zinkens betydelse för cellulär metabolism är det viktigt att förstå cellulär zinkdynamik.
Tidigare metoder för att bedöma zinkdynamik var beroende av att bedöma uttrycksnivåerna av mRNA under olika zinkförhållanden genom att korrelera dem med cellulära zinkmätningar av fasta vävnader eller celler10,11,12. Dessa metoder inkluderar kemisk detektion och immunhistokemisk färgning. Dessa metoder ger dock endast indirekta mått och bestämmer därmed endast en offline-korrelation mellan intracellulär zinkkoncentration och uttrycket av zinktransportörer. Följaktligen kan dessa metoder inte härleda några parametrar som kräver hög tidsupplösning.
En mer direkt mätning av Zn2+ -transport använder radioaktiva isotoper avzink-13. Denna metod bygger på mätning av radioaktivt märkt Zn2+ för att övervaka zinktransport och dess kinetik. Men på grund av zinkens betydelse för cellulär homeostas reglerar flera cellulära processer intracellulär zinkkoncentration. Bland dessa finns extracellulär bindning och flera transportsystem som arbetar tillsammans för att upprätthålla strikt kontroll av intracellulära Zn2+ -nivåer. Kombinationen av dessa processer skapar ett betydande bakgrundsbrus, vilket gör det svårt att testa enskilda zinkrelaterade transportfunktioner.
Den här artikeln demonstrerar en metod för att direkt övervaka zinktransporthastigheten genom att mäta den intracellulära fria zinkkoncentrationen med hjälp av ett zinkspecifikt fluorescerande färgämne, FluoZin-3. Färgämnet har hög specificitet för Zn2+ och liten störning från andra tvåvärda katjoner, såsom kalcium. Dessutom, i sin esterform, kommer den in i cellerna genom nonjonisk diffusion och fångas sedan på grund av aktiviteten hos intracellulärt di-esteras. Således är dess fluorescens främst korrelerad med den fria cytosoliska zinkkoncentrationen. Dessa experiment utfördes för att studera struktur-funktionsförhållandet hos zinktransportör 1 (ZnT1), en medlem av ZnT-familjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celltransfektion
- Odling HEK293T celler i Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin och 1x penicillin/streptomycin (se materialförteckning) i en befuktad inkubator vid 37 °C/5 % CO2 tills sammanflödet på en 10 cm platta (8,8 x 106 totala celler).
- Placera ett 13 mm täckglas i var och en av brunnarna på en 12-hålsplatta. Späd 0,44 x 106 trypsiniserade celler från steg 1,1 i 12 ml komplett DMEM. Blanda väl genom att pipettera upp och ner tre till fem gånger. Fyll varje brunn med 1 ml av den blandade lösningen. Odla i en fuktad inkubator vid 37 °C/5 % CO2 över natten.
- Ersätt hela DMEM i varje brunn med 1 ml serumfri DMEM (se materialförteckning) i varje brunn. Sätt tillbaka 12-hålsplattan i den befuktade inkubatorn som i steg 1.1.
- För varje transfektionsbrunn späds 1 μg pAAV2-plasmid innehållande proteinet av intresse märkt med mCherry fluorescerande protein (tilläggsfil 1) i 100 μl serumfritt DMEM i ett 1,5 ml rör.
- Tillsätt 3 μg polyetenimin (PEI, se materialtabell) till 100 μl serumfri DMEM per transfektion, med varje transfektion i ett annat 1,5 ml rör. Plasmid:PEI-förhållandet bör vara 1:3 (μg:μg).
- Virvla båda rören från steg 1.4 och steg 1.5 i 10 s och låt vila i rumstemperatur i minst 5 minuter.
- Blanda en del (100 μL per brunn) av DNA-lösningen från steg 1.4 med en del (100 μL per brunn) av PEI-lösningen från steg 1.5. Skölj den slutliga lösningen i 10 sekunder och låt den vila i rumstemperatur i minst 20 minuter och upp till 6 timmar.
- Ta 12-hålsplattan från inkubatorn. Vortex den slutliga lösningen från steg 1.7 och tillsätt 200 μL till var och en av brunnarna i 12-hålsplattan från steg 1.3. Sätt tillbaka 12-hålsplattan i den befuktade inkubatorn (steg 1.1).
- Efter 3 timmar byts mediet i varje brunn ut mot 1 ml komplett DMEM. Sätt tillbaka 12-hålsplattan i den befuktade inkubatorn som i steg 1.1.
- Efter 2 dagar tar du den transfekterade cellkulturen från 37 °C/5 % CO2 -inkubatorn och placerar den i ett inverterat fluorescensmikroskop med 10x förstoring.
- Använd mikroskopets fokushjul och fokusera på cellerna samtidigt som du använder ljusfältsljus.
- Byt till de fluorescerande mCherry-excitationsvåglängderna (587 nm) och emission (610 nm) och stäng av ljusfältsljuset. Kontrollera om cellerna fluorescerar för att bekräfta uttrycket av ZnT1 mCherry.
- Förbered färgladdningslösningen.
- Ta en alikvot på 4 μl zinkspecifikt fluorescerande färgämne (se materialtabell) i dess acetoximetyl (AM)esterform, löst i DMSO (1 μg/μL), från ett ljusskyddat lager som förvaras i en frys vid −20 °C. Denna form gör att färgämnet kan komma in i cellen genom plasmamembranet genom enkel diffusion.
- Tillsätt 4 μl 10 % pluronsyra (eller 2 μl 20 % pluronsyra, se Materialtabell) till alikvoten från steg 1.13.1. Blanda lösningen väl genom att pipettera upp och ner tre gånger och tillsätt sedan alla 8 μl till ett 1,5 ml rör.
- Tillsätt 750 μl Ringers lösning (egenberedd, se Materialtabell ) kompletterad med 1 mg/ml (~0,1 %) bovint serumalbumin till röret från steg 1.13.2 och virvla kraftigt. Tillsätt ytterligare 750 μL av samma lösning och virvla igen för att säkerställa maximal blandning.
- Tillsätt 750 μl av den slutliga lösningen från steg 1.13.3 till två brunnar i en ny odlingsplatta med 6 brunnar. Täck med aluminiumfolie.
OBS: För att undvika blekning är 6-hålsplattan alltid täckt med aluminiumfolie från detta steg. - Använd en fin pincett, ta upp till fyra replikattäckglas från den transfekterade cellodlingsplattan och placera dem i den första fyllda brunnen (upp till fyra glas per brunn) på den nya 6-hålsplattan från steg 1.14. Upprepa denna process för den andra fyllda brunnen.
OBS: Alla täckglas i samma fyllda brunn måste vara från samma skick. Varje brunn kan dock innehålla olika villkor. - Täck med aluminiumfolie och skaka försiktigt i 15-20 minuter.
- Ta bort färgladdningslösningen och ersätt den med en ny tvättlösning av Ringers plus albumin, som används i steg 1.13.3. Täck med aluminiumfolie. Låt skaka igen i 20 min. Detta gör det möjligt att klyva AM-estern av de intracellulära esteraserna.
2. Förberedelse av mikroskop
- Ordna de nödvändiga verktygen (se materialförteckningen) enligt ovan: ett inverterat fluorescensmikroskop som kan detektera GFP- och mCherry-fluoroforer, ett perfusionssystem som gör det möjligt att växla mellan minst två lösningar, ett sugsystem och en perfusionskammare.
- Slå på mikroskopet, dess ljuskälla och kameran. Slå på sugsystemet.
- Tvätta perfusionssystemet. Tvätta den första kammaren med Ringers lösning och den andra kammaren med Ringers lösning innehållande 7 μM zinklösning tillsatt med 7 μM pyrition (zinkjonofor, se Materialförteckning). För att undvika luftbubblor eller luckor, lämna lite vätska i varje kammare.
OBS: Eftersom båda behållarna är anslutna till samma rör som är anslutet till perfusionskammaren, se alltid till att det delade segmentet tvättas med Ringers lösning. - Stäng kranarna och fyll lämpliga kammare med Ringers lösning och Ringers zinklösning, som i steg 2.3.
3. Beredning av prover
- Ta perfusionskammaren och placera den med den smala sidan av spåret vänd uppåt.
OBS: Spåret är ett hål i mitten av perfusionskammaren. Det gör det möjligt för perfusionsvätskan att komma åt cellerna. Ena sidan av spåret är smal och den motsatta sidan är bred. - Applicera en tätningssilikon (se materialtabell) runt spåret. Rengör eventuellt tätningssilikon från spåret med en pipettspets.
OBS: Se till att det finns tillräckligt med silikontätning runt spåret för att täta en 22 mm täckglas. - Använd en fin pincett, ta ett täckglas från tvättlösningen och placera det ovanpå spåret med cellerna nedåt. På så sätt kommer cellerna att exponeras för lösningen som perfusionerar spåret under experimentet.
- Placera ett 22 mm täckglas ovanpå 13 mm täckglaset och dra åt det med pincetten. Var försiktig så att täckglasen inte spricker.
- Vänd på kammaren och tryck på den för att släppa ut alla nuvarande vätskor. Fyll spåret med 100 μL av Ringers tvättlösning och tryck igen för att säkerställa inget läckage.
OBS: Om ett läckage upptäcks, applicera ett tätningsmedel på platsen för läckaget och testa igen. - Montera perfusionskammaren på plattformen och säkra den. Placera perfusions- och sugrören så att de tillåter perfusion över cellerna i spåret.
- Ändra perfusionshastigheten till cirka 2 ml/min och slå på perfusionen av Ringers lösning. Se till att perfusionssystemet fungerar utan läckage eller spill.
4. Förberedelse av mätning
- Öppna bildbehandlingsprogrammet (se materialförteckning) genom att dubbelklicka på ikonen. Logga in med relevanta inloggningsuppgifter. Välj den anslutna kameran och tryck på Ok.
- Ställ in mikroskopets förstoring på 10x med knappen på vänster sida av mikroskopet.
- Välj live view och använd joysticken för att flytta plattformen för att fokusera på cellerna i spåret.
- Medan perfusionen är på, släck lamporna och ändra våglängden till mCherry genom att trycka på den dedikerade knappen i gränssnittet. Justera fokus med hjälp av mikroskopets fokushjul.
- När mikroskopet är fokuserat på cellerna, flytta plattformen med joysticken för att möjliggöra val av lämpliga cellfläckar.
OBS: Ett lämpligt område anses vara ett område med minst 10 celler för en ROI och ett tomt område för bakgrund. - Välj rullgardinsmenyn Aktivera och inaktivera ROI och välj Rita cirkulär ROI.
- Rita ROI för cellkluster med de mCherry-uttryckande cellerna (indikerar uttrycket av ZnT1).
- Från samma verktygsfält som steg 4.6 klickar du på knappen Slå på/av ROI för bakgrunden och justera platsen och storleken på bakgrunden ROI till ett område utan några celler alls.
- Kontrollera med mCherry- och EGFP-våglängderna för att säkerställa att inga celler är i den valda bakgrunds-ROI.
OBS: Våglängderna justerades så att mCherry använde en excitationsvåglängd på 520 nm och en emissionsvåglängd på 610 nm och EGFP använde en excitationsvåglängd på 470 nm och en emissionsvåglängd på 520 nm.
- Kontrollera med mCherry- och EGFP-våglängderna för att säkerställa att inga celler är i den valda bakgrunds-ROI.
- Välj underfliken Våglängd (λ). Markera dess kryssruta och se till att GFP-våglängden finns och att kryssrutan är markerad. Om inte, lägg till och markera det.
- Välj underfliken Varaktighet . Definiera mätintervallet som var 5:e sekund och ändra antalet intervall så att det passar experimentets varaktighet.
- I avsnittet Fokus på mikroskoppanelen under okularet klickar du på På-knappen för att aktivera det perfekta fokussystemet (PFS).
- Justera fokus med hjälp av PFS-fokushjulet. I programvarugränssnittet, Under ND-förvärv, se till att PFS på är markerat.
- Klicka på Kör nu.
5. Experimentellt förfarande
- Börja med en baslinjeperiodmätning på 90 sekunder med Ringers lösningsperfusion.
- När baslinjeperioden är slut, stäng av Ringers lösningsperfusion och slå sedan på Ringers zinklösningsperfusion. Markera bytet av lösningen genom att klicka på den röda flaggan längst ned till höger på huvudgränssnittspanelen. En ökning av fluorescensen förväntas förekomma.
- När fluorescensökningen börjar mättas, byt tillbaka till perfusion med Ringers lösning. Stäng av Ringers zinklösningsperfusion och slå sedan på Ringers lösningsperfusion.
- Vänta tills experimenttiden går ut. En märkbar men stadig minskning av fluorescensen förväntas om ZnT1 fungerar som den ska.
6. Export av data
- För att exportera data med baslinjesubtraktion, tryck på knappen Subtrahera baslinje och view ändringarna i "ND-förvärvsfönster".
- Klicka på knappen Exportera i programvarugränssnittet i "ND-förvärvsfönstret". Ett Excel-datablad öppnas. Spara på önskad plats.
7. Analys av data
- För varje ROI skapar du en genomsnittlig baslinjefluorescens från de första 90-100 sekunderna.
- Uttryck fluorescensen som beräknas för varje ROI som en procentandel av bakgrunden för den ROI.
- Skapa ett radmedelvärde av alla ROI:er och rita resultatet som ett linjediagram. Detta skapar ett genomsnitt av alla ROI:er som en funktion av tiden.
- Använd den linjära passningsfunktionen och välj den initiala hastigheten för minskningen av fluorescensen efter tvätten med Ringers lösning. Lutningsvärdet för ekvationen korrelerar med transporthastigheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZnT1 är en zinktransportör hos däggdjur som är belägen på cellplasmamembranet13. Det är en medlem av proteinfamiljen katjondiffusionsfacilitator (CDF) som extruderar zink från cytosolen till det extracellulära millieu14. ZnT1 har en arkitektur med två domäner: den transmembrana domänen, som transporterar jonerna över membranet, och en C-terminal domän14. Till skillnad från andra kända CDF-proteiner har ZnT1 en utvidgad ostrukturerad C-terminal domän (USCTD). USCTD:s roll är för närvarande okänd. Vi använde protokollet ovan för att jämföra ZnT1 WT med ZnT1 utan USCTD för att bedöma dess inblandning i zinktransportaktivitet.
HEK 293T-celler transfekterades med pAAV2-plasmiden innehållande antingen ZnT1 WT eller ZnT1 utan den ostrukturerade C-terminalen (ΔUSCTD) och testade transportaktivitetshastigheten enligt beskrivningen ovan. Kompletterande figur 1 visar att båda versionerna av ZnT1 uttrycker och lokaliserar till plasmamembranet utan problem. Figur 1 visar de typiska resultaten för ett exempel på ett sådant experiment. En ökning av fluorescens är resultatet av en ökning av den intracellulära Zn 2+-koncentrationen, medan en minskning är ett resultat av aktiviteten hos ZnT1 som transporterar Zn2+ över cellmembranet (individuella grafer, inklusive standardfel, finns i kompletterande figur 2 och kompletterande figur 3). Det framgår av denna figur att ZnT1 WT har en jämnare fluorescenskurva än mutanten. Detta är dock inte en inneboende differentierande egenskap utan är relaterad till variabilitet i cellulära svar på zinkbelastning, vilket har observerats i tidigare experiment. Figur 2 visar ett lådagram som sammanfattar resultaten från 15-17 sådana experiment. Av figuren framgår det tydligt att ΔUSCTD uppvisar en större spridning av transporthastigheter jämfört med WT. Även om detta kan tillskrivas den cellulära svarsvariabiliteten som tidigare nämnts, kan det också indikera en funktionell skillnad. Det kan till exempel innebära att ZnT1 USCTD-segmentet är en modulator av transporthastigheten. Det är uppenbart att det inte finns någon synlig skillnad mellan Zn2+ extruderingsaktiviteterna för WT och ΔUSCTD. Baserat på den statistiska analysen var data inte normalfördelade (WT-dataset, Shapiro-Wilk test15, statistik = 0,72404, p-värde = 0,0004), så två icke-parametriska tester användes för jämförelser mellan datauppsättningarna. Resultaten visade att det inte fanns någon statistisk skillnad mellan transporthastigheterna (Mann-Whitney16 U test: U = 132, Z = 0,15105, Asymp. Förmodligen>|U| = 0,87994; Kolmogorov-Smirnov17 test: D = 0,27059, Z = 0,76384, Exakt sannolikhet>|D|= 0,5161).
På grund av den betydande energetiska kostnaden för att skapa den ostrukturerade förlängningen (~80 aminosyror) är det rimligt att anta att denna domän tjänar en cellulär funktion. En cellulär funktion kopplad till denna domän har dock ännu inte identifierats. Denna domän är unik för ZnT1 och finns inte i några andra medlemmar av ZnT-familjen. Som sådan kan det bero på att ZnT1, till skillnad från andra ZnT, är belägen vid plasmamembranet, medan alla andra medlemmar med undantag för ZnT10 uttrycks i interna organeller.
Rådata och efterföljande grafer som visas här är baserade på 5 s intervallmätningar av fluorescensen som orsakas av det zinkkänsliga färgämnet. Detta innebär att på relativt kort tid (minuter) kan en visualisering av tidsberoende zinktransport genereras med hög tidsupplösning. Analysen bör inkludera en normalisering av baslinjeperioden eftersom färgämnet laddas in i cellerna före zinkladdning och kan ha initial intracellulär fluorescens orsakad av en liten mängd fritt zink. Dessutom blir zinkfärgämnet fluorescerande aktivt först efter klyvning av det intracellulära esteraset. Det rekommenderas därför att avestringsprocessen ges en viss tid för större delen av färgämnet för att undvika oregelbundna fluorescensmönster orsakade av klyvning av färgämnesester under hela försöket.
Figur 1: Zn2+ extruderingsaktiviteter för WT och ΔUSCTD med användning av zinktransportanalysen. X-axeln är tiden i sekunder. Y-axeln är fluorescensförändringen uttryckt i procent av baslinjen. Linjediagrammen är fluorescensförändringen som en funktion av tiden. Uppgifterna beräknas i genomsnitt över >10 ROI:er. Enskilda grafer med standardfel visas i tilläggsfigur 2 och tilläggsfigur 3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Jämförelse av aktiviteterna hos ZnT1 WT och ΔUSCTD avbildad som ett lådagram. Varje datapunkt representerar ett enda experiment. Den svarta linjen anger medianpoängen. Den ihåliga fyrkantiga rutan anger medelpoängen. Y-axeln anger förändringen i baslinjeprocent per sekund. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfigur 1: HEK 293T-celler transfekterade med (A) ZnT1 WT eller (B) ZnT1 ΔUSCTD stimulerade i mCherry-excitationsvåglängderna (520 nm) och emission (610 nm). I båda fallen finns det uttryck och membranlokalisering av ZnT1-varianten. Mikroskopets förstoring är 20x. Exponeringstiden är 100 ms. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: ZnT1 WT Zn2+ transportaktivitet med standardfelet visualiserat. X-axeln är tiden i sekunder. Y-axeln är den procentuella fluorescensförändringen från baslinjefluorescensen. Den svarta linjen är den genomsnittliga fluorescensförändringen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: ZnT1 ΔUSCTD Zn2+ transportaktivitet med standardfelet visualiserat. X-axeln är tiden i sekunder. Y-axeln är den procentuella fluorescensförändringen från baslinjefluorescensen. Den röda linjen är den genomsnittliga fluorescensförändringen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 1: pAAV2 plasmidsekvens. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovan beskrivna metoden möjliggör direkt mätning av den intracellulära zinkkoncentrationen med hög tidsupplösning. Jämfört med andra metoder kan denna metod som involverar övervakning av förändringar i intracellulärt Zn2+ avsevärt minska bakgrundsbruset. Dessutom eliminerar färgämnets selektivitet för zink potentiella korsinteraktioner med andra metallkatjoner18,19. Slutligen möjliggör dess brist på omedelbar cytotoxicitet testning av levande cellulära processer19.
Denna metod har dock vissa begränsningar. För det första kan detektering av intracellulär dynamik vara relativt mer utmanande med detta protokoll, eftersom färgämnet som används i denna metod är utformat för att fångas i cellen men inte kan riktas till regioner eller specifika processer. Andra fluorescerande färgämnen kan riktas mot ett specifikt område i cellerna men har tyvärr ett mycket lägre dynamiskt omfång20. För det andra orsakar färgämnets exponering för ljus en minskning av fluorescensen på grund av blekning, vilket begränsar exponeringstiden för ljus och följaktligen det aktiva fönstret för att köra experimentet. För det tredje är färgladdningen i detta protokoll besvärlig och tidskrävande jämfört med att använda andra färgämnen, särskilt genetiskt kodade färgämnen21. Slutligen, även efter klyvning av estrarna, läcker färgämnet, vilket leder till en Zn 2+-oberoende minskning av fluorescens22.
Flera åtgärder bör vidtas för att säkerställa att försöket lyckas. För det första, eftersom transfektionen kan vara ojämnt fördelad, bör de utvalda cellerna innehålla proteinet av intresse. För att undvika färgblekning är det viktigt att hålla de laddade cellerna skyddade från ljus. När experimentet körs bör perfusionshastigheten vara tillräcklig för att slutföra experimentet utan att orsaka att cellerna lossnar från täckglaset. Vid flera körningar rekommenderas att man behåller samma reservoarer för Ringers lösning och Ringers zinklösning. Färgladdningstiden och tvätttiden kan justeras enligt de första experimenten. Zinkladdning i cellerna via perfusion med pyrition kan ta från 1 min till 5 min, vilket bedöms genom att övervaka Zn2+-inducerad fluorescens med tiden.
Trots dessa svårigheter tillåter denna metod oss för första gången att studera dynamiken i Zn2+ extruderingsprocessen. Det förenklar processen och skapar ett direkt sätt att bättre fastställa orsakssamband jämfört med de tidigare metoderna23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Raz Zarivach stöds av Israel Science Foundation (anslag nr 163/22). Tomer Eli Ben Yosef och Arie Moran stöds av Israel Science Foundation (anslag nr 2047/20). Vi vill tacka Daniel Gitler och hans grupp vid Ben-Gurion University för deras samarbete, stöd och expertis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Sigma Aldrich | 31665 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d, Findley, S. d Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M.
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
