Stabilisiertes Fenster für die intravitale Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll für die chirurgische Implantation eines stabilisierten optischen Bleibefensters für die subzellulär aufgelöste Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse, das serielle und longitudinale Studien der gesunden und erkrankten Bauchspeicheldrüse ermöglicht.

Abstract

Die Physiologie und Pathophysiologie der Bauchspeicheldrüse ist komplex. Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse, wie Pankreatitis und Pankreas-Adenokarzinom (PDAC), weisen eine hohe Morbidität und Mortalität auf. Die Intravital-Bildgebung (IVI) ist eine leistungsstarke Technik, die die hochauflösende Bildgebung von Geweben sowohl im gesunden als auch im erkrankten Zustand ermöglicht und eine Echtzeitbeobachtung der Zelldynamik ermöglicht. Die IVI der murinen Bauchspeicheldrüse stellt aufgrund der tiefen viszeralen und nachgiebigen Natur des Organs eine große Herausforderung dar, was es sehr anfällig für Schäden und Bewegungsartefakte macht.

Hier wird der Prozess der Implantation des Stabilisierten Window für die Intravitale Bildgebung des murinen P-Ankreas (SWIP) beschrieben. Das SWIP ermöglicht die IVI der murinen Bauchspeicheldrüse in normalen gesunden Zuständen, während der Transformation von der gesunden Bauchspeicheldrüse zu einer akuten Pankreatitis, die durch Cerulein induziert wird, und in malignen Zuständen wie Pankreastumoren. In Verbindung mit genetisch markierten Zellen oder der Verabreichung von Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht das SWIP die Messung der einzelligen und subzellulären Dynamik (einschließlich Einzelzell- und kollektiver Migration) sowie die serielle Bildgebung derselben interessierenden Region über mehrere Tage.

Die Fähigkeit, die Migration von Tumorzellen zu erfassen, ist von besonderer Bedeutung, da die Hauptursache für die krebsbedingte Mortalität bei PDAC die überwältigende Metastasierungslast ist. Das Verständnis der physiologischen Dynamik der Metastasierung bei PDAC ist ein kritischer ungedeckter Bedarf und entscheidend für die Verbesserung der Patientenprognose. Insgesamt bietet das SWIP eine verbesserte Bildgebungsstabilität und erweitert die Anwendung von IVI bei gesunden Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse und der bösartigen Bauchspeicheldrüse.

Introduction

Gutartige und bösartige Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse sind potenziell lebensbedrohlich und weisen erhebliche Lücken im Verständnis ihrer Pathophysiologie auf. Pankreatitis – eine Entzündung der Bauchspeicheldrüse – ist die dritthäufigste Ursache für Krankenhauseinweisungen und Wiedereinweisungen im Zusammenhang mit Magen-Darm-Erkrankungen in den USA und ist mit erheblicher Morbidität, Mortalität und sozioökonomischer Belastung verbunden¹. Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC), das als dritthäufigste krebsbedingte Todesursache eingestuft wird 2, ist für die meisten Pankreasmalignome^{verantwortlich} 3 und weist eine schlechte 5-Jahres-Überlebensrate von nur 11 %² auf2. Die Hauptursache für krebsbedingte Mortalität bei PDAC ist eine überwältigende metastasierende Belastung. Leider weisen die meisten Patienten eine metastasierende Erkrankung auf. Daher ist das Verständnis der Dynamik der Metastasierung bei PDAC ein kritischer ungedeckter Bedarf auf dem Gebiet der Krebsforschung.

Die Mechanismen, die der Entzündung und der Metastasierung der Bauchspeicheldrüse zugrunde liegen, sind nur unzureichend verstanden. Ein wesentlicher Faktor für diese Wissenslücke ist die Unfähigkeit, die zelluläre Dynamik der Bauchspeicheldrüse in vivo zu beobachten. Die direkte Beobachtung dieser zellulären Dynamik verspricht, wichtige Ziele zu enthüllen, um die Diagnose und Behandlung von Menschen mit Bauchspeicheldrüsenerkrankungen zu verbessern und zu verbessern.

Intravital Imaging (IVI) ist eine Mikroskopietechnik, die es Forschern ermöglicht, biologische Prozesse in lebenden Tieren in Echtzeit zu visualisieren und zu untersuchen. IVI ermöglicht eine hochauflösende, direkte Visualisierung der intrazellulären und mikroumgebungsbezogenen Dynamik in vivo und in der nativen Umgebung des jeweiligen biologischen Prozesses. Daher ermöglicht die IVI die In-vivo-Beobachtung gesunder und pathologischer Prozesse.

Moderne Ganzkörper-Bildgebungsverfahren wie MRT, PET und CT bieten hervorragende Ansichten ganzer Organe und können Pathologien aufdecken, noch bevor klinische Symptome auftreten⁴. Sie sind jedoch nicht in der Lage, eine Einzelzellauflösung zu erreichen oder die frühesten Stadien der Krankheit – Pankreatitis oder Malignität – aufzudecken.

Frühere Forschungen haben die IVI mit Einzelzellauflösung verwendet, um gutartige und bösartige Erkrankungen der Haut^5,6, der Brust⁷, der Lunge⁸, der Leber⁹, des Gehirns¹⁰ und der Bauchspeicheldrüsentumoren 11 zu beobachten^, was zu Einblicken in die Mechanismen des Krankheitsverlaufs führte¹². Die murine Bauchspeicheldrüse stellt jedoch erhebliche Hindernisse für das Erreichen einer Einzelzellauflösung mit IVI dar, vor allem aufgrund ihrer tiefen viszeralen Lage und ihrer hohen Compliance. Darüber hinaus ist es ein verzweigtes, diffus verteiltes Organ innerhalb des Mesenteriums, das mit der Milz, dem Dünndarm und dem Magen verbunden ist, was den Zugang erschwert. Das Gewebe reagiert auch sehr empfindlich auf Bewegungen, die durch angrenzende Peristaltik und Atmung verursacht werden. Die Minimierung der Bewegung der Bauchspeicheldrüse ist für die Einzelzellauflösung von entscheidender Bedeutung, da Bewegungsartefakte von nur wenigen Mikrometern die Bilder verwischen und verzerren können, was es unmöglich macht, die Dynamik einzelner Zellen zu verfolgen¹³.

Um eine IVI durchführen zu können, muss ein abdominelles Bildgebungsfenster (AIW) chirurgisch implantiert werden ^9,11. Um die AIW operativ zu implantieren, wird ein Fensterrahmen aus Metall in die Bauchdecke eingenäht. Anschließend wird das gewünschte Organ mit Cyanacrylat-Kleber am Rahmen befestigt. Während dies für einige starre innere Organe (z. B. Leber, Milz, starre Tumore) ausreichend ist, werden Versuche, die gesunde murine Bauchspeicheldrüse abzubilden, durch suboptimale laterale und axiale Stabilität aufgrund der nachgiebigen Textur des Gewebes und der komplexen Architektur beeinträchtigt¹⁴. Um dieser Einschränkung zu begegnen, entwickelten Park et ^al.14 ein Bildgebungsfenster, das speziell für die gesunde Bauchspeicheldrüse entwickelt wurde. Dieses Pankreas-Bildgebungsfenster (PIW) minimiert den Einfluss der Darmbewegung und der Atmung, indem es ein horizontales Metallregal in den Fensterrahmen, direkt unter dem Deckglas, integriert, das Gewebe stabilisiert und seinen Kontakt mit dem Deckglas aufrechterhält. Während das PIW eine erhöhte laterale Stabilität bietet, haben wir festgestellt, dass dieses Fenster immer noch eine axiale Drift aufweist und zusätzlich die Bildgebung großer solider Tumore aufgrund des schmalen Spalts zwischen dem Metallregal und dem Deckglas¹⁵ verhindert.

Um diesen Einschränkungen zu begegnen, haben wir das Stabilisierte Window für die intravitaleBildgebung des murinen P-Ankras (SWIP) entwickelt, ein implantierbares Bildgebungsfenster, das in der Lage ist, eine stabile Langzeitbildgebung sowohl der gesunden als auch der erkrankten Bauchspeicheldrüse zu erreichen (Abbildung 1)¹⁵. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll für den chirurgischen Eingriff zur Implantation des SWIP zur Verfügung. Obwohl das primäre Ziel darin bestand, die dynamischen Mechanismen der Metastasierung zu untersuchen, kann diese Methode auch verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Biologie und Pathologie der Bauchspeicheldrüse zu untersuchen.

Protocol

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften für die Verwendung von Wirbeltieren durchgeführt, einschließlich der vorherigen Genehmigung durch das Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Passivierung von Fenstern

HINWEIS: Die Passivierung von Edelstahl reinigt das Metall von Verunreinigungen und erzeugt eine dünne Oxidschicht, die die Biokompatibilität des Metalls mit Weichgeweben erheblich erhöht, sogar über die von Titan¹⁶ hinaus.

1. Beginnen Sie den Passivierungsprozess, indem Sie die optischen Fensterrahmen mit einer 1%igen (w/v) enzymatisch aktiven Reinigungsmittellösung waschen.
2. Tauchen Sie die Rahmen in eine 5%ige (w/v) Natronlauge bei 70 °C für 30 Minuten in ein Glasgefäß.
3. Nehmen Sie die Rahmen heraus und spülen Sie sie mit deionisiertem Wasser ab.
4. Tauchen Sie die Rahmen in eine 7%ige Zitronensäurelösung bei 55 °C für 10 Minuten in einem neuen Glasgefäß.
5. Entfernen Sie die Rahmen und spülen Sie sie erneut mit deionisiertem Wasser ab.
6. Wiederholen Sie Schritt 1.2 und spülen Sie zum Schluss die Fensterrahmen ein letztes Mal mit entionisiertem Wasser ab.

2. Vorbereitung auf die Tumorimplantation oder Fensterchirurgie

HINWEIS: Für Untersuchungen von Pankreastumoren müssen Tumorzellen implantiert werden und zu manifesten Tumoren heranwachsen können. Um die Tumorzellen in vivo sichtbar zu machen, empfiehlt es sich, Zellen zu verwenden, die genetisch verändert wurden, um fluoreszierende Proteine wie Dendra2 zu exprimieren. Die Verwendung von fluoreszierenden Proteinmarkierungen, die hell sind, mindert potenzielle Probleme mit der Autofluoreszenz des Gewebes. Andere potentielle fluoreszierende Proteine, Farbstoffe und genetisch kodierte fluoreszierende Mausmodelle, die verwendet werden könnten, wurden an anderer Stelle diskutiert^17,18. Um eine Kontamination des Operationsfeldes zu vermeiden, führen Sie den chirurgischen Eingriff in einer Haube oder einem Laminar-Flow-Schrank durch und stellen Sie sicher, dass unterschiedliche Bereiche für die Vorbereitung, Operation und Genesung verwendet werden.

1. Sterilisieren Sie vor der Operation alle chirurgischen Instrumente in einem Autoklaven und verwenden Sie bei Bedarf einen Heißperlensterilisator für nachfolgende Eingriffe. Stellen Sie sicher, dass die Operation nur mit Tipps durchgeführt wird.
2. Schalten Sie das beheizte OP-Pad und den Perlensterilisator ein und warten Sie, bis die entsprechende Betriebstemperatur erreicht ist. Die Temperatur des Heizkissens sollte mit einem Oberflächenthermometer überwacht werden, um mögliche Verbrennungen zu vermeiden. Legen Sie ein steriles Tuch über das Heizkissen, wenn die Temperatur nicht ausreichend kontrolliert werden kann.
   HINWEIS: Die Körpertemperatur bei kurzen Eingriffen (≤20 Minuten), wie z. B. Tumor- und Fensterimplantationen, wird bei Verwendung eines beheizten chirurgischen Pads minimal beeinflusst. Längere Anästhesiephasen, wie z. B. bei längeren Zeitrafferaufnahmen, erfordern jedoch, dass die Maus in eine beheizte Kammer gebracht wird, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
3. Betäuben Sie die Maus mit 5% Isofluran in einer Anästhesiekammer.
4. Kritischer Schritt: Senken Sie die Anästhesie auf 2%, sobald die Maus bewusstlos ist. Überwachen Sie sorgfältig den Anästhesiegrad und die Vitalwerte der Maus (z. B. mit einem Pulsoximeter)¹⁹.
5. Geben Sie einen kleinen Tropfen Augengleitmittel auf jedes Auge der Maus, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
6. Tragen Sie vor der Operation die Enthaarungscreme großzügig auf den linken Oberbauch auf, um die Haare zu entfernen. Nach 20 s mit angefeuchtetem Seidenpapier die Haare und die Enthaarungscreme fest abwischen. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, bis alle Haare aus dem Operationsbereich entfernt sind.
7. Injizieren Sie 10 μl Buprenorphin (0,1 mg/kg), verdünnt in 90 μl PBS, subkutan, um eine präoperative Analgesie zu gewährleisten.

3. Implantation von Bauchspeicheldrüsentumoren

1. Präparation von Aliquoten von Tumorzellen in der gewünschten Konzentration (basierend auf der Verdopplungszeit der Tumorzellen). Geben Sie die Zellsuspension in eine Insulinspritze und lassen Sie sie auf Eis liegen. Um dieses Protokoll zu befolgen, verwenden Sie 10⁶ syngene KPC-Tumorzellen 20, die in maximal 50 μl PBS suspendiert sind, gemäß dem orthotopen Injektionsprotokoll, das von Erstad et al. übernommen^wurde.21
   HINWEIS: Diese Zelllinie, die in dieser Konzentration injiziert wurde, produzierte routinemäßig nach 10-14 Tagen tastbare oder entsprechend große Tumore. Subklone dieser Zelllinie und anderer Pankreas-Zelllinien müssten auf geeignete Konzentrationen und Zeiträume untersucht werden, um Tumore in angemessener Größe zu erzeugen.
2. Waschen Sie sich die Hände mit antiseptischer Seife.
3. Ziehen Sie vor jeder neuen Operation neue sterile Handschuhe an.
4. Übertragen Sie die Maus auf die sterile OP-Haube und legen Sie sie in eine teilweise rechte laterale Dekubitusposition.
5. Befestigen Sie die Gliedmaßen mit Klebeband.
   HINWEIS: Die richtige Verwendung der Instrumente ist während des gesamten Verfahrens wichtig. Beispiele für das Halten einer Pinzette, einer Castroviejo-Schere und des Vakuum-Aufnahmewerkzeugs sind in Abbildung 2A-C dargestellt.
6. Sterilisieren Sie den Bauch mit einem Antiseptikum (Abbildung 2D).
7. Stellen Sie sicher, dass das Tier vollständig betäubt ist, indem Sie einen Zehenkneiftest durchführen.
8. Führen Sie mit einer Zange und einer Castroviejo-Schere einen 10-15 mm langen linken subkostalen Schnitt in die Haut ein (Abbildung 2E).
9. Kontrollieren Sie die Hämostase mit Wattestäbchen oder einem Kauterstift, wenn dies als notwendig erachtet wird.
10. Den darunter liegenden Muskel vorsichtig mit einer Pinzette und einer Castroviejo-Schere durchtrennen, um in das Bauchfell einzudringen (Abbildung 2F).
11. Verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um die Bauchspeicheldrüse und die Milz atraumatisch zu externalisieren.
12. Spreizen Sie die Bauchspeicheldrüse, so dass keine Falten entstehen (Abbildung 2G).
13. Identifizieren Sie die gewünschte Tumorinjektionsstelle im Körper oder am Schwanz der Bauchspeicheldrüse (weg von den Blutgefäßen).
14. Kritischer Schritt: Nach sorgfältiger Positionierung der Bauchspeicheldrüse das Gewebe mit einer Pinzette spannen und die Spitze der Insulinspritze mit der Fase nach oben bis zu einer Tiefe von 4-5 mm in die gewünschte Stelle der Bauchspeicheldrüse einführen (Abbildung 2H).
15. Injizieren Sie langsam die Tumorzelllösung. Suchen Sie nach einer kleinen Blase, die eine erfolgreiche Injektion bestätigt (Abbildung 2I).
16. Führen Sie die Bauchspeicheldrüse vorsichtig in den Bauchraum zurück, ohne die Injektionsblase der Tumorzellen zu stören (Abbildung 2J).
17. Bei resorbierbaren 5-0-Polydioxanon-Nähten wird zuerst die Muskelschicht und dann die Haut mit unterbrochenen Nähten verschlossen (Abbildung 2K-N).
18. Decken Sie den Einschnitt mit Cyanacrylatkleber ab (Abbildung 2O) und legen Sie die Maus dann zur Erholung in einen sauberen Käfig unter einer Heizlampe. Verabreichen Sie Antibiotika im Trinkwasser, um Infektionen zu verhindern. Überwachen Sie die Mäuse und lassen Sie sie sich vollständig von der Operation erholen.
    HINWEIS: Antibiotika werden gemäß den Anforderungen des IACUC-Protokolls verabreicht. Alle Tiere werden einzeln untergebracht.
19. Lassen Sie den Tumor 10-14 Tage lang wachsen, bis er durch die Bauchdecke tastbar ist.

4. Pankreasfenster-Chirurgie

1. Wenn die Tiere für die Bildgebung bereit sind, beginnen Sie mit der Fensterimplantation. Waschen Sie sich zunächst die Hände mit antiseptischer Seife.
2. Ziehen Sie vor jeder neuen Operation frische, sterile Handschuhe an.
3. Legen Sie die Maus auf dem beheizten chirurgischen Ständer in die rechte seitliche Dekubitusposition, um den linken Bauch freizulegen.
4. Verankern Sie die vorderen und hinteren Gliedmaßen der Maus mit Papierklebeband kranial und kaudal an der erhitzten Operationsstufe. Stellen Sie sicher, dass die Milz (unter der Haut) innerhalb des Operationsfeldes sichtbar ist (Abbildung 3A).
5. Um die Sterilität zu wahren, packen Sie alle chirurgischen Instrumente in der Haube aus.
6. Desinfizieren Sie die Operationsstelle, indem Sie die Haut der Maus mit einem großzügigen Antiseptikum abtupfen.
7. Stellen Sie sicher, dass das Tier vollständig betäubt ist, indem Sie einen Zehenkneiftest durchführen.
8. Kritischer Schritt: Heben Sie die Haut des linken oberen Quadranten des Bauches mit einer Zange an und machen Sie einen ~10 mm kreisförmigen Schnitt in Haut und Muskulatur mit einer Castroviejo-Schere (Abbildung 3B,C).
9. Kontrollieren Sie die Blutung und halten Sie die Hämostase bei Bedarf mit Wattestäbchen oder dem Kauterstift aufrecht.
10. Lokalisieren Sie die Bauchspeicheldrüse, die mit der Milz verbunden ist, und identifizieren Sie die Richtung, in der die Bauchspeicheldrüse innerhalb des Einschnitts liegt, um zu entscheiden, wo der unterstützende Kreuzstich platziert werden soll.
11. Platzieren Sie mit 5-0 Seidennaht den ersten Stich an der gewünschten Stelle in der Muskelschicht. Binde dieses Ende mit 3-5 Knoten zusammen. (Abbildung 3D,E)
12. Fahren Sie mit dem Nähen direkt über den Schnitt fort. Schneiden Sie ab und lassen Sie einen Schwanz von ~5 cm (Abbildung 3F).
13. Wiederholen Sie die Schritte 4.11 und 4.12 senkrecht zur ersten Masche (Bild 3G,H).
14. Kritischer Schritt: Heben Sie die Bauchspeicheldrüse vorsichtig an und positionieren Sie sie über dem Kreuzstich (Abbildung 3I,J). Achten Sie darauf, die Bauchspeicheldrüse während der Manipulation nicht zu beschädigen.
15. Kritischer Schritt: Führen Sie mit der 5-0-Seidennaht einen Handtaschenstich ~1 mm vom Loch entfernt in Umfangsrichtung durch, wobei die Haut- und Muskelschicht miteinander verflochten werden (Abbildung 3K).
16. Positionieren Sie den Fensterrahmen so, dass die Ränder des kreisförmigen Einschnitts in der Nut des Fensters sitzen (Abbildung 3L).
17. Befestigen Sie das implantierte Fenster, indem Sie die 5-0-Seide fest festbinden.
18. Geben Sie 100 μl flüssigen Cyanacrylat-Klebstoff in die 1-ml-Spritze.
19. Trocknen Sie das Gewebe, indem Sie ~10 s lang einen sanften Druckluftstrom anwenden.
20. Fassen Sie den Fensterrahmen mit einer Pinzette an der Außenkante fest und heben Sie ihn vorsichtig an, um die Trennung der Bauchspeicheldrüse von der Unterseite des Fensterrahmens zu gewährleisten.
21. Kritischer Schritt: Tragen Sie eine dünne Schicht flüssigen Cyanacrylat-Klebstoffs entlang der Aussparung des Fensters auf (Abbildung 3M). Achten Sie darauf, dass der Klebstoff nicht auf das Bauchspeicheldrüsengewebe gelangt.
22. Heben Sie das 5-mm-Deckglas mit Hilfe von Vakuum-Tonabnehmern an.
23. Legen Sie das Deckglas vorsichtig in die Aussparung in der Mitte des optischen Fensterrahmens. Mit leichtem Druck halten, damit der Cyanacrylat-Kleber aushärten kann (~25 s).
24. Trennen Sie das Deckglas mit einer Pinzette von den Vakuumaufnehmern.
25. Ziehen Sie die Kreuzstichnähte fest, um die Bauchspeicheldrüse fest am Deckglas zu befestigen (Abbildung 3N,O). Hinweis: Ziehen Sie den Kreuzstich nicht zu fest an, da dies zu Schäden und Ischämie an der Bauchspeicheldrüse führen kann.
26. Schneiden Sie die Enden der Naht ab.
27. Ziehe das Klebeband von der Maus ab.
28. Schalten Sie den Isofluran-Vaporizer aus.
29. Bringen Sie die Maus in einen sauberen Käfig oder direkt in das intravitale Mikroskop.
30. Halten Sie die Tiere nach der Fensteroperation einzeln und überwachen Sie sie bis zur vollständigen Genesung.
31. Die Bildgebung erfolgt dann auf einem Zwei-Laser-Multiphotonenmikroskop, wie wir es bereits beschrieben haben ^22,23,24 Für lange Bildgebungssitzungen wird die Maus in eine beheizte Kammer gelegt^, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, und mit unterstützenden Flüssigkeiten gemäß IACUC-Standards versorgt.

5. Cerulein-Behandlung zur Induktion einer Pankreatitis

1. Um den Beginn einer Pankreatitis zu untersuchen, behandeln Sie gesunde Mäuse nach der Implantation des SWIP mit Cerulein. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse 14-18 Stunden lang nüchtern sind und vor der Verabreichung von Cerulein ad libitum Wasser erhalten.
2. Injizieren Sie 50 μg/kg Cerulein in 100 μl steriles 1x DPBS intraperitoneal in Abständen von 1 h für bis zu acht Injektionen. Den Kontrollmäusen wurde ein äquivalentes Volumen von 1x DPBS allein, intraperitoneal injiziert, verabreicht.
3. Nach der Bildgebung werden die Mäuse 24 Stunden nach der ersten Injektion durch Zervixluxation gemäß IACUC-Standards getötet.
4. Führen Sie die Bildgebung mit einem Zwei-Laser-Multiphotonenmikroskop durch, wie zuvor beschrieben^22,23,24. Legen Sie die Maus bei langen Bildgebungssitzungen in eine beheizte Kammer, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, und versorgen Sie sie mit unterstützenden Flüssigkeiten gemäß den IACUC-Standards.

Representative Results

Abbildung 1, adaptiert von Du et ^al.15, zeigt Standbilder aus einem Zeitraffer-IVI-Film der murinen Bauchspeicheldrüse. Innerhalb der anfänglichen Eingewöhnungsphase (erste Stunde der Bildgebung, Abbildung 1A) kann eine gewisse Gewebebewegung beobachtet werden. Bei fortgesetzter Bildgebung nach dieser Eingewöhnungsphase (>75 min) beobachteten wir jedoch eine Zunahme der lateralen und axialen Stabilität (Abbildung 1B). Der Vergleich der Stabilität des SWIP mit den vorherigen AIW- und PIW-Imaging-Fenstern zeigt, dass alle Fenster eine anfängliche Eingewöhnungszeit benötigen. Das SWIP wies jedoch insgesamt die geringste Drift auf und eignet sich am besten für die Langzeitbildgebung (Abbildung 1C-K). Die Bilder wurden auf einem speziell angefertigten Multiphotonenmikroskop 24 mit einer Beleuchtung von 880 nm erzeugt und einen z-Stack-t-Lapsus (Sichtfeldgröße = 340 x 340 μm, Pixelgröße 0,67 μm) mit 1,7 Minuten zwischen den Bildern, 11 Schichten mit einer Schrittweite von 2 μm,²⁰ Abbildungstiefe und ~1 Schicht/s erfasst. Die Verstärkung der Laserleistung und der Photomultiplierröhre (PMT) wurde gewählt, um das Signal zu maximieren und gleichzeitig Photobleichen und Lichtschäden zu minimieren.

Die Schritte der chirurgischen Eingriffe, die die Implantation des Pankreastumors und das anschließende Einsetzen des Pankreasfensters beschreiben, sind in Abbildung 2 bzw. Abbildung 3 dargestellt. Wichtig ist, dass es sich bei beiden Operationen um Überlebensoperationen handelt. Nach der korrekten Implantation bleibt die Bauchspeicheldrüse am optischen Fenster anliegen, das nun in die Bauchdecke integriert ist. Dies ermöglicht ein komfortables Überleben der Maus und ermöglicht eine kontinuierliche Bildgebung für bis zu 12 Stunden, wie es das Protokoll erlaubt. Darüber hinaus kann die serielle Bildgebung an mehreren aufeinanderfolgenden Tagen (bis zu 2 Wochen) durchgeführt werden, um die interessierenden Regionen im Laufe der Zeit zu überwachen. Die intravitale Bildgebung (IVI) kann durch das Fenster in ähnlicher Weise durchgeführt werden wie andere zuvor beschriebene Fenster^22,25,26.

Das SWIP kann verwendet werden, um die Dynamik zu Beginn einer akuten Pankreatitis zu untersuchen, die mit Cerulein induziert wird. Cerulein ist ein Oligopeptid mit ähnlicher Struktur und Funktion wie Cholecystokinin (CKK) und wird häufig zur experimentellen Induktion einer akuten Pankreatitis bei Nagetieren eingesetzt²⁷. Die Behandlung mit Cerulein führt zu einer Kontraktion der glatten Muskulatur im Magen-Darm-Trakt und stimuliert die Magen- und Bauchspeicheldreaskretion²⁸. Darüber hinaus führt die intraperitoneale Verabreichung von Cerulein zu einer Schwellung und Vergrößerung der Bauchspeicheldrüse²⁹.

Abbildung 4 zeigt die serielle Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse nach einer Cerulein-Behandlung unter Verwendung des SWIP-Protokolls. Die murine Bauchspeicheldrüse wird mit Einzelzellauflösung visualisiert, indem genetische Fluoreszenzmarkierung (ECFP-markierte Epithelien-MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP-transgene Mäuse) und die Verabreichung von hochmolekularen Farbstoffen (155 kD Dextran-TMR) zur Definition des lokalen Gefäßsystems verwendet wird, das durch die durchgezogenen gelben Linien gekennzeichnet ist. Das Fensterdesign, das zuvor für die Bildgebung der murinen Lunge⁸ verwendet wurde, umfasst drei geätzte Linien auf dem Rahmen (Abbildung 4, Einschub), die als Referenzmarker fungieren, die die Verwendung der Mikrokartographie³⁰ ermöglichen. Die Mikrokartographie ermöglicht die serielle Bildgebung derselben interessierenden Region der murinen Bauchspeicheldrüse über mehrere Tage. Hier wird das gleiche Läppchen der Bauchspeicheldrüse (gelbe gestrichelte Linien) an Tag 1 visualisiert und an Tag 2 relokalisiert, was durch das Vorhandensein der gleichen lokalen Blutgefäße belegt wird (Abbildung 4). Die Bilder wurden jeden Tag als einzelner Z-Stapel mit 11 Schichten und 2 μm Schrittweite bei ~1 Schicht/s, aufgenommen bei 880 nm Beleuchtung und einer Auflösung von 0,67 μm/Pixel (FOV = 340 x 340 μm). Laserleistung und PMT-Verstärkungen wurden gewählt, um das Signal zu maximieren und gleichzeitig Photobleaching und Lichtschäden zu minimieren.

Neben der seriellen Bildgebung eignet sich das SWIP auch für die Langzeit-Längsschnittbildgebung und ermöglicht die genaue Verfolgung und Messung der Dynamik subzellulärer Strukturen (z. B. Vakuolen) unter Kontroll- und Behandlungsbedingungen. Hier sind Vakuolen Regionen, in denen zytoplasmatische fluoreszierende Proteine ausgeschlossen sind, was dazu führt, dass dunkle, unmarkierte Löcher entstehen (Abbildung 5A). Die Markierung von Vakuolen mit Software wie ROI Tracker²⁴ ermöglicht die Visualisierung der Vakuolenmotilität (Abbildung 5A,B) und die Quantifizierung zahlreicher Motilitätsparameter. Zum Beispiel erhöhte sich die durchschnittliche Geschwindigkeit der Vakuolen in der murinen Bauchspeicheldrüse nach der Behandlung mit Cerulein, um eine Pankreatitis zu induzieren, um etwa 10 % im Vergleich zur PBS-Behandlung (0,37 ± 0,07 μm/min vs. 0,41 ± 0,09 μm/min, p = 0,02) (Abbildung 5C). Die Behandlung mit Cerulein erhöhte auch die durchschnittliche Drehfrequenz der subzellulären Strukturen um 10 % im Vergleich zur PBS-Behandlung (2,3 ± 0,3 Grad/min vs. 2,6 ± 0,6 Grad/min, p = 0,04) (Abbildung 5F). Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied (p > 0,05) in der Nettogeschwindigkeit, der Richtungsabhängigkeit oder der kumulativen zurückgelegten Strecke zwischen der Cerulein-Behandlung und der PBS-Behandlung (Abbildung 5D, E und Abbildung 5G). Die Bilder wurden auf einem speziell angefertigten Multiphotonenmikroskop²⁴ erzeugt, das bei 880 nm leuchtete und einen z-Stack-t-Lapse (FOV-Größe = 340 x 340 μm, Pixelgröße 0,67 μm) mit 2,9 Minuten zwischen den Bildern, 11 Schichten mit einer Schrittweite von 2 μm und ~1 Schicht/s aufnahm.

Schließlich ermöglicht das SWIP die Visualisierung und Erfassung der Tumorzellmigration. Abbildung 6A zeigt ein Standbild aus einem Zeitrafferfilm (Supplemental Video S1 und Supplemental Video S2) der Migration von Dendra-2-markierten KPC-Tumorzellen innerhalb der Bauchspeicheldrüse, die orthotop injiziert wurden. Sowohl die kollektive Migration von Zellen in Clustern (Abbildung 6B und ergänzendes Video S1) als auch die Migration einzelner Zellen (Abbildung 6C und ergänzendes Video S2) können über kurze Zeiträume (<1 h) beobachtet werden. Die Bilder wurden auf einem speziell angefertigten Multiphotonenmikroskop 24 mit einer Beleuchtung von 880 nm und einer 4 x 4 Mosaik-z-Stapel-T-Lücke mit²⁰ % Überlappung zwischen den Kacheln (Kachelgröße = 340 x 340 μm), 3,4 Minuten zwischen den Bildern, 3 Schichten mit einer Schrittweite von 5 μm und ~1 Schicht/s erzeugt. Laserleistung und PMT-Verstärkungen wurden gewählt, um das Signal zu maximieren und gleichzeitig Photobleaching und Lichtschäden zu minimieren.

Abbildung 1: Verbesserte Stabilität der Bildgebung durch SWIP. (A) Standbilder aus den ersten 72 Minuten eines Zeitrafferfilms der Bauchspeicheldrüse, aufgenommen mit dem SWIP. Es kann eine gewisse axiale, aber sehr geringe laterale Drift beobachtet werden. Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Die fortgesetzte Zeitrafferaufnahme nach 72 min zeigt eine hohe axiale und laterale Stabilität. (A,B) Rot = 155 kDa Tetramethylrhodamin-Dextran-markiertes Blutserum, Cyan = CFP-markierte Pankreaszellen (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgene Mäuse) (C-E) Vergleich der lateralen Stabilität jedes der Pankreas-Bildgebungsfenster während der ersten Stunde der Bildgebung für (C) AIW, (D) PIW und (E) SWIP. (F-H) Vergleich der lateralen Stabilität der einzelnen Pankreas-Bildgebung während der folgenden 150 Minuten für die (F) AIW, (G) PIW und (H) SWIP. Einschübe sind vergrößerte Ansichten der entsprechenden Plots. (I-K) Vergleich der axialen Stabilität der einzelnen Pankreas-Bildgebungsfenster für die ersten 120 Minuten der Bildgebung für (I) AIW, (J) PIW und (K) SWIP. Diese Abbildung stammt aus Du et al. Open Biology 2022, DOI:10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273. ¹⁵. Abkürzungen: SWIP = stabilisiertes Fenster für die intravitale Bildgebung der Bauchspeicheldrüse; AIW = abdominales Bildgebungsfenster; PIW = Pankreas-Bildgebungsfenster; CFP = cyan fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Überblick über das Operationsprotokoll der orthotopen Injektion von duktalen Adenokarzinomzellen (KPC) der Bauchspeicheldrüse . (A) Illustration des Haltens einer chirurgischen Pinzette. (B) Illustration, wie man eine Castroviejo-Schere hält. (C) Illustration des Haltens des Vakuum-Aufnahmewerkzeugs. (D) Desinfektion der Haut. (E) Einschnitt in die Haut. (F) Inzision im Muskel. (G) Gespreizte Bauchspeicheldrüse. (H) Einführen der Nadel in die gewünschte Injektionsstelle. (I) Injektion einer Krebszellsuspension, wodurch eine Blase entsteht (blauer Pfeil). (J) Die Bauchspeicheldrüse kehrte in die Bauchhöhle zurück. (K,L) Verschluss der Muskelschicht mit einer unterbrochenen Seidennaht. (M,N) Verschluss der Haut mit einer unterbrochenen Seidennaht. (O) Cyanacrylat-Kleber, der auf die Inzision aufgetragen wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Überblick über das Operationsprotokoll des stabilisierten Fensters für die Bildgebung der Bauchspeicheldrüse. (A) Identifizierung der Milz und der angehängten Bauchspeicheldrüse. (B,C) Kreisförmiger Schnitt in Haut und Muskel. Rote gestrichelte Linien in A-C zeigen die Umrisse der Milz an, die durch die Bauchdecke und die Haut zu sehen sind. (D,E) Erster Stich des Kreuzstichkorbs in die Muskelschicht gelegt und gebunden (E, gelber Pfeil). (F) Die Naht wird auf der gegenüberliegenden Seite des Muskelschnitts fortgesetzt, wobei ein Schwanz (weißer Pfeil) übrig bleibt. (G,H) Der zweite Stich wird senkrecht zum ersten gesetzt, an einem Ende gebunden (gelbe Pfeile) und ein Schwanz (weiße Pfeile) gelassen. (I,J) Einsetzen der Bauchspeicheldrüse in den Kreuzstichkorb. (K) Umlaufende Naht durch Muskel und Haut. (L) Implantation des Fensterrahmens. (M) Auftragen von Klebstoff auf den Fensterrahmen. (N) Anbringen eines Deckglases aus Glas. (O) Die hinteren Enden des Kreuzstichs angezogen. (P) Vollständig implantiertes SWIP. Abkürzung: SWIP = stabilisiertes Fenster zur intravitalen Bildgebung der Bauchspeicheldrüse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Mikrokartografie, die für die serielle Bildgebung verwendet wird, um die gleichen interessierenden Bereiche innerhalb des optischen Fensters zu relokalisieren. Intravitale Bildgebung einer einzelnen Region der murinen Bauchspeicheldrüse, die zeigt, dass dasselbe Läppchen über 2 aufeinanderfolgende Tage (D1-D2) mittels Mikrokartographie verlagert wurde. Gelbe gestrichelte Linien umreißen die Grenzen desselben Läppchens. Die durchgezogenen Linien markieren die gleichen Blutgefäße (was durch das Vorhandensein von rot markiertem Blutserum im Lumen belegt wird), die an jedem aufeinanderfolgenden Tag identifiziert wurden. Rot = 155 kDa Tetramethylrhodamin-Dextran-markiertes Blutserum, Cyan = CFP-markierte Pankreaszellen (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgene Mäuse) (Einschub) Bild des SWIP mit Kratzern für die Mikrokartographie. Die Verwendung der Mikrokartographie zur Verlagerung von interessierenden Bereichen während der seriellen Bildgebung wird durch die drei geätzten Linien auf dem Fensterrahmen (Einschub) ermöglicht. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Subzelluläre Auflösung und die Messung der subzellulären Dynamik mittels SWIP. (A) Einzelne Zellen (gestrichelte gelbe Umrisse) und subzelluläre Strukturen wie Vakuolen können durch die SWIP über die Zeit in der murinen Bauchspeicheldrüse sichtbar gemacht werden. Beispiele für diese Vakuolen sind durch gelbe Pfeile gekennzeichnet. Das SWIP ermöglicht somit die Verfolgung subzellulärer Strukturen (farbige Umrisse und Spuren, die auf dem Fluoreszenzbild überlagert sind) über die Zeit. Der Einschub ist eine vergrößerte Ansicht eines gelben Kastenbereichs, in dem drei gespurte Vakuolen zu sehen sind. Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Trajektorien subzellulärer Strukturen, wie Kerne und Vakuolen (hervorgehoben in A), nach einer Verschiebung der Koordinaten zum Ursprungspunkt. Die rot gestrichelte Linie zeigt den durchschnittlichen Nettopfad in 1 h (3,46 μm). Quantifizierung der dynamischen Parameter (C) Durchschnittsgeschwindigkeit, (D) Nettoweg, (E) Richtungsabhängigkeit, (F) durchschnittliche Drehfrequenz und (G) kumulative Entfernung. Rot = 155 kDa Tetramethylrhodamin-Dextran-markiertes Blutserum, Cyan = CFP-markierte Pankreaszellen (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgene Mäuse). Abkürzungen: SWIP = stabilisiertes Fenster für die intravitale Bildgebung der Bauchspeicheldrüse; CFP = cyan fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Erfassung der Zellmigration mit SWIP . (A) Ein Standbild aus einem Zeitraffer-Intravital-Bildgebungsfilm der Bauchspeicheldrüse in einem orthotopisch injizierten Mausmodell der PDAC. (B) Standbilder aus dem ergänzenden Video S1 , die ein Beispiel für eine kollektive Migration von Tumorzellen zeigen (gelber Pfeil). (C) Standbilder aus dem ergänzenden Video S2 , die Beispiele für die Migration einer Tumorzelle (gelber Pfeil) und eines Makrophagen (roter Pfeil) durch Einzelzellen zeigen. Grün = Dendra2-markierte Tumorzellen, Blau = CFP-markierte Makrophagen, Rot = 155 kDa Tetramethylrhodamin-Dextran-markiertes Blutserum. Maßstabsbalken = 50 μm (A), 15 μm (B,C). Abkürzungen: SWIP = stabilisiertes Fenster für die intravitale Bildgebung der Bauchspeicheldrüse; CFP = cyan fluoreszierendes Protein; PDAC = Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzendes Video S1: Zeitraffer-Intravital-Bildgebungsfilm, der Tumorzellen zeigt, die eine kollektive Migration durchlaufen, entsprechend Abbildung 6B. Grün = Dendra2-markierte Tumorzellen, Blau = CFP-markierte Makrophagen, Rot = 155 kDa Tetramethylrhodamin-Dextran-markiertes Blutserum. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video S2: Zeitraffer-Intravital-Bildgebungsfilm, der Tumorzellen bei der Migration einzelner Zellen entsprechend Abbildung 6C zeigt. Grün = Dendra2-markierte Tumorzellen, Blau = CFP-markierte Makrophagen, Rot = 155 kDa Tetramethylrhodamin-Dextran-markiertes Blutserum. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Das hier beschriebene SWIP-Protokoll bietet eine verbesserte Methode zur Stabilisierung des Bauchspeicheldrüsengewebes unter Verwendung einer Kreuzstichkorbtechnik. Frühe abdominale Bildgebungsfenster (AIWs) ermöglichten die intravitale Bildgebung (IVI) der inneren Organe des Abdomens, schränkten aber die Bewegung von Weichteilen wie der Bauchspeicheldrüse nicht ausreichend ein. Als Reaktion darauf entwickelten Park et al. ein Pankreas-Bildgebungsfenster (PIW), das eine horizontale Metallablage enthält und eine verbesserte Stabilisierung des Pankreasgewebes ermöglicht, während der Kontakt mit dem Glasdeckglas erhalten bleibt. Dieser Ansatz verbessert zwar die laterale Stabilität, schränkt aber die Bildgebung von soliden Pankreastumoren ein, da ihre Größe den engen Raum zwischen Regal und Deckglas überschreitet. Das SWIP löst dieses Problem, indem es die Bauchspeicheldrüse mit einem Kreuzstichkorb stabilisiert, der sowohl die axiale als auch die laterale Bewegung einschränkt und gleichzeitig große (≤10 mm) solide Tumore aufnehmen kann.

Direkte Vergleiche des SWIP mit früheren Bildgebungsfenstern wie AIW und PIW wurden zuvor durchgeführt¹⁵. Dies ist in Abbildung 1 dargestellt, die von Du et al.15 übernommen wurde, in der laterale und axiale Verschiebungen durch die Verfolgung zellulärer anatomischer Merkmale wie Zellkerne oder Blutgefäße quantifiziert wurden. Alle Bildgebungsfenster zeigten einen Bedarf an einer Periode der Beruhigung während der ersten Stunde der Bildgebung. Während dieser Zeit wurde bei der AIW und PIW ein höherer Grad an Seitwärtsbewegung beobachtet als bei der SWIP. Eine größere axiale Verschiebung wurde auch bei der AIW und PIW im Vergleich zur SWIP über einen Zeitraum von 2 h beobachtet. Insgesamt wies das SWIP die geringste Drift auf und eignet sich für die Langzeitbildgebung (≤12 h).

Leider ist die Bauchspeicheldrüse ein stark streuendes Gewebe, und als solches wird die Punktspreizfunktion für das Multiphotonenmikroskop, das bei der IVI verwendet wird, mit dem Eindringen in das Gewebe schnell abgebaut. Somit ist die Abbildungstiefe mit einem der optischen Fenster auf nur ~30-60 μm begrenzt. IVI birgt auch das Risiko einer lichtinduzierten Schädigung der Probe. Dies kann zu Beginn von Bildgebungssitzungen getestet werden, indem eine Zeitreihe von 100 Bildern aufgenommen und nach Anzeichen von Photobleaching oder Lichtschäden gesucht wird. Auf unserem Mikroskopsystem haben wir festgestellt, dass eine maximale Leistung von ~15 mW an der Probe verwendet werden kann, ohne das Gewebe zu beeinträchtigen.

Das SWIP-Protokoll ermöglicht eine stabile, hochauflösende, einzelzellige optische IVI der murinen Bauchspeicheldrüse sowohl unter normalen gesunden Bedingungen als auch in kranken Zuständen wie Pankreatitis und PDAC. Dies macht das SWIP besonders nützlich für die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung sowie für die Durchführung von 3D- und 4D-Bildgebung (3D + Zeit) durch die Aufnahme mehrerer z-Schichten (unter Nutzung der inhärenten optischen Schnittfunktionen der Multiphotonen- und konfokalen Mikroskopie). Durch die In-vivo-Visualisierung einzelner Zellen und ihrer Interaktionen mit den zellulären Bestandteilen der Bauchspeicheldrüse wird sich die hochauflösende IVI als unschätzbar wertvoll erweisen, um die Mechanismen zu verstehen, die Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse zugrunde liegen.

Für die Durchführung des SWIP-Protokolls ist ein gewisses Maß an technischem Know-how erforderlich. Mit der richtigen Übung und der Beachtung der wichtigsten Schritte kann das Verfahren jedoch mit einer hohen Erfolgsquote ausgeführt werden. Für die Darstellung der bösartigen Bauchspeicheldrüse ist es entscheidend, zunächst einen erfolgreich implantierten Tumor zu haben. Dies wird durch orthotope Injektion einer Suspension von murinen Pankreaskrebszellen in die Bauchspeicheldrüse der Maus erreicht. Eine erfolgreiche Injektion wird beobachtet, wenn sich das Parenchym der Bauchspeicheldrüse zu einer flüssigkeitsgefüllten Blase aufbläst und wurde bereits ausführlich beschrieben²¹. Um maximalen Erfolg und Überleben zu gewährleisten, ist es wichtig, dass die Zellsuspension nur minimal bis gar nicht ausläuft, da eine Leckage die potenzielle Tumorgröße drastisch reduziert und zu einer Karzinose führt. Darüber hinaus ist die Bauchspeicheldrüse ein stark vaskularisiertes Organ mit vielen verzweigten Blutgefäßen. Es ist wichtig, Gefäßrisse zu vermeiden, da dies zu Blutungen und anschließenden Hämatomen in der Bauchspeicheldrüse führt und das Tumorwachstum hemmt. In diesem Modell haben wir eine syngene PDAC-Zelllinie verwendet, die von KPC-Mäusen^{abgeleitet wurde 20}. Dies ermöglicht die Tumortransplantation in immunkompetenten Mäusen. Andere syngene PDAC-Zelllinien können je nach verwendetem Mausstamm verwendet werden. Es können auch humane PDAC-Zelllinien verwendet werden; Der Mausstamm muss jedoch immungeschwächt sein, um eine Abstoßung der Tumorimplantation zu vermeiden.

Die Größe der Tumoren, die in diesem Protokoll einer Bildgebung unterzogen werden, kann nach Bedarf geändert werden. Dies kann erreicht werden, indem eine höhere Konzentration von Krebszellen verwendet wird, die in die murine Bauchspeicheldrüse implantiert werden, um einen größeren Tumor zu erhalten, oder indem die Wachstumszeit des Tumors vor der Fensterimplantation verlängert wird. In dieser Studie injizierten wir 10⁶ KPC-PDAC-Zellen und implantierten das SWIP 10-14 Tage danach, wenn die Tumore tastbar waren. Auch kleinere und größere Tumore können durch dieses SWIP-Protokoll durch die entsprechende Platzierung des Gewebes in den Kreuzstichkorb aufgenommen werden.

Die sichere Platzierung des Bildgebungsfensters und der Bauchspeicheldrüse ist ebenfalls entscheidend, um eine qualitativ hochwertige Bildgebung zu erhalten und Bewegungsartefakte zu begrenzen. Die normale Bauchspeicheldrüse der Maus ist sehr nachgiebig und anfällig für Bewegungen durch Atmung und nahe gelegene Peristaltik. Um dies zu beheben und die Stabilität der Bauchspeicheldrüse während der Bildgebung zu erhöhen, wird eine zuvor beschriebene Kreuzstichkorbtechnik verwendet³¹. Der Kreuzstichkorb ist so konzipiert, dass er den Einsatz von Bändern durch den Körper nachahmt. Durch das Anlegen des Gewebes an das Deckglas und das Ausüben eines konstanten axialen Drucks wird sowohl eine laterale als auch eine axiale Bewegung verhindert. Bei größeren soliden Tumoren können der Stützpunkt und die Richtung des Kreuzstichs so modifiziert werden, dass sie der Größe und Position des Tumors für eine optimale Unterstützung am besten entsprechen.

Eine suboptimale Bildgebung kann auch auftreten, wenn der Fensterrahmen unzureichend in den Bauch der Maus implantiert wird. Ein locker sitzender Fensterrahmen kann zu Abbildungsschwierigkeiten und Bewegungsartefakten führen. Eine geeignete Handtaschennaht kann dieses Problem lösen, indem der Fensterrahmen durch die Haut und die Bauchdecke am Bauch befestigt wird. Um eine übermäßige Hautfaltung beim Anziehen der Geldbörsenschnur zu vermeiden, sollten die Stichschritte nicht größer als 5 mm zwischen den Stufen sein, die nicht mehr als 1 mm von der Gewebekante entfernt sind, um einen festen Sitz um den Fensterrahmen zu gewährleisten. Nach der Naht der Handtasche, der Platzierung der Bauchspeicheldrüse im Kreuzstichkorb und der Implantation des Fensterrahmens ist ein letzter kritischer Schritt das Einbringen des Klebstoffs in die Aussparung des Fensterrahmens. Es ist wichtig, dass während dieses Schritts kein Klebstoff mit dem Bauchspeicheldrüsengewebe in Kontakt kommt, da dies das Gewebe schädigt und die Bildgebung verfälscht. Eine mögliche Modifikation, die auch verhindern kann, dass der Kleber mit dem Bauchspeicheldrüsengewebe in Kontakt kommt, besteht darin, das Deckglas aus Glas auf den Fensterrahmen zu kleben und beides trocknen zu lassen, bevor es chirurgisch in den Bauchraum implantiert wird.

Das SWIP hat, wie alle intravitalen bildgebenden Verfahren, Einschränkungen in seiner Fähigkeit, Informationen über andere Zellen und Strukturen im Gewebe zu enthüllen, die nicht explizit markiert sind. Die Kombination des SWIP-Fensters mit fluoreszierenden Reportern (wie ECFP-exprimierenden Epithelien und Dendra2-markierten KPC-Zellen wie in dieser Studie) und die Kontrolle von Protein- oder Zellzuständen mit pharmakologischen und/oder optogenetischen Werkzeugen kann diese Einschränkungen jedoch beseitigen.

Darüber hinaus umfasst das SWIP-Fensterdesign drei geätzte Linien auf dem Fensterrahmen, die als Passermarken für die Mikrokartographie dienen, um Bereiche von Interesse während der seriellen Bildgebung³⁰ zu relokalisieren. Dies ermöglicht es, dasselbe Sichtfeld mehrfach zu lokalisieren, auch in unmarkiertem Gewebe.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der SWIP sowohl bei normalem gesundem Bauchspeicheldrüsengewebe als auch bei gutartigen und bösartigen Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse wie Pankreatitis und PDAC eingesetzt werden kann. Einzelzell- und subzelluläre Dynamiken können in diesen Zuständen mit dem SWIP erfasst werden und können Forschern helfen, wichtige physiologische Ereignisse wie die Metastasierung bei PDAC zu verstehen. Die verbesserte Qualität und Stabilität der IVI haben das Potenzial, wertvolle Einblicke in die Pathophysiologie und Zellbiologie der Bauchspeicheldrüse zu liefern, was sie zu einem vielversprechenden und nützlichen Werkzeug macht.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].