Fenêtre stabilisée pour l’imagerie intravitale du pancréas murin

Summary

Nous présentons un protocole pour l’implantation chirurgicale d’une fenêtre optique stabilisée à demeure pour l’imagerie à résolution subcellulaire du pancréas murin, permettant des études en série et longitudinales du pancréas sain et malade.

Abstract

La physiologie et la physiopathologie du pancréas sont complexes. Les maladies du pancréas, telles que la pancréatite et l’adénocarcinome pancréatique (PDAC), ont une morbidité et une mortalité élevées. L’imagerie intravitale (IVI) est une technique puissante permettant l’imagerie à haute résolution des tissus à l’état sain et malade, permettant l’observation en temps réel de la dynamique cellulaire. L’IVI du pancréas murin présente des défis importants en raison de la nature viscérale et souple profonde de l’organe, ce qui le rend très sujet aux dommages et aux artefacts de mouvement.

Le processus d’implantation de l’Indowtabilisé S pourl’imagerie intravitale du Pancréas murin (SWIP) est décrit ici. Le SWIP permet l’IVI du pancréas murin dans des états sains normaux, lors de la transformation du pancréas sain en pancréatite aiguë induite par la céruléine, et dans des états malins tels que les tumeurs pancréatiques. En conjonction avec des cellules génétiquement marquées ou l’administration de colorants fluorescents, le SWIP permet de mesurer la dynamique unicellulaire et subcellulaire (y compris la migration unicellulaire et collective) ainsi que l’imagerie en série d’une même région d’intérêt sur plusieurs jours.

La capacité de capturer la migration des cellules tumorales est particulièrement importante car la principale cause de mortalité liée au cancer dans la PDAC est la charge métastatique écrasante. Comprendre la dynamique physiologique des métastases dans la PDAC est un besoin critique non satisfait et crucial pour améliorer le pronostic des patients. Dans l’ensemble, le SWIP améliore la stabilité de l’imagerie et élargit l’application de l’IVI dans le pancréas sain et les maladies malignes du pancréas.

Introduction

Les maladies bénignes et malignes du pancréas peuvent mettre la vie en danger, avec des lacunes considérables dans la compréhension de leur physiopathologie. La pancréatite, c’est-à-dire l’inflammation du pancréas, est la troisième cause majeure d’hospitalisations et de réadmissions liées aux maladies gastro-intestinales aux États-Unis et est associée à une morbidité, une mortalité et^{un fardeau} socio-économique importants. Classé au troisième rang des causes^{de décès par} cancer2, l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) représente la plupart des tumeurs malignes du pancréas3 et laisse présager un faible taux de survie à 5 ans de seulement 11 %². La principale cause de mortalité liée au cancer chez les ACPE est le fardeau métastatique écrasant. Malheureusement, la plupart des patients présentent une maladie métastatique. Par conséquent, la compréhension de la dynamique des métastases dans l’ACPE est un besoin essentiel non satisfait dans le domaine de la recherche sur le cancer.

Les mécanismes sous-jacents à l’inflammation et à la cascade métastatique du pancréas sont mal compris. L’un des principaux facteurs contribuant à cette lacune dans les connaissances est l’incapacité d’observer la dynamique cellulaire pancréatique in vivo. L’observation directe de ces dynamiques cellulaires promet de révéler des cibles critiques pour tirer parti et améliorer le diagnostic et le traitement des personnes atteintes d’une maladie pancréatique.

L’imagerie intravitale (IVI) est une technique de microscopie qui permet aux chercheurs de visualiser et d’étudier en temps réel les processus biologiques chez les animaux vivants. L’IVI permet une visualisation directe et à haute résolution de la dynamique intracellulaire et microenvironnementale in vivo et dans l’environnement natif du processus biologique en question. Par conséquent, l’IVI permet d’observer in vivo les processus sains et pathologiques.

Les modalités contemporaines d’imagerie du corps entier telles que l’IRM, la TEP et la TDM offrent d’excellentes vues d’organes entiers et peuvent révéler des pathologies, avant même l’apparition des symptômes cliniques⁴. Ils sont cependant incapables d’atteindre une résolution unicellulaire ou de révéler les premiers stades de la maladie, la pancréatite ou la malignité.

Des recherches antérieures ont utilisé l’IVI à résolution unicellulaire pour observer les maladies bénignes et malignes de la peau^5,6, du sein⁷, du poumon⁸, du foie⁹, du cerveau 10 et des tumeurs pancréatiques 11^, ce qui a permis de mieux comprendre les mécanismes de progression de la maladie ¹². Cependant, le pancréas murin pose des obstacles importants à l’obtention d’une résolution unicellulaire à l’aide de l’IVI, principalement en raison de sa localisation viscérale profonde et de sa grande observance. De plus, il s’agit d’un organe ramifié et distribué de manière diffuse dans le mésentère qui se connecte à la rate, à l’intestin grêle et à l’estomac, ce qui le rend difficile d’accès. Le tissu est également très sensible aux mouvements causés par le péristaltisme et la respiration adjacents. La minimisation des mouvements du pancréas est essentielle pour la microscopie à résolution de cellule unique, car les artefacts de mouvement, même de quelques microns, peuvent brouiller et déformer les images, ce qui rend impossible le suivi de la dynamique des cellules individuelles¹³.

Pour réaliser une IVI, une fenêtre d’imagerie abdominale (AIW) doit être implantée chirurgicalement ^9,11. Pour implanter l’AIW chirurgicalement, un cadre de fenêtre métallique est suturé dans la paroi abdominale. Ensuite, l’organe d’intérêt est fixé au cadre à l’aide d’un adhésif cyanoacrylate. Bien que cela soit suffisant pour certains organes internes rigides (par exemple, le foie, la rate, les tumeurs rigides), les tentatives d’imagerie du pancréas murin sain sont compromises par une stabilité latérale et axiale sous-optimale en raison de la texture souple et de l’architecture complexe du tissu¹⁴. Pour remédier à cette limitation, Park et ^al.14 ont mis au point une fenêtre d’imagerie spécialement conçue pour le pancréas sain. Cette fenêtre d’imagerie du pancréas (PIW) minimise l’influence des mouvements intestinaux et de la respiration en incorporant une étagère métallique horizontale dans le cadre de la fenêtre, juste en dessous de la lamelle, stabilisant le tissu et maintenant son contact avec la vitre de protection. Bien que le PIW offre une stabilité latérale accrue, nous avons constaté que cette fenêtre présente toujours une dérive axiale et empêche en outre l’imagerie de grosses tumeurs solides en raison de l’espace étroit entre l’étagère métallique et la lamelle¹⁵.

Pour remédier à ces limitations, nous avons mis au point le Window tabilisé Spour l’imagerie intravitale du pancréasmurin (SWIP), une fenêtre d’imagerie implantable capable d’obtenir une imagerie stable à long terme du pancréas sain et malade (Figure 1)¹⁵. Ici, nous fournissons un protocole complet pour l’intervention chirurgicale utilisée pour implanter le SWIP. Bien que l’objectif principal ait été d’étudier les mécanismes dynamiques impliqués dans les métastases, cette méthode peut également être utilisée pour explorer divers aspects de la biologie et de la pathologie du pancréas.

Protocol

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été effectuées conformément aux directives et aux règlements pour l’utilisation d’animaux vertébrés, y compris l’approbation préalable du comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Albert Einstein College of Medicine.

1. Passivation des fenêtres

REMARQUE : La passivation de l’acier inoxydable nettoie le métal des contaminants et crée une fine couche d’oxyde qui augmente considérablement la biocompatibilité du métal avec les tissus mous, même au-delà de celle du titane¹⁶.

1. Commencez le processus de passivation en lavant les cadres optiques des fenêtres avec une solution détergente enzymatiquement active à 1 % (p/v).
2. Plongez les cadres dans une solution d’hydroxyde de sodium à 5 % (p/v) à 70 °C pendant 30 min à l’intérieur d’un bocal en verre.
3. Sortez les cadres et rincez-les à l’eau déminéralisée.
4. Plongez les cadres dans une solution d’acide citrique à 7 % (p/v) à 55 °C pendant 10 min à l’intérieur d’un nouveau bocal en verre.
5. Retirez les cadres et rincez-les à nouveau à l’eau déminéralisée.
6. Répétez l’étape 1.2 et, enfin, rincez une dernière fois les cadres de fenêtre à l’eau déminéralisée.

2. Préparation à l’implantation de la tumeur ou à la chirurgie de la fenêtre

REMARQUE : Pour les études sur les tumeurs pancréatiques, les cellules tumorales doivent être implantées et autorisées à se développer en tumeurs manifestes. Pour visualiser les cellules tumorales in vivo, il est recommandé d’utiliser des cellules génétiquement modifiées pour exprimer des protéines fluorescentes telles que Dendra2. L’utilisation d’étiquettes de protéines fluorescentes et lumineuses atténuera les problèmes potentiels d’autofluorescence des tissus. D’autres protéines fluorescentes potentielles, des colorants et des modèles murins fluorescents génétiquement codés qui pourraient être utilisés ont été discutés ailleurs^17,18. Pour éviter la contamination du champ opératoire, effectuez l’intervention chirurgicale dans une hotte ou une armoire à flux laminaire et assurez-vous que des zones distinctes sont utilisées pour la préparation, la chirurgie et la récupération.

1. Avant la chirurgie, stérilisez tous les instruments chirurgicaux dans un autoclave et, si nécessaire, utilisez un stérilisateur à billes chaudes pour les procédures ultérieures. Assurez-vous que la chirurgie utilise une technique de conseils uniquement.
2. Allumez le coussin chirurgical chauffant et le stérilisateur de billes et attendez qu’il atteigne la température de fonctionnement appropriée. La température du coussin chauffant doit être surveillée à l’aide d’un thermomètre de surface pour éviter les brûlures potentielles. Placez un chiffon stérile sur le coussin chauffant si la température ne peut pas être contrôlée de manière adéquate.
   REMARQUE : La température corporelle pendant les procédures courtes (≤20 min), telles que la tumeur et l’implantation de fenêtre, est peu affectée lors de l’utilisation d’un coussin chirurgical chauffant. Cependant, des périodes d’anesthésie plus longues, comme lors d’une imagerie en accéléré prolongée, nécessitent que la souris soit placée dans une chambre chauffée pour maintenir la température corporelle.
3. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane à 5 % dans une chambre d’anesthésie.
4. Étape critique : Abaissez l’anesthésie à 2 % une fois que la souris est inconsciente. Surveillez attentivement le niveau d’anesthésie et les signes vitaux de la souris (par exemple, à l’aide d’un oxymètre de pouls)¹⁹.
5. Placez une petite goutte de lubrifiant oculaire sur chaque œil de la souris pour éviter le dessèchement de la cornée.
6. Avant la chirurgie, appliquez généreusement la crème dépilatoire sur la partie supérieure gauche de l’abdomen pour éliminer les poils. Après 20 s, utilisez du papier de soie humidifié pour essuyer fermement les poils et la crème dépilatoire. Répétez le processus au besoin jusqu’à ce que tous les poils soient retirés de la zone chirurgicale.
7. Injecter 10 μL de buprénorphine (0,1 mg/kg) diluée dans 90 μL de PBS par voie sous-cutanée pour assurer l’analgésie préopératoire.

3. Implantation d’une tumeur du pancréas

1. Préparer des aliquotes de cellules tumorales à la concentration souhaitée (en fonction du temps de doublement des cellules tumorales). Placez la suspension cellulaire dans une seringue à insuline et conservez-la sur de la glace. Pour suivre ce protocole, utiliser 10⁶ cellules tumorales KPC syngéniques 20 en suspension dans un maximum de 50 μL de PBS, en suivant le protocole d’injection orthotopique adapté d’Erstad et^al.21
   REMARQUE : Cette lignée cellulaire injectée à cette concentration produisait régulièrement des tumeurs palpables ou de taille appropriée en 10 à 14 jours. Les sous-clones de cette lignée cellulaire et d’autres lignées cellulaires pancréatiques devraient être évalués pour les concentrations et les délais appropriés pour produire des tumeurs de taille appropriée).
2. Lavez-vous les mains avec un savon antiseptique.
3. Avant chaque nouvelle chirurgie, mettez de nouveaux gants stériles.
4. Transférez la souris dans le capot chirurgical stérile et placez-la dans une position de décubitus latéral droit partiel.
5. Fixez les membres avec du ruban adhésif en papier.
   REMARQUE : L’utilisation correcte des instruments est importante tout au long de la procédure. Des exemples de la façon de tenir les pinces, les ciseaux Castroviejo et l’outil de ramassage par le vide sont présentés à la figure 2A-C.
6. Stériliser l’abdomen avec un antiseptique (Figure 2D).
7. Assurez-vous que l’animal est complètement anesthésié en effectuant un test de pincement des orteils.
8. Faites une incision sous-costale gauche de 10 à 15 mm dans la peau à l’aide d’une pince et de ciseaux Castroviejo (Figure 2E).
9. Contrôlez l’hémostase à l’aide de cotons-tiges ou d’un stylo cautériste lorsque cela est jugé nécessaire.
10. Divisez soigneusement le muscle sous-jacent avec des pinces et des ciseaux Castroviejo pour entrer dans le péritoine (Figure 2F).
11. À l’aide de cotons-tiges stériles, extérioriser de manière atraumatique le pancréas et la rate.
12. Écartez le pancréas vers l’extérieur pour qu’il n’y ait pas de plis (Figure 2G).
13. Identifiez le site d’injection de tumeur souhaité dans le corps ou la queue du pancréas (loin des vaisseaux sanguins).
14. Étape critique : Après avoir soigneusement positionné le pancréas, utilisez une pince pour tendre le tissu et insérez l’embout de la seringue à insuline, le biseau vers le haut, dans le site souhaité du pancréas à une profondeur de 4 à 5 mm (Figure 2H).
15. Injectez lentement la solution de cellules tumorales. Recherchez une petite bulle qui confirme une injection réussie (Figure 2I).
16. Remettez délicatement le pancréas dans l’abdomen sans perturber la bulle d’injection de cellules tumorales (Figure 2J).
17. À l’aide de sutures résorbables en polydioxanone 5-0, fermez d’abord la couche musculaire, puis la peau avec des sutures interrompues (Figure 2K-N).
18. Couvrez l’incision avec de la colle cyanoacrylate (Figure 2O), puis remettez la souris dans une cage propre sous une lampe chauffante pour la récupérer. Administrer des antibiotiques dans l’eau potable pour prévenir l’infection. Surveillez les souris et laissez-les se remettre complètement de la chirurgie.
    REMARQUE : Les antibiotiques sont administrés conformément au protocole de l’IACUC. Tous les animaux sont logés individuellement.
19. Laissez la tumeur se développer pendant 10 à 14 jours jusqu’à ce qu’elle soit palpable à travers la paroi abdominale.

4. Chirurgie de la fenêtre du pancréas

1. Lorsque les animaux sont prêts pour l’imagerie, commencez la chirurgie d’implantation de la fenêtre. Pour commencer, lavez-vous les mains avec du savon antiseptique.
2. Avant chaque nouvelle intervention chirurgicale, enfilez des gants stériles neufs.
3. Sur le support chirurgical chauffé, placez la souris en position de décubitus latéral droit pour exposer l’abdomen gauche.
4. Ancrez les membres avant et arrière de la souris à la scène chirurgicale chauffée crânienne et caudale à l’aide de ruban adhésif en papier. Assurez-vous que la rate (sous la peau) est visible dans le champ chirurgical (Figure 3A).
5. Pour maintenir la stérilité, déballez tous les instruments chirurgicaux dans la capuche.
6. Désinfectez le site chirurgical en écouvillonnant la peau de la souris avec une application généreuse d’antiseptique.
7. Assurez-vous que l’animal est complètement anesthésié en effectuant un test de pincement des orteils.
8. Étape critique : Soulevez la peau du quadrant supérieur gauche de l’abdomen avec une pince et faites une incision circulaire de ~10 mm dans la peau et la musculature à l’aide de ciseaux Castroviejo (Figure 3B,C).
9. Contrôlez le saignement et maintenez l’hémostase à l’aide de cotons-tiges ou du stylo cautériste, si nécessaire.
10. Localisez le pancréas, qui est attaché à la rate, et identifiez la direction dans laquelle le pancréas se trouve dans l’incision pour décider où le point de croix de soutien doit être placé.
11. À l’aide de la suture en soie 5-0, placez la première maille à l’endroit souhaité dans la couche musculaire. Attachez cette extrémité avec 3-5 nœuds. (Graphique 3D, E)
12. Continuez à coudre directement sur l’incision. Coupez et laissez une queue de ~5 cm (Figure 3F).
13. Répétez les étapes 4.11 et 4.12 perpendiculairement à la première maille (Figure 3G,H).
14. Étape critique : Soulevez doucement le pancréas et positionnez-le sur le point de croix (Figure 3I,J). Veillez à ne pas endommager le pancréas lors de la manipulation.
15. Étape critique : À l’aide de la suture de soie 5-0, effectuez un point de cordon de bourse à ~1 mm du trou, sur le pourtour, en entrelaçant la couche de peau et de muscle (Figure 3K).
16. Positionnez le cadre de la fenêtre de manière à ce que les bords de l’incision circulaire soient insérés dans la rainure de la fenêtre (Figure 3L).
17. Fixez la fenêtre implantée en attachant fermement la soie 5-0.
18. Chargez 100 μL d’adhésif cyanoacrylate liquide dans la seringue de 1 mL.
19. Séchez le tissu en appliquant un flux délicat d’air comprimé pendant ~10 s.
20. Saisissez le cadre de la fenêtre par son bord extérieur avec une pince et soulevez-le doucement pour assurer la séparation du pancréas de la surface inférieure du cadre de la fenêtre.
21. Étape critique : Distribuer une fine couche d’adhésif cyanoacrylate liquide le long de l’évidement de la fenêtre (figure 3M). Assurez-vous de ne pas mettre d’adhésif sur le tissu pancréatique.
22. À l’aide de ramasseurs à vide, soulevez la lamelle de 5 mm.
23. Placez soigneusement la lamelle à l’intérieur de l’évidement au centre du cadre de la fenêtre optique. Maintenir avec une légère pression, en laissant l’adhésif cyanoacrylate durcir (~25 s).
24. Séparez la lamelle des ramasseurs à vide à l’aide d’une pince.
25. Serrez les sutures au point de croix pour bien fixer le pancréas à la lamelle (Figure 3N,O). Remarque : Ne serrez pas trop le point de croix car cela peut endommager et ischémier le pancréas.
26. Coupez les extrémités de la suture.
27. Débranchez le ruban adhésif de la souris.
28. Éteignez le vaporisateur d’isoflurane.
29. Déplacez la souris dans une cage propre ou directement dans le microscope intravital.
30. Hébergez les animaux individuellement après une chirurgie de la fenêtre et surveillez-les jusqu’à leur rétablissement complet.
31. L’imagerie est ensuite réalisée sur un microscope multiphotonique à deux lasers, comme nous l’avons décrit précédemment. ^22,23,24 Pour les longues séances d’imagerie^, la souris est placée dans une chambre chauffée pour maintenir la température corporelle et reçoit des fluides de soutien conformément aux normes de l’IACUC.

5. Traitement par céruléine pour l’induction de la pancréatite

1. Pour étudier l’apparition de la pancréatite, traiter des souris saines avec de la céruléine après l’implantation du SWIP. Assurez-vous que les souris sont à jeun pendant 14 à 18 h et qu’elles reçoivent de l’eau à volonté avant l’administration de céruléine.
2. Injecter 50 μg/kg de céruléine dans 100 μL de 1x DPBS stérile par voie intrapéritonéale à 1 h d’intervalle pour un maximum de huit injections. Administrer un volume équivalent de 1x DPBS seul, injecté par voie intrapéritonéale, aux souris témoins.
3. Après l’imagerie, sacrifier les souris 24 h après la première injection par luxation cervicale selon les normes de l’IACUC.
4. Effectuer l’imagerie sur un microscope multiphotonique à deux lasers comme décrit précédemment^22,23,24. Pour les longues séances d’imagerie, placez la souris dans une chambre chauffée pour maintenir la température du corps et lui fournir des fluides de soutien conformément aux normes de l’IACUC.

Representative Results

La figure 1, adaptée de Du et ^al.15, montre des images fixes d’un film IVI en accéléré du pancréas murin. Certains mouvements tissulaires peuvent être observés au cours de la période initiale de décantation (première heure d’imagerie, Figure 1A). Cependant, avec la poursuite de l’imagerie après cette période de stabilisation (>75 min), nous avons observé une augmentation de la stabilité latérale et axiale (Figure 1B). La comparaison de la stabilité du SWIP avec les fenêtres d’imagerie AIW et PIW précédentes permet de constater que toutes les fenêtres nécessitent une période initiale pour s’installer. Cependant, le SWIP a montré le niveau de dérive le plus faible dans l’ensemble et est le mieux adapté à l’imagerie à long terme (Figure 1C-K). Les images ont été générées sur un microscope multiphoton 24 construit sur mesure éclairant à 880 nm et acquérant un intervalle z stack-t (taille du champ de vision [FOV] = 340 x 340 μm, taille de pixel 0,67 μm) avec 1,7 min entre les images, 11 coupes avec une taille de pas de 2 μm,²⁰ profondeur d’imagerie, et ~1 tranche/s. La puissance du laser et les gains du tube photomultiplicateur (PMT) ont été choisis pour maximiser le signal tout en minimisant le photoblanchiment et les photodommages.

Les étapes des procédures chirurgicales décrivant l’implantation de la tumeur du pancréas et l’insertion ultérieure de la fenêtre pancréatique sont représentées dans la figure 2 et la figure 3, respectivement. Il est important de noter que les deux chirurgies sont des chirurgies de survie. Une fois correctement implanté, le pancréas restera apposé à la fenêtre optique, qui est maintenant intégrée dans la paroi abdominale. Cela permet une survie confortable de la souris et permet une imagerie continue jusqu’à 12 h, comme le permet le protocole. De plus, l’imagerie en série peut être effectuée sur plusieurs jours consécutifs (jusqu’à l’allocation de protocole de 2 semaines) pour surveiller les régions d’intérêt au fil du temps. L’imagerie intravitale (IVI) peut être réalisée à travers la fenêtre d’une manière similaire aux autres fenêtres décrites précédemment^22,25,26.

Le SWIP peut être utilisé pour étudier la dynamique au début de la pancréatite aiguë induite par la céruléine. La céruléine est un oligopeptide dont la structure et la fonction sont similaires à celles de la cholécystokinine (CKK) et est largement utilisée pour induire expérimentalement une pancréatite aiguë chez les rongeurs²⁷. Le traitement à la céruléine entraîne la contraction du muscle lisse dans le tractus gastro-intestinal et stimule les sécrétions gastriques et pancréatiques²⁸. De plus, l’administration intrapéritonéale de céruléine entraîne un gonflement et une hypertrophie du pancréas²⁹.

La figure 4 montre l’imagerie en série du pancréas murin après un traitement à la céruléine, à l’aide du protocole SWIP. Le pancréas murin est visualisé à une résolution unicellulaire à l’aide d’un marquage génétique fluorescent (épithélium marqué par ECFP-MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP souris transgéniques) et de l’administration de colorants de haut poids moléculaire (155 kD dextran-TMR) pour définir la vascularisation locale, indiquée par les lignes jaunes pleines. La conception de la fenêtre, utilisée précédemment pour l’imagerie pulmonaire murine⁸, comprend trois lignes gravées sur le cadre (figure 4, médaillon) qui agissent comme des repères qui permettent l’utilisation de la microcartographie³⁰. La microcartographie permet d’obtenir des images en série de la même région d’intérêt du pancréas murin sur plusieurs jours. Ici, le même lobule du pancréas (lignes pointillées jaunes) est visualisé le jour 1 et relocalisé le jour 2, comme en témoigne la présence des mêmes vaisseaux sanguins locaux (Figure 4). Les images ont été acquises chaque jour sous la forme d’une seule pile z avec 11 tranches et une taille de pas de 2 μm à ~1 tranche/s, prises à un éclairage de 880 nm et une résolution de 0,67 μm/pixel (FOV = 340 x 340 μm). La puissance du laser et les gains PMT ont été choisis pour maximiser le signal tout en minimisant le photoblanchiment et les photodommages.

En plus de l’imagerie sérielle, le SWIP est bien adapté à l’imagerie longitudinale à long terme, permettant le suivi et la mesure précis de la dynamique des structures subcellulaires (telles que les vacuoles) dans des conditions de contrôle et de traitement. Ici, les vacuoles sont des régions où les protéines fluorescentes cytoplasmiques sont exclues, ce qui provoque l’apparition de trous sombres non marqués (Figure 5A). Le marquage des vacuoles à l’aide d’un logiciel tel que ROI Tracker²⁴ permet de visualiser la motilité des vacuoles (Figure 5A,B) et de quantifier de nombreux paramètres de motilité. Par exemple, la vitesse moyenne des vacuoles dans le pancréas murin a augmenté d’environ 10 % après un traitement par la céruléine pour induire une pancréatite, par rapport au traitement PBS (0,37 ± 0,07 μm/min vs 0,41 ± 0,09 μm/min, p = 0,02) (Figure 5C). Le traitement par la céruléine a également augmenté la fréquence moyenne de retournement des structures subcellulaires de 10 % par rapport au traitement par PBS (2,3 ± 0,3 deg/min vs 2,6 ± 0,6 deg/min, p = 0,04) (Figure 5F). Cependant, il n’y avait pas de différence significative (p > 0,05) dans la vitesse nette, la directionnalité ou la distance cumulée parcourue entre le traitement par la céruléine et le traitement par PBS (Figure 5D, E et Figure 5G). Les images ont été générées sur un microscope multiphoton²⁴ construit sur mesure éclairant à 880 nm et acquérant un intervalle z stack-t (taille du champ de vision = 340 x 340 μm, taille des pixels 0,67 μm) avec 2,9 min entre les images, 11 tranches avec une taille de pas de 2 μm et ~1 tranche/s.

Enfin, le SWIP permet de visualiser et de capturer la migration des cellules tumorales. La figure 6A montre une image fixe d’un film en accéléré (vidéo supplémentaire S1 et vidéo supplémentaire S2) de la migration dans le pancréas de cellules tumorales KPC marquées par Dendra-2 qui ont été injectées orthotopiquement. La migration collective des cellules en grappes (figure 6B et vidéo supplémentaire S1) et la migration d’une seule cellule (figure 6C et vidéo supplémentaire S2) peuvent être observées sur de courtes périodes (<1 h). Les images ont été générées sur un microscope multiphotonique²⁴ construit sur mesure éclairant à 880 nm et acquérant un intervalle d’empilement Mosaic-Z de 4 x 4 avec un chevauchement de 20 % entre les tuiles (taille de la tuile = 340 x 340 μm), 3,4 min entre les images, 3 tranches avec une taille de pas de 5 μm et ~1 tranche/s. La puissance du laser et les gains PMT ont été choisis pour maximiser le signal tout en minimisant le photoblanchiment et les photodommages.

Figure 1 : Amélioration de la stabilité de l’imagerie grâce au SWIP. (A) Photos prises dans les 72 premières minutes d’une vidéo timelapse du pancréas photographiée par le SWIP. Une certaine dérive axiale mais très peu latérale peut être observée. Barres d’échelle = 50 μm. (B) L’imagerie accélérée continue après 72 min montre un haut niveau de stabilité axiale et latérale. (A,B) Rouge = 155 kDa de sérum sanguin marqué au dextran, Cyan = cellules pancréatiques marquées au CFP (souris transgéniques MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP) (C-E) Comparaison de la stabilité latérale de chacune des fenêtres d’imagerie du pancréas au cours de la première heure d’imagerie pour l’AIW (C), le PIW (D) et le SWIP (E). (F-H) Comparaison de la stabilité latérale de chacune des images du pancréas au cours des 150 minutes suivantes pour l’AIW (F), l’AIW (G) et l’SWIP (H). Les encarts sont des vues agrandies des tracés correspondants. (I-K) Comparaison de la stabilité axiale de chacune des fenêtres d’imagerie du pancréas pendant les 120 premières minutes d’imagerie pour (I) AIW, (J) PIW et (K) SWIP. Cette figure provient de Du et al. Open Biology 2022, DOI :10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273. ¹⁵. Abréviations : SWIP = fenêtre stabilisée pour l’imagerie intravitale du pancréas ; AIW = fenêtre d’imagerie abdominale ; PIW = fenêtre d’imagerie du pancréas ; CFP = protéine fluorescente cyan. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Vue d’ensemble du protocole chirurgical d’injection orthotopique de cellules d’adénocarcinome canalaire pancréatique (CPK). (A) Illustration de la façon de tenir les pinces chirurgicales. (B) Illustration de la façon de tenir les ciseaux Castroviejo. (C) Illustration de la façon de tenir l’outil de ramassage par le vide. (D) Assainissement de la peau. (E) Incision dans la peau. (F) Incision dans le muscle. (G) Pancréas évasé. (H) Insertion de l’aiguille dans le site d’injection souhaité. (I) Injection d’une suspension de cellules cancéreuses créant une bulle (flèche bleue). (J) Le pancréas est retourné dans la cavité péritonéale. (K,L) Fermeture de la couche musculaire par une suture de soie interrompue. (M,N) Fermeture de la peau par une suture de soie interrompue. (O) Colle cyanoacrylate appliquée sur l’incision. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Vue d’ensemble du protocole chirurgical de la fenêtre stabilisée pour l’imagerie du pancréas. (A) Identification de la rate et du pancréas attaché. (B,C) Incision circulaire dans la peau et le muscle. Les lignes pointillées rouges de A à C indiquent le contour de la rate qui peut être vu à travers la paroi abdominale et la peau. (D,E) Première maille de la corbeille au point de croix placée et nouée dans la couche musculaire (E, flèche jaune). (F) Le point de suture se poursuit jusqu’au côté opposé de l’incision musculaire, en laissant une queue (flèche blanche). (G,H) Deuxième maille placée perpendiculairement à la première, nouée à une extrémité (flèches jaunes) et laissant une queue (flèches blanches). (I,J) Placement du pancréas dans le panier de point de croix. (K) Suture circonférentielle du cordon de la bourse à travers les muscles et la peau. (L) Implantation du cadre de la fenêtre. (M) Application de colle sur le cadre de la fenêtre. (N) Fixation de la lamelle de verre. (O) Les extrémités de la queue du point de croix sont serrées. (P) SWIP complètement implanté. Abréviation : SWIP = fenêtre stabilisée pour l’imagerie intravitale du pancréas. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Microcartographie utilisée pour l’imagerie en série afin de relocaliser les mêmes zones d’intérêt dans la fenêtre optique. Imagerie intravitale d’une seule région du pancréas murin, montrant le même lobule déplacé sur 2 jours consécutifs (D1-D2) par microcartographie. Des lignes pointillées jaunes délimitent les limites d’un même lobule. Les lignes pleines mettent en évidence les mêmes vaisseaux sanguins (comme en témoigne la présence de sérum sanguin marqué en rouge dans la lumière) identifiés chaque jour consécutif. Rouge = 155 kDa de sérum sanguin marqué au dextrane tétraméthylrhodamine, Cyan = cellules pancréatiques marquées CFP (souris transgéniques MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP) (médaillon) Image du SWIP avec rayures pour la microcartographie. L’utilisation de la microcartographie pour déplacer les régions d’intérêt lors de l’imagerie en série est permise par les trois lignes gravées sur le cadre de la fenêtre (médaillon). Barres d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Résolution subcellulaire et mesure de la dynamique subcellulaire à l’aide du SWIP. (A) Les cellules individuelles (contours jaunes en pointillés) et les structures subcellulaires telles que les vacuoles peuvent être visualisées par le SWIP au fil du temps dans le pancréas murin. Des exemples de ces vacuoles sont indiqués par des flèches jaunes. Le SWIP permet ainsi de suivre les structures subcellulaires (contours colorés et traces superposées sur l’image de fluorescence) dans le temps. L’encart est une vue agrandie d’une zone encadrée jaune montrant trois vacuoles suivies. Barre d’échelle = 50 μm. (B) Trajectoires des structures subcellulaires, telles que les noyaux et les vacuoles (surlignées en A), après un décalage des coordonnées vers le point d’origine. La ligne pointillée rouge indique le trajet net moyen en 1 h (3,46 μm). Quantification des paramètres dynamiques de (C) vitesse moyenne, (D) trajectoire nette, (E) directionnalité, (F) fréquence moyenne de virage et (G) distance cumulée. Rouge = 155 kDa de sérum sanguin marqué au dextrane tétraméthylrhodamine, Cyan = cellules pancréatiques marquées CFP (souris transgéniques MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP). Abréviations : SWIP = fenêtre stabilisée pour l’imagerie intravitale du pancréas ; CFP = protéine fluorescente cyan. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Capture de la migration cellulaire avec SWIP. (A) Image fixe d’un film d’imagerie intravitale en accéléré du pancréas dans un modèle murin de PDAC injecté orthotopiquement. (B) Images fixes de la vidéo supplémentaire S1 montrant un exemple de cellules tumorales subissant une migration collective (flèche jaune). (C) Images fixes de la vidéo supplémentaire S2 montrant des exemples de migration unicellulaire d’une cellule tumorale (flèche jaune) et d’un macrophage (flèche rouge). Vert = cellules tumorales marquées à Dendra2, Bleu = macrophages marqués CFP, Rouge = sérum sanguin marqué à la dextrane tétraméthylrhodamine 155 kDa. Barres d’échelle = 50 μm (A), 15 μm (B,C). Abréviations : SWIP = fenêtre stabilisée pour l’imagerie intravitale du pancréas ; CFP = protéine fluorescente cyan ; PDAC = adénocarcinome pancréatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire S1 : Film d’imagerie intravitale en accéléré montrant des cellules tumorales subissant une migration collective correspondant à la figure 6B. Vert = cellules tumorales marquées à Dendra2, Bleu = macrophages marqués CFP, Rouge = sérum sanguin marqué à la dextrane tétraméthylrhodamine 155 kDa. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire S2 : Film d’imagerie intravitale en accéléré montrant des cellules tumorales subissant une migration de cellule unique correspondant à la figure 6C. Vert = cellules tumorales marquées à Dendra2, Bleu = macrophages marqués CFP, Rouge = sérum sanguin marqué à la dextrane tétraméthylrhodamine 155 kDa. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le protocole SWIP décrit ici fournit une méthode améliorée de stabilisation du tissu pancréatique en utilisant une technique de panier au point de croix. Les premières fenêtres d’imagerie abdominale (AIW) permettaient l’imagerie intravitale (IVI) des organes internes de l’abdomen, mais ne limitaient pas adéquatement le mouvement des tissus mous tels que le pancréas. En réponse, Park et al. ont mis au point une fenêtre d’imagerie du pancréas (PIW) qui intègre une étagère métallique horizontale et permet une meilleure stabilisation du tissu pancréatique tout en maintenant le contact avec la lamelle de verre. Bien que cette approche améliore la stabilité latérale, elle limite l’imagerie des tumeurs pancréatiques solides car leur taille dépasse l’espace étroit entre l’étagère et la vitre de protection. Le SWIP résout ce problème en stabilisant le pancréas avec un panier de point de croix, limitant les mouvements axiaux et latéraux, tout en étant capable d’accueillir des tumeurs solides de grande taille (≤10 mm).

Des comparaisons directes du SWIP avec des fenêtres d’imagerie antérieures telles que AIW et PIW ont été effectuées précédemment¹⁵. C’est ce que montre la figure 1, adaptée de Du et ^al.15, où les déplacements latéraux et axiaux ont été quantifiés en suivant les caractéristiques anatomiques cellulaires telles que les noyaux ou les vaisseaux sanguins. Toutes les fenêtres d’imagerie ont montré un besoin d’une période de stabilisation pendant environ la première heure d’imagerie. Au cours de cette période, un degré plus élevé de mouvement latéral a été observé avec l’AIW et le PIW par rapport au SWIP. Un décalage axial plus important a également été observé avec l’AIW et le PIW par rapport au SWIP sur une période de 2 h. Dans l’ensemble, le SWIP a montré le niveau de dérive le plus faible et convient à l’imagerie à long terme (≤12 h).

Malheureusement, le pancréas est un tissu très dispersé et, en tant que tel, la fonction d’étalement ponctuel du microscope multiphotonique utilisé dans l’IVI est rapidement dégradée avec la pénétration dans le tissu. Ainsi, la profondeur d’imagerie avec l’une des fenêtres optiques est limitée à seulement ~30-60 μm. L’IVI comporte également un risque de dommages induits par la lumière sur l’échantillon. Cela peut être testé au début des séances d’imagerie en acquérant une série chronologique de 100 images et en recherchant des signes de photoblanchiment ou de photodommage. Sur notre système de microscope, nous avons constaté qu’une puissance maximale de ~15 mW à l’échantillon peut être utilisée sans affecter négativement le tissu.

Le protocole SWIP permet d’obtenir une IVI optique unicellulaire stable et à haute résolution du pancréas murin dans des conditions saines normales, ainsi que dans des états pathologiques tels que la pancréatite et la PDAC. Cela rend le SWIP particulièrement utile pour l’imagerie en accéléré long, ainsi que pour l’imagerie 3D et 4D (3D + temps) en capturant plusieurs tranches z (en tirant parti des capacités de coupe optique inhérentes à la microscopie multiphotonique et confocale). En permettant la visualisation in vivo de cellules individuelles et de leurs interactions avec les constituants cellulaires du pancréas, l’IVI à haute résolution s’avérera inestimable pour comprendre les mécanismes sous-jacents aux maladies du pancréas.

Un certain niveau d’expertise technique est nécessaire pour exécuter le protocole SWIP. Cependant, avec une pratique appropriée et une attention aux étapes clés, la procédure peut être exécutée avec un taux de réussite élevé. Pour imager le pancréas malin, il est crucial d’avoir d’abord une tumeur implantée avec succès. Ceci est obtenu par injection orthotopique d’une suspension de cellules cancéreuses du pancréas murins dans le pancréas de la souris. Une injection réussie est observée lorsque le parenchyme du pancréas se gonfle en une bulle remplie de liquide et a été décrite en détail précédemment²¹. Pour assurer un succès et une survie optimaux, il est essentiel qu’il y ait peu ou pas de fuite de la suspension cellulaire, car la fuite réduira considérablement la taille potentielle de la tumeur et entraînera une carcinose . De plus, le pancréas est un organe hautement vascularisé, avec de nombreux vaisseaux sanguins ramifiés. Il est essentiel d’éviter de lacérer les vaisseaux, car cela provoquera des saignements et un hématome ultérieur dans le pancréas et inhibera la croissance tumorale. Dans ce modèle, nous avons utilisé une lignée cellulaire syngénique PDAC dérivée de souris KPC²⁰. Cela permet la greffe de tumeur chez les souris immunocompétentes. D’autres lignées cellulaires syngéniques PDAC peuvent être utilisées en fonction de la souche de souris utilisée. Des lignées cellulaires humaines PDAC peuvent également être utilisées ; Cependant, la souche de souris doit être immunodéprimée afin d’éviter le rejet de l’implantation de la tumeur.

La taille des tumeurs faisant l’objet d’une imagerie dans ce protocole peut être modifiée selon les besoins. Cela peut être accompli en utilisant une concentration plus élevée de cellules cancéreuses implantées dans le pancréas murin pour obtenir une tumeur plus grande ou en prolongeant le temps de croissance de la tumeur avant l’implantation de la fenêtre. Dans cette étude, nous avons injecté 10 cellules PDAC^KPC 6 et implanté le SWIP 10 à 14 jours après, lorsque les tumeurs étaient palpables. Les tumeurs plus petites et plus grandes peuvent également être prises en charge par ce protocole SWIP en plaçant le tissu de manière appropriée dans le panier de point de croix.

Le placement sécurisé de la fenêtre d’imagerie et du pancréas est également crucial pour obtenir une imagerie de haute qualité et limiter les artefacts de mouvement. Le pancréas murin normal est très docile et sujet aux mouvements de la respiration et du péristaltisme voisin. Pour remédier à ce problème et augmenter la stabilité du pancréas lors de l’imagerie, une technique de panier au point de croix décrite précédemment est utilisée³¹. Le panier au point de croix est conçu pour imiter l’utilisation des ligaments par le corps. En berçant le tissu contre la lamelle de verre et en appliquant une pression axiale constante, il empêche les mouvements latéraux et axiaux. Lorsqu’il s’agit de tumeurs solides plus grandes, le point d’appui et la direction du point de croix peuvent être modifiés pour s’adapter au mieux à la taille et à la position de la tumeur pour un soutien optimal.

Une imagerie sous-optimale peut également se produire lorsque le cadre de la fenêtre n’est pas correctement implanté dans l’abdomen de la souris. Un cadre de fenêtre mal ajusté peut entraîner des difficultés d’imagerie et des artefacts de mouvement. Une suture appropriée à cordon de bourse peut résoudre ce problème en fixant le cadre de la fenêtre à l’abdomen à travers la peau et la paroi abdominale. Pour éviter un pliage excessif de la peau lors du serrage du cordon de la bourse, les étapes de couture ne doivent pas dépasser 5 mm entre les marches qui ne sont pas placées à plus de 1 mm du bord du tissu, assurant un ajustement parfait autour du cadre de la fenêtre. Après la suture du cordon de la bourse, la mise en place du pancréas dans le panier au point de croix et l’implantation du cadre de la fenêtre, une dernière étape critique est la mise en place de l’adhésif dans l’évidement du cadre de la fenêtre. Il est essentiel qu’au cours de cette étape, aucun adhésif n’entre en contact avec le tissu pancréatique, car cela endommagerait le tissu et confondrait l’imagerie. Une modification potentielle qui peut également empêcher la colle d’entrer en contact avec le tissu pancréatique consiste à coller la lamelle de verre au cadre de la fenêtre et à laisser sécher les deux avant l’implantation chirurgicale dans l’abdomen.

Le SWIP, comme toutes les techniques d’imagerie intravitale, a des limites dans sa capacité à révéler des informations sur d’autres cellules et structures dans le tissu qui ne sont pas explicitement marquées. Cependant, la combinaison de la fenêtre SWIP avec des rapporteurs fluorescents (tels que les épithéliums exprimant l’ECFP et les cellules KPC marquées par Dendra2 comme dans cette étude) et le contrôle des états protéiques ou cellulaires avec des outils pharmacologiques et/ou optogénétiques peuvent éliminer ces limitations.

De plus, la conception de la fenêtre SWIP comprend trois lignes gravées sur le cadre de la fenêtre, servant de repères pour la microcartographie afin de relocaliser les zones d’intérêt pendant l’imagerie en série³⁰. Cela permet de localiser plusieurs fois le même champ de vision, même dans des tissus non marqués.

En résumé, le SWIP peut être utilisé dans le tissu pancréatique sain normal ainsi que dans les maladies pancréatiques bénignes et malignes telles que la pancréatite et la PDAC. La dynamique unicellulaire et subcellulaire peut être capturée dans ces états à l’aide du SWIP et peut aider les chercheurs à comprendre des événements physiologiques importants tels que la dissémination métastatique dans la PDAC. L’amélioration de la qualité et de la stabilité de l’IVI a le potentiel de fournir des informations précieuses sur la physiopathologie et la biologie cellulaire du pancréas, ce qui en fait un outil prometteur et bénéfique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].