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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Murine अग्न्याशय के intravital इमेजिंग के लिए स्थिर खिड़की

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/65498
Automatic Translation
*1,2,3, *4,5, 1,4, 6,7, 2,3,4,7,8,9, 1,3,4,7,8,9,10, 2,3,7, 1,2,3,7,8, 2,3,4,7,8,9
1Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Integrated Imaging Program for Cancer Research, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 5Breast Center, Peking University People's Hospital, 6Department of Microbiology & Immunology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 7Montefiore Einstein Cancer Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 8Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 9Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 10Department of Cell Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

हम murine अग्न्याशय के subcellular-संकल्प इमेजिंग के लिए एक स्थिर निवास ऑप्टिकल खिड़की के सर्जिकल आरोपण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, स्वस्थ और रोगग्रस्त अग्न्याशय के धारावाहिक और अनुदैर्ध्य अध्ययन की अनुमति देता है।

Abstract

अग्न्याशय के शरीर विज्ञान और पैथोफिज़ियोलॉजी जटिल हैं। अग्न्याशय के रोग, जैसे कि अग्नाशयशोथ और अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) में उच्च रुग्णता और मृत्यु दर होती है। इंट्रावाइटल इमेजिंग (आईवीआई) एक शक्तिशाली तकनीक है जो स्वस्थ और रोगग्रस्त दोनों राज्यों में ऊतकों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम करती है, जिससे सेल गतिशीलता के वास्तविक समय के अवलोकन की अनुमति मिलती है। murine अग्न्याशय का IVI अंग की गहरी आंत और आज्ञाकारी प्रकृति के कारण महत्वपूर्ण चुनौतियां प्रस्तुत करता है, जो इसे क्षति और गति कलाकृतियों के लिए अत्यधिक प्रवण बनाता है।

यहाँ वर्णित के आरोपण की प्रक्रिया है एसtabilized डब्ल्यूindow के लिए मैंmurine पीancreas की इमेजिंग (SWIP). एसडब्ल्यूआईपी सामान्य स्वस्थ राज्यों में म्यूरिन अग्न्याशय के आईवीआई की अनुमति देता है, स्वस्थ अग्न्याशय से सेरुलिन द्वारा प्रेरित तीव्र अग्नाशयशोथ में परिवर्तन के दौरान, और अग्नाशयी ट्यूमर जैसे घातक राज्यों में। आनुवंशिक रूप से लेबल कोशिकाओं या फ्लोरोसेंट रंगों के प्रशासन के साथ संयोजन के रूप में, SWIP एकल सेल और उपकोशिकीय गतिशीलता (एकल सेल और सामूहिक प्रवास सहित) के माप के रूप में अच्छी तरह से कई दिनों में ब्याज के एक ही क्षेत्र के धारावाहिक इमेजिंग सक्षम बनाता है.

ट्यूमर सेल माइग्रेशन को पकड़ने की क्षमता का विशेष महत्व है क्योंकि पीडीएसी में कैंसर से संबंधित मृत्यु दर का प्राथमिक कारण भारी मेटास्टेटिक बोझ है। पीडीएसी में मेटास्टेसिस की शारीरिक गतिशीलता को समझना रोगी के पूर्वानुमान में सुधार के लिए एक महत्वपूर्ण अपूर्ण आवश्यकता और महत्वपूर्ण है। कुल मिलाकर, एसडब्ल्यूआईपी बेहतर इमेजिंग स्थिरता प्रदान करता है और स्वस्थ अग्न्याशय और घातक अग्न्याशय रोगों में आईवीआई के आवेदन का विस्तार करता है।

Introduction

सौम्य और घातक अग्नाशय के रोग संभावित रूप से जीवन के लिए खतरा हैं, उनके पैथोफिज़ियोलॉजी की समझ में काफी अंतराल है। अग्नाशयशोथ-अग्न्याशय की सूजन-अमेरिका में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रोग से संबंधित अस्पताल में प्रवेश और पठन-पाठन का तीसरा प्रमुख कारण है और यह पर्याप्त रुग्णता, मृत्यु दर और सामाजिक आर्थिक बोझसे जुड़ा हुआ है। कैंसर से संबंधित मौत 2 के तीसरे प्रमुख कारण के रूप में रैंक किया गया, अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) अधिकांश अग्नाशयी विकृतियों3 के लिए जिम्मेदार है और केवल 11%2 की खराब 5 साल की जीवित रहने की दर को दर्शाता है। पीडीएसी में कैंसर से संबंधित मृत्यु दर का प्रमुख कारण भारी मेटास्टेटिक बोझ है। दुर्भाग्य से, अधिकांश रोगी मेटास्टैटिक बीमारी के साथ उपस्थित होते हैं। इसलिए, पीडीएसी में मेटास्टेसिस की गतिशीलता को समझना कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण अपूर्ण आवश्यकता है।

सूजन को कम करने वाले तंत्र और अग्न्याशय के मेटास्टैटिक झरने को खराब समझा जाता है। ज्ञान में इस अंतर के लिए एक प्रमुख योगदानकर्ता विवो में अग्नाशयी सेलुलर गतिशीलता का निरीक्षण करने में असमर्थता है। इन सेलुलर गतिशीलता का प्रत्यक्ष अवलोकन अग्नाशय की बीमारी वाले लोगों के निदान और उपचार का लाभ उठाने और सुधारने के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्यों का अनावरण करने का वादा करता है।

इंट्रावाइटल इमेजिंग (आईवीआई) एक माइक्रोस्कोपी तकनीक है जो शोधकर्ताओं को वास्तविक समय में जीवित जानवरों में जैविक प्रक्रियाओं की कल्पना और अध्ययन करने की अनुमति देती है। आईवीआई उच्च-रिज़ॉल्यूशन, विवो में इंट्रासेल्युलर और माइक्रोएन्वायरमेंटल डायनेमिक्स के प्रत्यक्ष दृश्य और प्रश्न में जैविक प्रक्रिया के मूल वातावरण के भीतर अनुमति देता है। इसलिए, आईवीआई स्वस्थ और रोग संबंधी प्रक्रियाओं के विवो अवलोकन में अनुमति देता है।

एमआरआई, पीईटी और सीटी जैसे समकालीन पूरे शरीर इमेजिंग तौर-तरीके पूरे अंगों के उत्कृष्ट विचार प्रदान करते हैं औरनैदानिक लक्षणों की शुरुआत से पहले भी विकृति प्रकट कर सकते हैं। हालांकि, वे एकल-कोशिका संकल्प प्राप्त करने या रोग-अग्नाशयशोथ या दुर्दमता के शुरुआती चरणों को प्रकट करने में असमर्थ हैं।

पिछले अनुसंधान एकल कोशिका संकल्प चतुर्थ का इस्तेमाल किया है त्वचा5,6, स्तन7, फेफड़े8, जिगर9, मस्तिष्क 10, और अग्नाशयी ट्यूमर 11, रोग प्रगति 12 के तंत्र में अंतर्दृष्टि के लिए अग्रणी, त्वचा के सौम्य और घातक रोगों का निरीक्षण करने के लिए. हालांकि, murine अग्न्याशय आईवीआई का उपयोग कर एकल-कोशिका संकल्प प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण बाधाएं पैदा करता है, मुख्य रूप से इसकी गहरी आंत के स्थान और उच्च अनुपालन के कारण। इसके अलावा, यह मेसेंटरी के भीतर एक शाखित, विसरित रूप से वितरित अंग है जो प्लीहा, छोटी आंत और पेट से जुड़ता है, जिससे इसे एक्सेस करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है। ऊतक आसन्न क्रमाकुंचन और श्वसन के कारण गति के प्रति भी अत्यधिक संवेदनशील होता है। अग्न्याशय के आंदोलन को कम करने एकल कोशिका संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक है, क्योंकि कुछ माइक्रोन की गति कलाकृतियां छवियों को धुंधला और विकृत कर सकती हैं, जिससे व्यक्तिगत कोशिकाओं की गतिशीलता को ट्रैक करना असंभवहो जाता है।

आईवीआई करने के लिए, एक पेट इमेजिंग खिड़की (एआईडब्ल्यू) शल्य चिकित्सा 9,11 प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए. एआईडब्ल्यू को शल्य चिकित्सा द्वारा प्रत्यारोपित करने के लिए, एक धातु की खिड़की के फ्रेम को पेट की दीवार में सीवन किया जाता है। बाद में, ब्याज का अंग साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला उपयोग करके फ्रेम से जुड़ा हुआ है। हालांकि यह कुछ कठोर आंतरिक अंगों (जैसे, यकृत, प्लीहा, कठोर ट्यूमर) के लिए पर्याप्त है, स्वस्थ murine अग्न्याशय इमेजिंग पर प्रयास ऊतक के अनुरूप बनावट और जटिल वास्तुकला14 के कारण suboptimal पार्श्व और अक्षीय स्थिरता से समझौता कर रहे हैं. इस सीमा को संबोधित करने के लिए, पार्क एट अल 14 ने विशेष रूप से स्वस्थ अग्न्याशय के लिए डिज़ाइन की गई एक इमेजिंग विंडो विकसित की। यह अग्न्याशय इमेजिंग विंडो (PIW) कवरस्लिप के ठीक नीचे, खिड़की के फ्रेम के भीतर एक क्षैतिज धातु शेल्फ को शामिल करके, ऊतक को स्थिर करके और कवर ग्लास के साथ अपना संपर्क बनाए रखकर आंतों के आंदोलन और श्वास के प्रभाव को कम करता है। जबकि PIW पार्श्व स्थिरता में वृद्धि प्रदान करता है, हमने पाया कि यह खिड़की अभी भी अक्षीय बहाव को प्रदर्शित करती है और धातु शेल्फ और कवरस्लिप15 के बीच संकीर्ण अंतर के कारण बड़े ठोस ट्यूमर की इमेजिंग को भी रोकती है।

इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम murine पीancreas (SWIP) के मैंntravital इमेजिंग के लिए एसtabilized डब्ल्यूindow विकसित, एक प्रत्यारोपण योग्य इमेजिंग खिड़की दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त अग्न्याशय (चित्रा 1)15 की स्थिर दीर्घकालिक इमेजिंग प्राप्त करने में सक्षम. यहां, हम SWIP को प्रत्यारोपित करने के लिए उपयोग की जाने वाली शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यद्यपि प्राथमिक उद्देश्य मेटास्टेसिस में शामिल गतिशील तंत्र का अध्ययन करना था, इस पद्धति का उपयोग अग्न्याशय जीव विज्ञान और विकृति विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रक्रियाओं को कशेरुक जानवरों के उपयोग के लिए दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार किया गया है, जिसमें अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) द्वारा पूर्व अनुमोदन शामिल है।

1. खिड़कियों का निष्क्रियता

नोट: स्टेनलेस स्टील की निष्क्रियता दूषित पदार्थों की धातु को साफ करती है और एक पतली ऑक्साइड परत बनाती है जो टाइटेनियम16 से परे भी नरम ऊतकों के साथ धातु की जैव-अनुकूलता को बढ़ाती है।

  1. ऑप्टिकल विंडो फ्रेम को 1% (w/v) एंजाइमेटिकली-एक्टिव डिटर्जेंट सॉल्यूशन से धोकर निष्क्रियता प्रक्रिया शुरू करें।
  2. एक ग्लास जार के अंदर 30 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% (डब्ल्यू / वी) सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान में फ्रेम जलमग्न.
  3. फ्रेम को बाहर निकालें और उन्हें विआयनीकृत पानी से कुल्ला।
  4. एक नए ग्लास जार के अंदर 10 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एक 7% (डब्ल्यू / वी) साइट्रिक एसिड समाधान में फ्रेम विसर्जित कर दिया.
  5. फ्रेम निकालें और उन्हें फिर से विआयनीकृत पानी से कुल्ला।
  6. चरण 1.2 दोहराएं, और अंत में, खिड़की के फ्रेम को आखिरी बार विआयनीकृत पानी से धो लें।

2. ट्यूमर आरोपण या खिड़की सर्जरी के लिए तैयारी

नोट: अग्नाशयी ट्यूमर के अध्ययन के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं को प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए और ओवरट ट्यूमर में बढ़ने की अनुमति दी जानी चाहिए। विवो में ट्यूमर कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, उन कोशिकाओं का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जिन्हें डेंड्रा 2 जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक रूप से बदल दिया गया है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल का उपयोग करना जो उज्ज्वल हैं, ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ संभावित मुद्दों को कम करेगा। अन्य संभावित फ्लोरोसेंट प्रोटीन, रंजक, और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट माउस मॉडल है कि इस्तेमाल किया जा सकता है कहीं और17,18 पर चर्चा की गई है. ऑपरेटिव क्षेत्र के संदूषण को रोकने के लिए, एक हुड या लामिना का प्रवाह कैबिनेट में शल्य चिकित्सा प्रक्रिया प्रदर्शन और अलग क्षेत्रों तैयारी के लिए उपयोग किया जाता है कि सुनिश्चित करें, सर्जरी, और वसूली.

  1. सर्जरी से पहले, एक आटोक्लेव में सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों बाँझ और, यदि आवश्यक हो, बाद की प्रक्रियाओं के लिए एक गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ का उपयोग करें. सुनिश्चित करें कि सर्जरी एक टिप्स-ओनली तकनीक का उपयोग करती है।
  2. गर्म सर्जिकल पैड और मनका स्टेरलाइज़र पर स्विच करें और उपयुक्त ऑपरेटिंग तापमान तक पहुंचने के लिए प्रतीक्षा करें। संभावित जलने से बचने के लिए सतह थर्मामीटर के साथ हीटिंग पैड तापमान की निगरानी की जानी चाहिए। यदि तापमान को पर्याप्त रूप से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है तो हीटिंग पैड के ऊपर एक बाँझ कपड़ा रखें।
    नोट: छोटी प्रक्रियाओं (≤20 मिनट) के दौरान शरीर का तापमान, जैसे ट्यूमर और खिड़की के आरोपण, एक गर्म सर्जिकल पैड का उपयोग करते समय न्यूनतम रूप से प्रभावित होता है। हालांकि, संज्ञाहरण की लंबी अवधि, इस तरह के विस्तारित टाइमलैप्स इमेजिंग के दौरान, माउस शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक गर्म कक्ष में रखा जा करने की आवश्यकता.
  3. एक संज्ञाहरण कक्ष में 5% isoflurane के साथ माउस संवेदनाहारी.
  4. महत्वपूर्ण कदम: 2% करने के लिए संज्ञाहरण कम एक बार माउस बेहोश है. ध्यान से संज्ञाहरण स्तर और माउस के vitals (जैसे, एक पल्स ऑक्सीमीटर का उपयोग कर)19की निगरानी करें.
  5. कॉर्नियल सुखाने को रोकने के लिए माउस की प्रत्येक आंख पर आंख स्नेहक की एक छोटी बूंद रखें।
  6. सर्जरी से पहले, बालों को हटाने के लिए बाएं ऊपरी पेट पर उदारतापूर्वक डिपिलिटरी क्रीम लगाएं। 20 एस के बाद, बालों और डिपिलिटरी क्रीम को मजबूती से पोंछने के लिए सिक्त टिशू पेपर का उपयोग करें। प्रक्रिया को आवश्यकतानुसार दोहराएं जब तक कि सर्जिकल क्षेत्र से सभी बाल हटा न दिए जाएं।
  7. प्रीऑपरेटिव एनाल्जेसिया सुनिश्चित करने के लिए पीबीएस के 90 माइक्रोन में पतला ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम/किग्रा) के 10 माइक्रोन इंजेक्ट करें।

3. अग्न्याशय ट्यूमर आरोपण

  1. वांछित एकाग्रता (ट्यूमर सेल दोहरीकरण समय के आधार पर) पर ट्यूमर कोशिकाओं के aliquots तैयार करें. सेल सस्पेंशन को इंसुलिन सिरिंज में रखें और इसे बर्फ पर रखें। इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, 106 syngeneic KPC ट्यूमर कोशिकाओं 20 पीबीएस के एक अधिकतम50 माइक्रोन में निलंबित, Erstad एट अल से अनुकूलित orthotopic इंजेक्शन प्रोटोकॉल के बाद21 का उपयोग करें
    नोट: इस सेल लाइन नियमित रूप से 10-14 दिनों तक स्पष्ट या उचित रूप से बड़े ट्यूमर का उत्पादन इस एकाग्रता पर इंजेक्शन. इस सेल लाइन और अन्य अग्नाशयी सेल लाइनों के subclones उचित आकार ट्यूमर का उत्पादन करने के लिए उचित सांद्रता और समयसीमा के लिए मूल्यांकन किया जा करने की आवश्यकता होगी).
  2. एंटीसेप्टिक साबुन का उपयोग करके हाथ धोएं।
  3. प्रत्येक नई सर्जरी से पहले, नए बाँझ दस्ताने पर डाल दिया.
  4. बाँझ शल्य चिकित्सा हुड के लिए माउस स्थानांतरण और एक आंशिक सही पार्श्व decubitus स्थिति में जगह है.
  5. पेपर टेप के साथ अंगों को सुरक्षित करें।
    नोट: पूरी प्रक्रिया में उपकरणों का उचित उपयोग महत्वपूर्ण है। संदंश, Castroviejo कैंची, और वैक्यूम पिकअप उपकरण पकड़ करने के लिए कैसे के उदाहरण चित्रा 2A-सी में दिखाए जाते हैं.
  6. एंटीसेप्टिक (चित्रा 2 डी) के साथ पेट बाँझ।
  7. पशु पूरी तरह से एक पैर की अंगुली चुटकी परीक्षण प्रदर्शन से संवेदनाहारी है सुनिश्चित करें.
  8. संदंश और Castroviejo कैंची (चित्रा 2E) का उपयोग कर त्वचा में एक 10-15 मिमी छोड़ दिया subcostal चीरा बनाओ.
  9. कपास झाड़ू या एक दाग़ना पेन का उपयोग करके हेमोस्टेसिस को नियंत्रित करें जब / जहां आवश्यक समझा जाए।
  10. ध्यान से संदंश और Castroviejo कैंची के साथ अंतर्निहित मांसपेशियों को विभाजित पेरिटोनियम (चित्रा 2F) में प्रवेश करने के लिए.
  11. बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करके, अग्न्याशय और प्लीहा को atraumatically बाहरी करें।
  12. अग्न्याशय बाहर खेलना ताकि कोई सिलवटों (चित्रा 2 जी) कर रहे हैं.
  13. अग्न्याशय (रक्त वाहिकाओं से दूर) के शरीर या पूंछ में वांछित ट्यूमर इंजेक्शन साइट की पहचान करें।
  14. महत्वपूर्ण कदम: अग्न्याशय की सावधानीपूर्वक स्थिति के बाद, ऊतक को तनाव प्रदान करने के लिए संदंश का उपयोग करें और इंसुलिन सिरिंज टिप डालें, ऊपर की ओर बेवल के साथ, अग्न्याशय की वांछित साइट में 4-5 मिमी(चित्रा 2एच)की गहराई तक।
  15. धीरे-धीरे ट्यूमर सेल समाधान इंजेक्षन. एक छोटे बुलबुले की तलाश करें जो एक सफल इंजेक्शन (चित्रा 2I) की पुष्टि करता है।
  16. ध्यान से ट्यूमर सेल इंजेक्शन बुलबुला (चित्रा 2J) परेशान किए बिना पेट के लिए अग्न्याशय वापसी.
  17. शोषक 5-0 polydioxanone टांके का प्रयोग, पहले मांसपेशियों की परत बंद और फिर बाधित टांके (चित्रा 2K-एन) के साथ त्वचा.
  18. सायनोएक्रिलेट गोंद (चित्रा 2 ओ) के साथ चीरा को कवर करें, फिर वसूली के लिए एक हीटिंग लैंप के नीचे एक साफ पिंजरे में माउस लौटें। संक्रमण को रोकने के लिए पीने के पानी में एंटीबायोटिक्स का प्रशासन करें। चूहों की निगरानी करें और उन्हें सर्जरी से पूरी तरह से ठीक होने दें।
    नोट: एंटीबायोटिक्स को IACUC प्रोटोकॉल द्वारा आवश्यकतानुसार प्रशासित किया जाता है। सभी जानवरों को व्यक्तिगत रूप से रखा जाता है।
  19. ट्यूमर को 10-14 दिनों तक विकसित होने दें जब तक कि यह पेट की दीवार के माध्यम से स्पष्ट न हो।

4. अग्न्याशय की खिड़की की सर्जरी

  1. जब जानवरों इमेजिंग के लिए तैयार हैं, खिड़की आरोपण सर्जरी शुरू. शुरू करने के लिए, एंटीसेप्टिक साबुन से हाथ धोएं।
  2. हर नई सर्जरी से पहले, ताजा बाँझ दस्ताने पर डाल दिया.
  3. गर्म शल्य चिकित्सा स्टैंड पर, बाएं पेट बेनकाब करने के लिए सही पार्श्व decubitus स्थिति में माउस जगह है.
  4. माउस के सामने और हिंद अंगों को गर्म शल्य चिकित्सा चरण में लंगर डालें और पेपर टेप का उपयोग करके पुच्छीय रूप से। तिल्ली (त्वचा के नीचे) शल्य चिकित्सा क्षेत्र (चित्रा 3 ए) के भीतर दिखाई दे रहा है सुनिश्चित करें.
  5. बाँझपन बनाए रखने के लिए, हुड में सभी सर्जिकल उपकरणों को अनपैकेज करें।
  6. एंटीसेप्टिक के एक उदार आवेदन के साथ माउस की त्वचा swabbing द्वारा शल्य साइट कीटाणुरहित.
  7. पशु पूरी तरह से एक पैर की अंगुली चुटकी परीक्षण प्रदर्शन से संवेदनाहारी है सुनिश्चित करें.
  8. महत्वपूर्ण कदम: संदंश के साथ पेट के बाएं ऊपरी चतुर्थांश की त्वचा लिफ्ट और Castroviejo कैंची(चित्रा 3B,C)का उपयोग कर त्वचा और मांसलता में एक ~ 10 मिमी परिपत्र चीरा बनाने.
  9. रक्तस्राव को नियंत्रित करें और जहां आवश्यक हो, कपास झाड़ू या दाग़ना कलम का उपयोग करके हेमोस्टेसिस बनाए रखें।
  10. अग्न्याशय का स्थानीयकरण करें, जो प्लीहा से जुड़ा हुआ है, और उस दिशा की पहचान करें जो अग्न्याशय चीरा के भीतर बिछा रहा है ताकि यह तय किया जा सके कि सहायक क्रॉस-सिलाई कहाँ रखी जानी चाहिए।
  11. 5-0 रेशम सिवनी का उपयोग करके, मांसपेशियों की परत में वांछित स्थान पर पहली सिलाई रखें। इस छोर को 3-5 समुद्री मील से बांधें। (चित्र 3D, E)
  12. चीरे पर सीधे सिलाई करना जारी रखें। कट और ~ 5 सेमी (चित्रा 3F) की एक पूंछ छोड़ दें.
  13. पहली सिलाई (चित्रा 3 जी, एच) के लंबवत चरण 4.11 और 4.12 दोहराएं।
  14. महत्वपूर्ण कदम: धीरे लिफ्ट और पार सिलाई (चित्रा 3I, जे) पर अग्न्याशय की स्थिति. ध्यान रखें कि हेरफेर के दौरान अग्न्याशय को नुकसान न पहुंचे।
  15. महत्वपूर्ण कदम: 5-0 रेशम सिवनी का उपयोग करके, छेद से ~ 1 मिमी एक पर्स-स्ट्रिंग सिलाई करें, परिधि से, त्वचा और मांसपेशियों की परत (चित्रा 3K)को इंटरलेसिंग करें।
  16. खिड़की के फ्रेम की स्थिति बनाएं ताकि गोलाकार चीरा के किनारों को खिड़की के खांचे (चित्रा 3L) के भीतर बैठाया जा सके।
  17. 5-0 रेशम को मजबूती से बांधकर प्रत्यारोपित खिड़की को जकड़ें।
  18. 1 एमएल सिरिंज में तरल साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला 100 माइक्रोन लोड करें।
  19. ~ 10 एस के लिए संपीड़ित हवा का एक नाजुक प्रवाह लागू करके ऊतक सूखी.
  20. संदंश के साथ अपने बाहरी किनारे से खिड़की के फ्रेम पकड़ो और धीरे खिड़की के फ्रेम के नीचे की सतह से अग्न्याशय की जुदाई सुनिश्चित करने के लिए इसे बढ़ाने.
  21. महत्वपूर्ण कदम: खिड़की के अवकाश के साथ तरल साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला की एक पतली परत फैलाएं (चित्र 3M)। सुनिश्चित करें कि अग्न्याशय के ऊतकों पर कोई भी चिपकने वाला न हो।
  22. वैक्यूम पिकअप का उपयोग करके, 5 मिमी कवरस्लिप उठाएं।
  23. ध्यान से ऑप्टिकल खिड़की फ्रेम के केंद्र में अवकाश के अंदर coverslip जगह है. हल्के दबाव के साथ पकड़ो, साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला सेट (~ 25 एस) की अनुमति देता है।
  24. संदंश का उपयोग वैक्यूम पिकअप से coverslip अलग.
  25. अग्न्याशय को कवरस्लिप (चित्रा 3N,O) को सुरक्षित करने के लिए क्रॉस-सिलाई टांके कस लें। नोट: क्रॉस-सिलाई को अधिक कसने न दें क्योंकि इससे अग्न्याशय को नुकसान और इस्किमिया हो सकता है।
  26. सिवनी के सिरों को काटें।
  27. माउस से टेप को पट्टी करें।
  28. आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र बंद करें।
  29. माउस को एक साफ पिंजरे में या सीधे इंट्राविटल माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित करें।
  30. खिड़की की सर्जरी के बाद व्यक्तिगत रूप से जानवरों को घर दें और पूरी तरह से ठीक होने तक उनकी निगरानी करें।
  31. इमेजिंग तो हम पहले 22,23,24 लंबे इमेजिंग सत्र के लिए माउस शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक गर्म कक्ष में रखा गया है और IACUC मानकों के अनुसार समर्थन तरल पदार्थ के साथ प्रदान की है के रूप में लंबे इमेजिंग सत्र के रूप में एक दो लेजर multiphoton माइक्रोस्कोप पर किया जाता है.

5. अग्नाशयशोथ के प्रेरण के लिए सेरुलिन उपचार

  1. अग्नाशयशोथ की शुरुआत की जांच करने के लिए, SWIP के आरोपण के बाद सेरुलिन के साथ स्वस्थ चूहों का इलाज करें। सुनिश्चित करें कि चूहों 14-18 घंटे के लिए उपवास कर रहे हैं और cerulein प्रशासन से पहले विज्ञापन libitum पानी दिया.
  2. आठ इंजेक्शन तक के लिए 1 घंटे के अंतराल पर बाँझ 1x DPBS intraperitoneally के 100 μL में 50 μg/kg cerulein इंजेक्ट करें। अकेले 1x DPBS के बराबर मात्रा का प्रशासन करें, इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन, नियंत्रण चूहों को।
  3. इमेजिंग के बाद, IACUC मानकों के अनुसार गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पहले इंजेक्शन के बाद चूहों 24 घंटे बलिदान.
  4. एक दो लेजर multiphoton खुर्दबीन पर इमेजिंग प्रदर्शन के रूप में पहले 22,23,24 वर्णित. लंबे इमेजिंग सत्र के लिए, माउस को शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक गर्म कक्ष में रखें और इसे IACUC मानकों के अनुसार सहायक तरल पदार्थ प्रदान करें।

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Representative Results

चित्र 1, Du et al.15 से अनुकूलित, murine अग्न्याशय की एक समय-चूक IVI फिल्म से छवि चित्र दिखाता है। कुछ ऊतक गति प्रारंभिक बसने की अवधि (इमेजिंग के पहले घंटे, चित्रा 1 ए) के भीतर देखा जा सकता है। हालांकि, इस बसने की अवधि (>75 मिनट) के बाद निरंतर इमेजिंग के साथ, हमने पार्श्व और अक्षीय स्थिरता(चित्रा 1बी)में वृद्धि देखी। पिछली AIW और PIW इमेजिंग विंडो के साथ SWIP की स्थिरता की तुलना से पता चलता है कि सभी विंडो को बसने के लिए प्रारंभिक अवधि की आवश्यकता होती है। हालांकि, एसडब्ल्यूआईपी ने समग्र रूप से बहाव के निम्नतम स्तर का प्रदर्शन किया और दीर्घकालिक इमेजिंग (चित्रा 1 सी-के) के लिए सबसे उपयुक्त है। छवियों को एक कस्टम-निर्मित मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप24 पर उत्पन्न किया गया था जो 880 एनएम पर रोशन था और एक जेड स्टैक-टी चूक (देखने के क्षेत्र [एफओवी] आकार = 340 x 340 माइक्रोन, पिक्सेल आकार 0.67 माइक्रोन) प्राप्त कर रहा था। लेजर शक्ति और photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) लाभ photobleaching और photodamageing को कम करते हुए संकेत को अधिकतम करने के लिए चुना गया.

अग्न्याशय ट्यूमर आरोपण और बाद में अग्न्याशय खिड़की सम्मिलन का वर्णन शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के कदम क्रमशः चित्रा 2 और चित्रा 3 में दर्शाया गया है. महत्वपूर्ण रूप से, दोनों सर्जरी उत्तरजीविता सर्जरी हैं। एक बार सही ढंग से प्रत्यारोपित होने के बाद, अग्न्याशय ऑप्टिकल विंडो से जुड़ा रहेगा, जो अब पेट की दीवार के भीतर एकीकृत है। यह माउस के आरामदायक अस्तित्व के लिए अनुमति देता है और प्रोटोकॉल द्वारा अनुमति के रूप में 12 घंटे तक निरंतर इमेजिंग को सक्षम बनाता है। इसके अतिरिक्त, सीरियल इमेजिंग समय के साथ ब्याज के क्षेत्रों की निगरानी के लिए लगातार कई दिनों (2 सप्ताह के प्रोटोकॉल भत्ते तक) पर आयोजित किया जा सकता है. इंट्रावाइटल इमेजिंग (आईवीआई) को खिड़की के माध्यम से पहले वर्णित अन्य खिड़कियों के समान तरीके से किया जा सकता है,22,25,26।

एसडब्ल्यूआईपी का उपयोग सेरुलिन का उपयोग करके प्रेरित तीव्र अग्नाशयशोथ की शुरुआत में गतिशीलता की जांच करने के लिए किया जा सकता है। सेरुलिन कोलेसीस्टोकिनिन (सीकेके) के समान संरचना और कार्य के साथ एक ऑलिगोपेप्टाइड है और कृन्तकों27 में प्रयोगात्मक रूप से तीव्र अग्नाशयशोथ को प्रेरित करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। सेरुलिन के साथ उपचार जठरांत्र संबंधी मार्ग में चिकनी मांसपेशियों के संकुचन में परिणाम और गैस्ट्रिक और अग्नाशयी स्राव28 को उत्तेजित करता है. इसके अलावा, सेरुलिन के इंट्रापेरिटोनियल प्रशासन से अग्न्याशय की सूजन और वृद्धिहोती है 29.

चित्रा 4 एसडब्ल्यूआईपी प्रोटोकॉल का उपयोग करके, सेरुलिन उपचार के बाद म्यूरिन अग्न्याशय की धारावाहिक इमेजिंग दिखाता है। murine अग्न्याशय आनुवंशिक फ्लोरोसेंट लेबलिंग का उपयोग कर एकल कोशिका संकल्प पर कल्पना की है (ECFP लेबल epithelia-MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP ट्रांसजेनिक चूहों), और उच्च आणविक वजन रंगों के प्रशासन (155 kD dextran-TMR) स्थानीय vasculature को परिभाषित करने के लिए, ठोस पीले रंग की रेखाओं द्वारा निरूपित. खिड़की डिजाइन, murine फेफड़े इमेजिंग8 के लिए पहले इस्तेमाल किया, फ्रेम (चित्रा 4, इनसेट) जो microcartography30 के उपयोग की अनुमति देते हैं कि प्रत्ययी मार्कर के रूप में कार्य पर तीन etched लाइनों में शामिल हैं. माइक्रोकार्टोग्राफी कई दिनों में murine अग्न्याशय के हित के एक ही क्षेत्र के धारावाहिक इमेजिंग की अनुमति देता है। यहाँ अग्न्याशय (पीले धराशायी लाइनों) के एक ही लोब्यूल दिन 1 पर कल्पना की है और एक ही स्थानीय रक्त वाहिकाओं (चित्रा 4) की उपस्थिति से सबूत के रूप में, दिन 2 पर relocalized है. छवियाँ ~ 1 टुकड़ा / एस पर 11 स्लाइस और 2 माइक्रोन कदम आकार के साथ एक एकल जेड ढेर के रूप में प्रत्येक दिन अधिग्रहित किया गया, 880 एनएम रोशनी, और 0.67 माइक्रोन / पिक्सेल (एफओवी = 340 एक्स 340 माइक्रोन) के संकल्प के संकल्प. लेजर शक्ति और पीएमटी लाभ संकेत को अधिकतम करने के लिए चुना गया, जबकि photobleaching और photodamageing को कम करने.

सीरियल इमेजिंग के अलावा, एसडब्ल्यूआईपी दीर्घकालिक अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जो नियंत्रण और उपचार स्थितियों के तहत उपकोशिकीय संरचनाओं (जैसे रिक्तिकाओं) की गतिशीलता की सटीक ट्रैकिंग और माप को सक्षम करता है। यहां, रिक्तिकाएं ऐसे क्षेत्र हैं जहां साइटोप्लाज्मिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन को बाहर रखा जाता है, जिससे अंधेरे बिना लेबल वाले छेद दिखाई देते हैं(चित्र 5ए)। आरओआई ट्रैकर24 जैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके रिक्तिकाएं चिह्नित करना, रिक्तिका गतिशीलता (चित्रा 5ए, बी) के दृश्य और कई गतिशीलता मापदंडों की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, पीबीएस उपचार (0.37 ± 0.07 माइक्रोन/मिनट बनाम 0.41 ± 0.09 माइक्रोन/मिनट, पी = 0.02) (चित्रा 5सी) की तुलना में अग्नाशयशोथ को प्रेरित करने के लिए सेरुलिन के साथ उपचार के बाद म्यूरिन अग्न्याशय में रिक्तिकाएं की औसत गति लगभग 10% बढ़ गई। सेरुलिन उपचार ने उप-सेलुलर संरचनाओं की औसत मोड़ आवृत्ति को 10% बनाम पीबीएस उपचार (2.3 ± 0.3 डिग्री/मिनट बनाम 2.6 ± 0.6 डिग्री/मिनट, पी = 0.04) (चित्रा 5एफ) में भी बढ़ा दिया। हालांकि, शुद्ध गति, दिशात्मकता, या सेरुलिन उपचार और पीबीएस उपचार(चित्रा 5डी, ई और चित्रा 5जी) के बीच यात्रा की गई संचयी दूरी में कोई महत्वपूर्ण अंतर (पी > 0.05) नहीं था। छवियाँ एक कस्टम-निर्मित मल्टीफोटन माइक्रोस्कोप24 पर उत्पन्न हुई थीं जो 880 एनएम पर रोशन थी और फ्रेम के बीच 2.9 मिनट के साथ जेड स्टैक-टी चूक (एफओवी आकार = 340 x 340 माइक्रोन, पिक्सेल आकार 0.67 माइक्रोन) प्राप्त कर रही थी, 2 माइक्रोन कदम आकार के साथ 11 स्लाइस, और ~ 1 टुकड़ा /

अंत में, SWIP दृश्य और ट्यूमर सेल प्रवास पर कब्जा सक्षम बनाता है. चित्रा 6 ए अभी भी एक समय चूक फिल्म (पूरक वीडियो एस 1 और पूरक वीडियो एस 2) से पता चलता है कि ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन वाले केपीसी ट्यूमर कोशिकाओं को डेंड्रा-2 लेबल केपीसी ट्यूमर कोशिकाओं के अग्न्याशय के भीतर प्रवास के बिना। समूहों में कोशिकाओं के सामूहिक प्रवास (चित्रा 6 बी और पूरक वीडियो एस 1) और एकल सेल माइग्रेशन (चित्रा 6 सी और पूरक वीडियो एस 2) दोनों को छोटी अवधि (<1 एच) में देखा जा सकता है। छवियाँ एक कस्टम-निर्मित मल्टीफोटन माइक्रोस्कोप 24 पर उत्पन्न हुई थीं जो 880 एनएम पर रोशन होती हैं और टाइल्स के बीच20% ओवरलैप के साथ 4 x 4 मोज़ेक-जेड स्टैक-टी लैप्स प्राप्त करती हैं (टाइल आकार = 340 x 340 माइक्रोन), फ्रेम के बीच 3.4 मिनट, 5 माइक्रोन कदम आकार के साथ 3 स्लाइस, और ~ 1 स्लाइस / लेजर शक्ति और पीएमटी लाभ संकेत को अधिकतम करने के लिए चुना गया, जबकि photobleaching और photodamageing को कम करने.

Figure 1
चित्रा 1: एसडब्ल्यूआईपी के कारण इमेजिंग की बेहतर स्थिरता। (ए) एसडब्ल्यूआईपी के माध्यम से चित्रित अग्न्याशय की टाइमलैप्स फिल्म के पहले 72 मिनट के भीतर से स्टिल्स। कुछ अक्षीय लेकिन बहुत कम पार्श्व बहाव देखा जा सकता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (बी) 72 मिनट के बाद निरंतर टाइमलैप्स इमेजिंग अक्षीय और पार्श्व स्थिरता का एक उच्च स्तर दिखाता है। (ए, बी) लाल = 155 केडीए टेट्रामेथिलरोडामाइन डेक्सट्रान-लेबल रक्त सीरम, सियान = सीएफपी-लेबल अग्नाशयी कोशिकाएं (एमएमटीवी-आईसीआरई / सीएजी-सीएसी-ईसीएफपी ट्रांसजेनिक चूहों) (सीई) (सी) एआईडब्ल्यू, (डी) पीआईडब्ल्यू, और (ई) एसडब्ल्यूआईपी के लिए इमेजिंग के पहले घंटे के दौरान अग्न्याशय इमेजिंग खिड़कियों में से प्रत्येक की पार्श्व स्थिरता की तुलना। (एफ-एच) (एफ) एआईडब्ल्यू, (जी) पीआईडब्ल्यू, और (एच) एसडब्ल्यूआईपी के लिए बाद के 150 मिनट के दौरान अग्न्याशय इमेजिंग में से प्रत्येक के पार्श्व स्थिरता की तुलना। इनसेट संबंधित भूखंडों के ज़ूम-इन दृश्य हैं। (आई-के) (I) AIW, (J) PIW, और (K) SWIP के लिए इमेजिंग के पहले 120 मिनट के लिए अग्न्याशय इमेजिंग खिड़कियों में से प्रत्येक की अक्षीय स्थिरता की तुलना। यह आंकड़ा Du et al. Open Biology 2022, DOI:10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273 से है। 15. संक्षिप्ताक्षर: SWIP = अग्न्याशय की इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए स्थिर खिड़की; AIW = पेट की इमेजिंग खिड़की; PIW = अग्न्याशय इमेजिंग खिड़की; सीएफपी = सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं (केपीसी) के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के सर्जरी प्रोटोकॉल का अवलोकन। (ए) सर्जिकल संदंश धारण करने के लिए कैसे का चित्रण. (बी) कास्त्रोविजो कैंची को पकड़ने का चित्रण। (सी) वैक्यूम पिकअप टूल को कैसे पकड़ना है, इसका चित्रण। (डी) त्वचा को साफ करना। (ई) त्वचा में चीरा। (एफ) मांसपेशियों में चीरा। (छ) स्प्लेड अग्न्याशय। (एच) इंजेक्शन की वांछित साइट में सुई का सम्मिलन। (I) एक बुलबुला (नीला तीर) बनाने वाले कैंसर सेल निलंबन का इंजेक्शन। (जे) अग्न्याशय पेरिटोनियल गुहा में लौट आया। (के, एल) एक बाधित रेशम सीवन के साथ मांसपेशियों की परत का समापन। (एम, एन) एक बाधित रेशम सिवनी के साथ त्वचा का समापन। (ओ) Cyanoacrylate गोंद चीरा करने के लिए लागू. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: अग्न्याशय की इमेजिंग के लिए स्थिर खिड़की की सर्जरी प्रोटोकॉल का अवलोकन। (ए) प्लीहा और संलग्न अग्न्याशय की पहचान। (बी, सी) त्वचा और मांसपेशियों में गोलाकार चीरा। एसी में लाल धराशायी रेखाएं प्लीहा की रूपरेखा को इंगित करती हैं जिसे पेट की दीवार और त्वचा के माध्यम से देखा जा सकता है। (डी, ई) क्रॉस-सिलाई टोकरी की पहली सिलाई रखी गई और मांसपेशियों की परत (ई, पीला तीर) में बंधी हुई। (एफ) सिलाई मांसपेशियों चीरा के विपरीत पक्ष के लिए जारी है, एक पूंछ (सफेद तीर) छोड़कर. (जी, एच) दूसरी सिलाई पहले के लंबवत रखी गई, एक छोर (पीले तीर) पर बंधी हुई और एक पूंछ (सफेद तीर) छोड़ दी। (मैं, जे) क्रॉस-सिलाई टोकरी में अग्न्याशय का प्लेसमेंट। (के) मांसपेशियों और त्वचा के माध्यम से परिधीय पर्स-स्ट्रिंग सिवनी। (एल) खिड़की के फ्रेम का प्रत्यारोपण। (एम) खिड़की के फ्रेम में गोंद का आवेदन। (एन) ग्लास कवरस्लिप का लगाव। (ओ) क्रॉस-सिलाई के पूंछ के सिरों को कड़ा कर दिया गया। (पी) पूरी तरह से प्रत्यारोपित एसडब्ल्यूआईपी। संक्षिप्त: SWIP = अग्न्याशय की इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए स्थिर खिड़की। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ऑप्टिकल विंडो के भीतर ब्याज के एक ही क्षेत्रों relocalize करने के लिए धारावाहिक इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया माइक्रोकार्टोग्राफी. म्यूरिन अग्न्याशय के एक क्षेत्र की इंट्रावाइटल इमेजिंग, माइक्रोकार्टोग्राफी का उपयोग करके लगातार 2 दिनों (डी 1-डी 2) में स्थानांतरित एक ही लोब्यूल दिखा रही है। पीली धराशायी रेखाएँ एक ही लोब्यूल की सीमाओं को रेखांकित करती हैं। ठोस रेखाएं एक ही रक्त वाहिकाओं को उजागर करती हैं (जैसा कि लुमेन के भीतर लाल लेबल वाले रक्त सीरम की उपस्थिति से स्पष्ट है) प्रत्येक लगातार दिन की पहचान की जाती है। लाल = 155 केडीए टेट्रामेथिलरोडामाइन डेक्सट्रान-लेबल रक्त सीरम, सियान = सीएफपी लेबल अग्नाशय कोशिकाओं (एमएमटीवी-आईसीई/सीएजी-सीएसी-ईसीएफपी ट्रांसजेनिक चूहों) (इनसेट) माइक्रोकार्टोग्राफी के लिए खरोंच के साथ एसडब्ल्यूआईपी की छवि। धारावाहिक इमेजिंग के दौरान ब्याज के क्षेत्रों को स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोकार्टोग्राफी का उपयोग खिड़की के फ्रेम (इनसेट) पर तीन etched लाइनों द्वारा अनुमति दी है. स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: उपकोशिकीय संकल्प और एसडब्ल्यूआईपी का उपयोग करके उपकोशिकीय गतिशीलता का माप। (ए) एकल कोशिकाओं (धराशायी पीले रूपरेखा) और इस तरह के रिक्तिकाएं के रूप में उपकोशिकीय संरचनाओं murine अग्न्याशय में समय के साथ SWIP के माध्यम से कल्पना की जा सकती है. इन रिक्तिकाओं के उदाहरण पीले तीरों द्वारा इंगित किए जाते हैं। SWIP इस प्रकार समय के साथ subcellular संरचनाओं (रंगीन रूपरेखा और प्रतिदीप्ति छवि पर मढ़ा पटरियों) की ट्रैकिंग की अनुमति देता है. इनसेट को एक पीले रंग के बॉक्स वाले क्षेत्र के ज़ूम-इन दृश्य में देखा जाता है जो तीन ट्रैक किए गए रिक्तिकाएं दिखाते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (बी) उपकोशिकीय संरचनाओं के प्रक्षेपवक्र, जैसे नाभिक और रिक्तिकाएं (ए में हाइलाइट की गईं), मूल बिंदु पर निर्देशांक के बदलाव के बाद। लाल धराशायी रेखा 1 घंटे (3.46 माइक्रोन) में औसत शुद्ध पथ से पता चलता है. (सी) औसत गति, (डी) शुद्ध पथ, (ई) दिशात्मकता, (एफ) औसत मोड़ आवृत्ति, और (जी) संचयी दूरी के गतिशील मापदंडों की मात्रा। लाल = 155 केडीए टेट्रामेथिलrhoडामाइन डेक्सट्रान-लेबल रक्त सीरम, सियान = सीएफपी-लेबल अग्नाशय कोशिकाओं (एमएमटीवी-आईसीई/सीएजी-सीएसी-ईसीएफपी ट्रांसजेनिक चूहों)। संक्षिप्ताक्षर: SWIP = अग्न्याशय की इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए स्थिर खिड़की; सीएफपी = सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एसडब्ल्यूआईपी के साथ सेल माइग्रेशन कैप्चर करना । (ए) पीडीएसी के ऑर्थोटोपिक रूप से इंजेक्शन माउस मॉडल में अग्न्याशय की एक टाइमलैप्स इंट्रावाइटल इमेजिंग फिल्म से एक स्थिर छवि। (बी) पूरक वीडियो एस 1 से अभी भी छवियां सामूहिक प्रवास (पीला तीर) से गुजरने वाले ट्यूमर कोशिकाओं का एक उदाहरण दिखा रही हैं। (सी) पूरक वीडियो S2 से अभी भी छवियों एक ट्यूमर सेल (पीला तीर) और एक मैक्रोफेज (लाल तीर) के एकल सेल प्रवास के उदाहरण दिखा रहा है. हरा = डेंड्रा2-लेबल ट्यूमर कोशिकाएं, नीला = सीएफपी-लेबल मैक्रोफेज, लाल = 155 केडीए टेट्रामेथिलरोडामाइन डेक्सट्रान-लेबल रक्त सीरम। स्केल बार = 50 माइक्रोन (ए), 15 माइक्रोन (बी, सी)। संक्षिप्ताक्षर: SWIP = अग्न्याशय की इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए स्थिर खिड़की; सीएफपी = सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन; PDAC = अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो एस 1: टाइमलैप्स इंट्रावाइटल इमेजिंग फिल्म चित्रा 6 बी के अनुरूप सामूहिक प्रवास से गुजरने वाले ट्यूमर कोशिकाओं को दिखाती है। हरा = डेंड्रा2-लेबल ट्यूमर कोशिकाएं, नीला = सीएफपी-लेबल मैक्रोफेज, लाल = 155 केडीए टेट्रामेथिलरोडामाइन डेक्सट्रान-लेबल रक्त सीरम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो एस 2: टाइमलैप्स इंट्राविटल इमेजिंग फिल्म चित्रा 6 सी के अनुरूप एकल सेल प्रवास से गुजरने वाले ट्यूमर कोशिकाओं को दिखाती है। हरा = डेंड्रा2-लेबल ट्यूमर कोशिकाएं, नीला = सीएफपी-लेबल मैक्रोफेज, लाल = 155 केडीए टेट्रामेथिलरोडामाइन डेक्सट्रान-लेबल रक्त सीरम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ वर्णित SWIP प्रोटोकॉल एक पार सिलाई टोकरी तकनीक का उपयोग करके अग्न्याशय ऊतक स्थिरीकरण की एक बेहतर विधि प्रदान करता है. प्रारंभिक पेट की इमेजिंग खिड़कियां (एआईडब्ल्यू) ने पेट के आंतरिक अंगों की इंट्राविटल इमेजिंग (आईवीआई) को सक्षम किया, लेकिन अग्न्याशय जैसे नरम ऊतकों की गति को पर्याप्त रूप से सीमित नहीं किया। जवाब में, पार्क एट अल ने एक अग्न्याशय इमेजिंग विंडो (PIW) विकसित की जिसमें एक क्षैतिज धातु शेल्फ शामिल है और ग्लास कवरस्लिप के साथ संपर्क बनाए रखते हुए अग्न्याशय ऊतक के बेहतर स्थिरीकरण की अनुमति देता है। हालांकि यह दृष्टिकोण पार्श्व स्थिरता में सुधार करता है, यह ठोस अग्नाशयी ट्यूमर की इमेजिंग को सीमित करता है क्योंकि उनका आकार शेल्फ और कवर ग्लास के बीच संकीर्ण स्थान से अधिक है। एसडब्ल्यूआईपी एक क्रॉस-सिलाई टोकरी के साथ अग्न्याशय को स्थिर करके, अक्षीय और पार्श्व आंदोलन दोनों को सीमित करके, जबकि बड़े (≤10 मिमी) ठोस ट्यूमर को समायोजित करने में सक्षम होने के कारण इस मुद्दे को संबोधित करता है।

AIW और PIW जैसी पिछली इमेजिंग विंडो के साथ SWIP की प्रत्यक्ष तुलना पहले15 आयोजित की गई थी। यह चित्र 1 में दिखाया गया है, जो ड्यू एट अल.15 से अनुकूलित है, जहां नाभिक या रक्त वाहिकाओं जैसे सेलुलर शारीरिक विशेषताओं को ट्रैक करके पार्श्व और अक्षीय बदलावों की मात्रा निर्धारित की गई थी। सभी इमेजिंग खिड़कियों इमेजिंग के लगभग पहले घंटे के दौरान बसने की अवधि के लिए एक की जरूरत का प्रदर्शन. इस समय के दौरान, SWIP की तुलना में AIW और PIW के साथ पार्श्व आंदोलन का एक उच्च स्तर देखा गया था। 2 घंटे की अवधि में SWIP की तुलना में AIW और PIW के साथ एक बड़ा अक्षीय बदलाव भी देखा गया। कुल मिलाकर, SWIP बहाव के निम्नतम स्तर प्रदर्शित किया और लंबी अवधि के इमेजिंग (≤12 घंटे) के लिए उपयुक्त है.

दुर्भाग्य से, अग्न्याशय एक अत्यधिक बिखरने वाला ऊतक है, और इस तरह, आईवीआई में उपयोग किए जाने वाले मल्टीफोटन माइक्रोस्कोप के लिए बिंदु प्रसार समारोह ऊतक में प्रवेश के साथ तेजी से अपमानित होता है। इस प्रकार, ऑप्टिकल खिड़कियों में से किसी के साथ इमेजिंग गहराई केवल ~ 30-60 माइक्रोन तक सीमित है. आईवीआई भी नमूने के लिए प्रकाश प्रेरित क्षति का जोखिम वहन करता है. यह 100 छवियों की एक समय श्रृंखला प्राप्त करने और photobleaching या photodamage के लक्षण के लिए देख द्वारा इमेजिंग सत्र की शुरुआत में परीक्षण किया जा सकता है. हमारे खुर्दबीन प्रणाली पर, हमने पाया कि नमूना पर ~ 15 मेगावाट की अधिकतम शक्ति का उपयोग ऊतक को प्रतिकूल रूप से प्रभावित किए बिना किया जा सकता है।

SWIP प्रोटोकॉल सामान्य स्वस्थ स्थितियों के साथ-साथ अग्नाशयशोथ और PDAC जैसे रोगग्रस्त राज्यों में murine अग्न्याशय के स्थिर, उच्च-रिज़ॉल्यूशन, एकल-सेल ऑप्टिकल IVI की अनुमति देता है। यह SWIP को लंबे समय तक इमेजिंग के लिए विशेष रूप से उपयोगी बनाता है, साथ ही साथ कई z स्लाइस (मल्टीफोटन और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की अंतर्निहित ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमताओं का लाभ उठाते हुए) कैप्चर करके 3D और 4D (3D + टाइम) इमेजिंग करने के लिए। एकल कोशिकाओं के विवो दृश्य और अग्न्याशय के सेलुलर घटकों के साथ उनकी बातचीत को सक्षम करके, उच्च-रिज़ॉल्यूशन आईवीआई अग्न्याशय के अंतर्निहित रोगों को समझने के लिए अमूल्य साबित होगा।

SWIP प्रोटोकॉल करने के लिए एक निश्चित स्तर की तकनीकी विशेषज्ञता आवश्यक है। हालांकि, उचित अभ्यास और प्रमुख चरणों पर ध्यान देने के साथ, प्रक्रिया को उच्च सफलता दर के साथ निष्पादित किया जा सकता है। घातक अग्न्याशय की छवि बनाने के लिए, पहले सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित ट्यूमर होना महत्वपूर्ण है। यह माउस के अग्न्याशय में murine अग्नाशयी कैंसर कोशिकाओं के निलंबन के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया जाता है। एक सफल इंजेक्शन मनाया जाता है जब अग्न्याशय के पैरेन्काइमा एक तरल पदार्थ से भरे बुलबुले में फुलाता है और पहले21 से विस्तार से वर्णित किया गया है. अधिकतम सफलता और अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि सेल निलंबन का न्यूनतम-से-कोई रिसाव न हो, क्योंकि रिसाव नाटकीय रूप से संभावित ट्यूमर के आकार को कम करेगा और साथ ही कार्सिनोमैटोसिस को जन्म देगा। इसके अतिरिक्त, अग्न्याशय एक अत्यधिक संवहनी अंग है, जिसमें कई शाखित रक्त वाहिकाएं होती हैं। किसी भी वाहिकाओं को खराब करने से बचना महत्वपूर्ण है क्योंकि इससे अग्न्याशय में रक्तस्राव और बाद में हेमेटोमा होगा और ट्यूमर के विकास को रोक दिया जाएगा। इस मॉडल में, हम एक syngeneic PDAC सेल लाइन KPC चूहों20 से व्युत्पन्न का इस्तेमाल किया है. यह प्रतिरक्षा-सक्षम चूहों में ट्यूमर engraftment की अनुमति देता है। अन्य syngeneic PDAC सेल लाइनों इस्तेमाल किया माउस के तनाव के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है. मानव पीडीएसी सेल लाइनों का भी उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, माउस तनाव प्रतिरक्षित किया जाना चाहिएसमझौता इतनी के रूप में ट्यूमर आरोपण की अस्वीकृति से बचने के लिए.

इस प्रोटोकॉल में इमेजिंग के दौर से गुजर ट्यूमर के आकार की जरूरत के रूप में संशोधित किया जा सकता है. यह एक बड़ा ट्यूमर प्राप्त करने के लिए या खिड़की के आरोपण से पहले ट्यूमर के विकास के समय का विस्तार करके murine अग्न्याशय में प्रत्यारोपित कैंसर कोशिकाओं की एक उच्च एकाग्रता का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है. इस अध्ययन में, हमने 106 केपीसी पीडीएसी कोशिकाओं को इंजेक्ट किया और एसडब्ल्यूआईपी को 10-14 दिनों के बाद प्रत्यारोपित किया, जब ट्यूमर स्पष्ट थे। क्रॉस-सिलाई टोकरी में ऊतक के उचित प्लेसमेंट का उपयोग करके इस एसडब्ल्यूआईपी प्रोटोकॉल द्वारा छोटे और बड़े ट्यूमर को भी समायोजित किया जा सकता है।

इमेजिंग खिड़की और अग्न्याशय के सुरक्षित प्लेसमेंट भी उच्च गुणवत्ता इमेजिंग प्राप्त करने के लिए और गति कलाकृतियों को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है. सामान्य murine अग्न्याशय बहुत आज्ञाकारी है और श्वास और आस-पास के पेरिस्टलसिस से आंदोलन के लिए प्रवण है। इसे संबोधित करने और इमेजिंग करते समय अग्न्याशय की स्थिरता को बढ़ाने के लिए, पहले से वर्णित क्रॉस-सिलाई टोकरी तकनीक का उपयोग31 किया जाता है। क्रॉस-सिलाई टोकरी को शरीर के स्नायुबंधन के उपयोग की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। ग्लास कवरस्लिप के खिलाफ ऊतक को पालना और निरंतर अक्षीय दबाव लागू करके, यह पार्श्व और अक्षीय गति दोनों को रोकता है। बड़े ठोस ट्यूमर से निपटने के दौरान, क्रॉस-सिलाई के समर्थन बिंदु और दिशा को इष्टतम समर्थन के लिए ट्यूमर के आकार और स्थिति को सर्वोत्तम रूप से समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

उप-इष्टतम इमेजिंग तब भी हो सकती है जब खिड़की के फ्रेम को माउस के पेट में अपर्याप्त रूप से प्रत्यारोपित किया जाता है। एक ढीले-ढाले खिड़की के फ्रेम से इमेजिंग कठिनाइयों और गति कलाकृतियों का कारण बन सकता है। एक उपयुक्त पर्स-स्ट्रिंग सिवनी त्वचा और पेट की दीवार के माध्यम से पेट के लिए खिड़की के फ्रेम को सुरक्षित करके इस मुद्दे को संबोधित कर सकती है। पर्स स्ट्रिंग को कसने पर अत्यधिक त्वचा की तह से बचने के लिए, सिलाई के कदम उन चरणों के बीच 5 मिमी से अधिक नहीं होने चाहिए जो ऊतक किनारे से 1 मिमी से अधिक नहीं रखे जाते हैं, जिससे खिड़की के फ्रेम के चारों ओर एक सुखद फिट सुनिश्चित होता है। पर्स-स्ट्रिंग सिवनी, क्रॉस-सिलाई टोकरी में अग्न्याशय की नियुक्ति और खिड़की के फ्रेम के आरोपण के बाद, एक अंतिम महत्वपूर्ण कदम खिड़की के फ्रेम के अवकाश के भीतर चिपकने वाला स्थान है। यह महत्वपूर्ण है कि इस चरण के दौरान, कोई चिपकने वाला अग्नाशय के ऊतकों से संपर्क नहीं करता है क्योंकि यह ऊतक को नुकसान पहुंचाएगा और इमेजिंग को भ्रमित करेगा। एक संभावित संशोधन जो अग्न्याशय के ऊतकों से संपर्क करने से गोंद को भी रख सकता है, कांच के कवरस्लिप को खिड़की के फ्रेम में गोंद करना है और पेट में सर्जिकल आरोपण से पहले दोनों को सूखने की अनुमति देना है।

एसडब्ल्यूआईपी, सभी इंट्राविटल इमेजिंग तकनीकों की तरह, ऊतक में अन्य कोशिकाओं और संरचनाओं के बारे में जानकारी प्रकट करने की क्षमता में सीमाएं हैं जिन्हें स्पष्ट रूप से लेबल नहीं किया गया है। हालांकि, फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ एसडब्ल्यूआईपी विंडो का संयोजन (जैसे ईसीएफपी-व्यक्त उपकला और डेंड्रा2-लेबल केपीसी कोशिकाओं के रूप में इस अध्ययन में) और फार्माकोलॉजिकल और / या ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों के साथ प्रोटीन या सेल राज्यों को नियंत्रित करना इन सीमाओं को समाप्त कर सकता है।

इसके अलावा, SWIP खिड़की डिजाइन में खिड़की के फ्रेम पर तीन नक्काशीदार लाइनें शामिल हैं, जो सीरियल इमेजिंग30 के दौरान ब्याज के क्षेत्रों को स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोकार्टोग्राफी के लिए फिड्यूशियल मार्कर के रूप में कार्य करती हैं। यह एक ही क्षेत्र को कई बार देखने में सक्षम बनाता है, यहां तक कि अचिह्नित ऊतक में भी।

सारांश में, SWIP का उपयोग सामान्य स्वस्थ अग्नाशयी ऊतक के साथ-साथ सौम्य और घातक अग्नाशय के रोगों जैसे अग्नाशयशोथ और PDAC में किया जा सकता है। एसडब्ल्यूआईपी का उपयोग करके इन राज्यों में सिंगल-सेल और उप-सेलुलर गतिशीलता पर कब्जा किया जा सकता है और शोधकर्ताओं को पीडीएसी में मेटास्टेटिक प्रसार जैसे महत्वपूर्ण शारीरिक घटनाओं को समझने में मदद कर सकता है। आईवीआई की बढ़ी हुई गुणवत्ता और स्थिरता में अग्न्याशय के पैथोफिज़ियोलॉजी और कोशिका जीव विज्ञान में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता है, जिससे यह एक आशाजनक और लाभकारी उपकरण बन जाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एवलिन लिपर चैरिटेबल फाउंडेशन, ग्रस-लिपर बायोफोटोनिक्स सेंटर, कैंसर रिसर्च के लिए इंटीग्रेटेड इमेजिंग प्रोग्राम, एक एनआईएच टी -32 फैलोशिप (CA200561), और रक्षा अग्नाशयी कैंसर अनुसंधान कार्यक्रम विभाग (पीसीएआरपी) अनुदान PA210223P1।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent Alconox Inc NA Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Passivation reagent
5 mm cover glass Electron Microscopy Sciences 72296-05 Round Glass Coverslips 
7% (w/v) solution of citric acid Sigma-Aldrich  251275 Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe BD 329410 Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin) Bayer (Santa Cruz Biotechnology) sc-362890Rx Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp McMaster-Carr 3349K51 Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL Covetrus North America 059122 Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors World Precision Instruments WP2220 Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse Jackson Laboratory 000664  C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution Durvet 7-45801-10258-3 Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister Falcon DPSJB-12 Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue Staples 234790-6 Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue Staples LOC1647358 Coverslip Glue
DPBS 1x Corning 21-031-CV DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit Harvard Apparatus 726067 Cautery Pen
Germinator 500 CellPoint Scientific GER 5287-120V Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical RS-5135  Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope NA NA See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software NA NA See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666-A  Kim Wipes
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit World Precision Instruments MOUSEKIT Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor Kent Scientific Corpo MSTAT Sensor-MSE Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite Kent Scientific SURGI-M04 Heated platform
Nair Hair Removal Lotion Amazon B001RVMR7K Depilatory Lotion
Oxygen TechAir OX TM Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 VWR 95056-872 Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x Life Technologies 10010-023 PBS
PhysioSuite System Kent Scientific PhysioSuite Heated Platform Controller
Puralube Henry Schein Animal Health 008897 Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs  Fisher Scientific 867WCNOGLUE Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL Denville Scientific Inc. P1125 100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich T1287-500MG Vascular Label
Window-fixturing plate NA NA Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame NA NA The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].

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References

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स्थिर खिड़की इंट्राविटल इमेजिंग murine अग्न्याशय अग्न्याशय शरीर क्रिया विज्ञान अग्नाशयशोथ अग्नाशयी Adenocarcinoma उच्च संकल्प इमेजिंग वास्तविक समय अवलोकन सेल गतिशीलता SWIP आरोपण प्रक्रिया स्वस्थ अग्न्याशय तीव्र अग्नाशयशोथ अग्नाशयी ट्यूमर आनुवंशिक रूप से लेबल कोशिकाओं फ्लोरोसेंट रंजक एकल कोशिका गतिशीलता उपकोशिकीय गतिशीलता सामूहिक प्रवासन सीरियल इमेजिंग ट्यूमर सेल प्रवासन मेटास्टेटिक बोझ PDAC
Murine अग्न्याशय के intravital इमेजिंग के लिए स्थिर खिड़की
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Petersen, J., Du, W., Adkisson, C., Gravekamp, C., Oktay, M. H., Condeelis, J., Panarelli, N. C., McAuliffe, J. C., Entenberg, D. Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas. J. Vis. Exp. (200), e65498, doi:10.3791/65498 (2023).

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