Stabiliseret vindue til intravital billeddannelse af murinbugspytkirtlen

Summary

Vi præsenterer en protokol til kirurgisk implantation af et stabiliseret indlagt optisk vindue til subcellulær opløsningsbilleddannelse af murinbugspytkirtlen, hvilket muliggør serielle og langsgående undersøgelser af den sunde og syge bugspytkirtel.

Abstract

Bugspytkirtlens fysiologi og patofysiologi er komplekse. Sygdomme i bugspytkirtlen, såsom pancreatitis og pancreas adenocarcinom (PDAC) har høj sygelighed og dødelighed. Intravital billeddannelse (IVI) er en kraftfuld teknik, der muliggør billeddannelse i høj opløsning af væv i både sunde og syge tilstande, hvilket muliggør observation i realtid af celledynamik. IVI i murinbugspytkirtlen giver betydelige udfordringer på grund af organets dybe viscerale og kompatible natur, hvilket gør det meget tilbøjeligt til skade og bevægelsesartefakter.

Beskrevet her er processen med implantation af Stabilized Window for Intravital billeddannelse af murine Pancreas (SWIP). SWIP tillader IVI af murinpancreasen i normale sunde tilstande under transformationen fra den sunde bugspytkirtel til akut pancreatitis induceret af cerulein og i ondartede tilstande såsom bugspytkirteltumorer. I forbindelse med genetisk mærkede celler eller administration af fluorescerende farvestoffer muliggør SWIP måling af enkeltcelle og subcellulær dynamik (herunder enkeltcelle og kollektiv migration) samt seriel billeddannelse af samme interesseområde over flere dage.

Evnen til at fange tumorcellemigration er af særlig betydning, da den primære årsag til kræftrelateret dødelighed i PDAC er den overvældende metastatiske byrde. Forståelse af den fysiologiske dynamik af metastaser i PDAC er et kritisk uopfyldt behov og afgørende for at forbedre patientprognosen. Samlet set giver SWIP forbedret billeddannelsesstabilitet og udvider anvendelsen af IVI i den sunde bugspytkirtel og ondartede bugspytkirtelsygdomme.

Introduction

Godartede og ondartede bugspytkirtelsygdomme er potentielt livstruende, med betydelige huller i forståelsen af deres patofysiologi. Pankreatitis-betændelse i bugspytkirtlen - er den tredje store årsag til gastrointestinale sygdomsrelaterede hospitalsindlæggelser og genindlæggelser i USA og er forbundet med betydelig sygelighed, dødelighed og socioøkonomisk byrde¹. Rangeret som den tredje førende årsag til kræftrelateret død 2, tegner pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) sig for de fleste pancreas maligniteter³ og varsler en dårlig 5-årig overlevelsesrate på kun 11%². Den hyppigste årsag til kræftrelateret dødelighed i PDAC er overvældende metastatisk byrde. Desværre har de fleste patienter metastatisk sygdom. Derfor er forståelse af metastasens dynamik i PDAC et kritisk uopfyldt behov inden for kræftforskning.

De mekanismer, der ligger til grund for inflammation og den metastatiske kaskade i bugspytkirtlen, er dårligt forstået. En stor bidragyder til dette hul i viden er manglende evne til at observere bugspytkirtlens cellulære dynamik in vivo. Direkte observation af disse cellulære dynamikker lover at afsløre kritiske mål for at udnytte og forbedre diagnosen og behandlingen af dem med bugspytkirtelsygdom.

Intravital imaging (IVI) er en mikroskopiteknik, der gør det muligt for forskere at visualisere og studere biologiske processer i levende dyr i realtid. IVI tillader høj opløsning, direkte visualisering af intracellulær og mikromiljømæssig dynamik in vivo og inden for det oprindelige miljø i den pågældende biologiske proces. Derfor tillader IVI in vivo observation af sunde og patologiske processer.

Moderne billeddannelsesmetoder til hele kroppen såsom MR, PET og CT giver fremragende udsigt over hele organer og kan afsløre patologier, selv før kliniske symptomer^{begynder 4}. De er imidlertid ikke i stand til at opnå enkeltcelleopløsning eller afsløre de tidligste stadier af sygdom-pancreatitis eller malignitet.

Tidligere forskning har brugt enkeltcelleopløsning IVI til at observere godartede og ondartede sygdomme i hud^5,6, bryst⁷, lunge⁸, lever⁹, hjerne 10 og bugspytkirteltumorer 11^, hvilket fører til indsigt i mekanismer for sygdomsprogression ¹². Imidlertid udgør murinbugspytkirtlen betydelige hindringer for at opnå enkeltcelleopløsning ved hjælp af IVI, primært på grund af dens dybe viscerale placering og høje overholdelse. Desuden er det et forgrenet, diffust fordelt organ i mesenteriet, der forbinder milten, tyndtarmen og maven, hvilket gør det udfordrende at få adgang til. Vævet er også meget følsomt over for bevægelse forårsaget af tilstødende peristaltik og åndedræt. Minimering af bevægelse af bugspytkirtlen er afgørende for enkeltcelleopløsningsmikroskopi, da bevægelsesartefakter af selv et par mikron kan sløre og forvrænge billeder, hvilket gør sporing af dynamikken i individuelle celler umulig¹³.

For at udføre IVI skal et abdominalt billeddannelsesvindue (AIW) implanteres kirurgisk ^9,11. For at implantere AIW kirurgisk sutureres en metalvinduesramme ind i abdominalvæggen. Derefter fastgøres det interessante organ til rammen ved hjælp af cyanoacrylatklæbemiddel. Selvom dette er tilstrækkeligt for nogle stive indre organer (f.eks. Lever, milt, stive tumorer), kompromitteres forsøg på billeddannelse af den sunde murinbugspytkirtel af suboptimal lateral og aksial stabilitet på grund af vævets kompatible tekstur og komplekse arkitektur¹⁴. For at løse denne begrænsning udviklede Park et ^al.14 et billedbehandlingsvindue specielt designet til den sunde bugspytkirtel. Dette Pancreas Imaging Window (PIW) minimerer indflydelsen af tarmbevægelse og vejrtrækning ved at inkorporere en vandret metalhylde inden for vinduesrammen lige under dæksedlen, stabilisere vævet og opretholde dets kontakt med dækglasset. Mens PIW giver øget lateral stabilitet, fandt vi, at dette vindue stadig demonstrerer aksial drift og desuden forhindrer billeddannelse af store faste tumorer på grund af det smalle mellemrum mellem metalhylden og coverslip¹⁵.

For at løse disse begrænsninger udviklede vi Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP), et implanterbart billeddannelsesvindue, der er i stand til at opnå stabil langsigtet billeddannelse af både den sunde og syge bugspytkirtel (figur 1)¹⁵. Her leverer vi en omfattende protokol til den kirurgiske procedure, der bruges til at implantere SWIP. Selvom det primære mål var at studere de dynamiske mekanismer, der er involveret i metastase, kan denne metode også bruges til at udforske forskellige aspekter af bugspytkirtelbiologi og patologi.

Protocol

Alle procedurer beskrevet i denne protokol er blevet udført i overensstemmelse med retningslinjer og forskrifter for brug af hvirveldyr, herunder forudgående godkendelse fra Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Passivering af vinduer

BEMÆRK: Passivering af rustfrit stål renser metallet for forurenende stoffer og skaber et tyndt oxidlag, der i høj grad øger metalets biokompatibilitet med blødt væv, selv ud over titanium¹⁶.

1. Start passiveringsprocessen ved at vaske de optiske vinduesrammer med en 1% (w/v) enzymatisk aktiv vaskemiddelopløsning.
2. Sænk rammerne i en 5% (w/v) natriumhydroxidopløsning ved 70 °C i 30 minutter inde i en glasbeholder.
3. Tag rammerne ud og skyl dem med deioniseret vand.
4. Sænk rammerne i en 7% (w/v) citronsyreopløsning ved 55 °C i 10 minutter i en ny glasbeholder.
5. Fjern rammerne og skyl dem med deioniseret vand igen.
6. Gentag trin 1.2, og skyl til sidst vinduesrammerne med deioniseret vand en sidste gang.

2. Forberedelse til tumorimplantation eller vindueskirurgi

BEMÆRK: Til undersøgelser af bugspytkirteltumorer skal tumorceller implanteres og få lov til at vokse til åbenlyse tumorer. For at visualisere tumorcellerne in vivo anbefales det at bruge celler, der er blevet genetisk ændret til at udtrykke fluorescerende proteiner såsom Dendra2. Brug af fluorescerende proteinetiketter, der er lyse, vil afbøde potentielle problemer med vævsautofluorescens. Andre potentielle fluorescerende proteiner, farvestoffer og genetisk kodede fluorescerende musemodeller, der kan anvendes, er blevet diskuteret andetsteds^17,18. For at forhindre kontaminering af det operative felt skal du udføre den kirurgiske procedure i en hætte eller laminært flowskab og sikre, at forskellige områder bruges til forberedelse, kirurgi og genopretning.

1. Før operationen steriliseres alle kirurgiske instrumenter i en autoklave og om nødvendigt anvendes en varm perlesterilisator til efterfølgende procedurer. Sørg for, at operationen anvender en spids-kun teknik.
2. Tænd for den opvarmede kirurgiske pude og perlesterilisator, og vent på, at den når den passende driftstemperatur. Varmepudens temperatur skal overvåges med et overfladetermometer for at undgå potentielle forbrændinger. Anbring en steril klud over varmepuden, hvis temperaturen ikke kan kontrolleres tilstrækkeligt.
   BEMÆRK: Kropstemperaturen under korte procedurer (≤20 min), såsom tumor- og vinduesimplantation, påvirkes minimalt, mens du bruger en opvarmet kirurgisk pude. Imidlertid kræver længere perioder med anæstesi, såsom under forlænget timelapse-billeddannelse, at musen placeres i et opvarmet kammer for at opretholde kropstemperaturen.
3. Bedøv musen med 5% isofluran i et anæstesikammer.
4. Kritisk trin: Sænk bedøvelsen til 2%, når musen er bevidstløs. Overvåg omhyggeligt anæstesiniveauet og musens vitalitet (f.eks. ved hjælp af et pulsoximeter)¹⁹.
5. Placer en lille dråbe øjensmøremiddel på hvert øje på musen for at forhindre hornhindetørring.
6. Før operationen skal du anvende hårfjerningscreme generøst på venstre øvre del af maven for at fjerne hår. Efter 20 sekunder skal du bruge fugtet silkepapir til at tørre håret og hårfjerningscremen fast. Gentag processen efter behov, indtil alt hår er fjernet fra det kirurgiske område.
7. Der injiceres 10 μL buprenorphin (0,1 mg/kg) fortyndet i 90 μL PBS subkutant for at sikre præoperativ analgesi.

3. Implantation af bugspytkirteltumor

1. Forbered alikvoter af tumorceller ved den ønskede koncentration (baseret på tumorcellefordoblingstid). Anbring cellesuspensionen i en insulinsprøjte og opbevar den på is. For at følge denne protokol skal du bruge 10⁶ syngeneiske KPC-tumorceller 20 suspenderet i maksimalt 50 μL PBS efter den ortopopiske injektionsprotokol tilpasset fra Erstad et^al.21
   BEMÆRK: Denne cellelinje injiceret ved denne koncentration producerede rutinemæssigt håndgribelige eller passende store tumorer med 10-14 dage. Subkloner af denne cellelinje og andre bugspytkirtelcellelinjer skal evalueres for passende koncentrationer og tidslinjer for at producere tumorer af passende størrelse).
2. Vask hænder med antiseptisk sæbe.
3. Før hver ny operation skal du tage nye sterile handsker på.
4. Overfør musen til den sterile kirurgiske hætte og placer den i en delvis højre lateral decubitusposition.
5. Fastgør lemmerne med papirtape.
   BEMÆRK: Korrekt brug af instrumenterne er vigtig under hele proceduren. Eksempler på, hvordan man holder pincet, Castroviejo-saks og vakuumopsamlingsværktøjet, er vist i figur 2A-C.
6. Steriliser maven med antiseptisk middel (figur 2D).
7. Sørg for, at dyret er fuldt bedøvet ved at udføre en tåklemmetest.
8. Lav et 10-15 mm venstre subkostalt snit i huden ved hjælp af tang og Castroviejo-saks (figur 2E).
9. Kontroller hæmostase ved hjælp af vatpinde eller en cautery pen, når / hvor det anses for nødvendigt.
10. Del forsigtigt den underliggende muskel med pincet og Castroviejo-saks for at komme ind i bughinden (figur 2F).
11. Ved hjælp af sterile bomuldspindler eksternaliseres bugspytkirtlen og milten atraumatisk.
12. Splay bugspytkirtlen ud, så der ikke er folder (figur 2G).
13. Identificer det ønskede tumorinjektionssted i kroppen eller halen af bugspytkirtlen (væk fra blodkarrene).
14. Kritisk trin: Efter omhyggelig placering af bugspytkirtlen skal du bruge tang til at give spænding til vævet og indsætte insulinsprøjtespidsen med skråningen opad i det ønskede sted i bugspytkirtlen til en dybde på 4-5 mm (figur 2H).
15. Injicer langsomt tumorcelleopløsningen. Se efter en lille boble, der bekræfter en vellykket injektion (figur 2I).
16. Returner forsigtigt bugspytkirtlen til maven uden at forstyrre tumorcelleinjektionsboblen (figur 2J).
17. Brug absorberbare 5-0 polydioxanon suturer til først at lukke muskellaget og derefter huden med afbrudte suturer (figur 2K-N).
18. Dæk snittet med cyanoacrylatlim (figur 2O), og returner derefter musen til et rent bur under en varmelampe til genopretning. Administrer antibiotika i drikkevand for at forhindre infektion. Overvåg musene og lad dem komme sig helt efter operationen.
    BEMÆRK: Antibiotika administreres som krævet af IACUC-protokollen. Alle dyr er opstaldet individuelt.
19. Lad tumoren udvikle sig i 10-14 dage, indtil den er håndgribelig gennem abdominalvæggen.

4. Bugspytkirtel vindue kirurgi

1. Når dyrene er klar til billeddannelse, skal du begynde vinduesimplantationsoperationen. Til at begynde med skal du vaske hænder med antiseptisk sæbe.
2. Før hver ny operation skal du tage friske sterile handsker på.
3. På det opvarmede kirurgiske stativ skal du placere musen i højre laterale decubitusposition for at udsætte venstre mave.
4. Forankr musens for- og bagben til det opvarmede kirurgiske stadium kranielt og kausalt ved hjælp af papirtape. Sørg for, at milten (under huden) er synlig inden for det kirurgiske felt (figur 3A).
5. For at opretholde sterilitet skal du pakke alle kirurgiske instrumenter ud i emhætten.
6. Desinficer det kirurgiske sted ved at pode musens hud med en generøs anvendelse af antiseptisk middel.
7. Sørg for, at dyret er fuldt bedøvet ved at udføre en tåklemmetest.
8. Kritisk trin: Løft huden på venstre øverste kvadrant af maven med pincet og lav et ~ 10 mm cirkulært snit i huden og muskulaturen ved hjælp af Castroviejo-saks (figur 3B, C).
9. Kontroller blødningen og vedligehold hæmostase ved hjælp af vatpinde eller cautery pen, hvor det er nødvendigt.
10. Lokaliser bugspytkirtlen, som er fastgjort til milten, og identificer den retning, bugspytkirtlen ligger inden for snittet for at bestemme, hvor den understøttende korssting skal placeres.
11. Brug 5-0 silkesutur til at placere det første sting på det ønskede sted i muskellaget. Bind denne ende med 3-5 knob. (Figur 3D,E)
12. Fortsæt med at sy direkte på tværs af snittet. Klip og efterlad en hale på ~5 cm (figur 3F).
13. Gentag trin 4.11 og 4.12 vinkelret på det første sting (figur 3G,H).
14. Kritisk trin: Løft og placer forsigtigt bugspytkirtlen over korsstingen (figur 3I, J). Pas på ikke at beskadige bugspytkirtlen under manipulation.
15. Kritisk trin: Brug 5-0 silkesuturen til at udføre en pungstrengsøm ~ 1 mm fra hullet, omkreds, sammenfletning af hud og muskellag (figur 3K).
16. Placer vinduesrammen, så kanterne af det cirkulære snit sidder inden for vinduets rille (figur 3L).
17. Fastgør det implanterede vindue ved at binde 5-0 silken fast.
18. Læg 100 μL flydende cyanoacrylatklæbemiddel i 1 ml sprøjten.
19. Tør vævet ved at påføre en delikat strøm af trykluft i ~ 10 s.
20. Lås vinduesrammen ved dens ydre kant med tang og hæv den forsigtigt for at sikre adskillelse af bugspytkirtlen fra vinduesrammens underside.
21. Kritisk trin: Dispenser et tyndt lag flydende cyanoacrylatklæbemiddel langs vinduets fordybning (figur 3M). Sørg for ikke at få noget af klæbemidlet på bugspytkirtelvævet.
22. Brug vakuumopsamlinger til at løfte 5 mm dæksel.
23. Placer forsigtigt dækslet inde i fordybningen i midten af den optiske vinduesramme. Hold med let tryk, så cyanoacrylatklæbemidlet kan hærde (~ 25 s).
24. Adskil dækselen fra vakuumopsamlingerne ved hjælp af tang.
25. Stram korsstingsuturerne for at fastgøre bugspytkirtlen tæt til dæksedlen (figur 3N, O). Bemærk: Stram ikke korsstingen for meget, da det kan forårsage skade og iskæmi i bugspytkirtlen.
26. Skær enderne af suturen.
27. Fjern båndet fra musen.
28. Sluk for isofluranfordamperen.
29. Flyt musen til et rent bur eller direkte til det intravitale mikroskop.
30. Opstald dyrene individuelt efter vinduesoperation og overvåg dem indtil fuld bedring.
31. Billeddannelse udføres derefter på et to-laser multifotonmikroskop, som vi tidligere har beskrevet ^22,23,24 For lange billeddannelsessessioner placeres musen i et opvarmet kammer for at opretholde kropstemperaturen og forsynes med understøttende væsker i henhold til IACUC-standarder.

5. Cerulein-behandling til induktion af pancreatitis

1. For at undersøge begyndelsen af pancreatitis skal du behandle raske mus med cerulein efter implantation af SWIP. Sørg for, at musene fastes i 14-18 timer og gives ad libitumvand før administration af cerulein.
2. 50 μg/kg cerulein injiceres i 100 μL steril 1x DPBS intraperitonealt med 1 times mellemrum til op til otte injektioner. Administrer et tilsvarende volumen på 1x DPBS alene, injiceret intraperitonealt, til kontrolmusene.
3. Efter billeddannelse ofres musene 24 timer efter den første injektion ved cervikal dislokation i henhold til IACUC-standarder.
4. Udfør billeddannelse på et to-laser multifotonmikroskop som tidligere beskrevet^22,23,24. Ved lange billeddannelsessessioner skal du placere musen i et opvarmet kammer for at opretholde kropstemperaturen og forsyne den med understøttende væsker i henhold til IACUC-standarder.

Representative Results

Figur 1, tilpasset fra Du et ^al.15, viser billedstillbilleder fra en time-lapse IVI-film af murinbugspytkirtlen. Nogle vævsbevægelser kan observeres inden for den indledende bundfældningsperiode (første times billeddannelse, figur 1A). Men med fortsat billeddannelse efter denne bundfældningsperiode (>75 min) observerede vi en stigning i lateral og aksial stabilitet (figur 1B). Sammenligningen af stabiliteten af SWIP med de tidligere AIW- og PIW-billedbehandlingsvinduer viser, at alle vinduer kræver en indledende periode til bundfældning. SWIP udviste imidlertid det laveste niveau af afdrift generelt og er bedst egnet til langtidsbilleddannelse (figur 1C-K). Billederne blev genereret på et specialbygget multifotonmikroskop 24, der lyser ved 880 nm og får et z stack-t lapse (synsfelt [FOV] størrelse = 340 x 340 μm, pixelstørrelse 0,67 μm) med 1,7 min mellem rammer, 11 skiver med en trinstørrelse på 2 μm,²⁰ billeddybde og ~ 1 skive / s. Lasereffekt og fotomultiplikatorrør (PMT) gevinster blev valgt for at maksimere signalet og samtidig minimere fotoblegning og fotoskader.

Trinene i de kirurgiske procedurer, der beskriver implantation af bugspytkirteltumor og efterfølgende indsættelse af bugspytkirtelvindue, er afbildet i henholdsvis figur 2 og figur 3. Det er vigtigt, at begge operationer er overlevelsesoperationer. Når den er korrekt implanteret, forbliver bugspytkirtlen anbragt i det optiske vindue, som nu er integreret i abdominalvæggen. Dette giver musen mulighed for komfortabel overlevelse og muliggør kontinuerlig billeddannelse i op til 12 timer, som tilladt af protokollen. Derudover kan seriel billeddannelse udføres over flere på hinanden følgende dage (op til protokoltillægget på 2 uger) for at overvåge interesseområder over tid. Intravital billeddannelse (IVI) kan udføres gennem vinduet på en måde, der ligner andre vinduer, der tidligere er beskrevet^22,25,26.

SWIP kan bruges til at undersøge dynamikken ved begyndelsen af akut pancreatitis induceret ved anvendelse af cerulein. Cerulein er et oligopeptid med struktur og funktion svarende til cholecystokinin (CKK) og anvendes i vid udstrækning til eksperimentelt at fremkalde akut pancreatitis hos gnavere²⁷. Behandling med cerulein resulterer i sammentrækning af den glatte muskulatur i mave-tarmkanalen og stimulerer mave- og bugspytkirtelsekretioner²⁸. Desuden fører intraperitoneal administration af cerulein til hævelse af bugspytkirtlen og udvidelse²⁹.

Figur 4 viser seriel billeddannelse af murinbugspytkirtlen efter ceruleinbehandling ved hjælp af SWIP-protokollen. Den murin bugspytkirtel visualiseres ved enkeltcelleopløsning ved hjælp af genetisk fluorescerende mærkning (ECFP mærket epitel-MMTV-iCre / CAG-CAC-ECFP transgene mus) og administration af højmolekylære farvestoffer (155 kD dextran-TMR) for at definere lokal vaskulatur, betegnet med de faste gule linjer. Vinduesdesignet, der tidligere blev brugt til murin lungebilleddannelse⁸, inkluderer tre ætsede linjer på rammen (figur 4, indsat), der fungerer som fiduciale markører, der tillader brug af mikrokartografi³⁰. Mikrokartografi tillader seriel billeddannelse af det samme interesseområde i murinbugspytkirtlen over flere dage. Her visualiseres den samme lobule i bugspytkirtlen (gule stiplede linjer) på dag 1 og relokaliseres på dag 2, som det fremgår af tilstedeværelsen af de samme lokale blodkar (figur 4). Billeder blev erhvervet hver dag som en enkelt z-stak med 11 skiver og 2 μm trinstørrelse ved ~ 1 skive / s, taget ved 880 nm belysning og opløsning på 0,67 μm / pixel (FOV = 340 x 340 μm). Lasereffekt og PMT-forstærkninger blev valgt for at maksimere signalet og samtidig minimere fotoblegning og fotoskader.

Ud over seriel billeddannelse er SWIP velegnet til langsigtet langsgående billeddannelse, hvilket muliggør nøjagtig sporing og måling af dynamikken i subcellulære strukturer (såsom vakuoler) under kontrol- og behandlingsbetingelser. Her er vakuoler regioner, hvor cytoplasmatiske fluorescerende proteiner udelukkes, hvilket får mørke umærkede huller til at dukke op (figur 5A). Mærkning af vakuoler ved hjælp af software som ROI Tracker²⁴ muliggør visualisering af vakuolmotilitet (figur 5A, B) og kvantificering af adskillige motilitetsparametre. For eksempel steg den gennemsnitlige hastighed af vakuoler i murinpancreaslen med ca. 10% efter behandling med cerulein for at inducere pancreatitis sammenlignet med PBS-behandling (0,37 ± 0,07 μm / min vs 0,41 ± 0,09 μm / min, p = 0,02) (figur 5C). Cerulein-behandling øgede også den gennemsnitlige drejningsfrekvens af subcellulære strukturer med 10% vs PBS-behandling (2,3 ± 0,3 grader / min vs 2,6 ± 0,6 grader / min, p = 0,04) (figur 5F). Der var imidlertid ingen signifikant forskel (p > 0,05) i nettohastighed, retningsvirkning eller kumulativ afstand mellem ceruleinbehandling og PBS-behandling (figur 5D, E og figur 5G). Billeder blev genereret på et specialbygget multifotonmikroskop²⁴, der lyser ved 880 nm og får et z stack-t lapse (FOV-størrelse = 340 x 340 μm, pixelstørrelse 0,67 μm) med 2,9 min mellem rammer, 11 skiver med en trinstørrelse på 2 μm og ~ 1 skive / s.

Endelig muliggør SWIP visualisering og indfangning af tumorcellemigration. Figur 6A viser et stillbillede fra en time-lapse-film (Supplemental Video S1 og Supplemental Video S2) af migrationen i bugspytkirtlen af Dendra-2 mærket KPC-tumorceller, der blev ortopisk injiceret. Både kollektiv migration af celler i klynger (figur 6B og supplerende video S1) og enkeltcellemigration (figur 6C og supplerende video S2) kan observeres over korte perioder (<1 timer). Billeder blev genereret på et specialbygget multifotonmikroskop 24, der lyser ved 880 nm og erhverver en 4 x 4 mosaik-z stack-t bortfald med²⁰% overlapning mellem fliser (flisestørrelse = 340 x 340 μm), 3,4 min mellem rammer, 3 skiver med en 5 μm trinstørrelse og ~ 1 skive / s. Lasereffekt og PMT-forstærkninger blev valgt for at maksimere signalet og samtidig minimere fotoblegning og fotoskader.

Figur 1: Forbedret stabilitet af billeddannelse på grund af SWIP. (A) Stillbilleder fra inden for de første 72 minutter af en timelapse-film af bugspytkirtlen afbildet gennem SWIP. Nogle aksiale, men meget lidt lateral drift kan observeres. Skalastænger = 50 μm. (B) Fortsat timelapsed billeddannelse efter 72 min viser et højt niveau af aksial og lateral stabilitet. (A,B) Rød = 155 kDa tetramethylrhodamin dextran-mærket blodserum, Cyan = CFP-mærkede bugspytkirtelceller (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgene mus) (C-E) Sammenligning af den laterale stabilitet af hvert af bugspytkirtelbilleddannelsesvinduerne i løbet af den første times billeddannelse for (C) AIW, (D) PIW og (E) SWIP. (F-H) Sammenligning af den laterale stabilitet af hver af bugspytkirtelbilleddannelserne i løbet af de efterfølgende 150 minutter for (F) AIW, (G) PIW og (H) SWIP. Justeringer er zoomede visninger af de tilsvarende plot. (I-K) Sammenligning af den aksiale stabilitet af hvert af bugspytkirtelbilleddannelsesvinduerne i de første 120 minutters billeddannelse for (I) AIW, (J) PIW og (K) SWIP. Dette tal er fra Du et al. Open Biology 2022, DOI:10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273. ¹⁵. Forkortelser: SWIP = stabiliseret vindue til intravital billeddannelse af bugspytkirtlen; AIW = abdominal billeddannelsesvindue; PIW = billedbehandlingsvindue i bugspytkirtlen; CFP = cyanfluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Oversigt over operationsprotokollen for ortopisk injektion af pancreas ductal adenocarcinomceller (KPC). (A) Illustration af, hvordan man holder kirurgiske tang. (B) Illustration af, hvordan man holder Castroviejo-saksen. (C) Illustration af, hvordan vakuumopsamlingsværktøjet holdes. (D) Desinficering af huden. E) Indsnit i huden. (F) Indsnit i musklen. g) Spredt bugspytkirtel. (H) Indsættelse af nålen på det ønskede injektionssted. (I) Injektion af kræftcellesuspension, der skaber en boble (blå pil). (J) Bugspytkirtlen vendte tilbage til bughulen. (K,L) Lukning af muskellaget med en afbrudt silkesutur. (M,N) Lukning af huden med en afbrudt silkesutur. (O) Cyanoacrylatlim påført snit. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Oversigt over operationsprotokollen for det stabiliserede vindue til billeddannelse af bugspytkirtlen . (A) Identifikation af milt og vedhæftet bugspytkirtel. (B,C) Cirkulært snit i hud og muskler. Røde stiplede linjer i A-C angiver omridset af milten, der kan ses gennem bugvæggen og huden. (D,E) Første sting af korsstingkurv placeret og bundet i muskellaget (E, gul pil). (F) Sting fortsættes til den modsatte side af muskelsnittet og efterlader en hale (hvid pil). (G,H) Anden søm placeret vinkelret på den første, bundet i den ene ende (gule pile) og efterlader en hale (hvide pile). (I,J) Placering af bugspytkirtlen i korsstingkurven. (K) Omkreds pungstrengsutur gennem muskler og hud. (L) Implantation af vinduesrammen. (M) Påføring af lim på vinduesrammen. (N) Fastgørelse af glasdæksel. (O) Tværstingets haleender strammes. (P) Fuldstændigt implanteret SWIP. Forkortelse: SWIP = stabiliseret vindue til intravital billeddannelse af bugspytkirtlen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Mikrokartografi, der bruges til seriel billeddannelse til at flytte de samme interesseområder inden for det optiske vindue. Intravital billeddannelse af en enkelt region af murin bugspytkirtel, der viser den samme lobule flyttet over 2 på hinanden følgende dage (D1-D2) ved hjælp af mikrokartografi. Gule stiplede linjer skitserer grænserne for den samme lobule. De faste linjer fremhæver de samme blodkar (som det fremgår af tilstedeværelsen af rødt mærket blodserum i lumen), der identificeres hver på hinanden følgende dag. Rød = 155 kDa tetramethylrhodamin dextran-mærket blodserum, Cyan = CFP-mærkede bugspytkirtelceller (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgene mus) (Indsat) Billede af SWIP med ridser til mikrokartografi. Brug af mikrokartografi til at flytte områder af interesse under seriel billeddannelse er tilladt af de tre ætsede linjer på vinduesrammen (indsats). Skalabjælker = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Subcellulær opløsning og måling af subcellulær dynamik ved hjælp af SWIP. (A) Enkeltceller (stiplede gule konturer) og subcellulære strukturer såsom vakuoler kan visualiseres gennem SWIP over tid i murinbugspytkirtlen. Eksempler på disse vakuoler er angivet med gule pile. SWIP tillader således sporing af subcellulære strukturer (farvede konturer og spor overlejret på fluorescensbilledet) over tid. Der er zoomet ind på et gult område med bokse, der viser tre sporede vakuoler. Skalabjælke = 50 μm. (B) Baner af subcellulære strukturer, såsom kerner og vakuoler (fremhævet i A), efter et skift af koordinater til oprindelsespunktet. Rød stiplet linje viser den gennemsnitlige nettosti i 1 time (3,46 μm). Kvantificering af de dynamiske parametre C) gennemsnitshastighed, D) nettobane, E) direktionalitet, F) gennemsnitlig vendefrekvens og G) kumulativ afstand. Rød = 155 kDa tetramethylrhodamin dextran-mærket blodserum, Cyan = CFP-mærkede bugspytkirtelceller (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgene mus). Forkortelser: SWIP = stabiliseret vindue til intravital billeddannelse af bugspytkirtlen; CFP = cyanfluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Registrering af celleoverførsel med SWIP . (A) Et stillbillede fra en timelapsed intravital billeddannelsesfilm af bugspytkirtlen i en ortopisk injiceret musemodel af PDAC. (B) Stillbilleder fra supplerende video S1 , der viser et eksempel på tumorceller, der gennemgår kollektiv migration (gul pil). (C) Stillbilleder fra supplerende video S2 , der viser eksempler på enkeltcellemigration af en tumorcelle (gul pil) og en makrofag (rød pil). Grøn = Dendra2-mærkede tumorceller, Blå = CFP-mærkede makrofager, Rød = 155 kDa tetramethylrhodamin dextran-mærket blodserum. Skalastænger = 50 μm (A), 15 μm (B, C). Forkortelser: SWIP = stabiliseret vindue til intravital billeddannelse af bugspytkirtlen; CFP = cyanfluorescerende protein PDAC = pancreas adenocarcinom. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende video S1: Timelapse intravital billeddannelsesfilm, der viser tumorceller, der gennemgår kollektiv migration svarende til figur 6B. Grøn = Dendra2-mærkede tumorceller, Blå = CFP-mærkede makrofager, Rød = 155 kDa tetramethylrhodamin dextran-mærket blodserum. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video S2: Timelapse intravital billeddannelsesfilm, der viser tumorceller, der gennemgår enkeltcellemigration svarende til figur 6C. Grøn = Dendra2-mærkede tumorceller, Blå = CFP-mærkede makrofager, Rød = 155 kDa tetramethylrhodamin dextran-mærket blodserum. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

SWIP-protokollen beskrevet her giver en forbedret metode til stabilisering af bugspytkirtelvæv ved at anvende en korsstingskurvteknik. Tidlige abdominale billeddannelsesvinduer (AIW'er) muliggjorde intravital billeddannelse (IVI) af indre organer i maven, men begrænsede ikke tilstrækkeligt bevægelsen af blødt væv såsom bugspytkirtlen. Som svar udviklede Park et al. et bugspytkirtelbilleddannelsesvindue (PIW), der indeholder en vandret metalhylde og muliggør forbedret stabilisering af bugspytkirtelvævet, samtidig med at kontakten med glasdækslet opretholdes. Mens denne tilgang forbedrer lateral stabilitet, begrænser den billeddannelse af solide bugspytkirteltumorer, fordi deres størrelse overstiger det smalle rum mellem hylden og dækglasset. SWIP løser dette problem ved at stabilisere bugspytkirtlen med en korsstingkurv, der begrænser både aksial og lateral bevægelse, samtidig med at den er i stand til at rumme store (≤10 mm) solide tumorer.

Direkte sammenligninger af SWIP med tidligere billedbehandlingsvinduer såsom AIW og PIW blev udført tidligere¹⁵. Dette er vist i figur 1, tilpasset fra Du et ^al.15, hvor laterale og aksiale skift blev kvantificeret ved at spore cellulære anatomiske træk såsom kerner eller blodkar. Alle billedvinduer udviste et behov for en periode med afregning i løbet af ca. den første times billeddannelse. I løbet af denne tid blev der observeret en højere grad af lateral bevægelse med AIW og PIW sammenlignet med SWIP. Et større aksialt skift blev også set med AIW og PIW sammenlignet med SWIP over en periode på 2 timer. Samlet set viste SWIP det laveste niveau af drift og er velegnet til langtidsbilleddannelse (≤12 timer).

Desværre er bugspytkirtlen et stærkt spredende væv, og som sådan nedbrydes punktspredningsfunktionen for multifotonmikroskopet, der anvendes i IVI, hurtigt med penetration i vævet. Således er billeddybden med et hvilket som helst af de optiske vinduer begrænset til kun ~ 30-60 μm. IVI bærer også risikoen for lysinduceret skade på prøven. Dette kan testes i begyndelsen af billedbehandlingssessioner ved at erhverve en tidsserie på 100 billeder og lede efter tegn på fotoblegning eller fotoskade. På vores mikroskopsystem fandt vi, at en maksimal effekt på ~ 15 mW ved prøven kan bruges uden at påvirke vævet negativt.

SWIP-protokollen tillader stabil, højopløselig, enkeltcelle optisk IVI i murinbugspytkirtlen under både normale sunde tilstande såvel som syge tilstande som pancreatitis og PDAC. Dette gør SWIP særligt nyttig til billeddannelse med lang tidsforløb samt til udførelse af 3D- og 4D-billeddannelse (3D + tid) ved at fange flere z-skiver (drage fordel af multifoton og konfokalmikroskopiens iboende optiske sektionsfunktioner). Ved at muliggøre in vivo-visualisering af enkeltceller og deres interaktioner med de cellulære bestanddele i bugspytkirtlen vil IVI med høj opløsning vise sig uvurderlig for forståelsen af mekanismer, der ligger til grund for sygdomme i bugspytkirtlen.

Et vist niveau af teknisk ekspertise er nødvendig for at udføre SWIP-protokollen. Men med korrekt praksis og opmærksomhed på vigtige trin kan proceduren udføres med en høj succesrate. For at afbilde den ondartede bugspytkirtel er det afgørende først at have en vellykket implanteret tumor. Dette opnås ved ortotopisk injektion af en suspension af murine kræftceller i bugspytkirtlen i musens bugspytkirtel. En vellykket injektion observeres, når parenchymen i bugspytkirtlen pustes op i en væskefyldt boble og er blevet beskrevet detaljeret tidligere²¹. For at sikre maksimal succes og overlevelse er det afgørende, at der er minimal eller ingen lækage af cellesuspensionen, da lækage dramatisk reducerer potentiel tumorstørrelse samt fører til carcinomatose. Derudover er bugspytkirtlen et stærkt vaskulariseret organ med mange forgrenede blodkar. Det er afgørende at undgå lacerating nogen skibe, da dette vil forårsage blødning og efterfølgende hæmatom i bugspytkirtlen og hæmme tumorvækst. I denne model har vi brugt en syngeneisk PDAC-cellelinje afledt af KPC-mus²⁰. Dette tillader tumorindkapsling hos immunkompetente mus. Andre syngeneiske PDAC-cellelinjer kan anvendes afhængigt af den anvendte musestamme. Humane PDAC-cellelinjer kan også anvendes; Imidlertid skal musestammen være immunkompromitteret for at undgå afvisning af tumorimplantationen.

Størrelsen af tumorer, der gennemgår billeddannelse i denne protokol, kan ændres efter behov. Dette kan opnås ved at bruge en højere koncentration af kræftceller implanteret i murinbugspytkirtlen for at opnå en større tumor eller ved at forlænge tumorens væksttid før vinduesimplantation. I denne undersøgelse injicerede vi 10⁶ KPC PDAC-celler og implanterede SWIP 10-14 dage bagefter, da tumorerne var håndgribelige. Mindre og større tumorer kan også rummes af denne SWIP-protokol ved hjælp af passende placering af vævet i korsstingkurven.

Sikker placering af billedbehandlingsvinduet og bugspytkirtlen er også afgørende for at opnå billeddannelse af høj kvalitet og for at begrænse bevægelsesartefakter. Den normale murin bugspytkirtel er meget kompatibel og tilbøjelig til bevægelse fra vejrtrækning og nærliggende peristaltik. For at løse dette og øge stabiliteten af bugspytkirtlen under billeddannelse anvendes en tidligere beskrevet korsstingskurvteknik³¹. Korsstingkurven er designet til at efterligne kroppens brug af ledbånd. Ved at vugge vævet mod glasdækslet og anvende konstant aksialt tryk forhindrer det både lateral og aksial bevægelse. Når man beskæftiger sig med større faste tumorer, kan støttepunktet og retningen af korsstingingen ændres for bedst at imødekomme tumorens størrelse og position for optimal støtte.

Suboptimal billeddannelse kan også ske, når vinduesrammen er utilstrækkeligt implanteret i musens underliv. En løst monteret vinduesramme kan føre til billeddannelsesvanskeligheder og bevægelsesartefakter. En passende pungstrengsutur kan løse dette problem ved at sikre vinduesrammen til maven gennem huden og bugvæggen. For at undgå overdreven hudfoldning, når pungstrengen strammes, bør stingtrinnene ikke være større end 5 mm mellem trin, der ikke placeres mere end 1 mm fra vævskanten, hvilket sikrer en tæt pasform omkring vinduesrammen. Efter pungstrengsuturen, bugspytkirtelplaceringen i korsstingkurven og implantation af vinduesrammen er et sidste kritisk trin placeringen af klæbemiddel i vinduesrammens fordybning. Det er afgørende, at intet klæbemiddel i dette trin kommer i kontakt med bugspytkirtelvævet, da dette vil beskadige vævet og forvirre billeddannelsen. En potentiel ændring, der også kan forhindre limen i at komme i kontakt med bugspytkirtelvævet, er at lime glasdækslet på vinduesrammen og lade begge tørre før kirurgisk implantation i maven.

SWIP, som alle intravitale billeddannelsesteknikker, har begrænsninger i sin evne til at afsløre information om andre celler og strukturer i vævet, der ikke eksplicit er mærket. Men at kombinere SWIP-vinduet med fluorescerende reportere (såsom ECFP-ekspressiv epitel og Dendra2-mærkede KPC-celler som i denne undersøgelse) og kontrollere protein- eller celletilstande med farmakologiske og / eller optogenetiske værktøjer kan eliminere disse begrænsninger.

Derudover inkluderer SWIP-vinduesdesignet tre ætsede linjer på vinduesrammen, der tjener som fiduciale markører for mikrokartografi for at flytte interesseområder under seriel billeddannelse³⁰. Dette gør det muligt at lokalisere det samme synsfelt flere gange, selv i umærket væv.

Sammenfattende kan SWIP anvendes i normalt sundt bugspytkirtelvæv såvel som i godartede og ondartede bugspytkirtelsygdomme såsom pancreatitis og PDAC. Enkeltcelle og subcellulær dynamik kan fanges i disse tilstande ved hjælp af SWIP og kan hjælpe forskere med at forstå vigtige fysiologiske begivenheder såsom metastatisk formidling i PDAC. Den forbedrede kvalitet og stabilitet af IVI har potentialet til at give værdifuld indsigt i patofysiologi og cellebiologi i bugspytkirtlen, hvilket gør det til et lovende og gavnligt værktøj.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].