Summary
Sağlıklı ve hastalıklı pankreasın seri ve uzunlamasına çalışmalarına izin veren, murin pankreasın hücre altı çözünürlüklü görüntülenmesi için stabilize kalıcı bir optik pencerenin cerrahi implantasyonu için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Pankreasın fizyolojisi ve patofizyolojisi karmaşıktır. Pankreatit ve pankreas adenokarsinomu (PDAC) gibi pankreas hastalıkları yüksek morbidite ve mortaliteye sahiptir. İntravital görüntüleme (IVI), hem sağlıklı hem de hastalıklı durumlarda dokuların yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayan ve hücre dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesini sağlayan güçlü bir tekniktir. Murin pankreasın IVI'si, organın derin içgüdüsel ve uyumlu doğası nedeniyle önemli zorluklar sunar, bu da onu hasara ve hareket artefaktlarına oldukça yatkın hale getirir.
Burada tarif edilen, murin Pankreasın (SWIP) I'ninntravital görüntülemesi için Stabilize Window'un implantasyon sürecidir. SWIP, normal sağlıklı durumlarda, sağlıklı pankreastan serulein tarafından indüklenen akut pankreatite dönüşüm sırasında ve pankreas tümörleri gibi malign durumlarda murin pankreasın IVI'sine izin verir. Genetik olarak etiketlenmiş hücreler veya floresan boyaların uygulanması ile bağlantılı olarak SWIP, tek hücreli ve hücre altı dinamiklerin (tek hücreli ve toplu göç dahil) ölçülmesini ve aynı ilgilenilen bölgenin birkaç gün boyunca seri görüntülenmesini sağlar.
PDAC'de kansere bağlı mortalitenin birincil nedeni ezici metastatik yük olduğundan, tümör hücresi göçünü yakalama yeteneği özellikle önemlidir. PDAC'de metastazın fizyolojik dinamiklerini anlamak, karşılanmamış kritik bir ihtiyaçtır ve hasta prognozunu iyileştirmek için çok önemlidir. Genel olarak, SWIP gelişmiş görüntüleme stabilitesi sağlar ve sağlıklı pankreas ve malign pankreas hastalıklarında IVI uygulamasını genişletir.
Introduction
İyi huylu ve kötü huylu pankreas hastalıkları potansiyel olarak yaşamı tehdit eder ve patofizyolojilerinin anlaşılmasında önemli boşluklar vardır. Pankreatit - pankreas iltihabı - ABD'de gastrointestinal hastalığa bağlı hastaneye yatışların ve yeniden kabullerin üçüncü ana nedenidir ve önemli morbidite, mortalite ve sosyoekonomik yük ile ilişkilidir1. Kansere bağlı ölümlerin üçüncü önde gelen nedeni2 olarak sıralanan pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC), çoğu pankreas malignitesini3 oluşturur ve sadece %11'lik kötü bir 5 yıllık sağkalım oranına işaret eder2. PDAC'de kansere bağlı mortalitenin önde gelen nedeni ezici metastatik yüktür. Ne yazık ki, çoğu hasta metastatik hastalık ile başvurur. Bu nedenle, PDAC'de metastaz dinamiklerini anlamak, kanser araştırmaları alanında karşılanmamış kritik bir ihtiyaçtır.
Enflamasyonu ve pankreasın metastatik kaskadını destekleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bilgideki bu boşluğa önemli bir katkı, pankreas hücresel dinamiklerini in vivo olarak gözlemleyememektir. Bu hücresel dinamiklerin doğrudan gözlemlenmesi, pankreas hastalığı olanların tanı ve tedavisini güçlendirmek ve iyileştirmek için kritik hedefleri ortaya çıkarmayı vaat ediyor.
İntravital görüntüleme (IVI), araştırmacıların canlı hayvanlardaki biyolojik süreçleri gerçek zamanlı olarak görselleştirmesine ve incelemesine olanak tanıyan bir mikroskopi tekniğidir. IVI, hücre içi ve mikroçevresel dinamiklerin in vivo ve söz konusu biyolojik sürecin doğal ortamında yüksek çözünürlüklü, doğrudan görselleştirilmesine izin verir. Bu nedenle IVI, sağlıklı ve patolojik süreçlerin in vivo olarak gözlemlenmesine izin verir.
MRI, PET ve BT gibi çağdaş tüm vücut görüntüleme yöntemleri, tüm organların mükemmel görüntülerini sunar ve klinik semptomların başlamasından önce bile patolojileri ortaya çıkarabilir4. Bununla birlikte, tek hücreli çözünürlüğe ulaşamazlar veya hastalık-pankreatit veya malignitenin en erken aşamalarını ortaya çıkaramazlar.
Önceki araştırmalar, cilt5,6, meme7, akciğer 8, karaciğer9, beyin 10 ve pankreas tümörlerinin 11 iyi huylu ve kötü huylu hastalıklarını gözlemlemek için tek hücreli çözünürlük IVI kullanmış ve hastalığın ilerleme mekanizmalarına ilişkin içgörülere yol açmıştır 12. Bununla birlikte, murin pankreası, öncelikle derin viseral konumu ve yüksek uyumu nedeniyle, IVI kullanarak tek hücreli çözünürlüğe ulaşmada önemli engeller oluşturmaktadır. Ayrıca, mezenter içinde dalak, ince bağırsak ve mideye bağlanan ve erişimi zorlaştıran dallı, dağınık dağılmış bir organdır. Doku ayrıca bitişik peristalsis ve solunumun neden olduğu harekete karşı oldukça hassastır. Pankreasın hareketini en aza indirmek, tek hücreli çözünürlük mikroskobu için çok önemlidir, çünkü birkaç mikronluk hareket artefaktları bile görüntüleri bulanıklaştırabilir ve bozabilir, bu da tek tek hücrelerin dinamiklerini izlemeyi imkansız hale getirir13.
IVI gerçekleştirmek için, bir abdominal görüntüleme penceresi (AIW) cerrahi olarak implante edilmelidir 9,11. AIW'yi cerrahi olarak implante etmek için, karın duvarına metal bir pencere çerçevesi dikilir. Daha sonra, ilgilenilen organ siyanoakrilat yapıştırıcı kullanılarak çerçeveye tutturulur. Bu, bazı sert iç organlar (örneğin, karaciğer, dalak, sert tümörler) için yeterli olsa da, sağlıklı murin pankreasını görüntüleme girişimleri, dokunun uyumlu dokusu ve karmaşık mimarisi nedeniyle optimal olmayan lateral ve eksenel stabilite nedeniyle tehlikeye girer14. Bu sınırlamayı ele almak için, Park ve ark.14, sağlıklı pankreas için özel olarak tasarlanmış bir görüntüleme penceresi geliştirdi. Bu Pankreas Görüntüleme Penceresi (PIW), pencere çerçevesi içinde, lamellerin hemen altına yatay bir metal raf ekleyerek, dokuyu stabilize ederek ve kapak camı ile temasını koruyarak bağırsak hareketinin ve solunumun etkisini en aza indirir. PIW daha fazla yanal stabilite sunarken, bu pencerenin hala eksenel kayma gösterdiğini ve ayrıca metal raf ile lamel15 arasındaki dar boşluk nedeniyle büyük katı tümörlerin görüntülenmesini önlediğini bulduk.
Bu sınırlamaları ele almak için, hem sağlıklı hem de hastalıklı pankreasın stabil uzun süreli görüntülemesini sağlayabilen implante edilebilir bir görüntüleme penceresi olan murin Pankreasın (SWIP) I ntravitalgörüntülemesi için Stabilize Window'u geliştirdik (Şekil 1)15. Burada, SWIP'yi implante etmek için kullanılan cerrahi prosedür için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Birincil amaç metastazda yer alan dinamik mekanizmaları incelemek olsa da, bu yöntem pankreas biyolojisi ve patolojisinin çeşitli yönlerini keşfetmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler, Albert Einstein Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından önceden onay da dahil olmak üzere, omurgalı hayvanların kullanımına ilişkin yönergelere ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Pencerelerin pasivasyonu
NOT: Paslanmaz çeliğin pasivasyonu, metali kirleticilerden temizler ve metalin yumuşak dokularla biyouyumluluğunu, titanyum16'nın ötesinde bile büyük ölçüde artıran ince bir oksit tabakası oluşturur.
- Optik pencere çerçevelerini %1 (a/h) enzimatik olarak aktif deterjan solüsyonu ile yıkayarak pasivasyon işlemini başlatın.
- Çerçeveleri bir cam kavanozun içinde 30 dakika boyunca 70 °C'de %5 (a/h) sodyum hidroksit çözeltisine daldırın.
- Çerçeveleri çıkarın ve deiyonize suyla durulayın.
- Çerçeveleri yeni bir cam kavanozun içinde 10 dakika boyunca 55 °C'de %7 (a/h) sitrik asit çözeltisine daldırın.
- Çerçeveleri çıkarın ve tekrar deiyonize su ile durulayın.
- Adım 1.2'yi tekrarlayın ve son olarak pencere çerçevelerini son bir kez deiyonize suyla durulayın.
2. Tümör implantasyonu veya pencere cerrahisi için hazırlık
NOT: Pankreas tümörleri üzerine yapılan çalışmalar için, tümör hücreleri implante edilmeli ve açık tümörlere dönüşmesine izin verilmelidir. Tümör hücrelerini in vivo olarak görselleştirmek için, Dendra2 gibi floresan proteinleri eksprese etmek için genetiği değiştirilmiş hücrelerin kullanılması önerilir. Parlak floresan protein etiketlerinin kullanılması, doku otofloresansı ile ilgili olası sorunları azaltacaktır. Kullanılabilecek diğer potansiyel floresan proteinler, boyalar ve genetik olarak kodlanmış floresan fare modelleri başka bir yerde tartışılmıştır17,18. Ameliyat alanının kirlenmesini önlemek için, cerrahi prosedürü bir başlık veya laminer akış kabininde gerçekleştirin ve hazırlık, ameliyat ve iyileşme için farklı alanların kullanıldığından emin olun.
- Ameliyattan önce, tüm cerrahi aletleri bir otoklavda sterilize edin ve gerekirse sonraki prosedürler için sıcak boncuk sterilizatörü kullanın. Ameliyatın yalnızca ipuçlarıyla yapılan bir teknik kullandığından emin olun.
- Isıtılmış cerrahi pedi ve boncuk sterilizatörünü açın ve uygun çalışma sıcaklığına ulaşmasını bekleyin. Olası yanıkları önlemek için ısıtma yastığı sıcaklığı bir yüzey termometresi ile izlenmelidir. Sıcaklık yeterince kontrol edilemiyorsa, ısıtma yastığının üzerine steril bir bez yerleştirin.
NOT: Tümör ve pencere implantasyonu gibi kısa prosedürler (≤20 dakika) sırasında vücut ısısı, ısıtılmış bir cerrahi ped kullanıldığında minimum düzeyde etkilenir. Bununla birlikte, uzun süreli görüntüleme sırasında olduğu gibi daha uzun anestezi süreleri, vücut ısısını korumak için farenin ısıtılmış bir odaya yerleştirilmesini gerektirir. - Fareyi bir anestezi odasında% 5 izofluran ile uyuşturun.
- Kritik Adım: Fare bilinçsiz olduğunda anesteziyi %2'ye düşürün. Anestezi seviyesini ve farenin hayati değerlerini dikkatlice izleyin (örneğin, bir nabız oksimetresi kullanarak)19.
- Korneanın kurumasını önlemek için farenin her bir gözüne küçük bir damla göz kayganlaştırıcı damlatın.
- Ameliyattan önce, tüyleri almak için sol üst karın bölgesine bolca tüy dökücü krem uygulayın. 20 saniye sonra, saçı ve tüy dökücü kremi sıkıca silmek için nemli kağıt mendil kullanın. Ameliyat bölgesinden tüm tüyler alınana kadar işlemi gerektiği kadar tekrarlayın.
- Preoperatif analjezi sağlamak için 90 μL PBS içinde seyreltilmiş 10 μL buprenorfin (0.1 mg/kg) subkutan olarak enjekte edilir.
3. Pankreas tümörü implantasyonu
- İstenilen konsantrasyonda tümör hücrelerinin alikotlarını hazırlayın (tümör hücresi ikiye katlanma süresine bağlı olarak). Hücre süspansiyonunu bir insülin şırıngasına yerleştirin ve buz üzerinde tutun. Bu protokolü takip etmek için, Erstad ve ark.21'den uyarlanan ortotopik enjeksiyon protokolünü izleyerek, maksimum 50 μL PBS içinde süspanse edilmiş 106 sinjeneik KPC tümör hücresi20 kullanın
NOT: Bu konsantrasyonda enjekte edilen bu hücre dizisi rutin olarak 10-14 gün boyunca palpe edilebilir veya uygun şekilde büyük tümörler üretti. Bu hücre hattının ve diğer pankreas hücre hatlarının alt klonlarının, uygun büyüklükte tümörler üretmek için uygun konsantrasyonlar ve zaman çizelgeleri açısından değerlendirilmesi gerekir). - Antiseptik sabun kullanarak ellerinizi yıkayın.
- Her yeni ameliyattan önce yeni steril eldivenler giyin.
- Fareyi steril cerrahi başlığa aktarın ve kısmi sağ lateral dekübit pozisyonuna yerleştirin.
- Uzuvları kağıt bantla sabitleyin.
NOT: Aletlerin doğru kullanımı prosedür boyunca önemlidir. Forseps, Castroviejo makası ve vakum alma aletinin nasıl tutulacağına dair örnekler Şekil 2A-C'de gösterilmektedir. - Karnı antiseptik ile sterilize edin (Şekil 2D).
- Ayak parmağı kıstırma testi yaparak hayvanın tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
- Forseps ve Castroviejo makası kullanarak ciltte 10-15 mm sol subkostal insizyon yapın (Şekil 2E).
- Gerekli görüldüğünde pamuklu çubuklar veya koter kalemi kullanarak hemostazı kontrol edin.
- Peritona girmek için alttaki kası forseps ve Castroviejo makası ile dikkatlice bölün (Şekil 2F).
- Steril pamuklu çubuklar kullanarak pankreas ve dalağı atravmatik olarak dışsallaştırın.
- Pankreası kıvrım kalmayacak şekilde dışarı doğru yayın (Şekil 2G).
- Pankreasın gövdesinde veya kuyruğunda (kan damarlarından uzakta) istenen tümör enjeksiyon bölgesini tanımlayın.
- Kritik adım: Pankreasın dikkatli bir şekilde konumlandırılmasından sonra, dokuya gerginlik sağlamak için forseps kullanın ve insülin şırınga ucunu, eğimi yukarı bakacak şekilde, pankreasın istenen bölgesine 4-5 mm derinliğe kadar yerleştirin (Şekil 2H).
- Tümör hücresi çözeltisini yavaşça enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyonu onaylayan küçük bir kabarcık arayın (Şekil 2I).
- Tümör hücresi enjeksiyon kabarcığını bozmadan pankreası dikkatlice karına geri koyun (Şekil 2J).
- Emilebilir 5-0 polidioksanon sütürler kullanılarak önce kas tabakası daha sonra kesintili sütürlerle cilt kapatılır (Şekil 2K-N).
- Kesi siyanoakrilat yapıştırıcı ile örtün (Şekil 2O), ardından fareyi bir ısıtma lambasının altındaki temiz bir kafese geri koyun.amp kurtarma için. Enfeksiyonu önlemek için içme suyuna antibiyotik verin. Fareleri izleyin ve ameliyattan tamamen iyileşmelerine izin verin.
NOT: Antibiyotikler IACUC protokolünün gerektirdiği şekilde uygulanır. Tüm hayvanlar ayrı ayrı barındırılır. - Tümörün karın duvarından ele gelene kadar 10-14 gün gelişmesine izin verin.
4. Pankreas pencere ameliyatı
- Hayvanlar görüntüleme için hazır olduğunda, pencere implantasyon ameliyatına başlayın. Başlamak için ellerinizi antiseptik sabunla yıkayın.
- Her yeni ameliyattan önce yeni steril eldivenler giyin.
- Isıtılmış cerrahi standda, sol karnı ortaya çıkarmak için fareyi sağ lateral dekübit pozisyonuna yerleştirin.
- Farenin ön ve arka bacaklarını kağıt bant kullanarak kraniyal ve kaudal olarak ısıtılmış cerrahi aşamaya sabitleyin. Dalağın (derinin altında) cerrahi alanda görünür olduğundan emin olun (Şekil 3A).
- Steriliteyi korumak için, kaputtaki tüm cerrahi aletleri ambalajından çıkarın.
- Farenin cildini bol miktarda antiseptik uygulamasıyla temizleyerek ameliyat bölgesini dezenfekte edin.
- Ayak parmağı kıstırma testi yaparak hayvanın tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
- Kritik adım: Karnın sol üst kadranının derisini forseps ile kaldırın ve Castroviejo makası kullanarak ciltte ve kas sisteminde ~10 mm'lik dairesel bir kesi yapın (Şekil 3B,C).
- Gerektiğinde pamuklu çubuklar veya koter kalemi kullanarak kanamayı kontrol edin ve hemostazı koruyun.
- Dalağa bağlı olan pankreasın lokalizasyonunu belirleyin ve destekleyici kanaviçe işinin nereye yerleştirilmesi gerektiğine karar vermek için pankreasın kesi içinde uzandığı yönü belirleyin.
- 5-0 ipek dikiş kullanarak, ilk dikişi kas tabakasında istenen yere yerleştirin. Bu ucu 3-5 düğüm ile bağlayın. (Şekil 3D,E)
- Doğrudan kesi boyunca dikmeye devam edin. ~5 cm'lik bir kuyruk kesin ve bırakın (Şekil 3F).
- 4.11 ve 4.12 adımlarını ilk dikişe dik olarak tekrarlayın (Şekil 3G,H).
- Kritik adım: Pankreası yavaşça kaldırın ve kanaviçe işinin üzerine yerleştirin (Şekil 3I,J). Manipülasyon sırasında pankreasa zarar vermemeye dikkat edin.
- Kritik adım: 5-0 ipek sütür kullanarak, delikten ~1 mm uzakta, cilt ve kas tabakasını birbirine geçirerek çevresel olarak bir çanta dikişi yapın (Şekil 3K).
- Pencere çerçevesini, dairesel kesiğin kenarları pencerenin oluğuna oturacak şekilde konumlandırın (Şekil 3L).
- 5-0 ipeği sıkıca bağlayarak implante edilmiş pencereyi sabitleyin.
- 1 mL şırıngaya 100 μL sıvı siyanoakrilat yapıştırıcı yükleyin.
- ~10 sn boyunca hassas bir basınçlı hava akışı uygulayarak dokuyu kurutun.
- Pencere çerçevesini dış kenarından forseps ile sıkıştırın ve pankreasın pencere çerçevesinin alt yüzeyinden ayrılmasını sağlamak için hafifçe kaldırın.
- Kritik adım: Pencerenin girintisi boyunca ince bir tabaka sıvı siyanoakrilat yapıştırıcı dağıtın (Şekil 3M). Pankreas dokusuna yapıştırıcı bulaşmadığından emin olun.
- Vakumlu manyetikleri kullanarak 5 mm'lik lamel kaldırın.
- Lameli optik pencere çerçevesinin ortasındaki girintinin içine dikkatlice yerleştirin. Hafif basınçla tutun ve siyanoakrilat yapıştırıcının sertleşmesine izin verin (~25 s).
- Lameli forseps kullanarak vakumlu manyetiklerden ayırın.
- Pankreası lame sıkıca sabitlemek için kanaviçe dikişlerini sıkın (Şekil 3N,O). Not: Pankreasta hasara ve iskemiye neden olabileceğinden kanaviçe işini aşırı sıkmayın.
- Dikişin uçlarını kesin.
- Bandı fareden çıkarın.
- İzofluran buharlaştırıcıyı kapatın.
- Fareyi temiz bir kafese veya doğrudan intravital mikroskoba yerleştirin.
- Pencere ameliyatını takiben hayvanları ayrı ayrı barındırın ve tamamen iyileşene kadar izleyin.
- Görüntüleme daha sonra daha önce tanımladığımız gibi iki lazerli bir multifoton mikroskobu üzerinde gerçekleştirilir 22,23,24 Uzun görüntüleme seansları için fare, vücut ısısını korumak için ısıtılmış bir odaya yerleştirilir ve IACUC standartlarına göre destekleyici sıvılarla sağlanır.
5. Pankreatit indüksiyonu için serulein tedavisi
- Pankreatitin başlangıcını araştırmak için, SWIP'nin implantasyonundan sonra sağlıklı fareleri serulein ile tedavi edin. Farelerin 14-18 saat aç bırakıldığından ve cerulein uygulamasından önce ad libitum su verildiğinden emin olun.
- Sekiz enjeksiyona kadar 1 saat aralıklarla intraperitoneal olarak 100 μL steril 1x DPBS'ye 50 μg / kg serulein enjekte edin. Kontrol farelerine intraperitoneal olarak enjekte edilen eşdeğer bir hacimde 1x DPBS'yi tek başına uygulayın.
- Görüntülemeyi takiben, fareleri ilk enjeksiyondan 24 saat sonra IACUC standartlarına göre servikal çıkık ile kurban edin.
- Daha önce açıklandığı gibi iki lazerli çoklu foton mikroskobunda görüntüleme yapın22,23,24. Uzun görüntüleme seansları için, vücut ısısını korumak ve IACUC standartlarına göre destekleyici sıvılar sağlamak için fareyi ısıtılmış bir odaya yerleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Du ve ark.15'ten uyarlanan Şekil 1, murin pankreasın hızlandırılmış IVI filminden görüntü karelerini göstermektedir. İlk yerleşme periyodu içinde bir miktar doku hareketi gözlenebilir (görüntülemenin ilk saati, Şekil 1A). Ancak bu yerleşme periyodundan sonra (>75 dk) devam eden görüntüleme ile lateral ve aksiyel stabilitede artış gözlenmiştir (Şekil 1B). SWIP'nin kararlılığının önceki AIW ve PIW görüntüleme pencereleriyle karşılaştırılması, tüm pencerelerin yerleşme için bir başlangıç periyodu gerektirdiğini belirler. Bununla birlikte, SWIP genel olarak en düşük sapma seviyesini sergilemiştir ve uzun süreli görüntüleme için en uygun olanıdır (Şekil 1C-K). Görüntüler, 880 nm'de aydınlatan ve kareler arasında 1,7 dakika, 2 μm adım boyutuna sahip 11 dilim, 20 görüntüleme derinliği ve ~1 dilim/sn ile bir z yığın-t atlaması (görüş alanı [FOV] boyutu = 340 x 340 μm, piksel boyutu 0,67 μm) elde eden özel yapım bir çoklu foton mikroskobu 24 üzerinde oluşturuldu. Lazer gücü ve fotoçoğaltıcı tüp (PMT) kazançları, foto ağartma ve fotohasarı en aza indirirken sinyali en üst düzeye çıkarmak için seçildi.
Pankreas tümörü implantasyonunu ve ardından pankreas penceresinin yerleştirilmesini tanımlayan cerrahi prosedürlerin adımları sırasıyla Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterilmektedir. Daha da önemlisi, her iki ameliyat da hayatta kalma ameliyatlarıdır. Doğru bir şekilde implante edildikten sonra, pankreas artık karın duvarına entegre edilmiş olan optik pencereye bağlı kalacaktır. Bu, farenin rahat bir şekilde hayatta kalmasını sağlar ve protokolün izin verdiği şekilde 12 saate kadar sürekli görüntüleme sağlar. Ek olarak, zaman içinde ilgilenilen bölgeleri izlemek için art arda birden fazla gün boyunca (2 haftalık protokol ödeneğine kadar) seri görüntüleme yapılabilir. İntravital görüntüleme (IVI), daha önce açıklanan diğer pencerelere benzer bir şekilde pencereden gerçekleştirilebilir22,25,26.
SWIP, serulein kullanılarak indüklenen akut pankreatitin başlangıcındaki dinamikleri araştırmak için kullanılabilir. Seruelin, kolesistokininkine (CKK) benzer yapı ve işleve sahip bir oligopeptittir ve kemirgenlerde deneysel olarak akut pankreatiti indüklemek için yaygın olarak kullanılır27. Cerulein ile tedavi, gastrointestinal sistemdeki düz kasın kasılmasına neden olur ve mide ve pankreas sekresyonlarını uyarır28. Ayrıca, seruleinin intraperitoneal uygulaması pankreas şişmesine ve genişlemesine yol açar29.
Şekil 4, SWIP protokolü kullanılarak serulein tedavisini takiben murin pankreasının seri görüntülemesini göstermektedir. Murin pankreası, genetik floresan etiketleme (ECFP etiketli epitel-MMTV-iCre / CAG-CAC-ECFP transgenik fareler) ve yüksek moleküler ağırlıklı boyaların (155 kD dekstran-TMR) uygulanması kullanılarak tek hücre çözünürlüğünde görselleştirilir. Daha önce murin akciğer görüntüleme8 için kullanılan pencere tasarımı, çerçeve üzerinde mikrokartografi30 kullanımına izin veren referans belirteçleri olarak işlev gören üç kazınmış çizgi (Şekil 4, ek) içerir. Mikrokartografi, murin pankreasının ilgilendiği aynı bölgenin birkaç gün boyunca seri olarak görüntülenmesine izin verir. Burada pankreasın aynı lobülü (sarı kesikli çizgiler) 1. günde görselleştirilir ve aynı yerel kan damarlarının varlığıyla kanıtlandığı gibi 2. günde yeniden lokalize edilir (Şekil 4). Görüntüler her gün ~1 dilim/sn'de 11 dilim ve 2 μm adım boyutuna sahip, 880 nm aydınlatmada ve 0,67 μm/piksel çözünürlükte (FOV = 340 x 340 μm) çekilen tek bir z-yığını olarak elde edildi. Lazer gücü ve PMT kazanımları, fotoağartma ve fotohasarı en aza indirirken sinyali en üst düzeye çıkarmak için seçildi.
Seri görüntülemeye ek olarak, SWIP, kontrol ve tedavi koşulları altında hücre altı yapıların (vakuoller gibi) dinamiklerinin doğru bir şekilde izlenmesini ve ölçülmesini sağlayan uzun süreli uzunlamasına görüntüleme için çok uygundur. Burada vakuoller, sitoplazmik floresan proteinlerin dışlandığı bölgelerdir ve koyu renkli etiketlenmemiş deliklerin ortaya çıkmasına neden olur (Şekil 5A). ROI Tracker24 gibi yazılımlar kullanılarak vakuollerin işaretlenmesi, vakuol motilitesinin görselleştirilmesine (Şekil 5A,B) ve çok sayıda motilite parametresinin ölçülmesine olanak tanır. Örneğin, murin pankreasındaki vakuollerin ortalama hızı, PBS tedavisine kıyasla pankreatiti indüklemek için serulein ile tedaviden sonra yaklaşık% 10 artmıştır (0.37 ± 0.07 μm / dak vs 0.41 ± 0.09 μm / dak, p = 0.02) (Şekil 5C). Seruin tedavisi ayrıca hücre altı yapıların ortalama dönme sıklığını PBS tedavisine göre% 10 artırdı (2.3 ± 0.3 derece / dak vs 2.6 ± 0.6 derece / dak, p = 0.04) (Şekil 5F). Bununla birlikte, serulein tedavisi ile PBS tedavisi arasında net hız, yönlülük veya kat edilen kümülatif mesafe açısından anlamlı bir fark yoktu (p > 0.05) (Şekil 5D, E ve Şekil 5G). Görüntüler, 880 nm'de aydınlatan ve kareler arasında 2,9 dakika, 2 μm adım boyutuna sahip 11 dilim ve ~1 dilim/sn ile bir z yığın-t atlaması (FOV boyutu = 340 x 340 μm, piksel boyutu 0,67 μm) elde eden özel yapım bir çoklu foton mikroskobunda oluşturuldu.
Son olarak, SWIP, tümör hücresi göçünün görselleştirilmesini ve yakalanmasını sağlar. Şekil 6A, ortotopik olarak enjekte edilen Dendra-2 etiketli KPC tümör hücrelerinin pankreas içindeki göçünün hızlandırılmış bir filminden (Ek Video S1 ve Ek Video S2) bir kareyi göstermektedir. Kümelerdeki hücrelerin hem toplu göçü (Şekil 6B ve Ek Video S1) hem de tek hücreli göç (Şekil 6C ve Ek Video S2) kısa sürelerde (<1 saat) gözlemlenebilir. Görüntüler, 880 nm'de aydınlatan ve karolar arasında %20 örtüşme ile 4 x 4 mozaik-z yığın-t atlaması elde eden özel yapım bir çoklu foton mikroskobu24 üzerinde oluşturuldu (karo boyutu = 340 x 340 μm), çerçeveler arasında 3,4 dakika, 5 μm adım boyutuna sahip 3 dilim ve ~1 dilim/sn. Lazer gücü ve PMT kazanımları, fotoağartma ve fotohasarı en aza indirirken sinyali en üst düzeye çıkarmak için seçildi.
Şekil 1: SWIP sayesinde görüntüleme kararlılığı iyileştirildi. (A) SWIP aracılığıyla görüntülenen pankreasın hızlandırılmış filminin ilk 72 dakikasından kareler. Bazı eksenel ancak çok az yanal kayma gözlemlenebilir. Ölçek çubukları = 50 μm. (B) 72 dakika sonra devam eden hızlandırılmış görüntüleme, yüksek düzeyde eksenel ve yanal stabilite gösterir. (A,B) Kırmızı = 155 kDa tetrametilrodamin dekstran etiketli kan serumu, Camgöbeği = CFP etiketli pankreas hücreleri (MMTV-iCre / CAG-CAC-ECFP transgenik fareler) (C-E) (C) AIW, (D) PIW ve (E) SWIP için görüntülemenin ilk saatinde pankreas görüntüleme pencerelerinin her birinin yanal stabilitesinin karşılaştırılması. (F-H) (F) AIW, (G) PIW ve (H) SWIP için sonraki 150 dakika boyunca pankreas görüntülemelerinin her birinin lateral stabilitesinin karşılaştırılması. Ekler, ilgili grafiklerin yakınlaştırılmış görünümleridir. (I-K) (I) AIW, (J) PIW ve (K) SWIP için görüntülemenin ilk 120 dakikası için pankreas görüntüleme pencerelerinin her birinin eksenel stabilitesinin karşılaştırılması. Bu rakam Du ve ark. Open Biology 2022, DOI:10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273. 15. Kısaltmalar: SWIP = pankreasın intravital görüntülemesi için stabilize pencere; AIW = abdominal görüntüleme penceresi; PIW = pankreas görüntüleme penceresi; CFP = camgöbeği floresan proteini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Pankreatik duktal adenokarsinom hücrelerinin (KPC) ortotopik enjeksiyonunun cerrahi protokolüne genel bakış. (A) Cerrahi forsepsin nasıl tutulacağının gösterimi. (B) Castroviejo makasının nasıl tutulacağının çizimi. (C) Vakumlu alma aletinin nasıl tutulacağına dair resim. (D) Cildi sterilize etmek. (E) Deride kesi. (F) Kasta kesi. (G) Yayvan pankreas. (H) İğnenin istenen enjeksiyon bölgesine yerleştirilmesi. (I) Bir baloncuk oluşturan kanser hücresi süspansiyonunun enjeksiyonu (mavi ok). (J) Pankreas periton boşluğuna geri döndü. (K,L) Kas tabakasının kesintili bir ipek dikiş ile kapatılması. (M,N) Kesintili ipek sütür ile derinin kapatılması. (O) İnsizyona uygulanan siyanoakrilat yapıştırıcı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Pankreasın Görüntülenmesi için Stabilize Pencerenin cerrahi protokolüne genel bakış . (A) Dalak ve yapışık pankreasın tanımlanması. (B,C) Deride ve kasta dairesel kesi. A-C'deki kırmızı kesikli çizgiler, karın duvarı ve deriden görülebilen dalağın ana hatlarını gösterir. (D,E) Kanaviçe sepetinin ilk dikişi kas tabakasına yerleştirilir ve bağlanır (E, sarı ok). (F) Dikiş, kas insizyonunun karşı tarafına, bir kuyruk (beyaz ok) bırakılarak devam ettirilir. (G,H) İkinci dikiş, birinciye dik olarak yerleştirilir, bir ucundan bağlanır (sarı oklar) ve bir kuyruk bırakılır (beyaz oklar). (I,J) Pankreasın kanaviçe sepetine yerleştirilmesi. (K) Kas ve deriden çevresel çanta ipi sütürü. (L) Pencere çerçevesinin implantasyonu. (M) Pencere çerçevesine yapıştırıcı uygulanması. (N) Cam lamel takılması. (O) Kanaviçe işinin kuyruk uçları sıkılmış. (P) Tamamen implante edilmiş SWIP. Kısaltma: SWIP = pankreasın intravital görüntülemesi için stabilize pencere. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Optik pencere içinde aynı ilgi alanlarını yeniden konumlandırmak için seri görüntüleme için kullanılan mikrokartografi. Mikrokartografi kullanılarak aynı lobülün art arda 2 gün boyunca (D1-D2) yer değiştirdiğini gösteren tek bir murin pankreas bölgesinin intravital görüntülemesi. Sarı kesikli çizgiler aynı lobülün sınırlarını çizer. Düz çizgiler, art arda her gün tanımlanan aynı kan damarlarını (lümen içinde kırmızı etiketli kan serumunun varlığıyla kanıtlandığı gibi) vurgular. Kırmızı = 155 kDa tetrametilrodamin dekstran etiketli kan serumu, Camgöbeği = CFP etiketli pankreas hücreleri (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgenik fareler) (İçinde) Mikrokartografi için çizikli SWIP görüntüsü. Seri görüntüleme sırasında ilgilenilen bölgelerin yerini değiştirmek için mikrokartografinin kullanılmasına, pencere çerçevesindeki (iç) kazınmış üç çizgi tarafından izin verilir. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hücre altı çözünürlük ve SWIP kullanılarak hücre altı dinamiklerinin ölçümü. (A) Tek hücreler (kesikli sarı ana hatlar) ve vakuoller gibi hücre altı yapılar, murin pankreasında zaman içinde SWIP aracılığıyla görselleştirilebilir. Bu vakuollerin örnekleri sarı oklarla gösterilir. Böylece SWIP, hücre altı yapıların (floresan görüntü üzerine bindirilmiş renkli ana hatlar ve izler) zaman içinde izlenmesine izin verir. Ek, izlenen üç vakuol gösteren sarı kutulu bir alanın yakınlaştırılmış görünümüdür. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Koordinatların başlangıç noktasına kaydırılmasından sonra çekirdekler ve vakuoller (A'da vurgulanmıştır) gibi hücre altı yapıların yörüngeleri. Kırmızı kesikli çizgi, 1 saat (3,46 μm) içindeki ortalama net yolu gösterir. (C) ortalama hız, (D) net yol, (E) yönlülük, (F) ortalama dönüş frekansı ve (G) kümülatif mesafenin dinamik parametrelerinin ölçülmesi. Kırmızı = 155 kDa tetrametilrodamin dekstran etiketli kan serumu, Camgöbeği = CFP etiketli pankreas hücreleri (MMTV-iCre / CAG-CAC-ECFP transgenik fareler). Kısaltmalar: SWIP = pankreasın intravital görüntülemesi için stabilize pencere; CFP = camgöbeği floresan proteini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: SWIP ile hücre göçünü yakalama . (A) PDAC'ın ortotopik olarak enjekte edilmiş bir fare modelinde pankreasın hızlandırılmış intravital görüntüleme filminden hareketsiz bir görüntü. (B) Toplu göç geçiren tümör hücrelerinin bir örneğini gösteren Ek Video S1'den hareketsiz görüntüler (sarı ok). (C) Bir tümör hücresinin (sarı ok) ve bir makrofajın (kırmızı ok) tek hücreli göç örneklerini gösteren Ek Video S2'den hareketsiz görüntüler. Yeşil = Dendra2 etiketli tümör hücreleri, Mavi = CFP etiketli makrofajlar, Kırmızı = 155 kDa tetrametilrodamin dekstran etiketli kan serumu. Ölçek çubukları = 50 μm (A), 15 μm (B,C). Kısaltmalar: SWIP = pankreasın intravital görüntülemesi için stabilize pencere; CFP = camgöbeği floresan proteini; PDAC = pankreas adenokarsinomu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video S1: Şekil 6B'ye karşılık gelen toplu göç geçiren tümör hücrelerini gösteren hızlandırılmış intravital görüntüleme filmi. Yeşil = Dendra2 etiketli tümör hücreleri, Mavi = CFP etiketli makrofajlar, Kırmızı = 155 kDa tetrametilrodamin dekstran etiketli kan serumu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video S2: Şekil 6C'ye karşılık gelen tek hücre göçü geçiren tümör hücrelerini gösteren hızlandırılmış intravital görüntüleme filmi. Yeşil = Dendra2 etiketli tümör hücreleri, Mavi = CFP etiketli makrofajlar, Kırmızı = 155 kDa tetrametilrodamin dekstran etiketli kan serumu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan SWIP protokolü, kanaviçe sepeti tekniğini kullanarak gelişmiş bir pankreas dokusu stabilizasyonu yöntemi sağlar. Erken abdominal görüntüleme pencereleri (AIW'ler), karın iç organlarının intravital görüntülemesini (IVI) mümkün kıldı, ancak pankreas gibi yumuşak dokuların hareketini yeterince sınırlamadı. Buna cevaben, Park ve ark. yatay bir metal raf içeren ve cam lamel ile teması sürdürürken pankreas dokusunun daha iyi stabilizasyonuna izin veren bir pankreas görüntüleme penceresi (PIW) geliştirdi. Bu yaklaşım lateral stabiliteyi geliştirirken, katı pankreas tümörlerinin görüntülenmesini sınırlar çünkü boyutları raf ve kapak camı arasındaki dar alanı aşar. SWIP, pankreası kanaviçe sepeti ile stabilize ederek, hem eksenel hem de yanal hareketi sınırlayarak ve aynı zamanda büyük (≤10 mm) katı tümörleri barındırarak bu sorunu giderir.
SWIP'nin AIW ve PIW gibi önceki görüntüleme pencereleriyle doğrudan karşılaştırmaları daha öncegerçekleştirilmiştir 15. Bu, Du ve ark.15'ten uyarlanan Şekil 1'de gösterilmiştir, burada yanal ve eksenel kaymalar, çekirdekler veya kan damarları gibi hücresel anatomik özelliklerin izlenmesiyle ölçülmüştür. Tüm görüntüleme pencereleri, görüntülemenin yaklaşık ilk saatinde bir yerleşme dönemine ihtiyaç duyuyordu. Bu süre zarfında, SWIP'ye kıyasla AIW ve PIW ile daha yüksek derecede yanal hareket gözlendi. AIW ve PIW ile 2 saatlik bir süre boyunca SWIP ile karşılaştırıldığında daha büyük bir eksenel kayma da görülmüştür. Genel olarak, SWIP en düşük sapma seviyesini gösterdi ve uzun süreli görüntüleme (≤12 saat) için uygundur.
Ne yazık ki, pankreas oldukça dağınık bir dokudur ve bu nedenle, IVI'de kullanılan çoklu foton mikroskobu için nokta yayılma işlevi, dokuya nüfuz ederek hızla bozulur. Bu nedenle, optik pencerelerden herhangi biriyle görüntüleme derinliği yalnızca ~30-60 μm ile sınırlıdır. IVI ayrıca numunede ışık kaynaklı hasar riski taşır. Bu, görüntüleme seanslarının başında 100 görüntüden oluşan bir zaman serisi elde ederek ve foto ağartma veya fotohasar belirtileri arayarak test edilebilir. Mikroskop sistemimizde, numunede maksimum ~15 mW'lık bir gücün dokuyu olumsuz etkilemeden kullanılabileceğini bulduk.
SWIP protokolü, hem normal sağlıklı koşullarda hem de pankreatit ve PDAC gibi hastalıklı durumlarda murin pankreasın kararlı, yüksek çözünürlüklü, tek hücreli optik IVI'sine izin verir. Bu, SWIP'yi özellikle uzun zaman atlamalı görüntüleme için ve ayrıca birden fazla z dilimi yakalayarak (çoklu foton ve konfokal mikroskopinin doğal optik kesit alma yeteneklerinden yararlanarak) 3D ve 4D (3D + zaman) görüntüleme gerçekleştirmek için kullanışlı hale getirir. Tek hücrelerin in vivo görselleştirilmesini ve bunların pankreasın hücresel bileşenleri ile etkileşimlerini sağlayarak, yüksek çözünürlüklü IVI, pankreas hastalıklarının altında yatan mekanizmaları anlamak için paha biçilmez olacaktır.
SWIP protokolünü gerçekleştirmek için belirli bir düzeyde teknik uzmanlık gereklidir. Bununla birlikte, uygun uygulama ve kilit adımlara dikkat edilerek, prosedür yüksek bir başarı oranıyla yürütülebilir. Kötü huylu pankreası görüntülemek için öncelikle başarılı bir şekilde implante edilmiş bir tümöre sahip olmak çok önemlidir. Bu, fare pankreas kanseri hücrelerinin bir süspansiyonunun farenin pankreasına ortotopik enjeksiyonu ile elde edilir. Pankreasın parankimi sıvı dolu bir baloncuğa şiştiğinde başarılı bir enjeksiyon gözlenir ve daha önce ayrıntılı olarak tarif edilmiştir21. Maksimum başarı ve sağkalımı sağlamak için, sızıntı potansiyel tümör boyutunu önemli ölçüde azaltacağından ve karsinomatozise yol açacağından, hücre süspansiyonunda minimum sızıntı olması veya hiç sızıntı olmaması hayati önem taşır. Ek olarak, pankreas, birçok dallı kan damarına sahip, oldukça vaskülarize bir organdır. Pankreasta kanamaya ve ardından hematoma neden olacağından ve tümör büyümesini engelleyeceğinden herhangi bir damarın yırtılmasından kaçınmak çok önemlidir. Bu modelde, KPC fareleri20'den türetilen bir sinjeneik PDAC hücre hattı kullandık. Bu, bağışıklığı yeterli farelerde tümör aşılamasına izin verir. Kullanılan farenin türüne bağlı olarak diğer sinjeneik PDAC hücre hatları kullanılabilir. İnsan PDAC hücre hatları da kullanılabilir; Bununla birlikte, tümör implantasyonunun reddedilmesini önlemek için fare suşu bağışıklık sistemi zayıflatılmalıdır.
Bu protokolde görüntüleme yapılan tümörlerin boyutu gerektiği gibi değiştirilebilir. Bu, daha büyük bir tümör elde etmek için murin pankreasına implante edilen daha yüksek konsantrasyonda kanser hücresi kullanılarak veya pencere implantasyonundan önce tümörün büyüme süresini uzatarak gerçekleştirilebilir. Bu çalışmada, 106 KPC PDAC hücresi enjekte ettik ve tümörler palpe edildiğinde 10-14 gün sonra SWIP implante ettik. Daha küçük ve daha büyük tümörler, dokunun kanaviçe sepetine uygun şekilde yerleştirilmesi kullanılarak bu SWIP protokolü ile de barındırılabilir.
Görüntüleme penceresinin ve pankreasın güvenli bir şekilde yerleştirilmesi, yüksek kaliteli görüntüleme elde etmek ve hareket artefaktlarını sınırlamak için de çok önemlidir. Normal murin pankreası çok uyumludur ve nefes alma ve yakındaki peristalsis hareketine eğilimlidir. Bunu ele almak ve görüntüleme sırasında pankreasın stabilitesini artırmak için, daha önce tarif edilen bir kanaviçe sepeti tekniği kullanılır31. Kanaviçe sepeti, vücudun bağ kullanımını taklit edecek şekilde tasarlanmıştır. Dokuyu cam lamele yaslayarak ve sabit eksenel basınç uygulayarak hem yanal hem de eksenel hareketi önler. Daha büyük katı tümörlerle uğraşırken, kanaviçe işinin destek noktası ve yönü, optimum destek için tümörün boyutuna ve konumuna en iyi şekilde uyacak şekilde değiştirilebilir.
Pencere çerçevesi farenin karnına yetersiz bir şekilde implante edildiğinde de optimal olmayan görüntüleme meydana gelebilir. Gevşek bir şekilde oturtulmuş bir pencere çerçevesi, görüntüleme zorluklarına ve hareket artefaktlarına yol açabilir. Uygun bir çanta ipi sütürü, pencere çerçevesini cilt ve karın duvarı yoluyla karına sabitleyerek bu sorunu çözebilir. Çanta ipini sıkarken aşırı cilt katlanmasını önlemek için, dikiş adımları, doku kenarından 5 mm'den fazla olmayacak şekilde yerleştirilen basamaklar arasında 1 mm'den fazla olmamalı ve pencere çerçevesinin etrafına tam oturmalıdır. Çanta ipi dikişini, kanaviçe sepetine pankreas yerleştirmeyi ve pencere çerçevesinin implantasyonunu takiben, son bir kritik adım, pencere çerçevesinin girintisine yapıştırıcı yerleştirilmesidir. Bu adım sırasında hiçbir yapıştırıcının pankreas dokusuna temas etmemesi çok önemlidir, çünkü bu dokuya zarar verir ve görüntülemeyi karıştırır. Yapıştırıcının pankreas dokusuna temas etmesini de önleyebilecek potansiyel bir modifikasyon, cam lamel pencere çerçevesine yapıştırılması ve karın içine cerrahi implantasyondan önce her ikisinin de kurumasına izin vermektir.
SWIP, tüm intravital görüntüleme teknikleri gibi, dokudaki açıkça etiketlenmemiş diğer hücreler ve yapılar hakkında bilgi ortaya çıkarma yeteneğinde sınırlamalara sahiptir. Bununla birlikte, SWIP penceresinin floresan raportörlerle (bu çalışmada olduğu gibi ECFP eksprese eden epitel ve Dendra2 etiketli KPC hücreleri gibi) birleştirilmesi ve protein veya hücre durumlarının farmakolojik ve/veya optogenetik araçlarla kontrol edilmesi bu sınırlamaları ortadan kaldırabilir.
Ek olarak, SWIP pencere tasarımı, pencere çerçevesi üzerinde, seri görüntüleme30 sırasında ilgi alanlarını yeniden konumlandırmak için mikrokartografi için referans belirteçleri olarak hizmet eden üç kazınmış çizgi içerir. Bu, işaretlenmemiş dokuda bile aynı görüş alanını birden çok kez bulmayı sağlar.
Özetle, SWIP normal sağlıklı pankreas dokusunda kullanılabileceği gibi pankreatit ve PDAC gibi iyi huylu ve kötü huylu pankreas hastalıklarında da kullanılabilir. Tek hücreli ve hücre altı dinamikler, SWIP kullanılarak bu durumlarda yakalanabilir ve araştırmacıların PDAC'de metastatik yayılma gibi önemli fizyolojik olayları anlamalarına yardımcı olabilir. IVI'nin gelişmiş kalitesi ve stabilitesi, pankreasın patofizyolojisi ve hücre biyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlama potansiyeline sahiptir ve bu da onu umut verici ve faydalı bir araç haline getirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Evelyn Lipper Yardım Vakfı, Gruss-Lipper Biyofotonik Merkezi, Kanser Araştırmaları için Entegre Görüntüleme Programı, NIH T-32 Bursu (CA200561) ve Savunma Bakanlığı Pankreas Kanseri Araştırma Programı (PCARP) hibe PA210223P1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
| 5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
| 28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
| Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
| Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
| Cyano acrylate - Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
| Cyano acrylate - Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
| DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
| Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
| Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
| Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
| Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
| Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
| Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |
References
- Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A.
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).
- Peters, N. C., et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science. 321 (5891), 970-974 (2008).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).
- Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital. 5 (3), e1261773 (2016).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Entenberg, D., et al. time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Du, W., et al. SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas. Open Biology Journal. 12 (6), 210273 (2022).
- DeBold, T. A. M., James, W. How To Passivate Stainless Steel Parts. , https://www.mmsonline.com/articles/how-to-passivate-stainless-steel-parts (2003).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).
- Moral, J. A., et al. ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity. Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793 (2018).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments. (116), 54603 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), 55115 (2018).
- Gorelick, F. S., Lerch, M. M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).
- Dolai, S., et al. Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis. Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).
