חלון מיוצב להדמיה תוך חיונית של הלבלב המוריני

Summary

אנו מציגים פרוטוקול להשתלה כירורגית של חלון אופטי מיוצב להדמיה ברזולוציה תת-תאית של הלבלב המורין, המאפשר מחקרים סדרתיים ואורכיים של הלבלב הבריא והחולה.

Abstract

הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הלבלב מורכבות. מחלות הלבלב, כגון דלקת הלבלב ואדנוקרצינומה של הלבלב (PDAC) הן בעלות תחלואה ותמותה גבוהות. הדמיה תוך-חיונית (IVI) היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של רקמות הן במצב בריא והן במצב חולה, ומאפשרת תצפית בזמן אמת על הדינמיקה של התא. IVI של הלבלב המורין מציב אתגרים משמעותיים בשל האופי הקרבי העמוק והתואם של האיבר, מה שהופך אותו למועד מאוד לנזק ותנועה.

מתואר כאן תהליך ההשתלה של Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP). SWIP מאפשר IVI של הלבלב murine במצבים בריאים נורמליים, במהלך המעבר מהלבלב הבריא לדלקת לבלב חריפה הנגרמת על ידי cerulein, ובמצבים ממאירים כגון גידולים בלבלב. בשילוב עם תאים המסומנים גנטית או מתן צבעים פלואורסצנטיים, SWIP מאפשר מדידה של דינמיקה של תא בודד ותת-תאי (כולל הגירה חד-תאית וקולקטיבית) כמו גם הדמיה סדרתית של אותו אזור עניין במשך מספר ימים.

היכולת ללכוד נדידת תאי גידול היא בעלת חשיבות מיוחדת מכיוון שהגורם העיקרי לתמותה הקשורה לסרטן ב- PDAC הוא הנטל הגרורתי העצום. הבנת הדינמיקה הפיזיולוגית של גרורות ב- PDAC היא צורך קריטי שלא נענה וחיוני לשיפור הפרוגנוזה של המטופל. בסך הכל, SWIP מספק יציבות הדמיה משופרת ומרחיב את היישום של IVI בלבלב בריא ומחלות לבלב ממאירות.

Introduction

מחלות לבלב שפירות וממאירות עלולות לסכן חיים, עם פערים ניכרים בהבנת הפתופיזיולוגיה שלהן. דלקת הלבלב - דלקת בלבלב - היא הגורם השלישי בחשיבותו לאשפוזים ואשפוזים חוזרים הקשורים למחלות במערכת העיכול בארה"ב והיא קשורה לתחלואה משמעותית, תמותה ונטל סוציו-אקונומי¹. מדורג כגורם השלישי המוביל למוות הקשור לסרטן², אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) מהווה את רוב הממאירויות בלבלב³ ומבשר על שיעור הישרדות גרוע של 5 שנים של 11% ^{בלבד 2}. הגורם המוביל לתמותה מסרטן ב-PDAC הוא עומס גרורתי עצום. למרבה הצער, רוב החולים נוכחים עם מחלה גרורתית. לכן, הבנת הדינמיקה של גרורות ב-PDAC היא צורך קריטי שלא נענה בתחום חקר הסרטן.

המנגנונים העומדים בבסיס הדלקת והמפל הגרורתי של הלבלב אינם מובנים היטב. תורם עיקרי לפער הידע הזה הוא חוסר היכולת לצפות בדינמיקה התאית של הלבלב in vivo. התבוננות ישירה בדינמיקה התאית הזו מבטיחה לחשוף מטרות קריטיות כדי למנף ולשפר את האבחון והטיפול בחולי מחלות לבלב.

הדמיה תוך-חיונית (IVI) היא טכניקת מיקרוסקופיה המאפשרת לחוקרים לדמיין ולחקור תהליכים ביולוגיים בבעלי חיים בזמן אמת. IVI מאפשר הדמיה ישירה ברזולוציה גבוהה של דינמיקה תוך-תאית ומיקרו-סביבתית in vivo ובתוך הסביבה הטבעית של התהליך הביולוגי המדובר. לכן, IVI מאפשר התבוננות in vivo של תהליכים בריאים ופתולוגיים.

שיטות הדמיה עכשוויות של כל הגוף כגון MRI, PET ו- CT מציעות תצוגות מצוינות של איברים שלמים ויכולות לחשוף פתולוגיות, עוד לפני הופעת הסימפטומים הקליניים⁴. הם אינם מסוגלים, עם זאת, להשיג רזולוציה של תא בודד או לחשוף את השלבים המוקדמים ביותר של מחלה - לבלב או ממאירות.

מחקרים קודמים השתמשו ב- IVI ברזולוציה של תא יחיד כדי לצפות במחלות שפירות וממאירות של עור^5,6, שד⁷, ריאות⁸, כבד⁹, מוח 10 וגידולי לבלב 11^, מה שהוביל לתובנות לגבי מנגנונים של התקדמות המחלה ¹². עם זאת, הלבלב המוריני מציב מכשולים משמעותיים להשגת רזולוציה של תא בודד באמצעות IVI, בעיקר בשל מיקומו הקרבי העמוק והתאימות הגבוהה שלו. יתר על כן, זהו איבר מסועף ומפוזר בתוך המזנטריה המתחבר לטחול, למעי הדק ולקיבה, מה שהופך אותו למאתגר לגישה. הרקמה גם רגישה מאוד לתנועה הנגרמת על ידי פריסטלטיקה סמוכה ונשימה. מזעור התנועה של הלבלב חיוני למיקרוסקופיה ברזולוציה של תא יחיד, מכיוון שתוצרי תנועה של אפילו מיקרונים בודדים יכולים לטשטש ולעוות תמונות, מה שהופך את המעקב אחר הדינמיקה של תאים בודדים לבלתי אפשרי¹³.

כדי לבצע IVI, חלון הדמיה בטני (AIW) חייב להיות מושתל בניתוח ^9,11. כדי להשתיל את AIW בניתוח, מסגרת חלון מתכת נתפרת לתוך דופן הבטן. לאחר מכן, האיבר המעניין מחובר למסגרת באמצעות דבק ציאנואקרילט. בעוד שזה מספיק עבור כמה איברים פנימיים נוקשים (למשל, כבד, טחול, גידולים קשיחים), ניסיונות הדמיה של הלבלב הבריא של מורין נפגעים על ידי יציבות צידית וצירית לא אופטימלית בשל מרקם תואם הרקמה וארכיטקטורה מורכבת¹⁴. כדי להתמודד עם מגבלה זו, Park et ^al.14 פיתחו חלון הדמיה שתוכנן במיוחד עבור הלבלב הבריא. חלון הדמיה זה של הלבלב (PIW) ממזער את השפעת תנועת המעי והנשימה על ידי שילוב מדף מתכת אופקי בתוך מסגרת החלון, ממש מתחת לכיסוי הכיסוי, מייצב את הרקמה ושומר על המגע שלה עם זכוכית הכיסוי. בעוד שה-PIW מציע יציבות צידית מוגברת, מצאנו כי חלון זה עדיין מדגים סחף צירי ובנוסף מונע הדמיה של גידולים מוצקים גדולים בשל המרווח הצר בין מדף המתכת לכיסוי¹⁵.

כדי להתמודד עם המגבלות האלה, פיתחנו את ה-Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP), חלון הדמיה מושתל המסוגל להשיג הדמיה יציבה לטווח ארוך של הלבלב הבריא והחולה כאחד (איור 1)¹⁵. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף עבור ההליך הכירורגי המשמש להשתלת SWIP. למרות שהמטרה העיקרית הייתה לחקור את המנגנונים הדינמיים המעורבים בגרורות, ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור היבטים שונים של ביולוגיה ופתולוגיה של הלבלב.

Protocol

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות לשימוש בבעלי חוליות, כולל אישור מראש של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה (IACUC).

1. פסיבציה של חלונות

הערה: פסיבציה של נירוסטה מנקה את המתכת ממזהמים ויוצרת שכבת תחמוצת דקה המגבירה מאוד את התאימות הביולוגית של המתכת לרקמות רכות, אפילו מעבר לזו של טיטניום¹⁶.

1. התחל את תהליך הפסיבציה על ידי שטיפת מסגרות החלון האופטיות בתמיסת דטרגנט פעילה אנזימטית 1% (w/v).
2. טבלו את המסגרות בתמיסת נתרן הידרוקסידי 5% (w/v) בטמפרטורה של 70°C למשך 30 דקות בתוך צנצנת זכוכית.
3. הוציאו את המסגרות ושטפו אותן במים נטולי יונים.
4. טבלו את המסגרות בתמיסת חומצת לימון בטמפרטורה של 7% (w/v) בטמפרטורה של 55°C למשך 10 דקות בתוך צנצנת זכוכית חדשה.
5. הסירו את המסגרות ושטפו אותן שוב במים שעברו דה-יוניזציה.
6. חזור על שלב 1.2, ולבסוף, שטוף את מסגרות החלון עם מים נטולי יונים.

2. הכנה להשתלת גידול או ניתוח חלון

הערה: במחקרים על גידולי לבלב, יש להשתיל תאי גידול ולאפשר להם לגדול לגידולים גלויים. כדי לדמיין את תאי הגידול in vivo, מומלץ להשתמש בתאים ששונו גנטית כדי לבטא חלבונים פלואורסצנטיים כגון Dendra2. שימוש בתוויות חלבון פלואורסצנטיות בהירות יקטין בעיות פוטנציאליות עם אוטופלואורסצנטיות של רקמות. חלבונים פלואורסצנטיים פוטנציאליים אחרים, צבעים, ומודלים פלואורסצנטיים של עכברים מקודדים גנטית שניתן להשתמש בהם נדונו במקומות אחרים^17,18. כדי למנוע זיהום של שדה הניתוח, בצע את ההליך הכירורגי במכסה מנוע או בארון זרימה למינרי וודא כי אזורים נפרדים משמשים להכנה, ניתוח והתאוששות.

1. לפני הניתוח, לעקר את כל כלי הניתוח באוטוקלאב, ואם יש צורך, להשתמש מעקר חרוזים חם עבור הליכים הבאים. ודא כי הניתוח משתמש בטכניקה של טיפים בלבד.
2. הפעל את כרית הניתוח המחוממת ואת מעקר החרוזים והמתן עד שיגיע לטמפרטורת ההפעלה המתאימה. יש לנטר את טמפרטורת כרית החימום באמצעות מדחום משטח כדי למנוע כוויות פוטנציאליות. הניחו מטלית סטרילית על כרית החימום אם לא ניתן לשלוט כראוי בטמפרטורה.
   הערה: טמפרטורת הגוף במהלך הליכים קצרים (≤20 דקות), כגון השתלת גידול וחלון, מושפעת באופן מינימלי בעת שימוש בכרית כירורגית מחוממת. עם זאת, תקופות ארוכות יותר של הרדמה, כגון במהלך הדמיה ממושכת, דורשות להכניס את העכבר לתא מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
3. מרדימים את העכבר עם 5% isoflurane בתא הרדמה.
4. שלב קריטי: הורידו את כמות ההרדמה ל-2% ברגע שהעכבר מאבד את הכרתו. עקוב בקפידה אחר רמת ההרדמה ואחר חיוניות העכבר (למשל, באמצעות מד דופק)¹⁹.
5. יש להניח טיפה קטנה של חומר סיכה לעיניים על כל עין של העכבר כדי למנוע התייבשות הקרנית.
6. לפני הניתוח, יש למרוח קרם מסיר שיער בנדיבות על הבטן השמאלית העליונה כדי להסיר שיער. לאחר 20 שניות, יש להשתמש בנייר טישו לח כדי לנגב היטב את השיער ואת קרם depilatory. חזור על התהליך לפי הצורך עד להסרת כל השיער מאזור הניתוח.
7. הזריקו 10 μL של buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) מדולל ב 90 μL של PBS תת עורית כדי להבטיח שיכוך כאבים לפני הניתוח.

3. השתלת גידול בלבלב

1. להכין aliquots של תאים סרטניים בריכוז הרצוי (מבוסס על זמן הכפלת תאי הגידול). מניחים את תרחיף התא במזרק אינסולין ושומרים אותו על קרח. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש ב- 10⁶ תאי גידול סינגניים KPC 20 מרחפים במקסימום של 50 מיקרוליטר PBS, בהתאם לפרוטוקול ההזרקה האורתוטופית שהותאם מ- Erstad et^al.21
   הערה: קו תאים זה שהוחדר בריכוז זה ייצר באופן שגרתי גידולים מוחשיים או גדולים כראוי במשך 10-14 ימים. יהיה צורך להעריך תת-שיבוטים של קו תאים זה וקווי תאים אחרים של הלבלב עבור ריכוזים ולוחות זמנים מתאימים כדי לייצר גידולים בגודל מתאים).
2. לשטוף ידיים באמצעות סבון חיטוי.
3. לפני כל ניתוח חדש, יש ללבוש כפפות סטריליות חדשות.
4. מעבירים את העכבר למכסה המנוע הכירורגי הסטרילי ומניחים אותו במצב דקוביטוס צדדי ימני חלקי.
5. אבטחו את הגפיים בעזרת נייר דבק.
   הערה: שימוש נכון במכשירים חשוב לאורך כל ההליך. דוגמאות להחזקת מלקחיים, מספריים של Castroviejo וכלי איסוף ואקום מוצגות באיור 2A-C.
6. עיקרו את הבטן באמצעות חומר חיטוי (איור 2D).
7. ודא שבעל החיים מורדם לחלוטין על ידי ביצוע בדיקת צביטת בוהן.
8. בצעו חתך תת-קוסטלי שמאלי בקוטר 10-15 מ"מ בעור באמצעות מלקחיים ומספריים של Castroviejo (איור 2E).
9. שליטה בהמוסטאזיס באמצעות צמר גפן או עט צמר גפן כאשר / היכן שנדרש הצורך.
10. חלקו בזהירות את השריר התחתון בעזרת מלקחיים ומספריים של Castroviejo כדי להיכנס לצפק (איור 2F).
11. באמצעות צמר גפן סטרילי, להחצין באופן א-טראומטי את הלבלב והטחול.
12. הוציאו את הלבלב החוצה כך שלא יהיו קפלים (איור 2G).
13. זהה את אתר הזרקת הגידול הרצוי בגוף או בזנב הלבלב (הרחק מכלי הדם).
14. שלב קריטי: לאחר מיקום זהיר של הלבלב, השתמשו במלקחיים כדי לספק מתח לרקמה והכניסו את קצה מזרק האינסולין, כשהשיפוע פונה כלפי מעלה, לאתר הרצוי של הלבלב לעומק של 4-5 מ"מ (איור 2H).
15. להזריק לאט את תמיסת תאי הגידול. חפשו בועה קטנה שמאשרת הזרקה מוצלחת (איור 2I).
16. החזירו בזהירות את הלבלב לבטן מבלי להפריע לבועת הזרקת תאי הגידול (איור 2J).
17. באמצעות תפרים נספגים של 5-0 פולידיוקסאנון, סגרו תחילה את שכבת השריר ולאחר מכן את העור באמצעות תפרים קטועים (איור 2K-N).
18. כסו את החתך בדבק ציאנואקרילט (איור 2O), ואז החזירו את העכבר לכלוב נקי מתחת למנורת חימום לצורך התאוששות. מתן אנטיביוטיקה במי שתייה כדי למנוע זיהום. עקוב אחר העכברים ואפשר להם להתאושש לחלוטין מהניתוח.
    הערה: אנטיביוטיקה ניתנת כנדרש על פי פרוטוקול IACUC. כל בעלי החיים שוכנים בנפרד.
19. לאפשר לגידול להתפתח במשך 10-14 ימים עד שהוא מוחשי דרך דופן הבטן.

4. ניתוח חלון לבלב

1. כאשר בעלי החיים מוכנים להדמיה, התחל בניתוח השתלת חלון. כדי להתחיל, לשטוף ידיים עם סבון חיטוי.
2. לפני כל ניתוח חדש, יש ללבוש כפפות סטריליות רעננות.
3. על מעמד כירורגי מחומם, הניחו את העכבר במצב דקוביטוס צדדי ימני כדי לחשוף את הבטן השמאלית.
4. עוגן את הגפיים הקדמיות והאחוריות של העכבר לשלב הניתוח המחומם בצורה גולגולתית וקאודלית באמצעות נייר דבק. ודאו שהטחול (מתחת לעור) נראה בתוך שדה הניתוח (איור 3A).
5. כדי לשמור על סטריליות, פרקו את כל כלי הניתוח במכסה המנוע.
6. לחטא את אתר הניתוח על ידי ספוג העור של העכבר עם יישום נדיב של חיטוי.
7. ודא שבעל החיים מורדם לחלוטין על ידי ביצוע בדיקת צביטת בוהן.
8. שלב קריטי: הרימו את עור הרביע העליון השמאלי של הבטן בעזרת מלקחיים ובצעו חתך מעגלי ~10 מ"מ בעור ובשרירים באמצעות מספריים של Castroviejo (איור 3B,C).
9. לשלוט על הדימום ולשמור על hemostasis באמצעות צמר גפן או עט cautery, במידת הצורך.
10. למקם את הלבלב, אשר מחובר לטחול, ולזהות את הכיוון הלבלב מונח בתוך החתך כדי להחליט היכן יש למקם את התפר הצולב.
11. באמצעות תפר משי 5-0, מניחים את התפר הראשון במיקום הרצוי בשכבת השריר. תיקו זה עם 3-5 קשרים. (איור 3D,E)
12. ממשיכים לתפור ישירות לרוחב החתך. חתכו והשאירו זנב של ~5 ס"מ (איור 3F).
13. חזור על שלבים 4.11 ו-4.12 בניצב לתפר הראשון (איור 3G,H).
14. שלב קריטי: הרימו ומקמו בעדינות את הלבלב מעל התפר הצולב, (איור 3I,J). היזהר לא לפגוע בלבלב במהלך מניפולציה.
15. שלב קריטי: באמצעות תפר משי 5-0, בצעו תפר של חוט ארנק ~1 מ"מ מהחור, באופן היקפי, תוך שזירה של העור ושכבת השריר (איור 3K).
16. מקמו את מסגרת החלון כך שקצוות החתך העגול יהיו בתוך החריץ של החלון (איור 3L).
17. הדקו את החלון המושתל על ידי קשירה חזקה של משי 5-0.
18. יש להעמיס 100 μL של דבק ציאנואקרילט נוזלי לתוך מזרק 1 מ"ל.
19. יבש את הרקמה על ידי החלת זרימה עדינה של אוויר דחוס במשך ~ 10 שניות.
20. אחזו את מסגרת החלון בקצה החיצוני שלה במלקחיים והרימו אותה בעדינות כדי להבטיח הפרדה של הלבלב מתחת לפני השטח של מסגרת החלון.
21. שלב קריטי: הניחו שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט נוזלי לאורך שקע החלון (איור 3M). הקפד לא לקבל שום דבק על רקמת הלבלב.
22. באמצעות טנדרים ואקום, הרימו את הכיסוי בקוטר 5 מ"מ.
23. הניחו בזהירות את הכיסוי בתוך השקע במרכז מסגרת החלון האופטי. החזק בלחץ קל, ומאפשר לדבק הציאנואקרילט להתקבע (~ 25 שניות).
24. יש להפריד את הכיסוי מאיסוף הוואקום באמצעות מלקחיים.
25. הדקו את התפרים הצולבים כדי להצמיד את הלבלב היטב למכסה (איור 3N,O). הערה: אין להדק יתר על המידה את התפר הצולב, שכן הוא עלול לגרום נזק ואיסכמיה ללבלב.
26. חותכים את קצות התפר.
27. הפשיט את הקלטת מהעכבר.
28. כבו את מכשיר האידוי איזופלורן.
29. העבר את העכבר לכלוב נקי או ישירות למיקרוסקופ התוך-חיוני.
30. שכן את בעלי החיים בנפרד לאחר ניתוח החלון והשגיח עליהם עד להחלמה מלאה.
31. לאחר מכן מתבצעת הדמיה במיקרוסקופ מולטיפוטון בעל שני לייזרים כפי שתיארנו בעבר ^22,23,24 עבור מפגשי הדמיה ארוכים העכבר ממוקם בתא מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ומסופק עם נוזלים תומכים בהתאם לתקני IACUC.

5. טיפול Cerulein עבור אינדוקציה של הלבלב

1. כדי לחקור את הופעת הלבלב, לטפל בעכברים בריאים עם cerulein לאחר ההשתלה של SWIP. ודא כי העכברים צמים במשך 14-18 שעות ונותנים להם מים ad libitum לפני מתן cerulein.
2. הזריקו 50 מיקרוגרם/ק"ג של צרולין ב-100 מיקרוליטר של DPBS סטרילי 1x תוך צפקי במרווחים של שעה למשך עד שמונה זריקות. יש לתת נפח שווה ערך של 1x DPBS בלבד, המוזרק תוך צפקית, לעכברי הביקורת.
3. לאחר ההדמיה, יש להקריב את העכברים 24 שעות לאחר הזריקה הראשונה על ידי פריקת צוואר הרחם בהתאם לתקני IACUC.
4. בצע הדמיה במיקרוסקופ מולטיפוטון דו-לייזר כמתואר לעיל^22,23,24. למפגשי הדמיה ארוכים, הניחו את העכבר בתא מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ולספק לו נוזלים תומכים בהתאם לתקני IACUC.

Representative Results

איור 1, שהותאם מ-Du et ^al.15, מראה תמונות סטילס מסרט IVI בהילוך מהיר של הלבלב המורין. ניתן לראות תנועה מסוימת של רקמות במהלך תקופת השקיעה הראשונית (השעה הראשונה של ההדמיה, איור 1A). אולם עם המשך ההדמיה לאחר תקופת השקיעה הזו (>75 דקות), ראינו עלייה ביציבות הצידית והצירית (איור 1B). השוואת היציבות של SWIP עם חלונות הדמיה קודמים של AIW ו- PIW מזהה שכל החלונות דורשים פרק זמן ראשוני לשיקוע. עם זאת, SWIP הציג את הרמה הנמוכה ביותר של סחף באופן כללי, והוא מתאים ביותר להדמיה לטווח ארוך (איור 1C-K). התמונות נוצרו במיקרוסקופ מולטיפוטון מותאם אישית²⁴ המאיר ב 880 ננומטר ומקבל z stack-t lapse (גודל שדה ראייה [FOV] = 340 x 340 מיקרומטר, גודל פיקסל 0.67 מיקרומטר) עם 1.7 דקות בין פריימים, 11 פרוסות עם גודל צעד של 2 מיקרומטר, 20 עומק הדמיה ו~ 1 פרוסה לשנייה. כוח לייזר ורווחי צינור מכפיל אור (PMT) נבחרו כדי למקסם את האות תוך מזעור הלבנה ונזקי אור.

שלבי ההליכים הכירורגיים המתארים השתלת גידול בלבלב והחדרת חלון לבלב לאחר מכן מתוארים באיור 2 ובאיור 3, בהתאמה. חשוב לציין ששני הניתוחים הם ניתוחי הישרדות. לאחר השתלתו הנכונה, הלבלב יישאר מחובר לחלון האופטי, המשולב כעת בתוך דופן הבטן. הדבר מאפשר הישרדות נוחה של העכבר ומאפשר הדמיה רציפה של עד 12 שעות, כפי שמתיר הפרוטוקול. בנוסף, ניתן לבצע הדמיה סדרתית במשך מספר ימים רצופים (עד לקצבת פרוטוקול של שבועיים) כדי לעקוב אחר אזורי עניין לאורך זמן. הדמיה תוך-חיונית (IVI) יכולה להתבצע דרך החלון באופן דומה לחלונות אחרים שתוארו קודם לכן^22,25,26.

SWIP ניתן להשתמש כדי לחקור את הדינמיקה עם תחילת דלקת הלבלב חריפה המושרה באמצעות cerulein. Cerulein הוא oligopeptide עם מבנה ותפקוד דומה לזה של cholecystokinin (CKK) והוא נמצא בשימוש נרחב כדי לגרום באופן ניסיוני דלקת לבלב חריפה מכרסמים²⁷. הטיפול בצרולין גורם להתכווצות השריר החלק במערכת העיכול וממריץ הפרשות קיבה ולבלב²⁸. יתר על כן, ניהול intraperitoneal של cerulein מוביל ללבלב נפיחות והגדלה²⁹.

איור 4 מראה הדמיה סדרתית של לבלב מורין לאחר טיפול בצרולין, תוך שימוש בפרוטוקול SWIP. הלבלב המורין מוצג ברזולוציה של תא בודד באמצעות תיוג פלואורסצנטי גנטי (ECFP המסומן epithelia-MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP עכברים טרנסגניים), ומתן צבעים בעלי משקל מולקולרי גבוה (155 kD dextran-TMR) להגדרת כלי דם מקומיים, המסומנים בקווים צהובים מוצקים. עיצוב החלון, ששימש בעבר להדמיית ריאות^{מורין 8}, כולל שלושה קווים חרוטים על המסגרת (איור 4, כניסה) המשמשים כסמנים פידוקיאליים המאפשרים שימוש במיקרוקרטוגרפיה³⁰. מיקרוקרטוגרפיה מאפשרת הדמיה סדרתית של אותו אזור עניין של הלבלב המורין במשך מספר ימים. כאן אותה לובולה של הלבלב (קווים מקווקווים צהובים) מוצגת ביום 1 וממוקמת מחדש ביום 2, כפי שמעידה נוכחותם של אותם כלי דם מקומיים (איור 4). התמונות נרכשו בכל יום כערימת z אחת עם 11 פרוסות וגודל צעד של 2 מיקרומטר ב~1 פרוסה לשנייה, שצולמו בהארה של 880 ננומטר ורזולוציה של 0.67 מיקרומטר לפיקסל (FOV = 340 x 340 מיקרומטר). כוח לייזר ורווחי PMT נבחרו כדי למקסם את האות תוך מזעור הלבנה ונזקי אור.

בנוסף לדימות סדרתי, SWIP מתאים היטב לדימות אורכי ארוך טווח, המאפשר מעקב ומדידה מדויקים של הדינמיקה של מבנים תת-תאיים (כגון vacuoles) בתנאי בקרה וטיפול. כאן, vacuoles הם אזורים שבהם חלבונים פלואורסצמיים ציטופלזמיים אינם נכללים, מה שגורם לחורים כהים לא מסומנים להופיע (איור 5A). סימון של vacuoles באמצעות תוכנה כגון ROI Tracker²⁴, מאפשר ויזואליזציה של תנועתיות vacuole (איור 5A,B) וכימות של פרמטרים רבים של תנועתיות. לדוגמה, המהירות הממוצעת של vacuoles בלבלב murine עלתה בכ -10% לאחר הטיפול עם cerulein כדי לגרום ללבלב, בהשוואה לטיפול PBS (0.37 ± 0.07 מיקרומטר / דקה לעומת 0.41 ± 0.09 מיקרומטר / דקה, p = 0.02) (איור 5C). טיפול Cerulein גם הגדיל את תדירות הפנייה הממוצעת של מבנים תת-תאיים ב -10% לעומת טיפול PBS (2.3 ± 0.3 deg/min לעומת 2.6 ± 0.6 deg/min, p = 0.04) (איור 5F). עם זאת, לא היה הבדל משמעותי (p > 0.05) במהירות נטו, כיווניות, או מרחק מצטבר שעבר בין טיפול cerulein לטיפול PBS (איור 5D,E ואיור 5G). התמונות נוצרו במיקרוסקופ מולטיפוטון מותאם אישית²⁴ המאיר ב 880 ננומטר ומקבל שקע z stack-t (גודל FOV = 340 x 340 מיקרומטר, גודל פיקסל 0.67 מיקרומטר) עם 2.9 דקות בין מסגרות, 11 פרוסות עם גודל צעד של 2 מיקרומטר, ו~ 1 פרוסה לשנייה.

לבסוף, SWIP מאפשר הדמיה ולכידה של נדידת תאי גידול. איור 6A מראה סטילס מסרט בהילוך מהיר (וידאו משלים S1 ווידאו משלים S2) של הנדידה בתוך הלבלב של Dendra-2 המסומן כתאי גידול KPC שהוזרקו באופן אורתוטופי. ניתן לצפות הן בהגירה קולקטיבית של תאים בצבירים (איור 6B ווידאו משלים S1) והן בנדידה של תא בודד (איור 6C ווידאו משלים S2) בפרקי זמן קצרים (<1 שעות). התמונות נוצרו במיקרוסקופ מולטיפוטון שנבנה בהתאמה אישית²⁴ המאיר ב 880 ננומטר ומקבל קיטוע ערימה 4 x 4 mosaic-z עם חפיפה של 20% בין אריחים (גודל אריח = 340 x 340 מיקרומטר), 3.4 דקות בין מסגרות, 3 פרוסות עם גודל צעד של 5 מיקרומטר, ו~ 1 פרוסה לשנייה. כוח לייזר ורווחי PMT נבחרו כדי למקסם את האות תוך מזעור הלבנה ונזקי אור.

איור 1: יציבות משופרת של הדמיה עקב SWIP. (A) תמונות סטילס מתוך 72 הדקות הראשונות של סרט בהילוך מהיר של הלבלב שצולם באמצעות SWIP. ניתן להבחין בסחף צירי אך מעט מאוד רוחבי. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) הדמיה מתמשכת לאחר 72 דקות מראה רמה גבוהה של יציבות צירית וצידית. (א,ב) אדום = 155 kDa tetramethylrhodamine דקסטרן מסומן בסרום הדם, ציאן = תאי לבלב עם תווית CFP (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP עכברים טרנסגניים) (C-E) השוואה של היציבות הצידית של כל אחד מחלונות הדימות של הלבלב במהלך השעה הראשונה של הדמיה עבור (C) AIW, (D) PIW ו-(E) SWIP. (פ-ח) השוואה של היציבות הצידית של כל אחת מהדמיות הלבלב במהלך 150 הדקות הבאות עבור (F) AIW, (G) PIW ו- (H) SWIP. כניסות הן תצוגות מוגדלות של התרשימים המתאימים. (ט-ק) השוואה של היציבות הצירית של כל אחד מחלונות ההדמיה של הלבלב במשך 120 הדקות הראשונות של הדמיה עבור (I) AIW, (J) PIW ו- (K) SWIP. איור זה לקוח מתוך Du et al. Open Biology 2022, DOI:10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273. ¹⁵. קיצורים: SWIP = חלון מיוצב להדמיה תוך חיונית של הלבלב; AIW = חלון הדמיה בטן; PIW = חלון הדמיה הלבלב; CFP = חלבון פלואורסצנטי ציאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: סקירה כללית של פרוטוקול הניתוח של הזרקה אורתוטופית של תאי אדנוקרצינומה צינורית הלבלב (KPC). (A) המחשה כיצד להחזיק מלקחיים כירורגיים. (B) איור כיצד להחזיק מספריים של Castroviejo. (C) המחשה כיצד להחזיק את כלי איסוף הוואקום. (D) חיטוי העור. (E) חתך בעור. (F) חתך בשריר. (G) לבלב משוחק. (H) החדרת מחט לאתר ההזרקה הרצוי. (I) הזרקה של תרחיף תאים סרטניים היוצר בועה (חץ כחול). (J) הלבלב חזר לחלל הצפק. (יא,ל) סגירת שכבת השריר בתפר משי קטוע. (ז,נ) סגירת העור בתפר משי קטוע. (O) דבק ציאנואקרילט שנמרח על החתך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: סקירה כללית של פרוטוקול הניתוח של החלון המיוצב להדמיית הלבלב . (A) זיהוי הטחול והלבלב המחובר. (ב,ג) חתך מעגלי בעור ובשריר. קווים מקווקווים אדומים ב- A-C מציינים את קווי המתאר של הטחול שניתן לראות דרך דופן הבטן והעור. (ד,ה) תפר ראשון של סל תפר צולב מונח ונקשר בשכבת השריר (E, חץ צהוב). (F) התפר נמשך לצד הנגדי של חתך השריר, ומשאיר זנב (חץ לבן). (ז,ח) תפר שני מונח בניצב לראשון, קשור בקצה אחד (חצים צהובים) ומשאיר זנב (חצים לבנים). (ט,י) מיקום הלבלב בסל התפרים הצולבים. (K) תפר ארנק-חוט היקפי דרך השרירים והעור. (יב) השתלת מסגרת החלון. (יג) מריחת דבק על מסגרת החלון. (יד) חיבור של חיפוי זכוכית. (O) קצות הזנב של התפר הצולב. (P) SWIP מושתל לחלוטין. קיצור: SWIP = חלון מיוצב להדמיה תוך חיונית של הלבלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מיקרוקרטוגרפיה המשמשת להדמיה סדרתית כדי למקם מחדש את אותם אזורי עניין בתוך החלון האופטי. הדמיה תוך חיונית של אזור יחיד בלבלב מורין, המראה את אותה לובולה שהועברה במשך יומיים רצופים (D1-D2) באמצעות מיקרוקרטוגרפיה. קווים מקווקווים צהובים מתווים את גבולותיה של אותה לובולה. הקווים המוצקים מדגישים את אותם כלי דם (כפי שמעידה נוכחותו של סרום דם מסומן אדום בתוך הלומן) שזוהו בכל יום רצוף. אדום = 155 kDa tetramethylrhodamine dextran מסומן בסרום הדם, ציאן = CFP מסומן תאי הלבלב (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP עכברים טרנסגניים) (כניסה) תמונה של SWIP עם שריטות עבור מיקרוקרטוגרפיה. השימוש במיקרוקרטוגרפיה למיקום מחדש של אזורי עניין במהלך הדמיה סדרתית מותר על ידי שלושת הקווים החרוטים על מסגרת החלון (כניסה). פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: רזולוציה תת-תאית ומדידת דינמיקה תת-תאית באמצעות SWIP. (A) תאים בודדים (קווי מתאר צהובים מקווקוים) ומבנים תת-תאיים כגון vacuoles יכולים להיות מוצגים באמצעות SWIP לאורך זמן בלבלב מורין. דוגמאות של vacuoles אלה מסומנים על ידי חצים צהובים. לפיכך, SWIP מאפשר מעקב אחר מבנים תת-תאיים (קווי מתאר צבעוניים ורצועות על גבי התמונה הפלואורסצנטית) לאורך זמן. הכניסה היא תצוגה מוגדלת של אזור קופסה צהוב המציג שלושה vacuoles מסומנים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) מסלולים של מבנים תת-תאיים, כגון גרעינים וחללים (מסומנים ב-A), לאחר הסטת קואורדינטות לנקודת המוצא. קו מקווקו אדום מציג את נתיב הרשת הממוצע בשעה אחת (3.46 מיקרומטר). כימות הפרמטרים הדינמיים של (C) מהירות ממוצעת, (D) נתיב נטו, (E) כיווניות, (F) תדירות פנייה ממוצעת ו-(G) מרחק מצטבר. אדום = 155 kDa tetramethylrhodamine dextran מסומן בסרום דם, ציאן = תאי לבלב עם תווית CFP (עכברים טרנסגניים MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP). קיצורים: SWIP = חלון מיוצב להדמיה תוך חיונית של הלבלב; CFP = חלבון פלואורסצנטי ציאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: לכידת נדידת תאים באמצעות SWIP . (A) תמונת סטילס מסרט הדמיה תוך-חיוני של הלבלב במודל עכבר מוזרק אורתוטופית של PDAC. (B) תמונות סטילס מסרטון משלים S1 המציגות דוגמה של תאי גידול שעוברים הגירה קולקטיבית (חץ צהוב). (C) תמונות סטילס מסרטון משלים S2 המציגות דוגמאות לנדידה חד-תאית של תא גידול (חץ צהוב) ומקרופאג (חץ אדום). ירוק = תאי גידול המסומנים Dendra2, כחול = מקרופאגים המסומנים ב- CFP, אדום = 155 kDa tetramethylrhodamine נסיוב דם המסומן על ידי דקסטרן. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר (A), 15 מיקרומטר (B,C). קיצורים: SWIP = חלון מיוצב להדמיה תוך חיונית של הלבלב; CFP = חלבון פלואורסצנטי ציאן; PDAC = אדנוקרצינומה של הלבלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו משלים S1: סרט הדמיה תוך-חיוני בהילוך מהיר המראה תאים סרטניים עוברים הגירה קולקטיבית המתאימה לאיור 6B. ירוק = תאי גידול המסומנים Dendra2, כחול = מקרופאגים המסומנים ב- CFP, אדום = 155 kDa tetramethylrhodamine נסיוב דם המסומן על ידי דקסטרן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים S2: סרט הדמיה תוך-חיוני בהילוך מהיר המראה תאים סרטניים שעוברים נדידת תא בודד המתאימה לאיור 6C. ירוק = תאי גידול המסומנים Dendra2, כחול = מקרופאגים המסומנים ב- CFP, אדום = 155 kDa tetramethylrhodamine נסיוב דם המסומן על ידי דקסטרן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

פרוטוקול SWIP המתואר כאן מספק שיטה משופרת לייצוב רקמת הלבלב על ידי שימוש בטכניקת סל תפר צולב. חלונות דימות בטן מוקדמים (AIWs) אפשרו הדמיה תוך חיונית (IVI) של איברים פנימיים של הבטן, אך לא הגבילו במידה מספקת את תנועת הרקמות הרכות כגון הלבלב. בתגובה, פארק ועמיתיו פיתחו חלון הדמיה לבלב (PIW) המשלב מדף מתכת אופקי ומאפשר ייצוב משופר של רקמת הלבלב תוך שמירה על מגע עם כיסוי הזכוכית. בעוד שגישה זו משפרת את היציבות הרוחבית, היא מגבילה הדמיה של גידולי לבלב מוצקים מכיוון שגודלם עולה על המרווח הצר בין המדף לזכוכית הכיסוי. SWIP מטפל בבעיה זו על ידי ייצוב הלבלב עם סל תפר צולב, הגבלת התנועה הצירית והצידית, תוך יכולת להכיל גידולים מוצקים גדולים (≤10 מ"מ).

השוואות ישירות של SWIP עם חלונות הדמיה קודמים כגון AIW ו- PIW נערכו בעבר¹⁵. זה מוצג באיור 1, שהותאם מ-Du et ^al.15, שבו כומתו שינויים רוחביים וציריים על-ידי מעקב אחר מאפיינים אנטומיים תאיים כמו גרעינים או כלי דם. כל חלונות ההדמיה הראו צורך בתקופה של שקיעה בערך בשעה הראשונה של ההדמיה. במהלך תקופה זו, נצפתה רמה גבוהה יותר של תנועה לרוחב עם AIW ו- PIW בהשוואה ל- SWIP. שינוי צירי גדול יותר נצפה גם עם AIW ו- PIW בהשוואה ל- SWIP במשך תקופה של שעתיים. בסך הכל, SWIP הציג את רמת הסחף הנמוכה ביותר והוא מתאים להדמיה לטווח ארוך (≤12 שעות).

למרבה הצער, הלבלב הוא רקמה מפוזרת מאוד, וככזה, פונקציית ההתפשטות הנקודתית של המיקרוסקופ הרב-פוטוני המשמש ב- IVI מתפרקת במהירות עם החדירה לרקמה. לפיכך, עומק ההדמיה עם כל אחד מהחלונות האופטיים מוגבל רק ~ 30-60 מיקרומטר. IVI נושאת גם את הסיכון של נזק המושרה על ידי אור לדגימה. ניתן לבדוק זאת בתחילת מפגשי הדמיה על ידי רכישת סדרת זמן של 100 תמונות וחיפוש סימנים של הלבנה או נזקי אור. במערכת המיקרוסקופ שלנו, מצאנו כי ניתן להשתמש בהספק מרבי של ~15 mW בדגימה מבלי להשפיע לרעה על הרקמה.

פרוטוקול SWIP מאפשר IVI אופטי יציב, ברזולוציה גבוהה, חד-תאי של הלבלב המורין הן בתנאים בריאים רגילים, והן במצבים חולים כגון דלקת הלבלב ו- PDAC. זה הופך את SWIP שימושי במיוחד עבור הדמיה בחלוף זמן רב, כמו גם לביצוע הדמיה תלת ממדית ו 4D (3D + זמן) על ידי לכידת פרוסות z מרובות (תוך ניצול יכולות החתך האופטי המובנות של מולטיפוטון ומיקרוסקופ קונפוקלי). על ידי הפעלת הדמיה in vivo של תאים בודדים והאינטראקציות שלהם עם המרכיבים התאיים של הלבלב, IVI ברזולוציה גבוהה יוכיח את עצמו כבעל ערך רב להבנת המנגנונים העומדים בבסיס מחלות הלבלב.

יש צורך ברמה מסוימת של מומחיות טכנית כדי לבצע את פרוטוקול SWIP. עם זאת, עם תרגול נכון ותשומת לב לשלבי מפתח, ניתן לבצע את ההליך עם אחוזי הצלחה גבוהים. כדי לדמיין את הלבלב הממאיר, חשוב תחילה לקבל גידול מושתל בהצלחה. זה מתקבל על ידי הזרקה אורתוטופית של השעיה של תאי סרטן הלבלב מורין לתוך הלבלב של העכבר. זריקה מוצלחת נצפתה כאשר הפרנכימה של הלבלב מתנפחת לבועה מלאה בנוזל ותוארה בפירוט בעבר²¹. כדי להבטיח הצלחה והישרדות מקסימלית, חיוני שתהיה דליפה מינימלית עד אפסית של תרחיף התא, שכן דליפה תפחית באופן דרמטי את גודל הגידול הפוטנציאלי, כמו גם תוביל לקרצינומטוזיס. בנוסף, הלבלב הוא איבר מאוד וסקולרי, עם כלי דם מסועפים רבים. זה קריטי כדי למנוע כל כלי דם כמו זה יגרום דימום המטומה לאחר מכן בלבלב ולעכב את צמיחת הגידול. במודל זה, השתמשנו בקו תאי PDAC סינגני הנגזר מעכברי KPC²⁰. זה מאפשר השתלת גידול בעכברים בעלי כשירות חיסונית. ניתן להשתמש בקווי תאי PDAC סינגניים אחרים בהתאם לזן העכבר שבו נעשה שימוש. ניתן להשתמש גם בקווי תאי PDAC אנושיים; עם זאת, זן העכבר חייב להיות מחוסן כדי למנוע דחייה של השתלת הגידול.

ניתן לשנות את גודל הגידולים העוברים הדמיה בפרוטוקול זה לפי הצורך. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בריכוז גבוה יותר של תאים סרטניים המושתלים בלבלב המורין כדי להשיג גידול גדול יותר או על ידי הארכת זמן הצמיחה של הגידול לפני השתלת חלון. במחקר זה, הזרקנו 10 6 תאי KPC PDAC ושתלנו את SWIP 10-14 ימים לאחר מכן, כאשר הגידולים היו מוחשיים. גידולים קטנים וגדולים יותר יכולים גם להיות מאוכלסים על ידי פרוטוקול SWIP זה באמצעות המיקום המתאים של הרקמה לתוך סל התפרים הצולבים.

מיקום מאובטח של חלון ההדמיה והלבלב הוא גם חיוני כדי לקבל הדמיה באיכות גבוהה ולהגביל את התנועה artifacts. הלבלב המוריני הרגיל תואם מאוד ונוטה לתנועה מנשימה ופריסטלטיקה סמוכה. כדי לטפל בכך ולהגביר את יציבות הלבלב בזמן ההדמיה, משתמשים בטכניקת סל תפר צולב^{שתוארה קודם לכן 31}. סל התפרים הצולבים נועד לחקות את השימוש של הגוף ברצועות. על ידי עריסת הרקמה כנגד כיסוי הזכוכית והפעלת לחץ צירי קבוע, היא מונעת תנועה צידית וצירית כאחד. כאשר מדובר בגידולים מוצקים גדולים יותר, ניתן לשנות את נקודת התמיכה והכיוון של התפר הצולב כדי להתאים בצורה הטובה ביותר לגודל ולמיקום הגידול לתמיכה אופטימלית.

הדמיה תת-אופטימלית יכולה להתרחש גם כאשר מסגרת החלון אינה מושתלת כראוי בבטנו של העכבר. מסגרת חלון המותאמת באופן רופף עלולה להוביל לקשיי הדמיה ולתוצרי תנועה. תפר מתאים של חוט ארנק יכול לטפל בבעיה זו על ידי אבטחת מסגרת החלון לבטן דרך העור ודופן הבטן. כדי למנוע קיפול יתר של העור בעת הידוק חוט הארנק, שלבי התפר צריכים להיות לא יותר מ -5 מ"מ בין צעדים הממוקמים לא יותר מ -1 מ"מ מקצה הרקמה, מה שמבטיח התאמה הדוקה סביב מסגרת החלון. לאחר תפר חוט הארנק, מיקום הלבלב בסלסלת התפרים הצולבים והשתלת מסגרת החלון, שלב קריטי אחרון הוא מיקום הדבק בתוך שסע מסגרת החלון. חשוב מאוד שבמהלך שלב זה, שום דבק לא יבוא במגע עם רקמת הלבלב מכיוון שהדבר יפגע ברקמה ויבלבל את ההדמיה. שינוי אפשרי שיכול גם למנוע מהדבק מגע עם רקמת הלבלב הוא להדביק את כיסוי הזכוכית למסגרת החלון ולאפשר לשניהם להתייבש לפני השתלה כירורגית בבטן.

ל-SWIP, כמו לכל טכניקות ההדמיה התוך-חיוניות, יש מגבלות ביכולתו לחשוף מידע על תאים ומבנים אחרים ברקמה שאינם מסומנים במפורש. עם זאת, שילוב חלון SWIP עם כתבים פלואורסצנטיים (כגון אפיתליה מבטאת ECFP ותאי KPC המסומנים Dendra2 כמו במחקר זה) ושליטה במצבי חלבון או תא עם כלים פרמקולוגיים ו / או אופטוגנטיים יכולים לבטל מגבלות אלה.

בנוסף, עיצוב חלון SWIP כולל שלושה קווים חרוטים על מסגרת החלון, המשמשים כסמנים פיקטיביים למיקרוקרטוגרפיה כדי למקם מחדש אזורי עניין במהלך הדמיה סדרתית³⁰. הדבר מאפשר לאתר את אותו שדה ראייה מספר פעמים, גם ברקמה לא מסומנת.

לסיכום, SWIP יכול לשמש ברקמת לבלב בריאה רגילה, כמו גם במחלות לבלב שפירות וממאירות כגון דלקת לבלב ו- PDAC. דינמיקה של תא בודד ותת-תאי יכולה להילכד במצבים אלה באמצעות SWIP ויכולה לסייע לחוקרים להבין אירועים פיזיולוגיים חשובים כגון הפצה גרורתית ב-PDAC. לאיכות וליציבות המשופרות של IVI יש פוטנציאל לספק תובנות יקרות ערך לגבי הפתופיזיולוגיה והביולוגיה התאית של הלבלב, מה שהופך אותו לכלי מבטיח ומועיל.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].