Finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino

Summary

Presentiamo un protocollo per l'impianto chirurgico di una finestra ottica stabilizzata a permanenza per l'imaging a risoluzione subcellulare del pancreas murino, consentendo studi seriali e longitudinali del pancreas sano e malato.

Abstract

La fisiologia e la fisiopatologia del pancreas sono complesse. Le malattie del pancreas, come la pancreatite e l'adenocarcinoma pancreatico (PDAC), hanno un'elevata morbilità e mortalità. L'imaging intravitale (IVI) è una potente tecnica che consente l'imaging ad alta risoluzione di tessuti sia in condizioni sane che malate, consentendo l'osservazione in tempo reale delle dinamiche cellulari. L'IVI del pancreas murino presenta sfide significative a causa della natura viscerale profonda e cedevole dell'organo, che lo rende altamente soggetto a danni e artefatti da movimento.

Di seguito è descritto il processo di impianto del P increasmurino (SWIP). Lo SWIP consente l'IVI del pancreas murino in stati di salute normali, durante la trasformazione dal pancreas sano a pancreatite acuta indotta da ceruleina, e in stati maligni come i tumori pancreatici. In combinazione con cellule geneticamente marcate o con la somministrazione di coloranti fluorescenti, lo SWIP consente la misurazione delle dinamiche a singola cellula e subcellulare (compresa la migrazione a singola cellula e collettiva), nonché l'imaging seriale della stessa regione di interesse per più giorni.

La capacità di catturare la migrazione delle cellule tumorali è di particolare importanza in quanto la causa primaria di mortalità correlata al cancro nel PDAC è il carico metastatico schiacciante. Comprendere le dinamiche fisiologiche delle metastasi nel PDAC è un'esigenza critica insoddisfatta e cruciale per migliorare la prognosi del paziente. Nel complesso, lo SWIP fornisce una migliore stabilità dell'imaging ed espande l'applicazione dell'IVI nelle malattie sane del pancreas e del pancreas maligno.

Introduction

Le malattie pancreatiche benigne e maligne sono potenzialmente pericolose per la vita, con notevoli lacune nella comprensione della loro fisiopatologia. La pancreatite, l'infiammazione del pancreas, è la terza causa principale di ricoveri ospedalieri e riammissioni correlati a malattie gastrointestinali negli Stati Uniti ed è associata a morbilità, mortalità e onere socioeconomico^sostanziali. Classificato come la terza causa di morte correlata al cancro 2, l'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) rappresenta la maggior parte delle neoplasie pancreatiche³ e fa presagire uno scarso tasso di sopravvivenza a 5 anni di solo l'11%². La principale causa di mortalità correlata al cancro nel PDAC è il carico metastatico schiacciante. Sfortunatamente, la maggior parte dei pazienti presenta una malattia metastatica. Pertanto, la comprensione delle dinamiche delle metastasi nel PDAC è un'esigenza critica insoddisfatta nel campo della ricerca sul cancro.

I meccanismi alla base dell'infiammazione e della cascata metastatica del pancreas sono poco conosciuti. Uno dei principali fattori che contribuiscono a questa lacuna nella conoscenza è l'incapacità di osservare le dinamiche cellulari pancreatiche in vivo. L'osservazione diretta di queste dinamiche cellulari promette di svelare bersagli critici per sfruttare e migliorare la diagnosi e il trattamento delle persone affette da malattie pancreatiche.

L'imaging intravitale (IVI) è una tecnica di microscopia che consente ai ricercatori di visualizzare e studiare i processi biologici negli animali viventi in tempo reale. IVI consente la visualizzazione diretta ad alta risoluzione delle dinamiche intracellulari e microambientali in vivo e all'interno dell'ambiente nativo del processo biologico in questione. Pertanto, l'IVI consente l'osservazione in vivo di processi sani e patologici.

Le moderne modalità di imaging di tutto il corpo come la risonanza magnetica, la PET e la TC offrono un'eccellente visione di interi organi e possono rivelare patologie, anche prima dell'insorgenza dei sintomi clinici⁴. Non sono in grado, tuttavia, di raggiungere la risoluzione di una singola cellula o di rivelare i primi stadi della malattia-pancreatite o neoplasia.

Ricerche precedenti hanno utilizzato l'IVI a risoluzione singola cellulare per osservare malattie benigne e maligne della pelle^5,6, della mammella⁷, del polmone⁸, del fegato⁹, del cervello 10 e dei tumori pancreatici 11^, portando a intuizioni sui meccanismi di progressione della malattia ¹². Tuttavia, il pancreas murino pone ostacoli significativi al raggiungimento della risoluzione di una singola cellula utilizzando IVI, principalmente a causa della sua posizione viscerale profonda e dell'elevata compliance. Inoltre, è un organo ramificato e diffusamente distribuito all'interno del mesentere che si collega alla milza, all'intestino tenue e allo stomaco, rendendolo di difficile accesso. Il tessuto è anche altamente sensibile al movimento causato dalla peristalsi e dalla respirazione adiacenti. Ridurre al minimo il movimento del pancreas è essenziale per la microscopia a risoluzione di una singola cellula, poiché artefatti da movimento anche di pochi micron possono sfocare e distorcere le immagini, rendendo impossibile il tracciamento della dinamica delle singole cellule¹³.

Per eseguire l'IVI, è necessario impiantare chirurgicamente una finestra di imaging addominale (AIW) ^9,11. Per impiantare chirurgicamente l'AIW, un telaio metallico della finestra viene suturato nella parete addominale. Successivamente, l'organo di interesse viene fissato al telaio utilizzando un adesivo cianoacrilato. Mentre questo è sufficiente per alcuni organi interni rigidi (ad esempio, fegato, milza, tumori rigidi), i tentativi di imaging del pancreas murino sano sono compromessi da una stabilità laterale e assiale non ottimale a causa della struttura conforme del tessuto e dell'architettura complessa¹⁴. Per affrontare questa limitazione, Park et ^al.14 hanno sviluppato una finestra di imaging specificamente progettata per il pancreas sano. Questa finestra per imaging del pancreas (PIW) riduce al minimo l'influenza del movimento intestinale e della respirazione incorporando un ripiano metallico orizzontale all'interno del telaio della finestra, appena sotto il vetrino coprioggetto, stabilizzando il tessuto e mantenendo il contatto con il vetro di copertura. Sebbene il PIW offra una maggiore stabilità laterale, abbiamo scoperto che questa finestra mostra ancora una deriva assiale e impedisce inoltre l'imaging di tumori solidi di grandi dimensioni a causa dello stretto spazio tra il ripiano metallico e il vetrino coprioggetto¹⁵.

Per ovviare a queste limitazioni, abbiamo sviluppato il Window tabilizzato a Sper l'imagingI ntravitale del Pancreas murino (SWIP), una finestra di imaging impiantabile in grado di ottenere un imaging stabile a lungo termine sia del pancreas sano che di quello malato (Figura 1)¹⁵. Qui forniamo un protocollo completo per la procedura chirurgica utilizzata per impiantare lo SWIP. Sebbene l'obiettivo primario fosse quello di studiare i meccanismi dinamici coinvolti nelle metastasi, questo metodo può essere utilizzato anche per esplorare vari aspetti della biologia e della patologia del pancreas.

Protocol

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti per l'uso di animali vertebrati, inclusa la previa approvazione da parte dell'Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Passivazione delle finestre

NOTA: La passivazione dell'acciaio inossidabile pulisce il metallo dai contaminanti e crea un sottile strato di ossido che aumenta notevolmente la biocompatibilità del metallo con i tessuti molli, anche oltre quella del titanio¹⁶.

1. Avviare il processo di passivazione lavando i serramenti ottici con una soluzione detergente enzimaticamente attiva all'1% (p/v).
2. Immergere i telai in una soluzione di idrossido di sodio al 5% (p/v) a 70 °C per 30 minuti all'interno di un barattolo di vetro.
3. Estrarre i telai e sciacquarli con acqua deionizzata.
4. Immergere i telai in una soluzione di acido citrico al 7% (p/v) a 55 °C per 10 minuti all'interno di un nuovo barattolo di vetro.
5. Rimuovere i telai e risciacquarli nuovamente con acqua deionizzata.
6. Ripetere il passaggio 1.2 e, infine, sciacquare un'ultima volta i telai delle finestre con acqua deionizzata.

2. Preparazione per l'impianto del tumore o la chirurgia della finestra

NOTA: Per gli studi sui tumori del pancreas, le cellule tumorali devono essere impiantate e lasciate crescere in tumori conclamati. Per visualizzare le cellule tumorali in vivo, si raccomanda di utilizzare cellule che sono state geneticamente modificate per esprimere proteine fluorescenti come Dendra2. L'uso di etichette proteiche fluorescenti luminose mitigherà potenziali problemi con l'autofluorescenza tissutale. Altre potenziali proteine fluorescenti, coloranti e modelli murini fluorescenti geneticamente codificati che possono essere utilizzati sono stati discussi altrove^17,18. Per prevenire la contaminazione del campo operatorio, eseguire la procedura chirurgica in una cappa o in un armadio a flusso laminare e assicurarsi che vengano utilizzate aree distinte per la preparazione, l'intervento chirurgico e il recupero.

1. Prima dell'intervento, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave e, se necessario, utilizzare uno sterilizzatore a microsfere calde per le procedure successive. Assicurati che l'intervento chirurgico utilizzi una tecnica di sole punte.
2. Accendere il tampone chirurgico riscaldato e lo sterilizzatore a microsfere e attendere che raggiunga la temperatura di esercizio appropriata. La temperatura del termoforo deve essere monitorata con un termometro di superficie per evitare potenziali ustioni. Posizionare un panno sterile sul termoforo se la temperatura non può essere controllata adeguatamente.
   NOTA: La temperatura corporea durante le procedure brevi (≤20 min), come il tumore e l'impianto di finestre, è minimamente influenzata durante l'utilizzo di un cuscinetto chirurgico riscaldato. Tuttavia, periodi più lunghi di anestesia, come durante l'imaging timelapse prolungato, richiedono che il topo venga posto in una camera riscaldata per mantenere la temperatura corporea.
3. Anestetizzare il topo con isoflurano al 5% in una camera di anestesia.
4. Passaggio critico: abbassare l'anestesia al 2% una volta che il topo è incosciente. Monitorare attentamente il livello di anestesia e i parametri vitali del topo (ad esempio, utilizzando un pulsossimetro)¹⁹.
5. Metti una piccola goccia di lubrificante per gli occhi su ciascun occhio del topo per evitare che la cornea si secchi.
6. Prima dell'intervento chirurgico, applicare generosamente la crema depilatoria sulla parte superiore sinistra dell'addome per rimuovere i peli. Dopo 20 secondi, utilizzare carta velina inumidita per rimuovere saldamente i peli e la crema depilatoria. Ripetere il processo secondo necessità fino a quando tutti i peli non sono stati rimossi dall'area chirurgica.
7. Iniettare 10 μL di buprenorfina (0,1 mg/kg) diluiti in 90 μL di PBS per via sottocutanea per garantire l'analgesia preoperatoria.

3. Impianto di tumore al pancreas

1. Preparare aliquote di cellule tumorali alla concentrazione desiderata (in base al tempo di raddoppio delle cellule tumorali). Mettere la sospensione cellulare in una siringa da insulina e tenerla in ghiaccio. Per seguire questo protocollo, utilizzare 10⁶ cellule tumorali KPC singeniche 20 sospese in un massimo di 50 μL di PBS, seguendo il protocollo di iniezione ortotopica adattato da Erstad et^al.21
   NOTA: Questa linea cellulare iniettata a questa concentrazione ha prodotto abitualmente tumori palpabili o adeguatamente grandi entro 10-14 giorni. I subcloni di questa linea cellulare e di altre linee cellulari pancreatiche dovrebbero essere valutati per concentrazioni e tempistiche appropriate per produrre tumori di dimensioni appropriate).
2. Lavarsi le mani con sapone antisettico.
3. Prima di ogni nuovo intervento chirurgico, indossare nuovi guanti sterili.
4. Trasferire il mouse sul cappuccio chirurgico sterile e posizionarlo in una posizione di decubito laterale destro parziale.
5. Fissare gli arti con del nastro di carta.
   NOTA: L'uso corretto degli strumenti è importante durante tutta la procedura. Esempi di come tenere in mano la pinza, le forbici Castroviejo e lo strumento di raccolta del vuoto sono mostrati nella Figura 2A-C.
6. Sterilizzare l'addome con antisettico (Figura 2D).
7. Assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato eseguendo un test di pizzicamento delle dita dei piedi.
8. Praticare un'incisione sottocostale sinistra di 10-15 mm nella pelle utilizzando una pinza e le forbici Castroviejo (Figura 2E).
9. Controllare l'emostasi utilizzando tamponi di cotone o una penna per cauterizzazione quando/dove ritenuto necessario.
10. Dividere con cura il muscolo sottostante con una pinza e una forbice di Castroviejo per entrare nel peritoneo (Figura 2F).
11. Utilizzando tamponi di cotone sterili, esternare in modo atraumatico il pancreas e la milza.
12. Allargare il pancreas in modo che non ci siano pieghe (Figura 2G).
13. Identificare il sito di iniezione del tumore desiderato nel corpo o nella coda del pancreas (lontano dai vasi sanguigni).
14. Passaggio critico: dopo un attento posizionamento del pancreas, utilizzare una pinza per fornire tensione al tessuto e inserire la punta della siringa da insulina, con lo smusso rivolto verso l'alto, nel sito desiderato del pancreas a una profondità di 4-5 mm (Figura 2H).
15. Iniettare lentamente la soluzione di cellule tumorali. Cercare una piccola bolla che confermi l'avvenuta iniezione (Figura 2I).
16. Riportare con cautela il pancreas nell'addome senza disturbare la bolla di iniezione delle cellule tumorali (Figura 2J).
17. Utilizzando suture riassorbibili in polidiossanone 5-0, chiudere prima lo strato muscolare e poi la pelle con punti di sutura interrotti (Figura 2K-N).
18. Coprite l'incisione con colla cianoacrilica (Figura 2O), quindi rimettete il topo in una gabbia pulita sotto una lampada riscaldante per il recupero. Somministrare antibiotici nell'acqua potabile per prevenire l'infezione. Monitora i topi e consenti loro di riprendersi completamente dall'intervento chirurgico.
    NOTA: Gli antibiotici vengono somministrati come richiesto dal protocollo IACUC. Tutti gli animali sono alloggiati individualmente.
19. Lasciare che il tumore si sviluppi per 10-14 giorni fino a quando non è palpabile attraverso la parete addominale.

4. Chirurgia della finestra del pancreas

1. Quando gli animali sono pronti per l'imaging, iniziare l'intervento chirurgico di impianto della finestra. Per iniziare, lavati le mani con sapone antisettico.
2. Prima di ogni nuovo intervento chirurgico, indossare guanti sterili nuovi.
3. Sul supporto chirurgico riscaldato, posizionare il mouse nella posizione di decubito laterale destro per esporre l'addome sinistro.
4. Ancorare gli arti anteriori e posteriori del topo alla fase chirurgica riscaldata cranialmente e caudalmente utilizzando del nastro di carta. Assicurarsi che la milza (sotto la pelle) sia visibile all'interno del campo operatorio (Figura 3A).
5. Per mantenere la sterilità, disimballare tutti gli strumenti chirurgici nel cappuccio.
6. Disinfettare il sito chirurgico tamponando la pelle del topo con una generosa applicazione di antisettico.
7. Assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato eseguendo un test di pizzicamento delle dita dei piedi.
8. Fase critica: sollevare la pelle del quadrante superiore sinistro dell'addome con una pinza e praticare un'incisione circolare di ~10 mm nella pelle e nella muscolatura utilizzando le forbici Castroviejo (Figura 3B,C).
9. Controllare l'emorragia e mantenere l'emostasi utilizzando tamponi di cotone o la penna per cauterizzazione, ove necessario.
10. Localizzare il pancreas, che è attaccato alla milza, e identificare la direzione in cui il pancreas si trova all'interno dell'incisione per decidere dove posizionare il punto croce di supporto.
11. Usando la sutura di seta 5-0, posiziona il primo punto nella posizione desiderata nello strato muscolare. Lega questa estremità con 3-5 nodi. (Figura 3D,E)
12. Continua a cucire direttamente attraverso l'incisione. Tagliare e lasciare una coda di ~5 cm (Figura 3F).
13. Ripetere i passaggi 4.11 e 4.12 perpendicolarmente al primo punto (Figura 3G,H).
14. Passaggio critico: sollevare delicatamente e posizionare il pancreas sopra il punto croce (Figura 3I,J). Fare attenzione a non danneggiare il pancreas durante la manipolazione.
15. Passaggio critico: utilizzando la sutura di seta 5-0, eseguire un punto a strappo ~1 mm dal foro, circonferenzialmente, intrecciando la pelle e lo strato muscolare (Figura 3K).
16. Posizionare il telaio della finestra in modo che i bordi dell'incisione circolare si trovino all'interno della scanalatura della finestra (Figura 3L).
17. Fissare la finestra impiantata legando saldamente la seta 5-0.
18. Caricare 100 μL di adesivo cianoacrilato liquido nella siringa da 1 mL.
19. Asciugare il tessuto applicando un delicato getto di aria compressa per ~10 s.
20. Afferrare il telaio della finestra dal bordo esterno con una pinza e sollevarlo delicatamente per garantire la separazione del pancreas dalla superficie inferiore del telaio della finestra.
21. Passaggio critico: erogare un sottile strato di adesivo cianoacrilato liquido lungo l'incavo della finestra (Figura 3M). Assicurati di non far cadere l'adesivo sul tessuto del pancreas.
22. Utilizzando i pickup a vuoto, sollevare il vetrino coprioggetti da 5 mm.
23. Posizionare con cautela il vetrino coprioggetti all'interno dell'incavo al centro del telaio della finestra ottica. Tenere premuto con una leggera pressione, lasciando che l'adesivo cianoacrilato si solidifichi (~25 s).
24. Separare il vetrino coprioggetti dai prelievi a vuoto utilizzando una pinza.
25. Stringere le suture a punto croce per fissare saldamente il pancreas al vetrino coprioggetto (Figura 3N,O). Nota: non stringere eccessivamente il punto croce in quanto può causare danni e ischemia al pancreas.
26. Tagliare le estremità della sutura.
27. Rimuovi il nastro dal mouse.
28. Spegnere il vaporizzatore isoflurano.
29. Riposizionare il topo in una gabbia pulita o direttamente nel microscopio intravitale.
30. Alloggiare gli animali singolarmente dopo l'intervento chirurgico alla finestra e monitorarli fino al completo recupero.
31. L'imaging viene quindi eseguito su un microscopio multifotone a due laser, come abbiamo descritto in precedenza ^22,23,24 Per lunghe sessioni di imaging^, il topo viene posto in una camera riscaldata per mantenere la temperatura corporea e dotato di fluidi di supporto secondo gli standard IACUC.

5. Trattamento con ceruleina per l'induzione della pancreatite

1. Per studiare l'insorgenza della pancreatite, trattare i topi sani con ceruleina dopo l'impianto dello SWIP. Assicurarsi che i topi siano a digiuno per 14-18 ore e che gli venga somministrata acqua ad libitum prima della somministrazione di ceruleina.
2. Iniettare 50 μg/kg di ceruleina in 100 μL di DPBS sterile 1x per via intraperitoneale a intervalli di 1 ora per un massimo di otto iniezioni. Somministrare un volume equivalente di 1x DPBS da solo, iniettato per via intraperitoneale, ai topi di controllo.
3. Dopo l'imaging, sacrificare i topi 24 ore dopo la prima iniezione mediante lussazione cervicale secondo gli standard IACUC.
4. Eseguire l'imaging su un microscopio multifotone a due laser come descritto in precedenza^22,23,24. Per lunghe sessioni di imaging, posizionare il topo in una camera riscaldata per mantenere la temperatura corporea e fornirgli fluidi di supporto secondo gli standard IACUC.

Representative Results

La Figura 1, adattata da Du et al.15, mostra immagini fisse da un filmato IVI time-lapse del pancreas murino. È possibile osservare un certo movimento dei tessuti durante il periodo di assestamento iniziale (prima ora di imaging, Figura 1A). Tuttavia, con l'imaging continuato dopo questo periodo di assestamento (>75 min), abbiamo osservato un aumento della stabilità laterale e assiale (Figura 1B). Il confronto della stabilità dello SWIP con le precedenti finestre di imaging AIW e PIW identifica che tutte le finestre richiedono un periodo iniziale per l'assestamento. Tuttavia, lo SWIP ha mostrato il livello più basso di deriva in assoluto ed è più adatto per l'imaging a lungo termine (Figura 1C-K). Le immagini sono state generate su un microscopio multifotone^{personalizzato 24} illuminando a 880 nm e acquisendo un lapse z stack-t (dimensione del campo visivo [FOV] = 340 x 340 μm, dimensione dei pixel 0,67 μm) con 1,7 minuti tra i fotogrammi, 11 sezioni con una dimensione del passo di 2 μm, 20 profondità di imaging e ~1 fetta/s. Sono stati scelti i guadagni di potenza laser e tubo fotomoltiplicatore (PMT) per massimizzare il segnale riducendo al minimo il fotosbiancamento e il fotodanneggiamento.

Le fasi delle procedure chirurgiche che descrivono l'impianto del tumore al pancreas e il successivo inserimento della finestra del pancreas sono rappresentate rispettivamente nella Figura 2 e nella Figura 3. È importante sottolineare che entrambi gli interventi chirurgici sono interventi chirurgici di sopravvivenza. Una volta correttamente impiantato, il pancreas rimarrà apposto alla finestra ottica, che ora è integrata all'interno della parete addominale. Ciò consente una comoda sopravvivenza del topo e consente l'imaging continuo fino a 12 ore, come consentito dal protocollo. Inoltre, l'imaging seriale può essere condotto per più giorni consecutivi (fino al limite di protocollo di 2 settimane) per monitorare le regioni di interesse nel tempo. L'imaging intravitale (IVI) può essere eseguito attraverso la finestra in modo simile alle altre finestre precedentemente descritte^22,25,26.

Lo SWIP può essere utilizzato per studiare le dinamiche all'insorgenza della pancreatite acuta indotta con ceruleina. La ceruleina è un oligopeptide con struttura e funzione simili a quelle della colecistochinina (CKK) ed è ampiamente utilizzata per indurre sperimentalmente la pancreatite acuta nei roditori²⁷. Il trattamento con ceruleina provoca la contrazione della muscolatura liscia nel tratto gastrointestinale e stimola le secrezioni gastriche e pancreatiche²⁸. Inoltre, la somministrazione intraperitoneale di ceruleina porta al gonfiore e all'ingrossamento del pancreas²⁹.

La Figura 4 mostra l'imaging seriale del pancreas murino dopo il trattamento con ceruleina, utilizzando il protocollo SWIP. Il pancreas murino viene visualizzato a risoluzione di singola cellula utilizzando la marcatura genetica fluorescente (topi transgenici epiteli marcati con ECFP-MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP) e la somministrazione di coloranti ad alto peso molecolare (destrano-TMR da 155 kD) per definire la vascolarizzazione locale, indicata dalle linee gialle continue. Il design della finestra, utilizzato in precedenza per l'imaging polmonare murino⁸, include tre linee incise sul telaio (Figura 4, riquadro) che fungono da marcatori fiduciali che consentono l'uso della microcartografia³⁰. La microcartografia consente l'imaging seriale della stessa regione di interesse del pancreas murino per più giorni. Qui lo stesso lobulo del pancreas (linee tratteggiate gialle) viene visualizzato il giorno 1 e rilocalizzato il giorno 2, come evidenziato dalla presenza degli stessi vasi sanguigni locali (Figura 4). Le immagini sono state acquisite ogni giorno come un singolo z-stack con 11 fette e una dimensione del passo di 2 μm a ~1 slice/s, scattate con un'illuminazione di 880 nm e una risoluzione di 0,67 μm/pixel (FOV = 340 x 340 μm). La potenza del laser e i guadagni PMT sono stati scelti per massimizzare il segnale riducendo al minimo il fotosbiancamento e il fotodanneggiamento.

Oltre all'imaging seriale, lo SWIP è adatto all'imaging longitudinale a lungo termine, consentendo il monitoraggio e la misurazione accurati della dinamica delle strutture subcellulari (come i vacuoli) in condizioni di controllo e trattamento. In questo caso, i vacuoli sono regioni in cui le proteine fluorescenti citoplasmatiche sono escluse, causando la comparsa di buchi scuri non marcati (Figura 5A). La marcatura dei vacuoli utilizzando un software come ROI Tracker²⁴, consente la visualizzazione della motilità dei vacuoli (Figura 5A,B) e la quantificazione di numerosi parametri di motilità. Ad esempio, la velocità media dei vacuoli nel pancreas murino è aumentata di circa il 10% dopo il trattamento con ceruleina per indurre pancreatite, rispetto al trattamento con PBS (0,37 ± 0,07 μm/min vs 0,41 ± 0,09 μm/min, p = 0,02) (Figura 5C). Il trattamento con ceruleina ha anche aumentato la frequenza media di rotazione delle strutture subcellulari del 10% rispetto al trattamento con PBS (2,3 ± 0,3 gradi/min vs 2,6 ± 0,6 gradi/min, p = 0,04) (Figura 5F). Tuttavia, non c'è stata alcuna differenza significativa (p > 0,05) nella velocità netta, nella direzionalità o nella distanza cumulativa percorsa tra il trattamento con ceruleina e il trattamento con PBS (Figura 5D, E e Figura 5G). Le immagini sono state generate su un microscopio multifotone^{personalizzato 24} illuminando a 880 nm e acquisendo un lasso z stack-t (dimensione FOV = 340 x 340 μm, dimensione pixel 0,67 μm) con 2,9 minuti tra i fotogrammi, 11 fette con una dimensione del passo di 2 μm e ~1 fetta/s.

Infine, lo SWIP consente la visualizzazione e l'acquisizione della migrazione delle cellule tumorali. La Figura 6A mostra un fermo immagine di un filmato time-lapse (Video supplementare S1 e Video supplementare S2) della migrazione all'interno del pancreas di cellule tumorali KPC marcate con Dendra-2 che sono state iniettate ortotopicamente. Sia la migrazione collettiva delle cellule in cluster (Figura 6B e Video supplementare S1) che la migrazione di singole cellule (Figura 6C e Video supplementare S2) possono essere osservate per brevi periodi (<1 h). Le immagini sono state generate su un microscopio multifotone personalizzato 24 illuminando a 880 nm e acquisendo un lasso di tempo 4 x 4 mosaic-z stack-t con una sovrapposizione del²⁰% tra le piastrelle (dimensione della piastrella = 340 x 340 μm), 3,4 minuti tra i fotogrammi, 3 fette con una dimensione del passo di 5 μm e ~1 fetta/s. La potenza del laser e i guadagni PMT sono stati scelti per massimizzare il segnale riducendo al minimo il fotosbiancamento e il fotodanneggiamento.

Figura 1: Miglioramento della stabilità dell'imaging grazie a SWIP. (A) Foto dei primi 72 minuti di un filmato timelapse del pancreas ripreso tramite SWIP. Si può osservare una certa deriva assiale, ma molto piccola quella laterale. Barre di scala = 50 μm. (B) L'imaging timelapsed continuato dopo 72 minuti mostra un alto livello di stabilità assiale e laterale. (A,B) Rosso = 155 kDa siero sanguigno marcato con tetrametilrodamina destrano, Ciano = cellule pancreatiche marcate con CFP (topi transgenici MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP) (C-E) Confronto della stabilità laterale di ciascuna delle finestre di imaging del pancreas durante la prima ora di imaging per (C) AIW, (D) PIW e (E) SWIP. (F-H) Confronto della stabilità laterale di ciascuna delle immagini del pancreas durante i successivi 150 minuti per (F) AIW, (G) PIW e (H) SWIP. I riquadri sono viste ingrandite dei grafici corrispondenti. (I-K) Confronto della stabilità assiale di ciascuna delle finestre di imaging del pancreas per i primi 120 minuti di imaging per (I) AIW, (J) PIW e (K) SWIP. Questa cifra è tratta da Du et al. Open Biology 2022, DOI:10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273. ¹⁵. Abbreviazioni: SWIP = finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas; AIW = finestra di imaging addominale; PIW = finestra di imaging del pancreas; CFP = proteina fluorescente ciano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Panoramica del protocollo chirurgico di iniezione ortotopica di cellule di adenocarcinoma duttale pancreatico (KPC). (A) Illustrazione di come tenere le pinze chirurgiche. (B) Illustrazione di come tenere le forbici Castroviejo. (C) Illustrazione di come tenere lo strumento di raccolta del vuoto. (D) Igienizzare la pelle. (E) Incisione nella pelle. (F) Incisione nel muscolo. (G) Pancreas divaricato. (H) Inserimento dell'ago nel sito di iniezione desiderato. (I) Iniezione di sospensione di cellule tumorali che crea una bolla (freccia blu). (J) Il pancreas è tornato nella cavità peritoneale. (K,L) Chiusura dello strato muscolare con una sutura di seta interrotta. (M,N) Chiusura della cute con sutura di seta interrotta. (O) Colla cianoacrilica applicata all'incisione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Panoramica del protocollo chirurgico della finestra stabilizzata per l'imaging del pancreas . (A) Identificazione della milza e del pancreas annesso. (B,C) Incisione circolare nella pelle e nel muscolo. Le linee tratteggiate rosse in A-C indicano il contorno della milza che può essere visto attraverso la parete addominale e la pelle. (D,E) Primo punto del cestino per punto croce posizionato e legato nello strato muscolare (E, freccia gialla). (F) Il punto viene continuato sul lato opposto dell'incisione muscolare, lasciando una coda (freccia bianca). (G,H) Secondo punto posto perpendicolarmente al primo, legato ad un'estremità (frecce gialle) e lasciando una coda (frecce bianche). (I,J) Posizionamento del pancreas nel cestino per il punto croce. (K) Sutura circonferenziale a cordino attraverso il muscolo e la pelle. (L) Impianto del telaio della finestra. (M) Applicazione di colla sul telaio della finestra. (N) Fissaggio del vetrino coprioggetto. (O) Estremità della coda del punto croce strette. (P) SWIP completamente impiantato. Abbreviazione: SWIP = finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Microcartografia utilizzata per l'imaging seriale per rilocalizzare le stesse aree di interesse all'interno della finestra ottica. Imaging intravitale di una singola regione del pancreas murino, che mostra lo stesso lobulo riposizionato per 2 giorni consecutivi (D1-D2) utilizzando la microcartografia. Le linee tratteggiate gialle delineano i confini dello stesso lobulo. Le linee continue evidenziano gli stessi vasi sanguigni (come evidenziato dalla presenza di siero sanguigno marcato in rosso all'interno del lume) identificati ogni giorno consecutivo. Rosso = 155 kDa siero sanguigno marcato con tetrametilrodamina destrano, Ciano = cellule pancreatiche marcate con CFP (topi transgenici MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP) (Riquadro) Immagine dello SWIP con graffi per microcartografia. L'uso della microcartografia per riposizionare le regioni di interesse durante l'imaging seriale è consentito dalle tre linee incise sul telaio della finestra (riquadro). Barre di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Risoluzione subcellulare e misurazione della dinamica subcellulare mediante SWIP. (A) Le singole cellule (contorni gialli tratteggiati) e le strutture subcellulari come i vacuoli possono essere visualizzate attraverso lo SWIP nel tempo nel pancreas murino. Esempi di questi vacuoli sono indicati da frecce gialle. Lo SWIP consente quindi di tracciare le strutture subcellulari (contorni colorati e tracce sovrapposte all'immagine di fluorescenza) nel tempo. Il riquadro è la vista ingrandita di un'area riquadrata gialla che mostra tre vacuoli tracciati. Barra della scala = 50 μm. (B) Traiettorie di strutture subcellulari, come nuclei e vacuoli (evidenziati in A), dopo uno spostamento di coordinate verso il punto di origine. La linea tratteggiata rossa mostra il percorso netto medio in 1 ora (3,46 μm). Quantificazione dei parametri dinamici di (C) velocità media, (D) traiettoria netta, (E) direzionalità, (F) frequenza media di sterzata e (G) distanza cumulativa. Rosso = 155 kDa siero sanguigno marcato con tetrametilrodamina destrano, Ciano = cellule pancreatiche marcate con CFP (topi transgenici MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP). Abbreviazioni: SWIP = finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas; CFP = proteina fluorescente ciano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Acquisizione della migrazione cellulare con SWIP . (A) Un'immagine fissa da un filmato di imaging intravitale timelapsed del pancreas in un modello murino iniettato ortotopicamente di PDAC. (B) Immagini fisse dal video supplementare S1 che mostrano un esempio di cellule tumorali in fase di migrazione collettiva (freccia gialla). (C) Immagini fisse dal video supplementare S2 che mostrano esempi di migrazione di una singola cellula tumorale (freccia gialla) e di un macrofago (freccia rossa). Verde = cellule tumorali marcate con Dendra2, blu = macrofagi marcati con CFP, rosso = siero sanguigno marcato con tetrametilrodamina destrano da 155 kDa. Barre di scala = 50 μm (A), 15 μm (B,C). Abbreviazioni: SWIP = finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas; CFP = proteina fluorescente ciano; PDAC = adenocarcinoma pancreatico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video supplementare S1: Filmato di imaging intravitale timelapse che mostra le cellule tumorali in fase di migrazione collettiva corrispondente alla Figura 6B. Verde = cellule tumorali marcate con Dendra2, blu = macrofagi marcati con CFP, rosso = siero sanguigno marcato con tetrametilrodamina destrano da 155 kDa. Fare clic qui per scaricare il file.

Video supplementare S2: Filmato di imaging intravitale timelapse che mostra le cellule tumorali in fase di migrazione di singole cellule corrispondente alla Figura 6C. Verde = cellule tumorali marcate con Dendra2, blu = macrofagi marcati con CFP, rosso = siero sanguigno marcato con tetrametilrodamina destrano da 155 kDa. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussion

Il protocollo SWIP qui descritto fornisce un metodo migliorato di stabilizzazione del tessuto pancreatico utilizzando una tecnica a punto croce. Le finestre di imaging addominale precoce (AIW) hanno consentito l'imaging intravitale (IVI) degli organi interni dell'addome, ma non hanno limitato adeguatamente il movimento dei tessuti molli come il pancreas. In risposta, Park et al. hanno sviluppato una finestra di imaging del pancreas (PIW) che incorpora un ripiano metallico orizzontale e consente una migliore stabilizzazione del tessuto pancreatico mantenendo il contatto con il vetrino coprioggetto. Se da un lato questo approccio migliora la stabilità laterale, dall'altro limita l'imaging dei tumori solidi del pancreas perché le loro dimensioni superano lo spazio ristretto tra lo scaffale e il vetro di copertura. Lo SWIP affronta questo problema stabilizzando il pancreas con un cestello a punto croce, limitando sia il movimento assiale che laterale, pur essendo in grado di accogliere tumori solidi di grandi dimensioni (≤10 mm).

Confronti diretti dello SWIP con le precedenti finestre di imaging come AIW e PIW sono stati condotti in precedenza¹⁵. Ciò è mostrato nella Figura 1, adattata da Du et ^al.15, in cui gli spostamenti laterali e assiali sono stati quantificati tracciando le caratteristiche anatomiche cellulari come nuclei o vasi sanguigni. Tutte le finestre di imaging hanno mostrato la necessità di un periodo di assestamento durante circa la prima ora di imaging. Durante questo periodo, è stato osservato un grado più elevato di movimento laterale con l'AIW e il PIW rispetto allo SWIP. Uno spostamento assiale maggiore è stato osservato anche con l'AIW e il PIW rispetto allo SWIP in un periodo di 2 ore. Nel complesso, lo SWIP ha mostrato il livello più basso di deriva ed è adatto per l'imaging a lungo termine (≤12 ore).

Sfortunatamente, il pancreas è un tessuto altamente scattering e, come tale, la funzione di diffusione del punto per il microscopio multifotone utilizzato nell'IVI viene rapidamente degradata con la penetrazione nel tessuto. Pertanto, la profondità di imaging con una qualsiasi delle finestre ottiche è limitata a soli ~30-60 μm. IVI comporta anche il rischio di danni indotti dalla luce al campione. Questo può essere testato all'inizio delle sessioni di imaging acquisendo una serie temporale di 100 immagini e cercando segni di fotosbiancamento o fotodanneggiamento. Sul nostro sistema di microscopio, abbiamo scoperto che una potenza massima di ~15 mW sul campione può essere utilizzata senza influire negativamente sul tessuto.

Il protocollo SWIP consente una IVI ottica stabile, ad alta risoluzione e a singola cellula del pancreas murino sia in condizioni di salute normali, sia in stati patologici come pancreatite e PDAC. Ciò rende lo SWIP particolarmente utile per l'imaging a lungo termine in timelapse, nonché per l'esecuzione di imaging 3D e 4D (3D + tempo) catturando più fette z (sfruttando le capacità intrinseche di sezionamento ottico della microscopia multifotone e confocale). Consentendo la visualizzazione in vivo delle singole cellule e delle loro interazioni con i costituenti cellulari del pancreas, l'IVI ad alta risoluzione si rivelerà preziosa per comprendere i meccanismi alla base delle malattie del pancreas.

Per eseguire il protocollo SWIP è necessario un certo livello di competenza tecnica. Tuttavia, con una pratica adeguata e l'attenzione ai passaggi chiave, la procedura può essere eseguita con un alto tasso di successo. Per visualizzare il pancreas maligno, è fondamentale avere prima un tumore impiantato con successo. Questo si ottiene mediante iniezione ortotopica di una sospensione di cellule tumorali pancreatiche murine nel pancreas del topo. Un'iniezione di successo si osserva quando il parenchima del pancreas si gonfia in una bolla piena di liquido ed è stata descritta in dettaglio in precedenza²¹. Per garantire il massimo successo e la massima sopravvivenza, è fondamentale che vi sia una perdita minima o nulla della sospensione cellulare, poiché la perdita ridurrà drasticamente le potenziali dimensioni del tumore e porterà alla carcinomatosi. Inoltre, il pancreas è un organo altamente vascolarizzato, con molti vasi sanguigni ramificati. È fondamentale evitare di lacerare i vasi sanguigni in quanto ciò causerebbe sanguinamento e successivo ematoma nel pancreas e inibirebbe la crescita del tumore. In questo modello, abbiamo utilizzato una linea cellulare PDAC singenica derivata da topi KPC²⁰. Ciò consente l'attecchimento del tumore nei topi immunocompetenti. Possono essere utilizzate altre linee cellulari PDAC singeniche a seconda del ceppo del topo utilizzato. Possono essere utilizzate anche linee cellulari PDAC umane; Tuttavia, il ceppo di topo deve essere immunocompromesso in modo da evitare il rigetto dell'impianto tumorale.

Le dimensioni dei tumori sottoposti a imaging in questo protocollo possono essere modificate secondo necessità. Ciò può essere ottenuto utilizzando una maggiore concentrazione di cellule tumorali impiantate nel pancreas murino per ottenere un tumore più grande o estendendo il tempo di crescita del tumore prima dell'impianto della finestra. In questo studio, abbiamo iniettato 10 cellule PDAC^{da 6} KPC e impiantato lo SWIP 10-14 giorni dopo, quando i tumori erano palpabili. Anche i tumori più piccoli e più grandi possono essere accolti da questo protocollo SWIP utilizzando il posizionamento appropriato del tessuto nel cestello del punto croce.

Anche il posizionamento sicuro della finestra di imaging e del pancreas è fondamentale per ottenere immagini di alta qualità e per limitare gli artefatti da movimento. Il pancreas murino normale è molto accondiscendente e incline al movimento dovuto alla respirazione e alla peristalsi vicina. Per affrontare questo problema e aumentare la stabilità del pancreas durante l'imaging, viene utilizzata una tecnica di cestino a punto croce descritta in precedenza³¹. Il cestino per il punto croce è progettato per imitare l'uso dei legamenti da parte del corpo. Cullando il tessuto contro il vetrino coprioggetti e applicando una pressione assiale costante, impedisce il movimento sia laterale che assiale. Quando si ha a che fare con tumori solidi più grandi, il punto di appoggio e la direzione del punto croce possono essere modificati per adattarsi al meglio alle dimensioni e alla posizione del tumore per un supporto ottimale.

L'imaging non ottimale può verificarsi anche quando il telaio della finestra è impiantato in modo inadeguato nell'addome del topo. Un telaio della finestra allentato può portare a difficoltà di imaging e artefatti da movimento. Una sutura appropriata può risolvere questo problema fissando il telaio della finestra all'addome attraverso la pelle e la parete addominale. Per evitare un'eccessiva piegatura della pelle quando si stringe il cordino della borsa, i gradini del punto non devono essere superiori a 5 mm tra i gradini posizionati a non più di 1 mm dal bordo del tessuto, garantendo una perfetta aderenza al telaio della finestra. Dopo la sutura del cordino a portamoneta, il posizionamento del pancreas nel cestello per il punto croce e l'impianto del telaio della finestra, un ultimo passaggio critico è il posizionamento dell'adesivo all'interno dell'incavo del telaio della finestra. È fondamentale che durante questa fase, nessun adesivo entri in contatto con il tessuto pancreatico in quanto ciò danneggerebbe il tessuto e confonderebbe l'imaging. Una potenziale modifica che può anche impedire alla colla di entrare in contatto con il tessuto del pancreas è quella di incollare il vetrino coprioggetti al telaio della finestra e lasciare che entrambi si asciughino prima dell'impianto chirurgico nell'addome.

Lo SWIP, come tutte le tecniche di imaging intravitale, ha limitazioni nella sua capacità di rivelare informazioni su altre cellule e strutture nel tessuto che non sono esplicitamente etichettate. Tuttavia, la combinazione della finestra SWIP con reporter fluorescenti (come gli epiteli che esprimono ECFP e le cellule KPC marcate con Dendra2 come in questo studio) e il controllo degli stati delle proteine o delle cellule con strumenti farmacologici e/o optogenetici può eliminare queste limitazioni.

Inoltre, il design della finestra SWIP include tre linee incise sul telaio della finestra, che fungono da marcatori fiduciali per la microcartografia per rilocalizzare le aree di interesse durante l'imaging seriale³⁰. Ciò consente di localizzare lo stesso campo visivo più volte, anche in tessuti non contrassegnati.

In sintesi, lo SWIP può essere utilizzato nel tessuto pancreatico sano normale e nelle malattie pancreatiche benigne e maligne come la pancreatite e il PDAC. Le dinamiche a singola cellula e subcellulare possono essere catturate in questi stati utilizzando lo SWIP e possono aiutare i ricercatori a comprendere importanti eventi fisiologici come la disseminazione metastatica nel PDAC. La maggiore qualità e stabilità dell'IVI ha il potenziale per fornire preziose informazioni sulla fisiopatologia e sulla biologia cellulare del pancreas, rendendolo uno strumento promettente e vantaggioso.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].