Summary
マウス膵臓の細胞内分解能イメージングのための安定化された留置光学窓の外科的移植のプロトコルを提示し、健康な膵臓と病気の膵臓の連続的および縦断的研究を可能にします。
Abstract
膵臓の生理学と病態生理学は複雑です。膵炎や膵臓腺癌(PDAC)などの膵臓の疾患は、罹患率と死亡率が高い。生体内イメージング(IVI)は、健康な状態と病気の状態の両方の組織の高解像度イメージングを可能にする強力な技術であり、細胞動態のリアルタイム観察を可能にします。マウス膵臓のIVIは、臓器の深い内臓とコンプライアンスの性質により、損傷や運動アーチファクトが非常に起こりやすいため、重大な課題を提示します。
ここで説明するのは、マウスPancreas(SWIP)のIntravitalイメージングのためのStabilized Wインドウの移植プロセスです。SWIPは、正常な健康な状態、健康な膵臓からセルレインによって誘発される急性膵炎への転換中、および膵臓腫瘍などの悪性状態におけるマウス膵臓のIVIを可能にします。SWIPは、遺伝子標識細胞または蛍光色素の投与と組み合わせて、単一細胞および細胞内動態(単一細胞および集団移動を含む)の測定、および数日間にわたる同じ関心領域の連続イメージングを可能にします。
PDACにおけるがん関連死亡率の主な原因は圧倒的な転移性負担であるため、腫瘍細胞の移動を捕捉する能力は特に重要です。PDACにおける転移の生理学的動態を理解することは、満たされていない重要なニーズであり、患者の予後を改善するために重要です。全体として、SWIPはイメージングの安定性を向上させ、健康な膵臓および悪性膵臓疾患におけるIVIの適用を拡大します。
Introduction
良性および悪性の膵臓疾患は生命を脅かす可能性があり、その病態生理学の理解にはかなりのギャップがあります。膵炎(膵臓の炎症)は、米国における消化器疾患関連の入院および再入院の第3大原因であり、かなりの罹患率、死亡率、および社会経済的負担に関連しています1。膵管腺がん(PDAC)は、がん関連死因の第3位2にランクされており、膵臓悪性腫瘍の大半を占めており3 、5年生存率はわずか11%2と低いことを示しています。PDACにおけるがん関連死亡率の主な原因は、圧倒的な転移性負担です。残念ながら、ほとんどの患者は転移性疾患を呈します。したがって、PDACにおける転移の動態を理解することは、がん研究の分野における重要なアンメットニーズです。
炎症と膵臓の転移カスケードを支えるメカニズムは十分に理解されていません。この知識のギャップの主な原因は、 in vivoで膵臓の細胞動態を観察できないことです。これらの細胞動態を直接観察することで、膵臓疾患患者の診断と治療を活用し、改善するための重要な標的を明らかにすることが期待されます。
生体内イメージング(IVI)は、研究者が生きている動物の生物学的プロセスをリアルタイムで視覚化して研究できるようにする顕微鏡技術です。IVIは、生体内および生体プロセスの天然環境内の細胞 内 および微小環境のダイナミクスを高解像度で直接可視化することができます。したがって、IVIは、健康および病理学的プロセスの in vivo 観察を可能にします。
MRI、PET、CTなどの現代の全身画像モダリティは、臓器全体の優れたビューを提供し、臨床症状の発症前でも病状を明らかにすることができます4。しかし、単一細胞の分解能を達成したり、膵炎や悪性腫瘍などの疾患の初期段階を明らかにしたりすることはできません。
これまでの研究では、皮膚5,6、乳房7、肺8、肝臓9、脳10、膵臓腫瘍11の良性および悪性疾患を単細胞分解能IVIで観察し、疾患の進行メカニズムに関する洞察を得ています12。しかし、マウスの膵臓は、主に内臓の奥深くに位置し、コンプライアンスが高いため、IVIを使用して単一細胞の解像度を達成する上で大きな障害となっています。さらに、腸間膜内の枝分かれしたびまん性に分布する器官であり、脾臓、小腸、胃に接続しているため、アクセスが困難です。組織はまた、隣接する蠕動運動と呼吸によって引き起こされる動きに対して非常に敏感です。膵臓の動きを最小限に抑えることは、数ミクロンの動きでさえ画像をぼやけさせ、歪ませ、個々の細胞の動態を追跡することを不可能にするため、単一細胞分解能顕微鏡検査に不可欠です13。
IVIを実施するには、腹部イメージングウィンドウ(AIW)を外科的に埋め込む必要があります9,11。AIWを外科的に移植するには、金属製の窓枠を腹壁に縫合します。その後、シアノアクリレート接着剤を使用して目的の臓器をフレームに取り付けます。これは一部の硬い内臓(肝臓、脾臓、硬い腫瘍など)には十分であるが、健康なマウスの膵臓を画像化する試みは、組織の準拠したテクスチャと複雑な構造のために最適ではない側方向および軸方向の安定性によって損なわれる14。この制限に対処するために、Parkらは、健康な膵臓用に特別に設計されたイメージングウィンドウを開発しました14。この膵臓イメージングウィンドウ(PIW)は、カバーガラスのすぐ下の窓枠内に水平な金属製の棚を組み込み、組織を安定させ、カバーガラスとの接触を維持することで、腸の動きと呼吸の影響を最小限に抑えます。PIWは横方向の安定性を高めているが、この窓は依然として軸方向のドリフトを示し、さらに金属製の棚とカバーガラス15の間の狭い隙間のために大きな固形腫瘍のイメージングを妨げることがわかった。
これらの制限に対処するために、私たちは、健康な膵臓と病気の膵臓の両方の安定した長期イメージングを達成できる埋め込み型イメージングウィンドウである、マウスPancreas(SWIP)のIntravitalイメージング用のStabilized Windowを開発しました(図1)15。ここでは、SWIPを埋め込むために使用される外科的処置の包括的なプロトコルを提供します。主な目的は転移に関与する動的メカニズムを研究することでしたが、この方法は、膵臓の生物学と病理学のさまざまな側面を探求するためにも利用できます。
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Protocol
このプロトコルに記載されているすべての手順は、アルバートアインシュタイン医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)による事前承認を含む、脊椎動物の使用に関するガイドラインと規制に従って実行されています。
1.窓の不動態化
注:ステンレス鋼の不動態化処理は、金属の汚染物質を洗浄し、薄い酸化物層を形成して、チタン16の生体適合性を超えて、軟部組織との金属の生体適合性を大幅に向上させます。
- 光学窓枠を1%(w / v)の酵素活性洗剤溶液で洗浄することにより、不動態化プロセスを開始します。
- フレームをガラス瓶内の5%(w / v)水酸化ナトリウム溶液に70°Cで30分間浸します。
- フレームを取り出し、脱イオン水ですすいでください。
- フレームを7%(w/v)クエン酸溶液、55°C、10分間、新しいガラス瓶に浸します。
- フレームを取り外し、脱イオン水で再度すすいでください。
- 手順1.2を繰り返し、最後にもう一度窓枠を脱イオン水ですすいでください。
2.腫瘍移植または窓手術の準備
注:膵臓腫瘍の研究では、腫瘍細胞を移植し、明白な腫瘍に成長させる必要があります。in vivoで腫瘍細胞を可視化するには、Dendra2などの蛍光タンパク質を発現するように遺伝子改変された細胞を使用することが推奨されます。明るい蛍光タンパク質標識を使用すると、組織の自家蛍光に関する潜在的な問題を軽減できます。使用される可能性のある他の潜在的な蛍光タンパク質、色素、および遺伝的にコードされた蛍光マウスモデルは、他の場所で議論されています17,18。術野の汚染を防ぐために、フードまたは層流キャビネットで外科的処置を行い、準備、手術、および回復に別々の領域が使用されるようにします。
- 手術の前に、すべての手術器具をオートクレーブで滅菌し、必要に応じて、その後の処置にはホットビーズ滅菌器を使用してください。手術がチップのみの技術を採用していることを確認してください。
- 加熱された手術パッドとビーズ滅菌器のスイッチを入れ、適切な動作温度に達するのを待ちます。加熱パッドの温度は、火傷の可能性を避けるために表面温度計で監視する必要があります。温度を適切に制御できない場合は、加熱パッドの上に滅菌布を置きます。
注:腫瘍や窓の移植などの短時間(≤20分)中の体温は、加熱された手術用パッドを使用している間は最小限に抑えられます。ただし、長時間のタイムラプスイメージングなど、長時間の麻酔では、体温を維持するためにマウスを加熱チャンバーに入れる必要があります。 - 麻酔チャンバー内で5%イソフルランでマウスを麻酔します。
- 重要なステップ:マウスが意識を失ったら、麻酔を2%に下げます。麻酔レベルとマウスのバイタルを注意深く監視します(例:パルスオキシメータを使用)19。
- 角膜の乾燥を防ぐために、マウスの両目に目の潤滑剤を少量垂らします。
- 手術前に、左上腹部に脱毛クリームをたっぷりと塗って脱毛します。20秒後、湿らせたティッシュペーパーを使用して、髪と脱毛クリームをしっかりと拭き取ります。手術部位からすべての髪の毛が取り除かれるまで、必要に応じてこのプロセスを繰り返します。
- 術前の鎮痛を確実にするために、90 μL の PBS で希釈した 10 μL のブプレノルフィン (0.1 mg/kg) を皮下注射します。
3.膵臓腫瘍移植
- 腫瘍細胞のアリコートを所望の濃度で調製します(腫瘍細胞の倍加時間に基づく)。細胞懸濁液をインスリン注射器に入れ、氷上に保管します。このプロトコルに従うには、Erstadらから適合した同所性注入プロトコルに従って、最大50μLのPBSに懸濁した106 同系KPC腫瘍細胞20 を使用します21
注:この濃度で注射されたこの細胞株は、10〜14日までに触知可能な、または適切に大きな腫瘍を日常的に産生しました。この細胞株と他の膵臓細胞株のサブクローンは、適切なサイズの腫瘍を産生するために、適切な濃度とタイムラインについて評価する必要があります)。 - 消毒石鹸を使用して手を洗ってください。
- 新しい手術の前に、新しい滅菌手袋を着用してください。
- マウスを滅菌手術用フードに移し、部分的な右外側褥瘡の位置に置きます。
- 手足を紙テープで固定します。
注意: 手順全体を通して、機器の適切な使用が重要です。鉗子、カストロビエホはさみ、バキュームピックアップツールの保持方法の例を図2A-Cに示します。 - 腹部を消毒剤で滅菌します(図2D)。
- つま先のつまみテストを実行して、動物が完全に麻酔されていることを確認します。
- 鉗子とカストロビエホハサミを使用して、皮膚に10〜15mmの左肋骨下切開を行います(図2E)。
- 必要に応じて、綿棒または焼灼ペンを使用して止血を制御します。
- 鉗子とカストロビエホハサミで下にある筋肉を慎重に分割して腹膜に入ります(図2F)。
- 滅菌綿棒を使用して、膵臓と脾臓を非外傷的に外在化します。
- 膵臓を広げて、ひだがないようにします(図2G)。
- 膵臓の体または尾部(血管から離れた場所)の目的の腫瘍注射部位を特定します。
- 重要なステップ:膵臓を慎重に配置した後、鉗子を使用して組織に張力を与え、インスリン注射器の先端を斜角を上に向けて、膵臓の目的の部位に4〜5 mmの深さまで挿入します(図2H)。
- 腫瘍細胞溶液をゆっくりと注入します。注入が成功したことを確認する小さな気泡を探します(図2I)。
- 腫瘍細胞注入気泡を乱すことなく、膵臓を慎重に腹部に戻します(図2J)。
- 吸収性の5-0ポリジオキサノン縫合糸を使用して、最初に筋肉層を閉じ、次に中断縫合糸で皮膚を閉じます(図2K-N)。
- 切開部をシアノアクリレート接着剤で覆い(図2O)、マウスを加熱ランプの下の清潔なケージに戻して回復させます。感染を防ぐために飲料水に抗生物質を投与します。マウスを監視し、手術から完全に回復するまで待ちます。
注:抗生物質は、IACUCプロトコルの要求に応じて投与されます。すべての動物は個別に飼育されています。 - 腫瘍が腹壁を通して触知できるようになるまで、腫瘍を10〜14日間発生させます。
4.膵臓の窓の手術
- 動物のイメージングの準備ができたら、窓埋め込み手術を開始します。まず、消毒石鹸で手を洗います。
- 新しい手術の前には、必ず新しい滅菌手袋を着用してください。
- 加熱された手術用スタンドで、マウスを右外側褥瘡の位置に置き、左腹部を露出させます。
- マウスの前肢と後肢を、紙テープを使用して頭蓋および尾側で加熱された手術ステージに固定します。脾臓(皮膚の下)が術野内に見えることを確認します(図3A)。
- 無菌状態を維持するために、フード内のすべての手術器具を開梱してください。
- マウスの皮膚を消毒剤をたっぷりと塗って手術部位を消毒します。
- つま先のつまみテストを実行して、動物が完全に麻酔されていることを確認します。
- 重要なステップ:鉗子で腹部の左上象限の皮膚を持ち上げ、カストロビエホハサミを使用して皮膚と筋肉組織に~10mmの円形切開を行います(図3B、C)。
- 必要に応じて、綿棒または焼灼ペンを使用して出血を制御し、止血を維持します。.
- 脾臓に付着している膵臓の位置を特定し、膵臓が切開部内に横たわっている方向を特定して、支持するクロスステッチを配置する場所を決定します。
- 5-0シルク縫合糸を使用して、最初のステッチを筋肉層の目的の場所に置きます。この端を3〜5ノットで結びます。(図3D、E)
- 切開部を直接縫い続けます。~5cmの尾を切り取って残します(図3F)。
- ステップ4.11と4.12を最初のステッチに垂直に繰り返します(図3G、H)。
- 重要なステップ:膵臓をゆっくりと持ち上げてクロスステッチの上に配置します(図3I、J)。操作中に膵臓を傷つけないように注意してください。
- 重要なステップ:5-0シルク縫合糸を使用して、穴から~1mmのところに、円周方向に、皮膚と筋肉層を織り交ぜて巾着紐ステッチを行います(図3K)。
- 円形の切り込みの端が窓の溝内に収まるように窓枠を配置します(図3L)。
- 5-0シルクをしっかりと縛って、埋め込まれた窓を固定します。
- 100 μLの液状シアノアクリレート接着剤を1 mLシリンジにロードします。
- ~10秒間、圧縮空気の繊細な流れを当てて組織を乾燥させます。
- 鉗子で窓枠の外縁をつかみ、ゆっくりと持ち上げて、膵臓が窓枠の下面から確実に分離されるようにします。
- 重要なステップ:窓のくぼみに沿って液体シアノアクリレート接着剤の薄層を塗布します(図3M)。膵臓組織に接着剤が付着しないように注意してください。
- バキュームピックアップを使用して、5mmのカバーガラスを持ち上げます。
- カバーガラスを光学窓枠の中央のくぼみの内側に慎重に置きます。シアノアクリレート系接着剤を硬化させながら、軽い圧力で保持します(~25秒)。
- 鉗子を使用してカバーガラスをバキュームピックアップから分離します。
- クロスステッチ縫合糸を締めて、膵臓をカバーガラスにぴったりと固定します(図3N、O)。注:クロスステッチは膵臓の損傷や虚血を引き起こす可能性があるため、締めすぎないでください。
- 縫合糸の端を切ります。
- マウスからテープをはがします。
- イソフルラン気化器のスイッチを切ります。
- マウスを清潔なケージに移すか、生体内顕微鏡に直接移動させます。
- 窓の手術後に動物を個別に収容し、完全に回復するまで監視します。
- 次に、以前に説明したように、22,23,24 長時間のイメージングセッションでは、マウスを加熱チャンバーに入れて体温を維持し、IACUC規格に従って支持体液を提供します。
5.膵炎誘発のためのセルレイン治療
- 膵炎の発症を調べるには、SWIPの移植後に健康なマウスにセルレインを投与します。セルレイン投与の前に、マウスを14〜18時間絶食させ、 自由自在の水 を与えてください。
- 50 μg/kg のセルレインを 100 μL の滅菌 1x DPBS に 1 時間間隔で腹腔内に注入し、最大 8 回の注射を行います。同等の量の1x DPBSを腹腔内に注射し、対照マウスに投与します。
- イメージング後、IACUC規格に従って、最初の注射から24時間後に子宮頸部脱臼によりマウスを犠牲にします。
- 前述したように2レーザー多光子顕微鏡でイメージングを行う22,23,24。長時間のイメージングセッションでは、マウスを加熱チャンバーに入れて体温を維持し、IACUC規格に従ってサポート液を提供します。
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Representative Results
図1は、Du et al.15から引用したもので、マウスの膵臓のタイムラプスIVI動画の静止画を示しています。初期の整定期間(イメージングの最初の1時間、図1A)内にいくつかの組織の動きが観察されます。しかし、このセトリング期間(>75分)後もイメージングを継続すると、横方向および軸方向の安定性の向上が観察されました(図1B)。SWIPの安定性を以前のAIWおよびPIWイメージングウィンドウと比較すると、すべてのウィンドウがセトリングに初期期間を必要とすることがわかります。しかし、SWIPは全体的に最も低いレベルのドリフトを示し、長時間のイメージングに最適です(図1C-K)。画像は、特注の多光子顕微鏡24で880nmを照射し、フレーム間1.7分、2μmステップサイズで11スライス、20イメージング深度、~1スライス/秒でzスタックtラプス(視野[FOV]サイズ=340×340μm、ピクセルサイズ0.67μm)を取得して生成した。レーザー出力と光電子増倍管(PMT)のゲインは、光退色と光損傷を最小限に抑えながら信号を最大化するために選択されました。
膵臓腫瘍の移植とその後の膵窓挿入を説明する外科的処置のステップをそれぞれ図 2 および 図3に示している。重要なのは、どちらの手術もサバイバル手術であるということです。正しく移植されると、膵臓は光学窓にアポジショニングされたままになり、光学窓は腹壁内に統合されます。これにより、マウスの快適な生存が可能になり、プロトコルで許可されているように、最大12時間の連続イメージングが可能になります。さらに、連続イメージングを複数日連続して実施し(プロトコル許容量2週間まで)、関心領域を経時的に監視することができます。生体内イメージング(IVI)は、以前に説明した他のウィンドウと同様の方法でウィンドウを通して行うことができる22、25、26。
SWIPは、セルレインを使用して誘発された急性膵炎の発症時の動態を調べるために利用できます。セルレインは、コレシストキニン(CKK)と同様の構造と機能を持つオリゴペプチドであり、げっ歯類の急性膵炎を実験的に誘発するために広く使用されている27。セルレインによる治療は、消化管の平滑筋の収縮をもたらし、胃および膵臓の分泌物を刺激する28。さらに、セルレインの腹腔内投与は、膵臓の腫れと肥大をもたらす29。
図4は、SWIPプロトコルを用いたセルレイン治療後のマウス膵臓の連続画像を示しています。マウスの膵臓は、遺伝子蛍光標識(ECFP標識上皮-MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFPトランスジェニックマウス)および高分子量色素(155 kDデキストラン-TMR)の投与を使用して単一細胞分解能で視覚化され、黄色の実線で示された局所血管系が定義されます。マウス肺イメージング8のために以前に使用されたウィンドウ設計は、マイクロカートグラフィ30の使用を可能にする基準マーカーとして作用するフレーム(図4、挿入図)上に3本のエッチングされた線を含む。マイクロカートグラフィーは、マウスの膵臓の同じ関心領域を数日間にわたって連続的にイメージングすることができます。ここでは、膵臓の同じ小葉(黄色の破線)が1日目に視覚化され、2日目に再局在化していることが、同じ局所血管の存在によって証明されています(図4)。画像は、11 スライス、2 μm ステップサイズ、~1 スライス/秒、880 nm 照明、分解能 0.67 μm/ピクセル(FOV = 340 x 340 μm)の単一の z スタックとして毎日取得しました。レーザー出力とPMTゲインは、光退色と光損傷を最小限に抑えながら信号を最大化するために選択されました。
SWIPは、連続イメージングに加えて、長期縦断イメージングに適しており、制御および治療条件下での細胞内構造(液胞など)の動態の正確な追跡と測定を可能にします。ここで、液胞は細胞質蛍光タンパク質が排除される領域であり、暗い標識されていない穴が現れます(図5A)。ROI Tracker24などのソフトウェアを使用した液胞のマーキングにより、液胞の運動性を可視化し(図5A、B)、多数の運動性パラメータを定量化することができます。例えば、膵炎を誘発するセルレイン投与後、PBS治療と比較して、マウス膵臓の液胞の平均速度が約10%増加しました(0.37 ± 0.07 μm/min対0.41 ± 0.09 μm/min、p = 0.02)(図5C)。また、セルリン処理は、PBS処理と比較して、細胞内構造の平均回転頻度を10%増加させました(2.3±0.3度/分 vs 2.6±0.6度/分、p = 0.04)(図5F)。しかし、セルレイン処理とPBS処理の間では、正味速度、指向性、累積移動距離に有意差(p > 0.05)はありませんでした(図5D、E、図5G)。画像は、特注の多光子顕微鏡24で880nmで照射し、zスタックtラプス(FOVサイズ=340×340μm、ピクセルサイズ0.67μm)をフレーム間隔2.9分、2μmステップサイズで11スライス、~1スライス/秒で取得して生成した。
最後に、SWIPは腫瘍細胞の移動を可視化し、捕捉することを可能にします。図6Aは、同所性注射されたDendra-2標識KPC腫瘍細胞の膵臓内への移動のタイムラプス動画(補足ビデオS1および補足ビデオS2)の静止画を示す。クラスター内の細胞の集団移動(図6Bおよび補足ビデオS1)と単一細胞移動(図6Cおよび補足ビデオS2)の両方が、短期間(<1時間)で観察できます。画像は、880nmで照射し、タイル間20%のオーバーラップ(タイルサイズ=340×340μm)、フレーム間3.4分、5μmステップサイズで3スライス、~1スライス/秒で4×4モザイク-zスタック-tラプスを取得して、特注の多光子顕微鏡24で生成した。レーザー出力とPMTゲインは、光退色と光損傷を最小限に抑えながら信号を最大化するために選択されました。
図1:SWIPによるイメージングの安定性の向上。 (A)SWIPで撮影した膵臓のタイムラプス動画の最初の72分以内の静止画。多少の軸方向のドリフトは観察されますが、横方向のドリフトはごくわずかです。スケールバー = 50 μm。 (B)72分後もタイムラプスイメージングを継続すると、軸方向および横方向の安定性が高くなります。(A,B)赤 = 155 kDaテトラメチルローダミンデキストラン標識血清、シアン = CFP 標識膵臓細胞 (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP トランスジェニックマウス) (C-E) AIW、(D) PIW、および (E) SWIP のイメージングの最初の 1 時間における各膵臓イメージングウィンドウの横方向の安定性の比較。(F-H)(F)AIW、(G)PIW、および(H)SWIPのその後の150分間の膵臓イメージングの各膵臓の横方向の安定性の比較。インセットは、対応するプロットを拡大して表示したものです。(I-K)(I)AIW、(J)PIW、および(K)SWIPのイメージングの最初の120分間の各膵臓イメージングウィンドウの軸安定性の比較。この図は、Du et al. Open Biology 2022, DOI:10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273 によるものです。15.略語:SWIP =膵臓の生体内イメージングのための安定化ウィンドウ。AIW = 腹部イメージングウィンドウ;PIW = 膵臓イメージングウィンドウ;CFP = シアン蛍光タンパク質。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:膵管腺癌細胞(KPC)の同所性注射の手術プロトコルの概要。 (A)手術用鉗子の持ち方のイメージ図。(B)カストロビエホハサミの持ち方のイラスト。(C)バキュームピックアップツールの持ち方の説明図。(D)皮膚の消毒。(E)皮膚の切開。(F)筋肉の切開。(G)膵臓を広げた。(H)注射の所望の部位に針を刺す。(I)がん細胞懸濁液を注入し、気泡(青矢印)を発生させる。(J)膵臓が腹腔に戻った。(K、L)中断された絹縫合糸による筋肉層の閉鎖。(M、N)中断された絹縫合糸による皮膚の閉鎖。(O)切開部に塗布したシアノアクリレート接着剤。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:膵臓のイメージングのための安定化窓の手術プロトコルの概要。 (A)脾臓と付着した膵臓の識別。(B、C)皮膚と筋肉の円形切開。A-Cの赤い破線は、腹壁と皮膚を通して見ることができる脾臓の輪郭を示しています。(D、E)クロスステッチバスケットの最初のステッチは、筋肉層に配置され、結ばれています(E、黄色の矢印)。(F)ステッチは、尾(白い矢印)を残して、筋肉切開の反対側に続きます。(G,H)2番目のステッチは最初のステッチに垂直に配置され、一方の端(黄色の矢印)で結ばれ、尾(白い矢印)を残します。(I,J)クロスステッチバスケットへの膵臓の配置。(K)筋肉と皮膚を通る円周方向の巾着紐縫合糸。(L)窓枠の埋め込み。(M)窓枠に接着剤を塗布します。(N)ガラスカバーガラスの取り付け。(O)クロスステッチのテールエンドが締められています。(P)完全に埋め込まれたSWIP。略語:SWIP = 膵臓の生体内イメージングのための安定化ウィンドウ。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:光学窓内の同じ関心領域を再局在化するためのシリアルイメージングに使用されるマイクロカートグラフィー。マウス膵臓の単一領域の生体内イメージング、マイクロカートグラフィーを使用して2日間連続して移動した同じ小葉(D1-D2)を示す。黄色の破線は、同じ小葉の境界の輪郭を描いています。実線は、連続した日に特定された同じ血管(内腔内に赤色のラベル付き血清が存在することからわかる)を強調しています。赤 = 155 kDaテトラメチルローダミンデキストラン標識血清、シアン = CFP標識膵臓細胞(MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP トランスジェニックマウス) (挿入図) マイクロカートグラフィ用の傷のあるSWIPの画像。シリアルイメージング中に関心領域を再配置するためのマイクロカートグラフィーの使用は、窓枠(挿入図)の3本のエッチングラインによって許可されています。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:SWIPを用いた細胞内分解能と細胞内動態の測定 。 (A)マウス膵臓の単一細胞(黄色の破線)や液胞などの細胞内構造をSWIPで経時的に可視化することができます。これらの液胞の例は黄色の矢印で示されています。したがって、SWIPは、細胞内構造(色付きの輪郭と蛍光画像に重ねられたトラック)を経時的に追跡することができます。挿入図は、3つの追跡された液胞を示す黄色のボックス領域の拡大図です。スケールバー = 50 μm。 (B)核や液胞( Aで強調表示)などの細胞内構造の軌跡を、座標を原点にシフトした後。赤色の破線は、1時間(3.46μm)の平均ネットパスを示しています。(C)平均速度、(D)ネットパス、(E)指向性、(F)平均旋回周波数、(G)累積距離の動的パラメータの定量化。赤 = 155 kDaのテトラメチルローダミンデキストラン標識血清、シアン = CFP標識膵臓細胞(MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP トランスジェニックマウス)。略語:SWIP = 膵臓の生体内イメージングのための安定化ウィンドウ。CFP = シアン蛍光タンパク質。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:SWIPによる細胞遊走の捕捉 。 (A)PDACの同位所注入マウスモデルにおける膵臓のタイムラプス生体内イメージング動画の静止画。(B)腫瘍細胞が集団移動している例を示す 補足ビデオS1 の静止画(黄色矢印)。(C)補足 動画S2 の静止画で、腫瘍細胞(黄矢印)とマクロファージ(赤矢印)の単一細胞遊走の例を示す。緑 = Dendra2 標識腫瘍細胞、青 = CFP 標識マクロファージ、赤 = 155 kDa テトラメチルローダミンデキストラン標識血清。スケールバー = 50 μm (A)、15 μm (B、C)。略語:SWIP = 膵臓の生体内イメージングのための安定化ウィンドウ。CFP = シアン蛍光タンパク質;PDAC = 膵臓腺癌。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS1: 図6Bに対応する集団移動を受けている腫瘍細胞を示すタイムラプス生体内イメージングムービー。 緑 = Dendra2 標識腫瘍細胞、青 = CFP 標識マクロファージ、赤 = 155 kDa テトラメチルローダミンデキストラン標識血清。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS2: 図6Cに対応する単一細胞遊走を受けている腫瘍細胞を示すタイムラプス生体内イメージングムービー。 緑 = Dendra2 標識腫瘍細胞、青 = CFP 標識マクロファージ、赤 = 155 kDa テトラメチルローダミンデキストラン標識血清。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明するSWIPプロトコルは、クロスステッチバスケット技術を利用して、膵臓組織を安定化するための改良された方法を提供します。初期の腹部画像窓(AIW)は、腹部の内臓の生体内画像(IVI)を可能にしたが、膵臓などの軟部組織の動きを適切に制限していなかった。これに対応して、Parkらは、水平の金属棚を組み込んで、ガラスカバーガラスとの接触を維持しながら膵臓組織の安定性を向上させることができる膵臓イメージングウィンドウ(PIW)を開発しました。このアプローチでは横方向の安定性は向上しますが、固形膵臓腫瘍のサイズが棚とカバーガラスの間の狭いスペースを超えるため、イメージングが制限されます。SWIPは、クロスステッチバスケットで膵臓を安定させ、軸方向と横方向の両方の動きを制限すると同時に、大きな(≤10mm)固形腫瘍にも対応できるようにすることで、この問題に対処します。
SWIPとAIWやPIWなどの以前のイメージングウィンドウとの直接比較は、以前に実施されました15。これは、Du et al.15 から引用した図 1 に示されており、核や血管などの細胞の解剖学的特徴を追跡することで、横方向および軸方向のシフトが定量化されました。すべてのイメージングウィンドウは、イメージングの最初の約1時間に落ち着きの期間の必要性を示しました。この間、SWIPと比較して、AIWとPIWでより高いレベルの横方向の動きが観察されました。また、AIWとPIWでは、SWIPと比較して、2時間にわたって軸方向のシフトが大きくなりました。全体として、SWIPはドリフトレベルが最も低く、長時間(≤12時間)のイメージングに適しています。
残念ながら、膵臓は散乱率の高い組織であるため、IVIで用いられる多光子顕微鏡の点像像機能は、組織への浸透とともに急速に低下してしまいます。したがって、光学窓のいずれかによるイメージング深度は、わずか30~60μmに制限されます。 IVIは、サンプルに光による損傷を与えるリスクも伴います。これは、イメージングセッションの開始時に、100枚の画像を時系列で取得し、光退色や光損傷の兆候を探すことでテストできます。当社の顕微鏡システムでは、サンプルの最大出力~15 mWを組織に悪影響を与えることなく使用できることがわかりました。
SWIPプロトコルは、通常の健康な状態だけでなく、膵炎やPDACなどの病状状態でも、マウス膵臓の安定した高解像度の単一細胞光学IVIを可能にします。これにより、SWIPは、長時間のタイムラプスイメージングや、複数のzスライスをキャプチャして3Dおよび4D(3D+時間)イメージングを実行する場合に特に役立ちます(多光子顕微鏡および共焦点顕微鏡固有の光学セクショニング機能を利用)。単一細胞と膵臓の細胞構成要素との相互作用を in vivo で可視化することで、高解像度IVIは膵臓の疾患の根底にあるメカニズムを理解する上で非常に貴重であることが証明されます。
SWIPプロトコルを実行するには、ある程度の技術的専門知識が必要です。しかし、適切な練習と重要なステップへの注意を払えば、手順を高い成功率で実行することができます。悪性膵臓を画像化するには、まず腫瘍の移植が成功することが重要です。これは、マウスの膵臓癌細胞の懸濁液をマウスの膵臓に同所性注射することによって得られます。膵臓の実質が液体で満たされた気泡に膨張すると、注射の成功が観察され、以前に詳細に説明されています21。最大限の成功と生存を確保するためには、細胞懸濁液の漏出が最小限またはまったくないことが不可欠であり、漏出は潜在的な腫瘍サイズを劇的に縮小し、発がん症につながるためです。さらに、膵臓は高度に血管新生した器官であり、多くの分岐した血管があります。血管の裂傷は、膵臓の出血とその後の血腫を引き起こし、腫瘍の成長を抑制するため、避けることが重要です。このモデルでは、KPCマウス20に由来する同系PDAC細胞株を用いた。これにより、免疫能力のあるマウスにおける腫瘍の生着が可能になります。他の同系PDAC細胞株は、使用するマウスの系統に応じて使用されてもよい。ヒトPDAC細胞株も使用できます。ただし、マウス株は、腫瘍移植の拒絶反応を避けるために免疫不全でなければなりません。
このプロトコルで画像検査を受ける腫瘍のサイズは、必要に応じて変更できます。これは、マウスの膵臓に移植された高濃度のがん細胞を使用してより大きな腫瘍を取得するか、窓移植前に腫瘍の増殖時間を延長することによって達成できます。この研究では、106 KPC PDAC細胞を注入し、腫瘍が触知可能になった10〜14日後にSWIPを移植しました。より小さく、より大きい腫瘍は、クロスステッチバスケットへの組織の適切な配置を使用して、このSWIPプロトコルによって収容することもできます。
イメージングウィンドウと膵臓の安全な配置も、高品質のイメージングを取得し、モーションアーチファクトを制限するために重要です。正常なマウスの膵臓は非常に従順で、呼吸や近くの蠕動運動から動きやすいです。これに対処し、イメージング中の膵臓の安定性を高めるために、以前に説明したクロスステッチバスケット技術が利用される31。クロスステッチバスケットは、体の靭帯の使用を模倣するように設計されています。組織をガラスのカバーガラスに押し付け、一定の軸方向の圧力を加えることで、横方向と軸方向の両方の動きを防ぎます。より大きな固形腫瘍を扱う場合、クロスステッチのサポートポイントと方向を変更して、腫瘍のサイズと位置に最も適したものにすることで、最適なサポートを得ることができます。
最適でないイメージングは、窓枠がマウスの腹部に不適切に埋め込まれている場合にも発生する可能性があります。窓枠が緩く取り付けられていると、イメージングが困難になったり、動きが乱れたりする可能性があります。適切な巾着縫合糸は、皮膚と腹壁を通して窓枠を腹部に固定することで、この問題に対処できます。財布の紐を締めるときに皮膚が過度に折りたたまれないように、ステッチのステップは、ティッシュの端から5mm以内に配置されたステップ間の1mmを超えないようにし、窓枠にぴったりとフィットするようにする必要があります。巾着の縫合、クロスステッチバスケットへの膵臓の配置、窓枠の埋め込みに続いて、最後の重要なステップは、窓枠のくぼみ内に接着剤を配置することです。このステップでは、接着剤が膵臓組織に接触しないことが重要であり、これは組織を損傷し、イメージングを混乱させるためです。接着剤が膵臓組織に接触するのを防ぐことができる潜在的な変更は、ガラスカバーガラスを窓枠に接着し、腹部に外科的に移植する前に両方を乾燥させることです。
SWIPは、すべての生体内イメージング技術と同様に、明示的に標識されていない組織内の他の細胞や構造に関する情報を明らかにする能力に制限があります。しかし、SWIPウィンドウを蛍光レポーター(本研究のようにECFP発現上皮細胞やDendra2標識KPC細胞など)と組み合わせ、薬理学的および/または光遺伝学的ツールを用いてタンパク質または細胞の状態を制御することで、これらの制限を排除することができます。
さらに、SWIPウィンドウ設計は、ウィンドウフレーム上に3本のエッチング線を含み、シリアルイメージング30中に関心領域を再局在化するためのマイクロカートグラフィの基準マーカーとして機能する。これにより、マークのない組織でも、同じ視野を複数回見つけることができます。
要約すると、SWIPは、正常な健康な膵臓組織だけでなく、膵炎やPDACなどの良性および悪性の膵臓疾患にも使用できます。SWIPを使用して、これらの状態での単一細胞および細胞内動態を捉えることができ、研究者がPDACにおける転移播種などの重要な生理学的イベントを理解するのに役立ちます。IVIの品質と安定性の向上は、膵臓の病態生理学と細胞生物学に関する貴重な洞察を提供する可能性を秘めており、有望で有益なツールとなっています。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
Evelyn Lipper Charitable Foundation、Gruss-Lipper Biophotonics Center、Integrated Imaging Program for Cancer Research、NIH T-32 Fellowship (CA200561)、および国防総省の膵臓がん研究プログラム (PCARP) 助成金PA210223P1。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
| 5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
| 28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
| Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
| Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
| Cyano acrylate - Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
| Cyano acrylate - Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
| DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
| Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
| Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
| Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
| Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
| Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
| Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |
References
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