Gestabiliseerd venster voor intravitale beeldvorming van de alvleesklier van muizen

Summary

We presenteren een protocol voor de chirurgische implantatie van een gestabiliseerd inwonend optisch venster voor subcellulaire beeldvorming van de alvleesklier van muizen, waardoor seriële en longitudinale studies van de gezonde en zieke alvleesklier mogelijk zijn.

Abstract

De fysiologie en pathofysiologie van de alvleesklier zijn complex. Ziekten van de alvleesklier, zoals pancreatitis en adenocarcinoom van de alvleesklier (PDAC) hebben een hoge morbiditeit en mortaliteit. Intravitale beeldvorming (IVI) is een krachtige techniek die het mogelijk maakt om weefsels in zowel gezonde als zieke toestand met hoge resolutie in beeld te brengen, waardoor de celdynamiek in realtime kan worden waargenomen. IVI van de alvleesklier van muizen vormt een aanzienlijke uitdaging vanwege de diepe viscerale en meegaande aard van het orgaan, waardoor het zeer vatbaar is voor beschadiging en bewegingsartefacten.

Hier wordt het proces beschreven van implantatie van de S-getabiliseerde Window voor Intravitale beeldvorming van de muizen Pancreas (SWIP). Het SWIP maakt IVI van de alvleesklier van muizen mogelijk in normale gezonde toestanden, tijdens de transformatie van de gezonde alvleesklier naar acute pancreatitis geïnduceerd door ceruleïne, en in kwaadaardige toestanden zoals pancreastumoren. In combinatie met genetisch gelabelde cellen of de toediening van fluorescerende kleurstoffen, maakt de SWIP het mogelijk om de dynamiek van eencellige en subcellulaire (inclusief eencellige en collectieve migratie) te meten, evenals seriële beeldvorming van hetzelfde interessegebied gedurende meerdere dagen.

Het vermogen om tumorcelmigratie vast te leggen is van bijzonder belang, aangezien de primaire oorzaak van kankergerelateerde sterfte bij PDAC de overweldigende metastatische belasting is. Het begrijpen van de fysiologische dynamiek van metastase bij PDAC is een kritieke onvervulde behoefte en cruciaal voor het verbeteren van de prognose van de patiënt. Over het algemeen biedt de SWIP verbeterde beeldvormingsstabiliteit en breidt het de toepassing van IVI uit bij de gezonde alvleesklier en kwaadaardige alvleesklierziekten.

Introduction

Goedaardige en kwaadaardige pancreasaandoeningen zijn potentieel levensbedreigend, met aanzienlijke hiaten in het begrip van hun pathofysiologie. Pancreatitis - ontsteking van de alvleesklier - is de derde belangrijke oorzaak van gastro-intestinale ziektegerelateerde ziekenhuisopnames en heropnames in de VS en wordt in verband gebracht met aanzienlijke morbiditeit, mortaliteit en sociaaleconomische lasten^. Gerangschikt als de derde belangrijkste doodsoorzaak door kanker 2, is ductaal adenocarcinoom (PDAC) van de pancreas verantwoordelijk voor de meeste maligniteiten van de alvleesklier³ en voorspelt het een slechte 5-jaarsoverleving van slechts 11%². De belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte bij PDAC is een overweldigende metastatische belasting. Helaas vertonen de meeste patiënten gemetastaseerde ziekte. Daarom is het begrijpen van de dynamiek van metastase in PDAC een kritieke onvervulde behoefte op het gebied van kankeronderzoek.

De mechanismen die ten grondslag liggen aan ontstekingen en de metastatische cascade van de alvleesklier zijn slecht begrepen. Een belangrijke oorzaak van deze lacune in kennis is het onvermogen om de cellulaire dynamiek van de alvleesklier in vivo te observeren. Directe observatie van deze cellulaire dynamiek belooft kritieke doelen te onthullen om de diagnose en behandeling van mensen met pancreasaandoeningen te benutten en te verbeteren.

Intravitale beeldvorming (IVI) is een microscopietechniek waarmee onderzoekers biologische processen in levende dieren in realtime kunnen visualiseren en bestuderen. IVI maakt directe visualisatie met hoge resolutie mogelijk van intracellulaire en micro-omgevingsdynamiek in vivo en binnen de oorspronkelijke omgeving van het biologische proces in kwestie. Daarom maakt IVI in vivo observatie van gezonde en pathologische processen mogelijk.

Hedendaagse beeldvormingsmodaliteiten voor het hele lichaam, zoals MRI, PET en CT, bieden een uitstekend beeld van hele organen en kunnen pathologieën onthullen, zelfs vóór het begin van klinische symptomen^. Ze zijn echter niet in staat om eencellige resolutie te bereiken of de vroegste stadia van ziekte - pancreatitis of maligniteit - te onthullen.

Eerder onderzoek heeft eencellige resolutie IVI gebruikt om goedaardige en kwaadaardige ziekten van huid^5,6, borst⁷, long⁸, lever⁹, hersenen 10 en pancreastumoren 11 te observeren^, wat leidde tot inzichten in mechanismen van ziekteprogressie ¹². De alvleesklier van muizen vormt echter aanzienlijke obstakels voor het bereiken van eencellige resolutie met behulp van IVI, voornamelijk vanwege de diepe viscerale locatie en hoge compliantie. Bovendien is het een vertakt, diffuus verdeeld orgaan in het mesenterium dat verbinding maakt met de milt, dunne darm en maag, waardoor het moeilijk toegankelijk is. Het weefsel is ook zeer gevoelig voor beweging veroorzaakt door aangrenzende peristaltiek en ademhaling. Het minimaliseren van de beweging van de alvleesklier is essentieel voor microscopie met eencellige resolutie, omdat bewegingsartefacten van zelfs een paar micron beelden kunnen vervagen en vervormen, waardoor^{het onmogelijk wordt} om de dynamiek van individuele cellen te volgen.

Om IVI uit te voeren, moet een abdominaal beeldvormingsvenster (AIW) chirurgisch worden geïmplanteerd ^9,11. Om de AIW operatief te implanteren, wordt een metalen raamkozijn in de buikwand gehecht. Daarna wordt het orgaan van belang met cyanoacrylaatlijm aan het frame bevestigd. Hoewel dit voldoende is voor sommige stijve inwendige organen (bijv. lever, milt, stijve tumoren), worden pogingen om de gezonde alvleesklier van muizen in beeld te brengen gecompromitteerd door suboptimale laterale en axiale stabiliteit als gevolg van de conforme textuur en complexe architectuur van het weefsel¹⁴. Om deze beperking aan te pakken, ontwikkelden Park et ^al.14 een beeldvormingsvenster dat speciaal is ontworpen voor de gezonde alvleesklier. Dit Pancreas Imaging Window (PIW) minimaliseert de invloed van darmbeweging en ademhaling door een horizontale metalen plank in het raamkozijn op te nemen, net onder het dekglaasje, waardoor het weefsel wordt gestabiliseerd en het contact met het dekglas behouden blijft. Hoewel de PIW een verhoogde laterale stabiliteit biedt, ontdekten we dat dit venster nog steeds axiale drift vertoont en bovendien de beeldvorming van grote solide tumoren verhindert vanwege de smalle opening tussen de metalen plank en het dekglaasje¹⁵.

Om deze beperkingen aan te pakken, ontwikkelden we de Sgetabiliseerde Window for Intravital beeldvorming van de muizen Pancreas (SWIP), een implanteerbaar beeldvormingsvenster dat in staat is om stabiele langetermijnbeeldvorming van zowel de gezonde als de zieke alvleesklier te bereiken (Figuur 1)¹⁵. Hier bieden we een uitgebreid protocol voor de chirurgische ingreep die wordt gebruikt om de SWIP te implanteren. Hoewel het primaire doel was om de dynamische mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij metastase, kan deze methode ook worden gebruikt om verschillende aspecten van de biologie en pathologie van de alvleesklier te onderzoeken.

Protocol

Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften voor het gebruik van gewervelde dieren, inclusief voorafgaande goedkeuring door het Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Passiveren van ramen

OPMERKING: Passiveren van roestvrij staal reinigt het metaal van verontreinigingen en creëert een dunne oxidelaag die de biocompatibiliteit van het metaal met zachte weefsels aanzienlijk verhoogt, zelfs buiten die van titanium¹⁶.

1. Start het passiveringsproces door de optische raamkozijnen te wassen met een enzymatisch actieve reinigingsmiddeloplossing van 1% (g/v).
2. Dompel de frames gedurende 30 minuten onder in een natriumhydroxideoplossing van 5% (m/v) bij 70 °C in een glazen pot.
3. Haal de frames eruit en spoel ze af met gedeïoniseerd water.
4. Dompel de frames gedurende 10 minuten onder in een citroenzuuroplossing van 7% (g/v) bij 55 °C in een nieuwe glazen pot.
5. Verwijder de frames en spoel ze opnieuw af met gedeïoniseerd water.
6. Herhaal stap 1.2 en spoel tot slot de kozijnen nog een laatste keer af met gedeïoniseerd water.

2. Voorbereiding op tumorimplantatie of raamchirurgie

OPMERKING: Voor onderzoeken naar pancreastumoren moeten tumorcellen worden geïmplanteerd en mogen uitgroeien tot openlijke tumoren. Om de tumorcellen in vivo te visualiseren, wordt aanbevolen om cellen te gebruiken die genetisch zijn veranderd om fluorescerende eiwitten zoals Dendra2 tot expressie te brengen. Het gebruik van fluorescerende eiwitlabels die helder zijn, vermindert mogelijke problemen met autofluorescentie van weefsels. Andere potentiële fluorescerende eiwitten, kleurstoffen en genetisch gecodeerde fluorescerende muismodellen die kunnen worden gebruikt, zijn elders besproken^17,18. Om besmetting van het operatieveld te voorkomen, voert u de chirurgische ingreep uit in een kap of laminaire stroomkast en zorgt u ervoor dat verschillende gebieden worden gebruikt voor voorbereiding, chirurgie en herstel.

1. Steriliseer voorafgaand aan de operatie alle chirurgische instrumenten in een autoclaaf en gebruik indien nodig een sterilisator met hete kralen voor volgende procedures. Zorg ervoor dat de operatie een techniek met alleen tips gebruikt.
2. Schakel het verwarmde operatiekussen en de hielsterilisator in en wacht tot deze de juiste bedrijfstemperatuur hebben bereikt. De temperatuur van het verwarmingskussen moet worden gecontroleerd met een oppervlaktethermometer om mogelijke brandwonden te voorkomen. Leg een steriele doek over het verwarmingskussen als de temperatuur niet voldoende kan worden geregeld.
   OPMERKING: De lichaamstemperatuur tijdens korte procedures (≤20 min), zoals tumor- en raamimplantatie, wordt minimaal beïnvloed bij gebruik van een verwarmd chirurgisch kussen. Voor langere perioden van anesthesie, zoals tijdens uitgebreide timelapse-beeldvorming, moet de muis echter in een verwarmde kamer worden geplaatst om de lichaamstemperatuur op peil te houden.
3. Verdoof de muis met 5% isofluraan in een anesthesiekamer.
4. Kritieke stap: Verlaag de anesthesie tot 2% zodra de muis bewusteloos is. Houd het anesthesieniveau en de vitale functies van de muis zorgvuldig in de gaten (bijv. met behulp van een pulsoximeter)¹⁹.
5. Breng een kleine druppel oogglijmiddel aan op elk oog van de muis om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
6. Breng voorafgaand aan de operatie royaal ontharingscrème aan op de linker bovenbuik om haar te verwijderen. Gebruik na 20 seconden vochtig tissuepapier om het haar stevig weg te vegen en ontharingscrème. Herhaal het proces indien nodig totdat al het haar uit het operatiegebied is verwijderd.
7. Injecteer subcutaan 10 μl buprenorfine (0,1 mg/kg) verdund in 90 μl PBS om preoperatieve analgesie te garanderen.

3. Implantatie van pancreastumoren

1. Bereid aliquots van tumorcellen voor in de gewenste concentratie (op basis van de verdubbelingstijd van de tumorcellen). Plaats de celsuspensie in een insulinespuit en bewaar deze op ijs. Om dit protocol te volgen, gebruikt u 10⁶ syngene KPC-tumorcellen 20 gesuspendeerd in maximaal 50 μL PBS, volgens het orthotope injectieprotocol aangepast van Erstad et^al.21
   OPMERKING: Deze cellijn die in deze concentratie werd geïnjecteerd, produceerde routinematig voelbare of voldoende grote tumoren na 10-14 dagen. Subklonen van deze cellijn en andere pancreascellijnen zouden moeten worden geëvalueerd op geschikte concentraties en tijdlijnen om tumoren van de juiste grootte te produceren).
2. Was de handen met antiseptische zeep.
3. Trek voor elke nieuwe operatie nieuwe steriele handschoenen aan.
4. Breng de muis over naar de steriele operatiekap en plaats deze in een gedeeltelijke rechter laterale decubituspositie.
5. Zet de ledematen vast met plakband.
   NOTITIE: Correct gebruik van de instrumenten is belangrijk tijdens de hele procedure. Voorbeelden van het vasthouden van een pincet, een Castroviejo-schaar en het vacuümopnamegereedschap worden weergegeven in afbeelding 2A-C.
6. Steriliseer de buik met een antisepticum (Figuur 2D).
7. Zorg ervoor dat het dier volledig verdoofd is door een teenknijptest uit te voeren.
8. Maak een incisie van 10-15 mm in de linker subcostale huid met behulp van een pincet en een Castroviejo-schaar (Figuur 2E).
9. Controleer hemostase met wattenstaafjes of een cauterisatiepen wanneer/waar dit nodig wordt geacht.
10. Verdeel de onderliggende spier voorzichtig met een tang en een Castroviejo-schaar om het buikvlies binnen te gaan (Figuur 2F).
11. Gebruik steriele wattenstaafjes om de alvleesklier en milt atraumatisch naar buiten te brengen.
12. Spreid de alvleesklier uit zodat er geen plooien zijn (Figuur 2G).
13. Identificeer de gewenste tumorinjectieplaats in het lichaam of de staart van de alvleesklier (weg van bloedvaten).
14. Kritieke stap: Gebruik na zorgvuldige positionering van de alvleesklier een pincet om het weefsel onder spanning te zetten en steek de punt van de insulinespuit, met de schuine kant naar boven gericht, op de gewenste plaats van de alvleesklier tot een diepte van 4-5 mm (Figuur 2H).
15. Injecteer langzaam de tumorceloplossing. Zoek naar een kleine luchtbel die een succesvolle injectie bevestigt (Figuur 2I).
16. Breng de alvleesklier voorzichtig terug naar de buik zonder de injectiebel van de tumorcel te verstoren (Figuur 2J).
17. Gebruik resorbeerbare 5-0 polydioxanonhechtingen om eerst de spierlaag te sluiten en vervolgens de huid met onderbroken hechtingen (Figuur 2K-N).
18. Bedek de incisie met cyanoacrylaatlijm (Figuur 2O) en plaats de muis vervolgens terug in een schone kooi onder een verwarmingslamp voor herstel. Dien antibiotica toe in drinkwater om infectie te voorkomen. Houd de muizen in de gaten en laat ze volledig herstellen van de operatie.
    OPMERKING: Antibiotica worden toegediend zoals vereist door het IACUC-protocol. Alle dieren worden individueel gehuisvest.
19. Laat de tumor zich 10-14 dagen ontwikkelen totdat deze voelbaar is door de buikwand.

4. Raamoperatie van de alvleesklier

1. Wanneer de dieren klaar zijn voor beeldvorming, begint u met de raamimplantatie-operatie. Was om te beginnen de handen met antiseptische zeep.
2. Trek voor elke nieuwe operatie verse steriele handschoenen aan.
3. Plaats de muis op de verwarmde chirurgische standaard in de rechter laterale decubituspositie om de linkerbuik bloot te leggen.
4. Veranker de voor- en achterpoten van de muis craniaal en caudaal aan de verwarmde chirurgische fase met behulp van papieren tape. Zorg ervoor dat de milt (onder de huid) zichtbaar is in het operatieveld (Figuur 3A).
5. Om de steriliteit te behouden, pakt u alle chirurgische instrumenten in de kap uit.
6. Desinfecteer de operatieplaats door de huid van de muis af te vegen met een royale toepassing van een antisepticum.
7. Zorg ervoor dat het dier volledig verdoofd is door een teenknijptest uit te voeren.
8. Kritieke stap: Til de huid van het linker bovenkwadrant van de buik op met een pincet en maak een cirkelvormige incisie van ~10 mm in de huid en het spierstelsel met behulp van een Castroviejo-schaar (Figuur 3B,C).
9. Houd het bloeden onder controle en handhaaf de hemostase met wattenstaafjes of de cauterisatiepen, waar nodig.
10. Lokaliseer de alvleesklier, die aan de milt is bevestigd, en identificeer de richting waarin de alvleesklier in de incisie ligt om te beslissen waar de ondersteunende kruissteek moet worden geplaatst.
11. Plaats met behulp van 5-0 zijden hechting de eerste steek op de gewenste plaats in de spierlaag. Knoop dit uiteinde vast met 3-5 knopen. (Figuur 3D,E)
12. Blijf direct over de incisie hechten. Knip en laat een staart van ~5 cm over (Figuur 3F).
13. Herhaal stap 4.11 en 4.12 loodrecht op de eerste steek (Figuur 3G,H).
14. Kritieke stap: Til de alvleesklier voorzichtig op en plaats deze over de kruissteek (Figuur 3I,J). Zorg ervoor dat u de alvleesklier niet beschadigt tijdens de manipulatie.
15. Cruciale stap: Gebruik de 5-0 zijden hechtdraad om een tas-touwtje ~1 mm van het gat uit te voeren, omtrek, waarbij de huid- en spierlaag in elkaar worden gevlochten (Figuur 3K).
16. Plaats het raamkozijn zo dat de randen van de cirkelvormige incisie binnen de groef van het raam zitten (Figuur 3L).
17. Maak het geïmplanteerde venster vast door de 5-0 zijde stevig vast te binden.
18. Laad 100 μL vloeibare cyanoacrylaatlijm in de spuit van 1 ml.
19. Droog het weefsel door een delicate stroom perslucht aan te brengen gedurende ~10 s.
20. Klem het raamkozijn met een pincet aan de buitenrand vast en til het voorzichtig op om ervoor te zorgen dat de alvleesklier van de onderkant van het raamkozijn wordt gescheiden.
21. Kritieke stap: Breng een dunne laag vloeibare cyanoacrylaatlijm aan langs de uitsparing van het raam (Figuur 3M). Zorg ervoor dat er geen lijm op het alvleesklierweefsel komt.
22. Til met behulp van vacuümpickups het dekglaasje van 5 mm op.
23. Plaats het dekglaasje voorzichtig in de uitsparing in het midden van het optische raamkozijn. Houd met lichte druk vast, zodat de cyanoacrylaatlijm kan uitharden (~25 s).
24. Scheid het dekglaasje van de vacuümpickups met een pincet.
25. Draai de kruissteekhechtingen vast om de alvleesklier goed vast te zetten aan het dekglaasje (Figuur 3N,O). Opmerking: Draai de kruissteek niet te strak aan, omdat dit schade en ischemie aan de alvleesklier kan veroorzaken.
26. Knip de uiteinden van de hechting af.
27. Verwijder de tape van de muis.
28. Schakel de isofluraanverdamper uit.
29. Verplaats de muis naar een schone kooi of rechtstreeks naar de intravitale microscoop.
30. Huisvest de dieren individueel na een raamoperatie en volg ze op tot ze volledig hersteld zijn.
31. Beeldvorming wordt vervolgens uitgevoerd op een multifotonenmicroscoop met twee lasers, zoals we eerder hebben beschreven ^22,23,24 Voor lange beeldvormingssessies wordt de muis in een verwarmde kamer geplaatst om de lichaamstemperatuur op peil te houden en voorzien van ondersteunende vloeistoffen volgens de IACUC-normen.

5. Ceruleine-behandeling voor de inductie van pancreatitis

1. Om het begin van pancreatitis te onderzoeken, behandelt u gezonde muizen met ceruleïne na implantatie van de SWIP. Zorg ervoor dat de muizen 14-18 uur nuchter zijn en ad libitum water krijgen voordat ze ceruleïne toedienen.
2. Injecteer 50 μg/kg ceruleïne in 100 μL steriele 1x DPBS intraperitoneaal met tussenpozen van 1 uur voor maximaal acht injecties. Dien een equivalent volume van 1x DPBS alleen, intraperitoneaal geïnjecteerd, toe aan de controlemuizen.
3. Offer de muizen na beeldvorming 24 uur na de eerste injectie op door cervicale dislocatie volgens de IACUC-normen.
4. Voer beeldvorming uit op een multifotonenmicroscoop met twee lasers zoals eerder beschreven^22,23,24. Plaats de muis voor lange beeldvormingssessies in een verwarmde kamer om de lichaamstemperatuur op peil te houden en hem te voorzien van ondersteunende vloeistoffen volgens de IACUC-normen.

Representative Results

Figuur 1, een bewerking van Du et ^al.15, toont beeldstills uit een time-lapse IVI-film van de alvleesklier van muizen. Enige weefselbeweging kan worden waargenomen binnen de initiële bezinkingsperiode (eerste uur van beeldvorming, figuur 1A). Bij voortgezette beeldvorming na deze bezinkingsperiode (>75 min) zagen we echter een toename van de laterale en axiale stabiliteit (Figuur 1B). Uit de vergelijking van de stabiliteit van het SWIP met de vorige AIW- en PIW-beeldvensters blijkt dat alle vensters een initiële periode nodig hebben om te bezinken. De SWIP vertoonde echter over het algemeen het laagste niveau van drift en is het meest geschikt voor beeldvorming op lange termijn (Figuur 1C-K). De beelden werden gegenereerd op een op maat gemaakte multifotonenmicroscoop²⁴ die oplichtte bij 880 nm en een z stack-t-lapse verkreeg (gezichtsveld [FOV] grootte = 340 x 340 μm, pixelgrootte 0,67 μm) met 1,7 min tussen frames, 11 plakjes met een stapgrootte van 2 μm, 20 beelddiepte en ~1 plak/s. Er werd gekozen voor laservermogen en fotomultiplicatorbuis (PMT) om het signaal te maximaliseren en tegelijkertijd fotobleken en fotoschade te minimaliseren.

De stappen van de chirurgische ingrepen die de implantatie van de pancreastumor en het daaropvolgende inbrengen van het pancreasvenster beschrijven, zijn weergegeven in respectievelijk figuur 2 en figuur 3. Belangrijk is dat beide operaties overlevingsoperaties zijn. Eenmaal correct geïmplanteerd, blijft de alvleesklier tegenover het optische venster, dat nu in de buikwand is geïntegreerd. Dit zorgt voor een comfortabele overleving van de muis en maakt continue beeldvorming mogelijk gedurende maximaal 12 uur, zoals toegestaan door het protocol. Bovendien kan seriële beeldvorming gedurende meerdere opeenvolgende dagen worden uitgevoerd (tot de protocoltoeslag van 2 weken) om interessegebieden in de loop van de tijd te volgen. Intravitale beeldvorming (IVI) kan via het venster worden uitgevoerd op een manier die vergelijkbaar is met andere eerder beschreven vensters^22,25,26.

De SWIP kan worden gebruikt om de dynamiek te onderzoeken bij het begin van acute pancreatitis geïnduceerd met behulp van ceruleïne. Ceruleïne is een oligopeptide met een structuur en functie die vergelijkbaar is met die van cholecystokinine (CKK) en wordt veel gebruikt om experimenteel acute pancreatitis bij knaagdieren te induceren²⁷. Behandeling met ceruleïne resulteert in de samentrekking van de gladde spier in het maagdarmkanaal en stimuleert maag- en pancreassecreties²⁸. Bovendien leidt intraperitoneale toediening van ceruleïne tot zwelling en vergroting van de alvleesklier²⁹.

Figuur 4 toont seriële beeldvorming van de alvleesklier bij muizen na behandeling met ceruleïne, met behulp van het SWIP-protocol. De alvleesklier van muizen wordt gevisualiseerd met een resolutie van één cel met behulp van genetische fluorescerende etikettering (ECFP-gelabelde epithelia-MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgene muizen) en toediening van kleurstoffen met een hoog molecuulgewicht (155 kD dextran-TMR) om lokale vasculatuur te definiëren, aangeduid met de ononderbroken gele lijnen. Het raamontwerp, dat eerder werd gebruikt voor beeldvorming van de muizenlongen⁸, omvat drie geëtste lijnen op het frame (Figuur 4, inzet) die fungeren als fiduciale markeringen die het gebruik van microcartografie³⁰ mogelijk maken. Microcartografie maakt seriële beeldvorming mogelijk van hetzelfde interessegebied van de alvleesklier van muizen gedurende meerdere dagen. Hier wordt dezelfde lobulus van de alvleesklier (gele stippellijnen) gevisualiseerd op dag 1 en geherlokaliseerd op dag 2, zoals blijkt uit de aanwezigheid van dezelfde lokale bloedvaten (Figuur 4). Beelden werden elke dag verkregen als een enkele z-stack met 11 plakjes en een stapgrootte van 2 μm bij ~1 plak/s, genomen bij een belichting van 880 nm en een resolutie van 0,67 μm/pixel (FOV = 340 x 340 μm). Er werd gekozen voor laservermogen en PMT-versterking om het signaal te maximaliseren en tegelijkertijd fotobleken en fotoschade te minimaliseren.

Naast seriële beeldvorming is de SWIP zeer geschikt voor langdurige longitudinale beeldvorming, waardoor de dynamiek van subcellulaire structuren (zoals vacuolen) nauwkeurig kan worden gevolgd en gemeten onder controle- en behandelingsomstandigheden. Hier zijn vacuolen gebieden waar cytoplasmatische fluorescerende eiwitten zijn uitgesloten, waardoor donkere, niet-gelabelde gaten verschijnen (Figuur 5A). Het markeren van vacuolen met behulp van software zoals ROI Tracker²⁴ maakt visualisatie van de motiliteit van de vacuole mogelijk (Figuur 5A,B) en kwantificering van talrijke motiliteitsparameters. Zo nam de gemiddelde snelheid van vacuolen in de alvleesklier van muizen met ongeveer 10% toe na behandeling met ceruleïne om pancreatitis te induceren, vergeleken met PBS-behandeling (0,37 ± 0,07 μm/min versus 0,41 ± 0,09 μm/min, p = 0,02) (Figuur 5C). Behandeling met ceruleïne verhoogde ook de gemiddelde draaifrequentie van subcellulaire structuren met 10% ten opzichte van PBS-behandeling (2,3 ± 0,3 graden/min versus 2,6 ± 0,6 graden/min, p = 0,04) (Figuur 5F). Er was echter geen significant verschil (p > 0,05) in netto snelheid, directionaliteit of cumulatieve afgelegde afstand tussen ceruleïnebehandeling en PBS-behandeling (Figuur 5D,E en Figuur 5G). Beelden werden gegenereerd op een op maat gemaakte multifotonenmicroscoop²⁴ die oplichtte bij 880 nm en een z stack-t-lapse verkreeg (FOV-grootte = 340 x 340 μm, pixelgrootte 0,67 μm) met 2,9 min tussen frames, 11 plakjes met een stapgrootte van 2 μm en ~1 plak/s.

Ten slotte maakt het SWIP visualisatie en vastlegging van tumorcelmigratie mogelijk. Figuur 6A toont een still uit een time-lapse-film (Supplemental Video S1 en Supplemental Video S2) van de migratie in de alvleesklier van Dendra-2 gelabelde KPC-tumorcellen die orthotopisch werden geïnjecteerd. Zowel collectieve migratie van cellen in clusters (Figuur 6B en aanvullende video S1) als migratie van één cel (figuur 6C en aanvullende video S2) kunnen gedurende korte perioden (<1 uur) worden waargenomen. De beelden werden gegenereerd op een op maat gemaakte multifotonenmicroscoop²⁴ die oplichtte bij 880 nm en een 4 x 4 mosaic-z stack-t-lapse kreeg met 20% overlap tussen tegels (tegelgrootte = 340 x 340 μm), 3,4 min tussen frames, 3 plakjes met een stapgrootte van 5 μm en ~1 plak/s. Er werd gekozen voor laservermogen en PMT-versterking om het signaal te maximaliseren en tegelijkertijd fotobleken en fotoschade te minimaliseren.

Figuur 1: Verbeterde stabiliteit van beeldvorming door SWIP. (A) Foto's van binnen de eerste 72 minuten van een timelapse-film van de alvleesklier die via de SWIP in beeld is gebracht. Er kan enige axiale maar zeer weinig zijwaartse drift worden waargenomen. Schaalbalken = 50 μm. (B) Voortgezette timelapse beeldvorming na 72 minuten toont een hoge mate van axiale en laterale stabiliteit. (A,B) Rood = 155 kDa tetramethylrhodamine dextran-gelabeld bloedserum, cyaan = CFP-gelabelde alvleeskliercellen (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgene muizen) (C-E) Vergelijking van de laterale stabiliteit van elk van de beeldvormingsvensters van de alvleesklier tijdens het eerste uur van beeldvorming voor de (C) AIW, (D) PIW en (E) SWIP. (F-H) Vergelijking van de laterale stabiliteit van elk van de pancreasbeeldvorming gedurende de daaropvolgende 150 minuten voor de (F) AIW, (G) PIW en (H) SWIP. Inzetstukken zijn ingezoomde weergaven van de bijbehorende percelen. (I-K) Vergelijking van de axiale stabiliteit van elk van de beeldvormingsvensters van de alvleesklier gedurende de eerste 120 minuten beeldvorming voor de (I) AIW, (J) PIW en (K) SWIP. Deze figuur komt uit Du et al. Open Biology 2022, DOI:10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273. ¹⁵. Afkortingen: SWIP = gestabiliseerd venster voor intravitale beeldvorming van de alvleesklier; AIW = abdominaal beeldvormingsvenster; PIW = beeldvormingsvenster van de alvleesklier; CFP = cyaan fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Overzicht van het operatieprotocol van orthotope injectie van ductaal adenocarcinoom (KPC) van de pancreas. (A) Illustratie van het vasthouden van een chirurgische pincet. (B) Illustratie van het vasthouden van een Castroviejo-schaar. (C) Illustratie van het vasthouden van het vacuümopnamegereedschap. (D) Ontsmetting van de huid. (E) Incisie in de huid. (F) Incisie in de spier. (G) Gespreide alvleesklier. (H) Inbrengen van de naald op de gewenste injectieplaats. (I) Injectie van kankercelsuspensie waardoor een luchtbel ontstaat (blauwe pijl). (J) Pancreas keerde terug naar de peritoneale holte. (K,L) Sluiting van de spierlaag met een onderbroken zijden hechting. (M,N) Sluiting van de huid met een onderbroken zijden hechtdraad. (O) Cyanoacrylaatlijm aangebracht op incisie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Overzicht van het operatieprotocol van het gestabiliseerde venster voor beeldvorming van de pancreas. (A) Identificatie van milt en aangehechte pancreas. (B,C) Cirkelvormige incisie in de huid en spier. Rode stippellijnen in A-C geven de omtrek van de milt aan die door de buikwand en de huid heen te zien is. (D,E) Eerste steek van de kruissteekmand geplaatst en vastgebonden in de spierlaag (E, gele pijl). (F) De hechting wordt voortgezet naar de andere kant van de spierincisie, waarbij een staart overblijft (witte pijl). (G,H) De tweede steek wordt loodrecht op de eerste geplaatst, aan het ene uiteinde vastgebonden (gele pijlen) en een staart achterlatend (witte pijlen). (I,J) Plaatsing van de alvleesklier in de kruissteekmand. (K) Omtreknaad door spieren en huid. (L) Implantatie van het raamkozijn. (M) Aanbrengen van lijm op het raamkozijn. (N) Bevestiging van glazen dekglaasje. (O) De uiteinden van de kruissteek worden strakker gemaakt. (P) Volledig geïmplanteerde SWIP. Afkorting: SWIP = gestabiliseerd venster voor intravitale beeldvorming van de alvleesklier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Microcartografie gebruikt voor seriële beeldvorming om dezelfde interessegebieden binnen het optische venster te herlokaliseren. Intravitale beeldvorming van een enkel gebied van de alvleesklier van muizen, waarbij dezelfde lobulus gedurende 2 opeenvolgende dagen (D1-D2) wordt verplaatst met behulp van microcartografie. Gele stippellijnen omlijnen de grenzen van dezelfde lobulus. De ononderbroken lijnen markeren dezelfde bloedvaten (zoals blijkt uit de aanwezigheid van rood gelabeld bloedserum in het lumen) die elke opeenvolgende dag worden geïdentificeerd. Rood = 155 kDa tetramethylrhodamine dextran-gelabeld bloedserum, Cyaan = CFP-gelabelde alvleeskliercellen (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgene muizen) (Inzet) Afbeelding van de SWIP met krassen voor microcartografie. Het gebruik van microcartografie om interessante gebieden te verplaatsen tijdens seriële beeldvorming wordt toegestaan door de drie geëtste lijnen op het raamkozijn (inzet). Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Subcellulaire resolutie en de meting van subcellulaire dynamica met behulp van SWIP. (A) Afzonderlijke cellen (gele stippellijnen) en subcellulaire structuren zoals vacuolen kunnen in de loop van de tijd door de SWIP in de alvleesklier van muizen worden gevisualiseerd. Voorbeelden van deze vacuolen zijn aangegeven met gele pijlen. Het SWIP maakt het dus mogelijk om subcellulaire structuren (gekleurde contouren en sporen die over het fluorescentiebeeld worden gelegd) in de loop van de tijd te volgen. De inzet is een ingezoomde weergave van een geel omkaderd gebied met drie vacuolen met rupsbanden. Schaalbalk = 50 μm. (B) Trajecten van subcellulaire structuren, zoals kernen en vacuolen (gemarkeerd in A), na een verschuiving van coördinaten naar het oorsprongspunt. De rode stippellijn toont het gemiddelde nettopad in 1 uur (3,46 μm). Kwantificering van de dynamische parameters van (C) gemiddelde snelheid, (D) nettopad, (E) richtingsgevoeligheid, (F) gemiddelde draaifrequentie en (G) cumulatieve afstand. Rood = 155 kDa tetramethylrhodamine dextran-gelabeld bloedserum, cyaan = CFP-gelabelde alvleeskliercellen (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgene muizen). Afkortingen: SWIP = gestabiliseerd venster voor intravitale beeldvorming van de pancreas; CFP = cyaan fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Vastleggen van celmigratie met SWIP . (A) Een stilstaand beeld van een timelapsed intravitale beeldvormingsfilm van de alvleesklier in een orthotopisch geïnjecteerd muismodel van PDAC. (B) Stilstaande beelden van aanvullende video S1 met een voorbeeld van tumorcellen die collectieve migratie ondergaan (gele pijl). (C) Stilstaande beelden van aanvullende video S2 met voorbeelden van eencellige migratie van een tumorcel (gele pijl) en een macrofaag (rode pijl). Groen = Dendra2-gelabelde tumorcellen, Blauw = CFP-gelabelde macrofagen, Rood = 155 kDa tetramethylrhodamine dextran-gelabeld bloedserum. Schaalbalken = 50 μm (A), 15 μm (B,C). Afkortingen: SWIP = gestabiliseerd venster voor intravitale beeldvorming van de pancreas; CFP = cyaan fluorescerend eiwit; PDAC = adenocarcinoom van de pancreas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende video S1: Timelapse intravitale beeldvormingsfilm met tumorcellen die collectieve migratie ondergaan die overeenkomt met figuur 6B. Groen = Dendra2-gelabelde tumorcellen, Blauw = CFP-gelabelde macrofagen, Rood = 155 kDa tetramethylrhodamine dextran-gelabeld bloedserum. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video S2: Timelapse intravitale beeldvormingsfilm met tumorcellen die eencellige migratie ondergaan die overeenkomt met figuur 6C. Groen = Dendra2-gelabelde tumorcellen, Blauw = CFP-gelabelde macrofagen, Rood = 155 kDa tetramethylrhodamine dextran-gelabeld bloedserum. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het hier beschreven SWIP-protocol biedt een verbeterde methode voor stabilisatie van het alvleesklierweefsel door gebruik te maken van een kruissteekmandtechniek. Vroege abdominale beeldvormingsvensters (AIW's) maakten intravitale beeldvorming (IVI) van inwendige organen van de buik mogelijk, maar beperkten de beweging van zachte weefsels zoals de alvleesklier niet voldoende. Als reactie hierop ontwikkelden Park et al. een pancreas imaging window (PIW) dat een horizontale metalen plank bevat en een betere stabilisatie van het pancreasweefsel mogelijk maakt terwijl het contact met de glazen dekglaasjes. Hoewel deze aanpak de laterale stabiliteit verbetert, beperkt het de beeldvorming van solide pancreastumoren omdat hun grootte groter is dan de smalle ruimte tussen de plank en het afdekglas. De SWIP pakt dit probleem aan door de alvleesklier te stabiliseren met een kruissteekmandje, waardoor zowel axiale als zijwaartse beweging wordt beperkt, terwijl het ook in staat is om grote (≤10 mm) solide tumoren op te vangen.

Directe vergelijkingen van het SWIP met eerdere beeldvormingsvensters zoals AIW en PIW werden eerder uitgevoerd¹⁵. Dit wordt weergegeven in figuur 1, aangepast van Du et ^al.15, waar laterale en axiale verschuivingen werden gekwantificeerd door cellulaire anatomische kenmerken zoals kernen of bloedvaten te volgen. Alle beeldvensters vertoonden een behoefte aan een periode van bezinking gedurende ongeveer het eerste uur van de beeldvorming. Gedurende deze tijd werd een hogere mate van zijwaartse beweging waargenomen met de AIW en PIW in vergelijking met de SWIP. Er werd ook een grotere axiale verschuiving waargenomen met de AIW en PIW in vergelijking met de SWIP over een periode van 2 uur. Over het algemeen vertoonde de SWIP het laagste driftniveau en is het geschikt voor langdurige beeldvorming (≤12 uur).

Helaas is de alvleesklier een sterk verstrooiend weefsel, en als zodanig wordt de puntspreidingsfunctie voor de multifotonenmicroscoop die bij IVI wordt gebruikt, snel afgebroken met penetratie in het weefsel. De beelddiepte met een van de optische vensters is dus beperkt tot slechts ~30-60 μm. IVI brengt ook het risico met zich mee van door licht veroorzaakte schade aan het monster. Dit kan aan het begin van beeldvormingssessies worden getest door een tijdreeks van 100 beelden te verkrijgen en te zoeken naar tekenen van fotobleken of fotoschade. Op ons microscoopsysteem ontdekten we dat een maximaal vermogen van ~15 mW bij het monster kan worden gebruikt zonder het weefsel nadelig te beïnvloeden.

Het SWIP-protocol maakt stabiele, eencellige optische IVI met hoge resolutie van de alvleesklier van muizen mogelijk in zowel normale gezonde omstandigheden als in zieke toestanden zoals pancreatitis en PDAC. Dit maakt de SWIP bijzonder nuttig voor lange timelapse-beeldvorming, maar ook voor het uitvoeren van 3D- en 4D-beeldvorming (3D + tijd) door meerdere z-segmenten vast te leggen (gebruikmakend van de inherente optische sectiemogelijkheden van multifotonen en confocale microscopie). Door in vivo visualisatie van afzonderlijke cellen en hun interacties met de cellulaire bestanddelen van de alvleesklier mogelijk te maken, zal IVI met hoge resolutie van onschatbare waarde blijken te zijn voor het begrijpen van mechanismen die ten grondslag liggen aan ziekten van de alvleesklier.

Een bepaald niveau van technische expertise is nodig om het SWIP-protocol uit te voeren. Met de juiste oefening en aandacht voor de belangrijkste stappen kan de procedure echter met een hoog slagingspercentage worden uitgevoerd. Om de kwaadaardige alvleesklier in beeld te brengen, is het cruciaal om eerst een succesvol geïmplanteerde tumor te hebben. Dit wordt verkregen door orthotope injectie van een suspensie van alvleesklierkankercellen van muizen in de alvleesklier van de muis. Een succesvolle injectie wordt waargenomen wanneer het parenchym van de alvleesklier wordt opgeblazen tot een met vloeistof gevulde bel en is eerder in detail beschreven²¹. Om maximaal succes en overleving te garanderen, is het van vitaal belang dat er minimale tot geen lekkage van de celsuspensie is, aangezien lekkage de potentiële tumorgrootte drastisch zal verminderen en tot carcinomatose zal leiden. Bovendien is de alvleesklier een sterk gevasculariseerd orgaan, met veel vertakte bloedvaten. Het is van cruciaal belang om te voorkomen dat bloedvaten worden gescheurd, omdat dit bloedingen en daaropvolgende hematoom in de alvleesklier veroorzaakt en de tumorgroei remt. In dit model hebben we een syngene PDAC-cellijn gebruikt die is afgeleid van KPC-muizen²⁰. Dit maakt tumorimplantatie mogelijk bij immuuncompetente muizen. Andere syngene PDAC-cellijnen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de stam van de gebruikte muis. Menselijke PDAC-cellijnen kunnen ook worden gebruikt; De muizenstam moet echter immuungecompromitteerd zijn om afstoting van de tumorimplantatie te voorkomen.

De grootte van de tumoren die in dit protocol worden afgebeeld, kan indien nodig worden aangepast. Dit kan worden bereikt door een hogere concentratie kankercellen te gebruiken die in de alvleesklier van de muizen worden geïmplanteerd om een grotere tumor te verkrijgen of door de groeitijd van de tumor te verlengen voordat het venster wordt geïmplanteerd. In deze studie injecteerden we 10⁶ KPC PDAC-cellen en implanteerden we de SWIP 10-14 dagen daarna, toen de tumoren voelbaar waren. Kleinere en grotere tumoren kunnen ook worden opgevangen door dit SWIP-protocol met behulp van de juiste plaatsing van het weefsel in de kruissteekmand.

Veilige plaatsing van het beeldvenster en de alvleesklier is ook cruciaal om beeldvorming van hoge kwaliteit te verkrijgen en bewegingsartefacten te beperken. De normale alvleesklier van muizen is zeer meegaand en vatbaar voor beweging door ademhaling en nabijgelegen peristaltiek. Om dit aan te pakken en de stabiliteit van de alvleesklier tijdens het maken van beeldvorming te vergroten, wordt een eerder beschreven kruissteekmandtechniek gebruikt³¹. De kruissteekmand is ontworpen om het gebruik van ligamenten door het lichaam na te bootsen. Door het weefsel tegen het glazen dekglaasje te wiegen en constante axiale druk uit te oefenen, wordt zowel zijwaartse als axiale beweging voorkomen. Bij grotere solide tumoren kunnen het steunpunt en de richting van de kruissteek worden aangepast aan de grootte en positie van de tumor voor optimale ondersteuning.

Suboptimale beeldvorming kan ook optreden wanneer het raamkozijn onvoldoende in de buik van de muis is geïmplanteerd. Een losjes gemonteerd raamkozijn kan leiden tot beeldvormingsproblemen en bewegingsartefacten. Een geschikte hechting met portemonnee kan dit probleem verhelpen door het raamkozijn via de huid en de buikwand aan de buik te bevestigen. Om overmatige huidvouw bij het aanspannen van het taskoord te voorkomen, mogen de steekstappen niet groter zijn dan 5 mm tussen de treden die niet meer dan 1 mm van de weefselrand zijn geplaatst, zodat ze goed rond het raamkozijn passen. Na het hechten van de tas, het plaatsen van de alvleesklier in de kruissteekmand en het implanteren van het raamkozijn, is een laatste cruciale stap het plaatsen van lijm in de uitsparing van het raamkozijn. Het is van cruciaal belang dat tijdens deze stap geen lijm in contact komt met het alvleesklierweefsel, omdat dit het weefsel zal beschadigen en de beeldvorming zal verwarren. Een mogelijke aanpassing die ook kan voorkomen dat de lijm in contact komt met het alvleesklierweefsel, is om het glazen dekglaasje op het raamkozijn te lijmen en beide te laten drogen voordat ze chirurgisch in de buik worden geïmplanteerd.

Het SWIP heeft, net als alle intravitale beeldvormingstechnieken, beperkingen in zijn vermogen om informatie over andere cellen en structuren in het weefsel te onthullen die niet expliciet zijn gelabeld. Het combineren van het SWIP-venster met fluorescerende reporters (zoals ECFP-expressie-epitheel en Dendra2-gelabelde KPC-cellen zoals in deze studie) en het controleren van eiwit- of celtoestanden met farmacologische en/of optogenetische hulpmiddelen kan deze beperkingen echter elimineren.

Bovendien omvat het SWIP-raamontwerp drie geëtste lijnen op het raamkozijn, die dienen als fiduciale markeringen voor microcartografie om interessegebieden te herlokaliseren tijdens seriële beeldvorming³⁰. Dit maakt het mogelijk om hetzelfde gezichtsveld meerdere keren te lokaliseren, zelfs in ongemarkeerd weefsel.

Samengevat kan de SWIP worden gebruikt in normaal gezond pancreasweefsel en bij goedaardige en kwaadaardige pancreasaandoeningen zoals pancreatitis en PDAC. Eencellige en subcellulaire dynamiek kan in deze toestanden worden vastgelegd met behulp van de SWIP en kan onderzoekers helpen belangrijke fysiologische gebeurtenissen te begrijpen, zoals metastatische verspreiding in PDAC. De verbeterde kwaliteit en stabiliteit van IVI hebben het potentieel om waardevolle inzichten te verschaffen in de pathofysiologie en celbiologie van de alvleesklier, waardoor het een veelbelovend en nuttig hulpmiddel is.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].