Stabilisert vindu for intravital avbildning av murinpancreas

Summary

Vi presenterer en protokoll for kirurgisk implantasjon av et stabilisert inneliggende optisk vindu for subcellulær oppløsningsavbildning av murine pancreas, som tillater serielle og langsgående studier av den friske og syke bukspyttkjertelen.

Abstract

Fysiologien og patofysiologien i bukspyttkjertelen er kompleks. Sykdommer i bukspyttkjertelen, som pankreatitt og bukspyttkjerteladenokarsinom (PDAC), har høy sykelighet og dødelighet. Intravital imaging (IVI) er en kraftig teknikk som muliggjør høyoppløselig avbildning av vev i både friske og syke tilstander, noe som muliggjør sanntidsobservasjon av celledynamikk. IVI i murine bukspyttkjertelen gir betydelige utfordringer på grunn av organets dype viscerale og kompatible natur, noe som gjør det svært utsatt for skade og bevegelsesartefakter.

Beskrevet her er prosessen med implantasjon av Stabilisert Window for Intravital avbildning av murine Pancreas (SWIP). SWIP tillater IVI av murine bukspyttkjertelen i normale sunne tilstander, under transformasjonen fra den sunne bukspyttkjertelen til akutt pankreatitt indusert av cerulein, og i ondartede tilstander som bukspyttkjerteltumorer. I forbindelse med genetisk merkede celler eller administrering av fluorescerende fargestoffer, muliggjør SWIP måling av enkeltcelle- og subcellulær dynamikk (inkludert enkeltcelle- og kollektivmigrasjon) samt seriell avbildning av samme interesseregion over flere dager.

Evnen til å fange tumorcellemigrasjon er spesielt viktig, da den primære årsaken til kreftrelatert dødelighet i PDAC er den overveldende metastatiske byrden. Å forstå den fysiologiske dynamikken til metastase i PDAC er et kritisk udekket behov og avgjørende for å forbedre pasientens prognose. Samlet sett gir SWIP forbedret bildestabilitet og utvider anvendelsen av IVI i den sunne bukspyttkjertelen og ondartede bukspyttkjertelsykdommer.

Introduction

Godartede og ondartede bukspyttkjertelsykdommer er potensielt livstruende, med betydelige hull i forståelsen av deres patofysiologi. Pankreatitt-betennelse i bukspyttkjertelen-er den tredje hovedårsaken til gastrointestinale sykdomsrelaterte sykehusinnleggelser og reinnleggelser i USA og er forbundet med betydelig sykelighet, dødelighet og sosioøkonomisk byrde¹. Rangert som den tredje ledende årsaken til kreftrelatert død 2, står bukspyttkjertelduktalt adenokarsinom (PDAC) for de fleste bukspyttkjertelmaligniteter³ og gir en dårlig 5-års overlevelse på bare 11%². Den viktigste årsaken til kreftrelatert dødelighet i PDAC er overveldende metastatisk byrde. Dessverre presenterer de fleste pasienter med metastatisk sykdom. Derfor er forståelse av dynamikken i metastase i PDAC et kritisk udekket behov innen kreftforskning.

Mekanismene som ligger til grunn for betennelse og metastatisk kaskade i bukspyttkjertelen er dårlig forstått. En stor bidragsyter til dette kunnskapsgapet er manglende evne til å observere bukspyttkjertelcellulær dynamikk in vivo. Direkte observasjon av disse cellulære dynamikkene lover å avdekke kritiske mål for å utnytte og forbedre diagnosen og behandlingen av de med bukspyttkjertel sykdom.

Intravital imaging (IVI) er en mikroskopiteknikk som gjør det mulig for forskere å visualisere og studere biologiske prosesser i levende dyr i sanntid. IVI tillater høyoppløselig, direkte visualisering av intracellulær og mikromiljømessig dynamikk in vivo og innenfor det opprinnelige miljøet i den aktuelle biologiske prosessen. Derfor tillater IVI in vivo observasjon av sunne og patologiske prosesser.

Moderne bildebehandlingsmodaliteter for hele kroppen som MR, PET og CT gir utmerket utsikt over hele organer og kan avsløre patologier, selv før utbruddet av kliniske symptomer⁴. De er imidlertid ikke i stand til å oppnå enkeltcelleoppløsning eller avsløre de tidligste stadiene av sykdomspankreatitt eller malignitet.

Tidligere forskning har brukt enkeltcelleoppløsning IVI for å observere godartede og ondartede sykdommer i hud^5,6, bryst⁷, lunge⁸, lever⁹, hjerne 10 og bukspyttkjerteltumorer 11^, noe som fører til innsikt i mekanismer for sykdomsprogresjon ¹². Imidlertid utgjør murine bukspyttkjertelen betydelige hindringer for å oppnå enkeltcelleoppløsning ved bruk av IVI, hovedsakelig på grunn av sin dype viscerale plassering og høy etterlevelse. Videre er det et forgrenet, diffust distribuert organ i mesenteriet som kobles til milten, tynntarmen og magen, noe som gjør det utfordrende å få tilgang til. Vevet er også svært følsomt for bevegelse forårsaket av tilstøtende peristaltikk og respirasjon. Minimering av bevegelse av bukspyttkjertelen er avgjørende for mikroskopi av enkeltcelleoppløsning, da bevegelsesartefakter av selv noen få mikron kan uskarpe og forvrenge bilder, noe som gjør sporing av dynamikken til individuelle celler umulig¹³.

For å utføre IVI, må et abdominal bildevindu (AIW) implanteres kirurgisk ^9,11. For å implantere AIW kirurgisk, sutureres en metallvindusramme inn i bukveggen. Etterpå er interesseorganet festet til rammen ved hjelp av cyanoakrylat lim. Selv om dette er tilstrekkelig for noen stive indre organer (f.eks. lever, milt, stive svulster), blir forsøk på avbildning av den sunne murine bukspyttkjertelen kompromittert av suboptimal lateral og aksial stabilitet på grunn av vevets kompatible tekstur og komplekse arkitektur¹⁴. For å løse denne begrensningen utviklet Park et ^al.14 et bildevindu spesielt designet for den sunne bukspyttkjertelen. Dette Pancreas Imaging Window (PIW) minimerer påvirkning av tarmbevegelse og pust ved å innlemme en horisontal metallhylle i vindusrammen, like under dekselet, stabilisere vevet og opprettholde kontakten med dekselglasset. Mens PIW gir økt sidestabilitet, fant vi at dette vinduet fortsatt demonstrerer aksial drift og i tillegg forhindrer avbildning av store faste svulster på grunn av det smale gapet mellom metallhyllen og dekselet¹⁵.

For å møte disse begrensningene utviklet vi Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP), et implanterbart avbildningsvindu som er i stand til å oppnå stabil langtidsavbildning av både frisk og syk bukspyttkjertel (figur 1)¹⁵. Her gir vi en omfattende protokoll for den kirurgiske prosedyren som brukes til å implantere SWIP. Selv om det primære målet var å studere de dynamiske mekanismene som er involvert i metastase, kan denne metoden også brukes til å utforske ulike aspekter av bukspyttkjertelbiologi og patologi.

Protocol

Alle prosedyrer beskrevet i denne protokollen er utført i samsvar med retningslinjer og forskrifter for bruk av virveldyr, inkludert forhåndsgodkjenning fra Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Passivering av vinduer

MERK: Passivering av rustfritt stål renser metallet for forurensninger og skaper et tynt oksidlag som i stor grad øker metallets biokompatibilitet med bløtvev, selv utover titan¹⁶.

1. Start passiveringsprosessen ved å vaske de optiske vindusrammene med en 1 % (w/v) enzymatisk aktiv vaskemiddelløsning.
2. Senk rammene i en 5 % (w/v) natriumhydroksidoppløsning ved 70 °C i 30 minutter inne i en glasskrukke.
3. Ta ut rammene og skyll dem med avionisert vann.
4. Dypp rammene i en 7 % (w/v) sitronsyreoppløsning ved 55 °C i 10 minutter inne i en ny glasskrukke.
5. Fjern rammene og skyll dem med avionisert vann igjen.
6. Gjenta trinn 1.2, og skyll til slutt vinduskarmene med avionisert vann en siste gang.

2. Forberedelse for tumorimplantasjon eller vinduskirurgi

MERK: For studier av bukspyttkjerteltumorer må tumorceller implanteres og få lov til å vokse til åpne svulster. For å visualisere tumorcellene in vivo anbefales det å bruke celler som har blitt genetisk endret for å uttrykke fluorescerende proteiner som Dendra2. Bruk av fluorescerende proteinetiketter som er lyse, vil redusere potensielle problemer med vevsautofluorescens. Andre potensielle fluorescerende proteiner, fargestoffer og genetisk kodede fluorescerende musemodeller som kan brukes, har blitt diskutert andre steder^17,18. For å forhindre forurensning av det operative feltet, utfør den kirurgiske prosedyren i et hette eller laminært strømningskabinett og sørg for at forskjellige områder brukes til forberedelse, kirurgi og gjenoppretting.

1. Før operasjonen, steriliser alle kirurgiske instrumenter i en autoklav og bruk om nødvendig en varm perlesterilisator for påfølgende prosedyrer. Sørg for at operasjonen benytter en tips-bare teknikk.
2. Slå på den oppvarmede kirurgiske puten og perlesterilisatoren og vent til den når riktig driftstemperatur. Temperaturen på varmeputen bør overvåkes med et overflatetermometer for å unngå potensielle forbrenninger. Legg en steril klut over varmeputen hvis temperaturen ikke kan kontrolleres tilstrekkelig.
   MERK: Kroppstemperaturen under korte prosedyrer (≤20 min), for eksempel tumor- og vindusimplantasjon, påvirkes minimalt ved bruk av en oppvarmet kirurgisk pute. Imidlertid krever lengre perioder med anestesi, for eksempel under utvidet timelapse-avbildning, at musen plasseres i et oppvarmet kammer for å opprettholde kroppstemperaturen.
3. Bedøv musen med 5% isofluran i et anestesikammer.
4. Kritisk trinn: Senk anestesien til 2% når musen er bevisstløs. Overvåk anestesinivået og musens vitalitet nøye (f.eks. ved hjelp av et pulsoksymeter)¹⁹.
5. Plasser en liten dråpe øye smøremiddel på hvert øye av musen for å forhindre hornhindetørke.
6. Før operasjonen, bruk hårfjerningskrem sjenerøst til venstre øvre del av magen for å fjerne hår. Etter 20 s, bruk fuktet silkepapir for å tørke bort håret og hårfjerningskrem. Gjenta prosessen etter behov til alt håret er fjernet fra operasjonsområdet.
7. Injiser 10 mikrol buprenorfin (0,1 mg/kg) fortynnet i 90 mikrol PBS subkutant for å sikre preoperativ analgesi.

3. Bukspyttkjertel tumor implantasjon

1. Forbered alikoter av tumorceller ved ønsket konsentrasjon (basert på tumorcelle doblingstid). Plasser cellesuspensjonen i en insulinsprøyte og oppbevar den på is. For å følge denne protokollen, bruk 10⁶ syngene KPC-tumorceller 20 suspendert i maksimalt 50 μL PBS, etter den ortotopiske injeksjonsprotokollen tilpasset fra Erstad et^al.21
   MERK: Denne cellelinjen injisert ved denne konsentrasjonen produserte rutinemessig palpable eller passende store svulster med 10-14 dager. Subkloner av denne cellelinjen og andre pankreascellelinjer må evalueres for passende konsentrasjoner og tidslinjer for å produsere svulster av passende størrelse).
2. Vask hendene med antiseptisk såpe.
3. Før hver ny operasjon, ta på nye sterile hansker.
4. Overfør musen til den sterile kirurgiske hetten og legg den i delvis høyre lateral decubitusstilling.
5. Fest lemmer med papirbånd.
   MERK: Riktig bruk av instrumentene er viktig gjennom hele prosedyren. Eksempler på hvordan du holder tang, Castroviejo-saks og vakuumoppsamlingsverktøyet er vist i figur 2A-C.
6. Steriliser magen med antiseptisk middel (figur 2D).
7. Sørg for at dyret er fullt bedøvet ved å utføre en tåklemmetest.
8. Lag et 10-15 mm venstre subkostalt snitt i huden ved hjelp av tang og Castroviejo saks (figur 2E).
9. Kontrollhemostase ved hjelp av bomullspinner eller en cautery penn når / hvor det anses nødvendig.
10. Del forsiktig den underliggende muskelen med tang og Castroviejo-saks for å komme inn i bukhinnen (figur 2F).
11. Ved hjelp av sterile bomullspinner, eksternaliserer atraumatisk bukspyttkjertelen og milten.
12. Splay bukspyttkjertelen ut slik at det ikke er folder (figur 2G).
13. Identifiser ønsket tumorinjeksjonssted i kroppen eller halen av bukspyttkjertelen (vekk fra blodkar).
14. Kritisk trinn: Etter forsiktig plassering av bukspyttkjertelen, bruk tang for å gi spenning til vevet og sett insulinsprøytespissen, med skråningen vendt oppover, inn i ønsket sted i bukspyttkjertelen til en dybde på 4-5 mm (figur 2H).
15. Injiser langsomt tumorcelleoppløsningen. Se etter en liten boble som bekrefter en vellykket injeksjon (figur 2I).
16. Sett bukspyttkjertelen forsiktig tilbake til magen uten å forstyrre tumorcelleinjeksjonsboblen (figur 2J).
17. Bruk absorberbare 5-0 polydioksanonsuturer, lukk muskellaget først og deretter huden med avbrutte suturer (figur 2K-N).
18. Dekk snittet med cyanoakrylat lim (figur 2O), og sett musen tilbake til et rent bur under en varmelampe for gjenvinning. Administrer antibiotika i drikkevann for å forhindre infeksjon. Overvåk musene og la dem fullstendig gjenopprette fra kirurgi.
    MERK: Antibiotika administreres som kreves av IACUC-protokollen. Alle dyr er plassert individuelt.
19. La svulsten utvikle seg i 10-14 dager til den er palpabel gjennom bukveggen.

4. Bukspyttkjertel vindu kirurgi

1. Når dyrene er klare for avbildning, begynner vinduet implantasjon kirurgi. For å begynne, vask hendene med antiseptisk såpe.
2. Før hver ny operasjon, ta på friske sterile hansker.
3. På det oppvarmede kirurgiske stativet, plasser musen i høyre lateral decubitusstilling for å avsløre venstre underliv.
4. Forankre musens fremre og bakre lemmer til det oppvarmede kirurgiske stadiet kranialt og kaudalt ved hjelp av papirbånd. Sørg for at milten (under huden) er synlig i operasjonsfeltet (figur 3A).
5. For å opprettholde steriliteten, pakk ut alle kirurgiske instrumenter i hetten.
6. Desinfiser operasjonsstedet ved å swabbing musens hud med en sjenerøs påføring av antiseptisk.
7. Sørg for at dyret er fullt bedøvet ved å utføre en tåklemmetest.
8. Kritisk trinn: Løft huden i venstre øvre kvadrant av magen med tang og gjør et ~ 10 mm sirkulært snitt i huden og muskulaturen ved hjelp av Castroviejo saks (figur 3B, C).
9. Kontroller blødningen og oppretthold hemostase ved hjelp av bomullspinner eller cautery pennen, der det er nødvendig.
10. Lokaliser bukspyttkjertelen, som er festet til milten, og identifiser retningen bukspyttkjertelen legger i snittet for å bestemme hvor støttekorset skal plasseres.
11. Bruk 5-0 silkesutur, plasser det første stinget på ønsket sted i muskellaget. Uavgjort denne enden med 3-5 knop. (Figur 3D,E)
12. Fortsett å sy direkte over snittet. Klipp og la en hale på ~ 5 cm (figur 3F).
13. Gjenta trinn 4.11 og 4.12 vinkelrett på den første sømmen (figur 3G,H).
14. Kritisk trinn: Løft og plasser bukspyttkjertelen forsiktig over tverrstinget (figur 3I,J). Pass på at du ikke skader bukspyttkjertelen under manipulering.
15. Kritisk trinn: Bruk 5-0 silkesuturen, utfør en veskestrengssøm ~ 1 mm fra hullet, omkretsende, interlacing huden og muskellaget (figur 3K).
16. Plasser vindusrammen slik at kantene på det sirkulære snittet sitter innenfor sporet i vinduet (figur 3L).
17. Fest det implanterte vinduet ved å binde 5-0-silken godt.
18. Legg 100 mikrol flytende cyanoakrylat lim inn i 1 ml sprøyten.
19. Tørk vevet ved å påføre en delikat strøm av trykkluft i ~ 10 s.
20. Fest vindusrammen ved ytterkanten med tang og løft den forsiktig for å sikre separasjon av bukspyttkjertelen fra undersiden av vindusrammen.
21. Kritisk trinn: Dispenser et tynt lag flytende cyanoakrylat lim langs fordypningen av vinduet (figur 3M). Pass på at du ikke får noe av limet på bukspyttkjertelen.
22. Bruk vakuum-pickuper til å løfte 5 mm dekselet.
23. Plasser dekselet forsiktig inne i fordypningen i midten av den optiske vindusrammen. Hold med lett trykk, slik at cyanoakrylat limet kan stivne (~ 25 s).
24. Skill dekselet fra vakuum-pickupene med tang.
25. Stram tverrstingssuturene for å feste bukspyttkjertelen godt til dekselet (figur 3N,O). Merk: Ikke stram tverrmasken, da det kan forårsake skade og iskemi i bukspyttkjertelen.
26. Klipp endene av suturen.
27. Fjern båndet fra musen.
28. Slå av isofluran fordamper.
29. Flytt musen til et rent bur eller direkte til det intravitale mikroskopet.
30. Hus dyrene individuelt etter vindusoperasjon og overvåke dem til full gjenoppretting.
31. Avbildning utføres deretter på et to-laser multifotonmikroskop som vi tidligere har beskrevet ^22,23,24 For lange bildebehandlingsøkter plasseres musen i et oppvarmet kammer for å opprettholde kroppstemperatur og forsynes med støttevæsker i henhold til IACUC-standarder.

5. Ceruleinbehandling for induksjon av pankreatitt

1. For å undersøke utbruddet av pankreatitt, behandle friske mus med cerulein etter implantasjon av SWIP. Sørg for at musene fastes i 14-18 timer og gis ad libitumvann før ceruleinadministrasjon.
2. Injiser 50 mikrogram / kg cerulein i 100 mikrol steril 1x DPBS intraperitonealt med 1 timers intervaller i opptil åtte injeksjoner. Administrer et ekvivalent volum på 1x DPBS alene, injisert intraperitonealt, til kontrollmusene.
3. Etter avbildning, ofre musene 24 timer etter den første injeksjonen ved cervikal dislokasjon i henhold til IACUC-standarder.
4. Utfør avbildning på et to-laser multifoton mikroskop som tidligere beskrevet^22,23,24. For lange bildebehandlingsøkter, plasser musen i et oppvarmet kammer for å opprettholde kroppstemperaturen og gi den støttevæsker i henhold til IACUC-standarder.

Representative Results

Figur 1, tilpasset fra Du et ^al.15, viser bildestillbilder fra en time-lapse IVI-film av murine pancreas. Noe vevsbevegelse kan observeres i løpet av den første sedimenteringsperioden (første time med avbildning, figur 1A). Ved fortsatt bildediagnostikk etter denne sedimenteringsperioden (>75 min) observerte vi imidlertid en økning i lateral og aksial stabilitet (figur 1B). Sammenligningen av stabiliteten til SWIP med de tidligere AIW- og PIW-bildevinduene identifiserer at alle vinduer krever en innledende periode for sedimentering. SWIP viste imidlertid det laveste nivået av drift totalt sett og er best egnet for langtidsavbildning (figur 1C-K). Bildene ble generert på et spesialbygd multifotonmikroskop²⁴ som lyser opp ved 880 nm og får en z stack-t lapse (synsfelt [FOV] størrelse = 340 x 340 μm, pikselstørrelse 0,67 μm) med 1,7 min mellom rammer, 11 skiver med en trinnstørrelse på 2 μm, 20 bildedybde og ~1 skive/s. Laser power og photomultiplier tube (PMT) gevinster ble valgt for å maksimere signalet samtidig minimere fotobleking og fotodamage.

Trinnene i de kirurgiske prosedyrene som beskriver pancreas tumorimplantasjon og påfølgende pancreas window insertion er vist i henholdsvis figur 2 og figur 3. Det er viktig at begge operasjonene er overlevelsesoperasjoner. Når den er riktig implantert, vil bukspyttkjertelen forbli apposed til det optiske vinduet, som nå er integrert i bukveggen. Dette muliggjør musens komfortable overlevelse og muliggjør kontinuerlig avbildning i opptil 12 timer, som tillatt av protokollen. I tillegg kan seriell avbildning utføres over flere påfølgende dager (opptil protokolltillatelsen på 2 uker) for å overvåke regioner av interesse over tid. Intravital avbildning (IVI) kan utføres gjennom vinduet på en måte som ligner på andre vinduer som tidligere er beskrevet^22,25,26.

SWIP kan brukes til å undersøke dynamikken ved utbruddet av akutt pankreatitt indusert ved bruk av cerulein. Cerulein er et oligopeptid med struktur og funksjon som ligner på kolecystokinin (CKK) og er mye brukt til å eksperimentelt indusere akutt pankreatitt hos gnagere²⁷. Behandling med cerulein resulterer i sammentrekning av glatt muskulatur i mage-tarmkanalen og stimulerer mage- og bukspyttkjertelsekret²⁸. Videre fører intraperitoneal administrering av cerulein til hevelse i bukspyttkjertelen og utvidelse²⁹.

Figur 4 viser seriell avbildning av murine pancreas etter ceruleinbehandling med SWIP-protokoll. Murine pancreas visualiseres ved enkeltcelleoppløsning ved hjelp av genetisk fluorescerende merking (ECFP-merket epitel-MMTV-iCre / CAG-CAC-ECFP transgene mus) og administrasjon av høymolekylære fargestoffer (155 kD dextran-TMR) for å definere lokal vaskulatur, betegnet med de faste gule linjene. Vindusdesignet, som tidligere ble brukt til murine lungeavbildning⁸, inkluderer tre etsede linjer på rammen (figur 4, innfelt) som fungerer som fiducialmarkører som tillater bruk av mikrokartografi³⁰. Mikrokartografi tillater seriell avbildning av samme område av interesse for murine pancreas over flere dager. Her visualiseres samme lobule i bukspyttkjertelen (gule stiplede linjer) på dag 1 og relokaliseres på dag 2, noe som fremgår av tilstedeværelsen av de samme lokale blodkarene (figur 4). Bilder ble tatt hver dag som en enkelt z-stack med 11 skiver og 2 μm trinnstørrelse ved ~ 1 skive / s, tatt ved 880 nm belysning og oppløsning på 0,67 μm / piksel (FOV = 340 x 340 μm). Laserkraft og PMT-gevinster ble valgt for å maksimere signalet samtidig som fotobleking og fotoskader minimeres.

I tillegg til seriell avbildning er SWIP godt egnet for langsiktig langsgående avbildning, noe som muliggjør nøyaktig sporing og måling av dynamikken til subcellulære strukturer (som vakuoler) under kontroll- og behandlingsforhold. Her er vakuoler regioner hvor cytoplasmatiske fluorescerende proteiner er utelukket, noe som fører til at mørke umerkede hull vises (figur 5A). Merking av vakuoler ved hjelp av programvare som ROI Tracker²⁴, tillater visualisering av vakuolmotilitet (figur 5A, B) og kvantifisering av mange motilitetsparametere. For eksempel økte gjennomsnittshastigheten for vakuoler i murine pancreas med ca. 10 % etter behandling med cerulein for å indusere pankreatitt, sammenlignet med PBS-behandling (0,37 ± 0,07 μm/min vs. 0,41 ± 0,09 μm/min, p = 0,02) (figur 5C). Ceruleinbehandling økte også den gjennomsnittlige svingfrekvensen av subcellulære strukturer med 10 % vs PBS-behandling (2,3 ± 0,3 grader/min vs 2,6 ± 0,6 grader/min, p = 0,04) (figur 5F). Det var imidlertid ingen signifikant forskjell (p > 0,05) i nettohastighet, direksjonalitet eller kumulativ tilbakelagt avstand mellom ceruleinbehandling og PBS-behandling (figur 5D, E og figur 5G). Bildene ble generert på et spesialbygd multifotonmikroskop,²⁴ som lyste opp ved 880 nm og fikk en z-stack-t-lapse (FOV-størrelse = 340 x 340 μm, pikselstørrelse 0,67 μm) med 2,9 minutter mellom rammer, 11 skiver med en trinnstørrelse på 2 μm og ~1 skive/s.

Til slutt muliggjør SWIP visualisering og fangst av tumorcellemigrasjon. Figur 6A viser et stillbilde fra en time-lapse-film (Supplemental Video S1 og Supplemental Video S2) av migrasjonen i bukspyttkjertelen av Dendra-2-merkede KPC-tumorceller som ble injisert ortotopisk. Både kollektiv migrasjon av celler i klynger (figur 6B og supplerende video S1) og encellemigrasjon (figur 6C og supplerende video S2) kan observeres over korte perioder (<1 timer). Bilder ble generert på et spesialbygd multifotonmikroskop²⁴ som lyste opp ved 880 nm og fikk en 4 x 4 mosaikk-z stack-t lapse med 20% overlapping mellom fliser (flisstørrelse = 340 x 340 μm), 3,4 min mellom rammer, 3 skiver med en trinnstørrelse på 5 μm og ~ 1 skive / s. Laserkraft og PMT-gevinster ble valgt for å maksimere signalet samtidig som fotobleking og fotoskader minimeres.

Figur 1: Forbedret bildestabilitet på grunn av SWIP. (A) Stillbilder fra løpet av de første 72 minuttene av en timelapse-film av bukspyttkjertelen avbildet gjennom SWIP. Noe aksial, men svært lite lateral drift kan observeres. Skalastenger = 50 μm. (B) Fortsatt timelapsed avbildning etter 72 min viser et høyt nivå av aksial og lateral stabilitet. (A,B) Rød = 155 kDa tetrametylrhodamin dekstranmerket blodserum, Cyan = CFP-merkede pankreasceller (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgene mus) (C-E) Sammenligning av lateral stabilitet for hvert av pankreasbildevinduene i løpet av den første timen av avbildning for (C) AIW, (D) PIW og (E) SWIP. (VG Nett) Sammenligning av lateral stabilitet av hver av bukspyttkjertelen imaging i løpet av de påfølgende 150 min for (F) AIW, (G) PIW, og (H) SWIP. Rammemarger er innzoomede visninger av de tilsvarende plottene. (I-K) Sammenligning av aksial stabilitet av hver av bukspyttkjertelen imaging vinduer for de første 120 min av avbildning for (I) AIW, (J) PIW, og (K) SWIP. Dette tallet er fra Du et al. Open Biology 2022, DOI:10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273. ¹⁵. Forkortelser: SWIP = stabilisert vindu for intravital avbildning av bukspyttkjertelen; AIW = abdominal imaging vindu; PIW = bukspyttkjertel bildevindu; CFP = cyan fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2 Oversikt over operasjonsprotokollen for ortotopisk injeksjon av pankreasduktale adenokarsinomceller (KPC). (A) Illustrasjon av hvordan man holder kirurgiske tang. (B) Illustrasjon av hvordan du holder Castroviejo-saks. (C) Illustrasjon av hvordan vakuumopptakerverktøyet skal holdes. (D) Desinfisering av huden. (E) Snitt i huden. (F) Snitt i muskelen. (g) Splayed bukspyttkjertel. (H) Innstikk av kanyle inn på ønsket injeksjonssted. (I) Injeksjon av kreftcellesuspensjon som skaper en boble (blå pil). (J) Pancreas returnert til bukhulen. (K,L) Lukking av muskellaget med en avbrutt silkeutur. (M,N) Lukking av huden med en avbrutt silkeutur. (O) Cyanoakrylat lim påført snitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3 Oversikt over operasjonsprotokollen til Stabilisert vindu for avbildning av pancreas. (A) Identifisering av milt og påmontert bukspyttkjertel. (B,C) Sirkulært snitt i hud og muskel. Røde stiplede linjer i A-C indikerer omrisset av milten som kan ses gjennom bukveggen og huden. (D,E) Første sting av korsstingkurv plassert og bundet i muskellaget (E, gul pil). (F) Sting fortsetter til motsatt side av muskelsnittet, og etterlater en hale (hvit pil). (G,H) Andre søm plassert vinkelrett på den første, bundet i den ene enden (gule piler) og etterlater en hale (hvite piler). (I,J) Plassering av bukspyttkjertelen i korsmaskekurven. (K) Omkrets veske-streng sutur gjennom muskler og hud. (L) Implantasjon av vindusrammen. (M) Påføring av lim på vindusrammen. (N) Festing av glassdeksel. (O) Haleendene på korsstinget strammes. (P) Fullstendig implantert SWIP. Forkortelse: SWIP = stabilisert vindu for intravital avbildning av bukspyttkjertelen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Mikrokartografi brukt til seriell avbildning for å relokalisere de samme interesseområdene i det optiske vinduet. Intravital avbildning av en enkelt region av murine pancreas, som viser samme lobule flyttet over 2 påfølgende dager (D1-D2) ved hjelp av mikrokartografi. Gule stiplede linjer skisserer grensene for den samme lobulen. De faste linjene fremhever de samme blodkarene (som det fremgår av tilstedeværelsen av rødmerket blodserum i lumen) identifisert hver påfølgende dag. Rød = 155 kDa tetrametylrhodamin dekstranmerket blodserum, Cyan = CFP-merkede bukspyttkjertelceller (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgene mus) (Innfelt) Bilde av SWIPEP med riper for mikrokartografi. Bruk av mikrokartografi for å flytte områder av interesse under seriell avbildning er tillatt av de tre etsede linjene på vindusrammen (innfelt). Skalastenger = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Subcellulær oppløsning og måling av subcellulær dynamikk ved hjelp av SWIP . (A) Enkeltceller (stiplede gule konturer) og subcellulære strukturer som vakuoler kan visualiseres gjennom SWIPEP over tid i murine pancreas. Eksempler på disse vakuolene er indikert med gule piler. SWIP tillater dermed sporing av subcellulære strukturer (fargede konturer og spor lagt på fluorescensbildet) over tid. Innfelt er zoomet inn av et gult boksområde som viser tre sporede støvsugere. Skala bar = 50 μm. (B) Baner av subcellulære strukturer, som kjerner og vakuoler (uthevet i A), etter et skifte av koordinater til opprinnelsespunktet. Rød stiplet linje viser gjennomsnittlig nettobane i 1 time (3,46 μm). Kvantifisering av de dynamiske parametrene for (C) gjennomsnittshastighet, (D) nettobane, (E) retningsbestemmelse, (F) gjennomsnittlig svingfrekvens og (G) kumulativ avstand. Rød = 155 kDa tetrametylrhodamin dekstranmerket blodserum, cyan = CFP-merkede pankreasceller (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgene mus). Forkortelser: SWIP = stabilisert vindu for intravital avbildning av bukspyttkjertelen; CFP = cyan fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Fange cellemigrasjon med SWIP . (A) Et stillbilde fra en timelapsed intravital imaging film av bukspyttkjertelen i en ortotopisk injisert musemodell av PDAC. (B) Stillbilder fra supplerende video S1 som viser et eksempel på tumorceller som gjennomgår kollektiv migrasjon (gul pil). (C) Stillbilder fra supplerende video S2 som viser eksempler på encellet migrasjon av en tumorcelle (gul pil) og en makrofag (rød pil). Grønn = Dendra2-merkede tumorceller, Blå = CFP-merkede makrofager, Rød = 155 kDa tetrametylrhodamin dekstranmerket blodserum. Skalastenger = 50 μm (A), 15 μm (B,C). Forkortelser: SWIP = stabilisert vindu for intravital avbildning av bukspyttkjertelen; CFP = cyan fluorescerende protein; PDAC = adenokarsinom i bukspyttkjertelen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsvideo S1: Timelapse intravital bildefilm som viser tumorceller som gjennomgår kollektiv migrasjon tilsvarende figur 6B. Grønn = Dendra2-merkede tumorceller, Blå = CFP-merkede makrofager, Rød = 155 kDa tetrametylrhodamin dekstranmerket blodserum. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo S2: Timelapse intravital bildefilm som viser tumorceller som gjennomgår enkeltcellemigrasjon tilsvarende figur 6C. Grønn = Dendra2-merkede tumorceller, Blå = CFP-merkede makrofager, Rød = 155 kDa tetrametylrhodamin dekstranmerket blodserum. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

SWIP-protokollen beskrevet her gir en forbedret metode for stabilisering av bukspyttkjertelvev ved å bruke en kryssstingskurvteknikk. Tidlige abdominale bildevinduer (AIW) muliggjorde intravital avbildning (IVI) av indre organer i magen, men begrenset ikke tilstrekkelig bevegelsen av bløtvev som bukspyttkjertelen. Som svar utviklet Park et al. et bukspyttkjertelbildevindu (PIW) som inneholder en horisontal metallhylle og muliggjør forbedret stabilisering av bukspyttkjertelvevet samtidig som kontakten med glassdekselet opprettholdes. Mens denne tilnærmingen forbedrer sidestabiliteten, begrenser den avbildning av faste bukspyttkjerteltumorer fordi størrelsen overskrider det smale rommet mellom hyllen og dekkglasset. SWIP løser dette problemet ved å stabilisere bukspyttkjertelen med en korsstingkurv, noe som begrenser både aksial og lateral bevegelse, samtidig som den kan imøtekomme store (≤10 mm) solide svulster.

Direkte sammenligninger av SWIP med tidligere bildevinduer som AIW og PIW ble utført tidligere¹⁵. Dette er vist i figur 1, tilpasset fra Du et ^al.15, hvor laterale og aksiale forskyvninger ble kvantifisert ved å spore cellulære anatomiske trekk som kjerner eller blodkar. Alle bildevinduene hadde behov for en periode med sedimentering i løpet av omtrent den første timen med avbildning. I løpet av denne tiden ble det observert en høyere grad av lateral bevegelse med AIW og PIW sammenlignet med SWIP. En større aksial forskyvning ble også sett med AIW og PIW sammenlignet med SWIP over en 2 timers periode. Totalt sett viste SWIPEP det laveste avdriftnivået og er egnet for langtidsavbildning (≤12 timer).

Dessverre er bukspyttkjertelen et svært spredende vev, og som sådan blir punktspredningsfunksjonen for multifotonmikroskopet som brukes i IVI raskt nedbrutt med penetrasjon i vevet. Dermed er bildedybden med noen av de optiske vinduene begrenset til bare ~ 30-60 μm. IVI bærer også risikoen for lysindusert skade på prøven. Dette kan testes i begynnelsen av bildebehandlingsøkter ved å skaffe en tidsserie på 100 bilder og lete etter tegn på fotobleking eller fotoskade. På vårt mikroskopsystem fant vi at en maksimal effekt på ~ 15 mW ved prøven kan brukes uten å påvirke vevet negativt.

SWIP-protokollen tillater stabil, høyoppløselig, enkeltcellet optisk IVI i murine pancreas under både normale sunne forhold, samt syke tilstander som pankreatitt og PDAC. Dette gjør SWIP spesielt nyttig for lang timelapsed imaging, samt for å utføre 3D og 4D (3D + tid) avbildning ved å fange flere z-skiver (dra nytte av multifoton og konfokalmikroskopiens iboende optiske seksjoneringsfunksjoner). Ved å muliggjøre in vivo visualisering av enkeltceller og deres interaksjoner med de cellulære bestanddelene i bukspyttkjertelen, vil høyoppløselig IVI være uvurderlig for å forstå mekanismer som ligger til grunn for sykdommer i bukspyttkjertelen.

Et visst nivå av teknisk ekspertise er nødvendig for å utføre SWIP-protokollen. Imidlertid, med riktig praksis og oppmerksomhet på viktige trinn, kan prosedyren utføres med høy suksessrate. For å avbilde den ondartede bukspyttkjertelen, er det avgjørende å først ha en vellykket implantert svulst. Dette oppnås ved ortotopisk injeksjon av en suspensjon av murine kreftceller i bukspyttkjertelen i musen. En vellykket injeksjon observeres når parankymen i bukspyttkjertelen blåses opp i en væskefylt boble og har blitt beskrevet i detalj tidligere²¹. For å sikre maksimal suksess og overlevelse er det viktig at det er minimal eller ingen lekkasje av cellesuspensjonen, da lekkasje vil dramatisk redusere potensiell tumorstørrelse samt føre til karsinomatose. I tillegg er bukspyttkjertelen et svært vaskularisert organ, med mange forgrenede blodkar. Det er viktig å unngå lacerating noen fartøy, da dette vil forårsake blødning og påfølgende hematom i bukspyttkjertelen og hemme tumorvekst. I denne modellen har vi brukt en syngen PDAC-cellelinje avledet fra KPC-mus²⁰. Dette tillater tumortransplantasjon i immunkompetente mus. Andre syngene PDAC-cellelinjer kan brukes, avhengig av belastningen på musen som brukes. Humane PDAC-cellelinjer kan også brukes; Imidlertid må musestammen være immunkompromittert for å unngå avvisning av tumorimplantasjonen.

Størrelsen på svulstene som gjennomgår avbildning i denne protokollen kan endres etter behov. Dette kan oppnås ved å bruke en høyere konsentrasjon av kreftceller implantert i murine bukspyttkjertelen for å oppnå en større svulst eller ved å forlenge veksttiden til svulsten før vindusimplantasjon. I denne studien injiserte vi 10⁶ KPC PDAC-celler og implanterte SWIP 10-14 dager etterpå, da svulstene var palpable. Mindre og større svulster kan også innkvarteres av denne SWIP-protokollen ved å bruke riktig plassering av vevet i korsstingskurven.

Sikker plassering av bildevinduet og bukspyttkjertelen er også avgjørende for å oppnå bilder av høy kvalitet og for å begrense bevegelsesartefakter. Den normale murine bukspyttkjertelen er svært kompatibel og utsatt for bevegelse fra pust og nærliggende peristaltikk. For å løse dette og øke stabiliteten i bukspyttkjertelen under avbildning, brukes en tidligere beskrevet korsstingskurvteknikk³¹. Korsstingkurven er designet for å etterligne kroppens bruk av leddbånd. Ved å vugge vevet mot glassdekselet og påføre konstant aksialt trykk, forhindrer det både lateral og aksial bevegelse. Når du arbeider med større solide svulster, kan støttepunktet og retningen til korsmasken modifiseres for best å imøtekomme størrelsen og posisjonen til svulsten for optimal støtte.

Suboptimal avbildning kan også skje når vindusrammen er utilstrekkelig implantert i magen på musen. En løst montert vindusramme kan føre til bildevansker og bevegelsesartefakter. En passende veskestrengsutur kan løse dette problemet ved å feste vindusrammen til magen gjennom huden og bukveggen. For å unngå overdreven hudfolding når du strammer veskestrengen, bør stingtrinnene ikke være større enn 5 mm mellom trinnene som ikke er plassert større enn 1 mm fra vevkanten, noe som sikrer en tett passform rundt vindusrammen. Etter veskestrengsuturen, bukspyttkjertelplassering i korsstingkurven og implantasjon av vindusrammen, er et siste kritisk trinn plasseringen av lim i vindusrammens fordypning. Det er avgjørende at ingen lim i løpet av dette trinnet kommer i kontakt med bukspyttkjertelvevet, da dette vil skade vevet og forvirre avbildning. En potensiell modifikasjon som også kan holde limet fra å kontakte bukspyttkjertelen vev er å lim glassdekselet til vindusrammen og la begge tørke før kirurgisk implantasjon i magen.

SWIP, som alle intravitale bildebehandlingsteknikker, har begrensninger i sin evne til å avsløre informasjon om andre celler og strukturer i vevet som ikke er eksplisitt merket. Ved å kombinere SWIPE-vinduet med fluorescerende reportere (som ECFP-uttrykkende epitel og Dendra2-merkede KPC-celler som i denne studien) og kontrollere protein- eller celletilstander med farmakologiske og/eller optogenetiske verktøy kan man imidlertid eliminere disse begrensningene.

I tillegg inkluderer SWIP-vindusdesignet tre etsede linjer på vindusrammen, som fungerer som fiducial markører for mikrokartografi for å relokalisere interesseområder under seriell avbildning³⁰. Dette gjør det mulig å lokalisere det samme synsfeltet flere ganger, selv i umerket vev.

Oppsummert kan SWIP brukes i normalt sunt bukspyttkjertelvev, så vel som i godartede og ondartede bukspyttkjertelsykdommer som pankreatitt og PDAC. Enkeltcelle- og subcellulær dynamikk kan fanges opp i disse tilstandene ved hjelp av SWIP og kan hjelpe forskere med å forstå viktige fysiologiske hendelser som metastatisk spredning i PDAC. Den forbedrede kvaliteten og stabiliteten til IVI har potensial til å gi verdifull innsikt i patofysiologien og cellebiologien i bukspyttkjertelen, noe som gjør den til et lovende og gunstig verktøy.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].