Janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas murino

Summary

Apresentamos um protocolo para o implante cirúrgico de uma janela óptica de demora estabilizada para imagens de resolução subcelular do pâncreas murino, permitindo estudos seriados e longitudinais do pâncreas sadio e doente.

Abstract

A fisiologia e fisiopatologia do pâncreas são complexas. Doenças do pâncreas, como pancreatite e adenocarcinoma pancreático (ADP), apresentam alta morbidade e mortalidade. A imagem intravital (IVI) é uma técnica poderosa que permite a obtenção de imagens de alta resolução de tecidos em estados saudáveis e doentes, permitindo a observação em tempo real da dinâmica celular. A IVI do pâncreas murino apresenta desafios significativos devido à natureza visceral profunda e complacente do órgão, o que o torna altamente propenso a danos e artefatos de movimento.

Descreve-se aqui o processo de implantação do Stabilizado Window para Intravital imageamento do pâncreas Pmurino (SWIP). O SWIP permite IVI do pâncreas murino em estados normais saudáveis, durante a transformação do pâncreas saudável para pancreatite aguda induzida por ceruleína, e em estados malignos, como tumores pancreáticos. Em conjunto com células geneticamente marcadas ou a administração de corantes fluorescentes, o SWIP permite a medição da dinâmica de célula única e subcelular (incluindo migração de célula única e coletiva), bem como imagens seriadas da mesma região de interesse durante vários dias.

A capacidade de capturar a migração de células tumorais é de particular importância, pois a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer no ADP é a carga metastática esmagadora. A compreensão da dinâmica fisiológica das metástases no ADP é uma necessidade crítica não atendida e crucial para melhorar o prognóstico dos pacientes. Em geral, o SWIP fornece melhor estabilidade de imagem e expande a aplicação de IVI no pâncreas saudável e doenças malignas do pâncreas.

Introduction

As doenças pancreáticas benignas e malignas são potencialmente fatais, com lacunas consideráveis no entendimento de sua fisiopatologia. A pancreatite, inflamação do pâncreas, é a terceira maior causa de internações e readmissões hospitalares relacionadas a doenças gastrointestinais nos EUA e está associada a substancial morbidade, mortalidade e carga socioeconômica¹. Classificado como a terceira causa de morte relacionada ao^câncer2, o adenocarcinoma ductal do pâncreas (ADP) é responsável pela maioria das neoplasias malignas pancreáticas3 e prenuncia uma baixa taxa de sobrevida em 5 anos de apenas 11%². A principal causa de mortalidade relacionada ao câncer no ADP é a sobrecarga metastática. Infelizmente, a maioria dos pacientes apresenta doença metastática. Portanto, compreender a dinâmica das metástases no ADP é uma necessidade crítica não atendida no campo da pesquisa em câncer.

Os mecanismos subjacentes à inflamação e à cascata metastática do pâncreas são pouco compreendidos. Um dos principais contribuintes para essa lacuna no conhecimento é a incapacidade de observar a dinâmica celular pancreática in vivo. A observação direta dessas dinâmicas celulares promete desvendar alvos críticos para alavancar e melhorar o diagnóstico e o tratamento de pessoas com doença pancreática.

A imagem intravital (IVI) é uma técnica de microscopia que permite aos pesquisadores visualizar e estudar processos biológicos em animais vivos em tempo real. O IVI permite a visualização direta e de alta resolução da dinâmica intracelular e microambiental in vivo e dentro do ambiente nativo do processo biológico em questão. Portanto, a IVI permite a observação in vivo de processos patológicos e saudáveis.

As modalidades contemporâneas de imagem de corpo inteiro, como RM, PET e TC, oferecem excelentes visões de órgãos inteiros e podem revelar patologias, mesmo antes do início dos sintomas^clínicos4. Eles são incapazes, no entanto, de atingir resolução de célula única ou revelar os estágios iniciais da doença-pancreatite ou malignidade.

Pesquisas anteriores utilizaram IVI de resolução unicelular para observar doenças benignas e malignas de tumores cutâneos^5,6, mama⁷, pulmão⁸, fígado⁹, cérebro 10 e^pâncreas11, levando a insights sobre mecanismos de progressão da doença¹². No entanto, o pâncreas murino apresenta obstáculos significativos para alcançar a resolução unicelular usando IVI, principalmente devido à sua localização visceral profunda e alta complacência. Além disso, é um órgão ramificado e difusamente distribuído dentro do mesentério que se conecta ao baço, intestino delgado e estômago, dificultando o acesso. O tecido também é altamente sensível ao movimento causado pelo peristaltismo adjacente e pela respiração. A minimização do movimento do pâncreas é essencial para a microscopia de resolução unicelular, pois artefatos de movimento de até alguns mícrons podem borrar e distorcer as imagens, impossibilitando o rastreamento da dinâmica de células individuais¹³.

Para a realização da IVI, uma janela de imagem abdominal (AIW) deve ser implantada cirurgicamente ^9,11. Para implantar o AIW cirurgicamente, uma moldura de janela metálica é suturada na parede abdominal. Em seguida, o órgão de interesse é fixado ao quadro com adesivo de cianoacrilato. Embora isso seja suficiente para alguns órgãos internos rígidos (por exemplo, fígado, baço, tumores rígidos), as tentativas de obtenção de imagens do pâncreas murino saudável são comprometidas pela estabilidade lateral e axial subótima, devido à textura compatível e à arquitetura complexa do tecido¹⁴. Para resolver essa limitação, Park et ^al.14 desenvolveram uma janela de imagem projetada especificamente para o pâncreas saudável. Esta Janela de Imagem do Pâncreas (PIW) minimiza a influência do movimento intestinal e da respiração, incorporando uma prateleira metálica horizontal dentro da moldura da janela, logo abaixo da lamínula, estabilizando o tecido e mantendo seu contato com o vidro da tampa. Embora o PIP ofereça maior estabilidade lateral, observamos que essa janela ainda demonstra desvio axial e, adicionalmente, impede a obtenção de imagens de grandes tumores sólidos devido ao estreito espaço entre a plataforma metálica e o lamínulo¹⁵.

Para resolver essas limitações, desenvolvemos o Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP), uma janela de imagem implantável capaz de obter imagens estáveis a longo prazo do pâncreas saudável e doente (Figura 1)¹⁵. Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para o procedimento cirúrgico usado para implantar o SWIP. Embora o objetivo primário tenha sido estudar os mecanismos dinâmicos envolvidos na metástase, este método também pode ser utilizado para explorar vários aspectos da biologia e patologia do pâncreas.

Protocol

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina Albert Einstein (IACUC).

1. Passivação de janelas

NOTA: A passivação do aço inoxidável limpa o metal de contaminantes e cria uma fina camada de óxido que aumenta muito a biocompatibilidade do metal com os tecidos moles, mesmo além do titânio¹⁶.

1. Inicie o processo de passivação lavando as esquadrias ópticas com uma solução de detergente enzimaticamente ativa a 1% (p/v).
2. Submergir as armações em uma solução de hidróxido de sódio a 5% (p/v) a 70 °C por 30 min dentro de um frasco de vidro.
3. Retire as armações e enxágue-as com água deionizada.
4. Mergulhe as armações em uma solução de ácido cítrico a 7% (p/v) a 55 °C por 10 min dentro de um novo frasco de vidro.
5. Retire as armações e enxágue-as com água deionizada novamente.
6. Repita o passo 1.2 e, finalmente, lave as esquadrias das janelas com água deionizada uma última vez.

2. Preparo para implante de tumor ou cirurgia de janela

NOTA: Para estudos de tumores pancreáticos, as células tumorais devem ser implantadas e permitir que cresçam em tumores evidentes. Para visualizar as células tumorais in vivo, recomenda-se o uso de células geneticamente alteradas para expressar proteínas fluorescentes, como a Dendra2. O uso de rótulos de proteínas fluorescentes brilhantes atenuará possíveis problemas com a autofluorescência tecidual. Outras potenciais proteínas fluorescentes, corantes e modelos de camundongos fluorescentes codificados geneticamente que podem ser utilizados têm sido discutidos em outros estudos^17,18. Para evitar a contaminação do campo operatório, realize o procedimento cirúrgico em uma capela ou gabinete de fluxo laminar e garanta que áreas distintas sejam usadas para preparação, cirurgia e recuperação.

1. Antes da cirurgia, esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em autoclave e, se necessário, usar um esterilizador de esferas quentes para procedimentos subsequentes. Certifique-se de que a cirurgia emprega uma técnica apenas de pontas.
2. Ligue a almofada cirúrgica aquecida e o esterilizador de contas e aguarde que atinja a temperatura de operação adequada. A temperatura da almofada de aquecimento deve ser monitorada com um termômetro de superfície para evitar possíveis queimaduras. Coloque um pano estéril sobre a almofada de aquecimento se a temperatura não puder ser adequadamente controlada.
   NOTA: A temperatura corporal durante procedimentos curtos (≤20 min), como tumor e implante de janela, é minimamente afetada durante o uso de um coxim cirúrgico aquecido. No entanto, períodos mais longos de anestesia, como durante imagens de lapso de tempo prolongado, exigem que o mouse seja colocado em uma câmara aquecida para manter a temperatura corporal.
3. Anestesiar o camundongo com isoflurano a 5% em câmara de anestesia.
4. Passo crítico: Abaixe a anestesia para 2% quando o rato estiver inconsciente. Monitorar cuidadosamente o nível de anestesia e os sinais vitais do mouse (por exemplo, usando um oxímetro de pulso)¹⁹.
5. Coloque uma pequena gota de lubrificante ocular em cada olho do rato para evitar o ressecamento da córnea.
6. Antes da cirurgia, aplique creme depilatório generosamente no abdome superior esquerdo para remover os pelos. Após 20 s, use papel higiênico umedecido para limpar firmemente o cabelo e creme depilatório. Repita o processo conforme necessário até que todos os cabelos sejam removidos da área cirúrgica.
7. Injetar 10 μL de buprenorfina (0,1 mg/kg) diluídos em 90 μL de PBS por via subcutânea para garantir analgesia pré-operatória.

3. Implante de tumor de pâncreas

1. Preparar alíquotas de células tumorais na concentração desejada (com base no tempo de duplicação de células tumorais). Coloque a suspensão celular em uma seringa de insulina e mantenha-a no gelo. Para seguir esse protocolo, utilizar^{10 6} células tumorais KPC singênicas 20 suspensas em no máximo 50 μL de PBS, seguindo o protocolo de injeção ortotópica adaptado de Erstad et^al.21
   NOTA: Esta linhagem celular injetada nesta concentração produziu rotineiramente tumores palpáveis ou apropriadamente grandes por 10-14 dias. Subclones dessa linhagem celular e de outras linhagens de células pancreáticas precisariam ser avaliados quanto a concentrações e prazos apropriados para produzir tumores de tamanho adequado).
2. Lave as mãos usando sabão antisséptico.
3. Antes de cada nova cirurgia, coloque novas luvas estéreis.
4. Transfira o mouse para o capuz cirúrgico estéril e coloque-o em decúbito lateral parcial direito.
5. Fixe os membros com fita adesiva de papel.
   NOTA: O uso adequado dos instrumentos é importante durante todo o procedimento. Exemplos de como segurar pinças, tesouras Castroviejo e a ferramenta de captação a vácuo são mostrados na Figura 2A-C.
6. Esterilizar o abdome com antisséptico (Figura 2D).
7. Certifique-se de que o animal está totalmente anestesiado realizando um teste de pinça dos dedos.
8. Realizar incisão subcostal esquerda de 10 a 15 mm na pele com pinça e tesoura de Castroviejo (Figura 2E).
9. Controle a hemostasia com cotonetes ou cautério quando/quando necessário.
10. Divida cuidadosamente o músculo subjacente com pinça e tesoura de Castroviejo para entrar no peritônio (Figura 2F).
11. Usando cotonetes estéreis, exteriorizar atraumaticamente o pâncreas e o baço.
12. Jogue o pâncreas para fora para que não haja dobras (Figura 2G).
13. Identificar o local de injeção do tumor desejado no corpo ou cauda do pâncreas (longe dos vasos sanguíneos).
14. Passo crítico: Após o posicionamento cuidadoso do pâncreas, utilizar pinça para dar tensão ao tecido e inserir a ponta da seringa de insulina, com o bisel voltado para cima, no local desejado do pâncreas a uma profundidade de 4-5 mm (Figura 2H).
15. Injete lentamente a solução de células tumorais. Procure uma pequena bolha que confirme o sucesso da injeção (Figura 2I).
16. Retornar cuidadosamente o pâncreas para o abdome sem perturbar a bolha de injeção de células tumorais (Figura 2J).
17. Com fio absorvível de polidioxanona 5-0, fechar-se primeiro a camada muscular e, em seguida, a pele com pontos interrompidos (Figura 2K-N).
18. Cubra a incisão com cola de cianoacrilato (Figura 2O) e, em seguida, devolva o rato a uma gaiola limpa sob uma lâmpada de aquecimento para recuperação. Administrar antibióticos em água potável para prevenir a infecção. Monitore os ratos e permita que eles se recuperem completamente da cirurgia.
    NOTA: Os antibióticos são administrados conforme exigido pelo protocolo da IACUC. Todos os animais são alojados individualmente.
19. Deixe o tumor se desenvolver por 10-14 dias até que seja palpável através da parede abdominal.

4. Cirurgia da janela do pâncreas

1. Quando os animais estiverem prontos para exames de imagem, inicie a cirurgia de implante de janela. Para começar, lave as mãos com sabão antisséptico.
2. Antes de cada nova cirurgia, coloque luvas estéreis frescas.
3. No banco cirúrgico aquecido, colocar o mouse em decúbito lateral direito para expor o abdome esquerdo.
4. Ancorar os membros anteriores e posteriores do mouse ao estágio cirúrgico aquecido cranial e caudalmente usando fita adesiva de papel. Verifique se o baço (abaixo da pele) é visível dentro do campo cirúrgico (Figura 3A).
5. Para manter a esterilidade, desembale todos os instrumentos cirúrgicos no capô.
6. Desinfete o local cirúrgico esfregando a pele do rato com uma generosa aplicação de antisséptico.
7. Certifique-se de que o animal está totalmente anestesiado realizando um teste de pinça dos dedos.
8. Passo crítico: Levantar a pele do quadrante superior esquerdo do abdome com pinça e fazer uma incisão circular de ~10 mm na pele e musculatura com tesoura de Castroviejo (Figura 3B,C).
9. Controle o sangramento e mantenha a hemostasia usando cotonetes ou cautério, quando necessário.
10. Localize o pâncreas, que está preso ao baço, e identifique a direção em que o pâncreas está deitado dentro da incisão para decidir onde o ponto cruzado de suporte deve ser colocado.
11. Usando sutura de seda 5-0, coloque o primeiro ponto no local desejado na camada muscular. Empate este final com 3-5 nós. (Figura 3D,E)
12. Continue a costurar diretamente através da incisão. Corte e deixe uma cauda de ~5 cm (Figura 3F).
13. Repetir os passos 4.11 e 4.12 perpendicularmente ao primeiro ponto (Figura 3G,H).
14. Passo crítico: Levante e posicione suavemente o pâncreas sobre o ponto cruzado (Figura 3I,J). Tome cuidado para não danificar o pâncreas durante a manipulação.
15. Passo crítico: Com fio de seda 5-0, realizar um ponto bolsa-corda a ~1 mm do orifício, circunferencialmente, entrelaçando a pele e a camada muscular (Figura 3K).
16. Posicione a moldura da janela de modo que as bordas da incisão circular fiquem assentadas dentro do sulco da janela (Figura 3L).
17. Aperte a janela implantada amarrando firmemente a seda 5-0.
18. Carregar 100 μL de adesivo líquido de cianoacrilato na seringa de 1 mL.
19. Seque o tecido aplicando um fluxo delicado de ar comprimido por ~10 s.
20. Aperte a moldura da janela por sua borda externa com pinça e levante-a suavemente para garantir a separação do pâncreas da superfície inferior da moldura da janela.
21. Etapa crítica: Dispensar uma fina camada de adesivo líquido de cianoacrilato ao longo do recesso da janela (Figura 3M). Certifique-se de não obter nenhum do adesivo no tecido do pâncreas.
22. Usando captadores a vácuo, levante a tampa de 5 mm.
23. Coloque cuidadosamente a tampa dentro do recesso no centro da moldura da janela óptica. Segure com leve pressão, permitindo que o adesivo de cianoacrilato se ajuste (~25 s).
24. Separe a tampa dos captadores a vácuo usando pinças.
25. Apertar as suturas de ponto cruzado para fixar o pâncreas confortavelmente à lamínula (Figura 3N,O). Nota: Não aperte demais o ponto cruz, pois pode causar danos e isquemia ao pâncreas.
26. Corte as extremidades da sutura.
27. Retire a fita do mouse.
28. Desligue o vaporizador de isoflurano.
29. Deslocar o rato para uma gaiola limpa ou diretamente para o microscópio intravital.
30. Alojar os animais individualmente após a cirurgia de janela e monitorá-los até a recuperação completa.
31. As imagens são então realizadas em microscópio multifóton bilaser, como descrito anteriormente ^22,23,24 Para longas sessões de imagem^, o camundongo é colocado em uma câmara aquecida para manter a temperatura corporal e fornecido com fluidos de suporte de acordo com os padrões da IACUC.

5. Tratamento com Ceruleína para a indução de pancreatite

1. Para investigar o início da pancreatite, tratar camundongos saudáveis com cerúleina após a implantação do SWIP. Certifique-se de que os ratos estão em jejum durante 14-18 h e recebem água ad libitum antes da administração de ceruleína.
2. Injetar 50 μg/kg de ceruleína em 100 μL de 1x DPBS estéril por via intraperitoneal a intervalos de 1 h para até oito injeções. Administrar um volume equivalente de 1x DPBS isoladamente, injetado intraperitonealmente, aos camundongos controle.
3. Após a aquisição de imagem, sacrificar os camundongos 24 h após a primeira injeção por deslocamento cervical de acordo com os padrões da IACUC.
4. Realizar exames de imagem em microscópio multifóton bilaser conforme descrito anteriormente^22,23,24. Para longas sessões de imagem, coloque o mouse em uma câmara aquecida para manter a temperatura corporal e fornecer-lhe fluidos de suporte de acordo com os padrões da IACUC.

Representative Results

A Figura 1, adaptada de Du et ^al.15, mostra imagens de um filme de IVI com lapso de tempo do pâncreas murino. Alguma movimentação tecidual pode ser observada dentro do período inicial de sedimentação (primeira hora de exame, Figura 1A). No entanto, com a continuidade dos exames de imagem após esse período de sedimentação (>75 min), observamos um aumento da estabilidade lateral e axial (Figura 1B). A comparação da estabilidade do SWIP com as janelas de imagem AIW e PIW anteriores identifica que todas as janelas requerem um período inicial para a instalação. No entanto, o SWIP exibiu o menor nível de deriva geral e é mais adequado para imagens de longo prazo (Figura 1C-K). As imagens foram geradas em um microscópio multifóton personalizado²⁴ iluminando a 880 nm e adquirindo um lapso z stack-t (field of view [FOV] size = 340 x 340 μm, pixel size 0,67 μm) com 1,7 min entre os quadros, 11 cortes com tamanho de passo de 2 μm, 20 de profundidade de imagem e ~1 corte/s. A potência do laser e os ganhos do tubo fotomultiplicador (PMT) foram escolhidos para maximizar o sinal, minimizando o fotoclareamento e o fotodano.

As etapas dos procedimentos cirúrgicos que descrevem o implante do tumor pancreático e a subsequente inserção da janela do pâncreas estão representadas na Figura 2 e na Figura 3, respectivamente. É importante ressaltar que ambas as cirurgias são cirurgias de sobrevivência. Uma vez implantado corretamente, o pâncreas permanecerá apto à janela óptica, que agora está integrada à parede abdominal. Isso permite a sobrevivência confortável do mouse e permite imagens contínuas por até 12 horas, conforme permitido pelo protocolo. Além disso, imagens seriadas podem ser realizadas em vários dias consecutivos (até a permissão do protocolo de 2 semanas) para monitorar regiões de interesse ao longo do tempo. A imagem intravital (IVI) pode ser realizada através da janela de maneira semelhante a outras janelas previamente descritas^22,25,26.

O SWIP pode ser utilizado para investigar a dinâmica no início da pancreatite aguda induzida com ceruleína. A ceruleína é um oligopeptídeo com estrutura e função semelhantes à colecistocinina (CKK) e é amplamente utilizada para induzir experimentalmente pancreatite aguda em^roedores27. O tratamento com ceruleína resulta na contração da musculatura lisa do trato gastrointestinal e estimula secreções gástricas e pancreáticas²⁸. Além disso, a administração intraperitoneal de ceruleína leva ao edema e aumento do pâncreas²⁹.

A Figura 4 mostra imagens seriadas do pâncreas murino após o tratamento com ceruleína, usando o protocolo SWIP. O pâncreas murino é visualizado em resolução unicelular usando marcação genética fluorescente (ECFP marcado com epitélios-MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgênicos) e administração de corantes de alto peso molecular (155 kD dextran-TMR) para definir a vasculatura local, denotada pelas linhas amarelas sólidas. O desenho da janela, utilizado anteriormente para imagens pulmonares murinas⁸, inclui três linhas gravadas no quadro (Figura 4, inset) que atuam como marcadores fiduciais que permitem o uso da microcartografia³⁰. A microcartografia permite imagens seriadas da mesma região de interesse do pâncreas murino durante vários dias. Aqui, o mesmo lóbulo do pâncreas (linhas tracejadas amarelas) é visualizado no Dia 1 e relocalizado no Dia 2, evidenciado pela presença dos mesmos vasos sanguíneos locais (Figura 4). As imagens foram adquiridas diariamente como uma única pilha z com 11 cortes e passo de 2 μm a ~1 corte/s, tomadas com iluminação de 880 nm, e resolução de 0,67 μm/pixel (FOV = 340 x 340 μm). A potência do laser e os ganhos de PMT foram escolhidos para maximizar o sinal, minimizando o fotoclareamento e o fotodano.

Além de imagens seriadas, o SWIP é adequado para imagens longitudinais de longo prazo, permitindo o rastreamento e a medição precisos da dinâmica de estruturas subcelulares (como vacúolos) sob condições de controle e tratamento. Aqui, os vacúolos são regiões onde as proteínas fluorescentes citoplasmáticas são excluídas, fazendo com que buracos escuros não marcados apareçam (Figura 5A). A marcação dos vacúolos, utilizando softwares como o ROI Tracker²⁴, permite a visualização da motilidade dos vacúolos (Figura 5A,B) e a quantificação de inúmeros parâmetros de motilidade. Por exemplo, a velocidade média dos vacúolos no pâncreas murino aumentou aproximadamente 10% após o tratamento com cerúleína para induzir pancreatite, em comparação com o tratamento com PBS (0,37 ± 0,07 μm/min vs 0,41 ± 0,09 μm/min, p = 0,02) (Figura 5C). O tratamento com ceruleína também aumentou a frequência média de giro das estruturas subcelulares em 10% vs tratamento PBS (2,3 ± 0,3 deg/min vs 2,6 ± 0,6 deg/min, p = 0,04) (Figura 5F). No entanto, não houve diferença significativa (p > 0,05) na velocidade líquida, direcionalidade ou distância acumulada percorrida entre o tratamento com cerúlea e o tratamento com PBS (Figura 5D,E e Figura 5G). As imagens foram geradas em um microscópio multifóton²⁴ customizado iluminando a 880 nm e adquirindo um z stack-t lapse (FOV size = 340 x 340 μm, pixel size 0,67 μm) com 2,9 min entre os quadros, 11 cortes com um passo de 2 μm e ~1 slice/s.

Finalmente, o SWIP permite a visualização e captura da migração de células tumorais. A Figura 6A mostra um alambique de um filme de lapso de tempo (Supplemental Video S1 e Supplemental Video S2) da migração dentro do pâncreas de células tumorais KPC marcadas com Dendra-2 que foram injetadas ortotopicamente. Tanto a migração coletiva de células em clusters (Figura 6B e Supplemental Video S1) quanto a migração de célula única (Figura 6C e Supplemental Video S2) podem ser observadas em curtos períodos (<1 h). As imagens foram geradas em um microscópio multifóton²⁴ personalizado iluminando a 880 nm e adquirindo um lapso de pilha-t 4 x 4 mosaic-z com sobreposição de 20% entre as telhas (tamanho da telha = 340 x 340 μm), 3,4 min entre quadros, 3 cortes com tamanho de passo de 5 μm e ~1 corte/s. A potência do laser e os ganhos de PMT foram escolhidos para maximizar o sinal, minimizando o fotoclareamento e o fotodano.

Figura 1: Melhora da estabilidade das imagens devido ao SWIP. (A) Fotografias de dentro dos primeiros 72 min de um filme timelapse do pâncreas fotografado através do SWIP. Alguma deriva axial, mas muito pouca lateral, pode ser observada. Barras de escala = 50 μm. (B) A continuação da imagem com lapso temporal após 72 min mostra um alto nível de estabilidade axial e lateral. (A,B) Vermelho = soro sanguíneo marcado com dextran tetrametilrodamina 155 kDa, ciano = células pancreáticas marcadas com CFP (camundongos transgênicos MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP) (C-E) Comparação da estabilidade lateral de cada uma das janelas de imagem do pâncreas durante a primeira hora de imagem para o (C) AIW, (D) PIW e (E) SWIP. (F-H) Comparação da estabilidade lateral de cada uma das imagens do pâncreas durante os 150 min subsequentes para o (F) AIW, (G) PIW e (H) SWIP. Inserções são exibições ampliadas dos gráficos correspondentes. (I-K) Comparação da estabilidade axial de cada uma das janelas de imagem do pâncreas nos primeiros 120 min de imagem para o SWIP (I), (J) PIW e (K). Este número é de Du et al., Open Biology 2022, DOI:10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273. ¹⁵. Abreviações: SWIP = janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas; PIA = janela de imagem abdominal; PIW = janela de imagem do pâncreas; CFP = proteína fluorescente ciano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visão geral do protocolo cirúrgico de injeção ortotópica de células de adenocarcinoma ductal pancreático (KPC). (A) Ilustração de como segurar pinças cirúrgicas. (B) Ilustração de como segurar a tesoura Castroviejo. (C) Ilustração de como segurar a ferramenta de captação a vácuo. (D) Higienização da pele. (E) Incisão na pele. (F) Incisão no músculo. (G) Pâncreas recortado. (H) Inserção da agulha no local desejado de injeção. (I) Injeção de suspensão de células cancerígenas criando uma bolha (seta azul). (J) O pâncreas retornou à cavidade peritoneal. (K,L) Fechamento da camada muscular com sutura de seda interrompida. (M,N) Fechamento da pele com sutura de seda interrompida. (O) Cola de cianoacrilato aplicada à incisão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Visão geral do protocolo cirúrgico da Janela Estabilizada para Imagem do Pâncreas . (A) Identificação do baço e pâncreas aderido. (B,C) Incisão circular na pele e músculo. Linhas tracejadas vermelhas em A-C indicam o contorno do baço que pode ser visto através da parede abdominal e da pele. (D,E) Primeiro ponto de cesto de ponto cruzado colocado e amarrado na camada muscular (E, seta amarela). (F) O ponto é continuado para o lado oposto da incisão muscular, deixando uma cauda (seta branca). (G,H) Segundo ponto colocado perpendicularmente ao primeiro, amarrado em uma extremidade (setas amarelas) e deixando uma cauda (setas brancas). (I,J) Colocação do pâncreas no cesto de ponto cruz. (K) Sutura circunferencial em bolsa através do músculo e da pele. (L) Implantação da esquadria. (M) Aplicação de cola na esquadria. (N) Fixação de tampa de vidro. (O) Extremidades da cauda do ponto cruzado apertadas. (P) SWIP completamente implantado. Abreviação: SWIP = janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Microcartografia usada para imagens seriadas para realocar as mesmas áreas de interesse dentro da janela óptica. Imagem intravital de uma única região do pâncreas murino, mostrando o mesmo lóbulo realocado por 2 dias consecutivos (D1-D2) usando microcartografia. Linhas tracejadas amarelas delineiam os limites do mesmo lóbulo. As linhas sólidas destacam os mesmos vasos sanguíneos (evidenciado pela presença de soro sanguíneo marcado em vermelho dentro do lúmen) identificados a cada dia consecutivo. Vermelho = soro sanguíneo marcado com dextran tetrametilrodamina 155 kDa, ciano = células pancreáticas marcadas com CFP (camundongos transgênicos MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP) (Inset) Imagem do SWIP com arranhões para microcartografia. O uso da microcartografia para realocar regiões de interesse durante imagens seriadas é permitido pelas três linhas gravadas na moldura da janela (inset). Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Resolução subcelular e a medida da dinâmica subcelular usando SWIP. (A) Células únicas (contornos amarelos tracejados) e estruturas subcelulares como vacúolos podem ser visualizadas através do SWIP ao longo do tempo no pâncreas murino. Exemplos desses vacúolos são indicados por setas amarelas. O SWIP permite, assim, o rastreamento de estruturas subcelulares (contornos coloridos e trilhas sobrepostas à imagem de fluorescência) ao longo do tempo. Inset é uma exibição ampliada de uma área de caixa amarela mostrando três vacúolos rastreados. Barra de escala = 50 μm. (B) Trajetórias de estruturas subcelulares, como núcleos e vacúolos (destacados em A), após um deslocamento de coordenadas para o ponto de origem. A linha tracejada vermelha mostra o caminho líquido médio em 1 h (3,46 μm). Quantificação dos parâmetros dinâmicos de (C) velocidade média, (D) caminho líquido, (E) direcionalidade, (F) frequência média de giro e (G) distância cumulativa. Vermelho = soro sanguíneo marcado com dextran tetrametilrodamina 155 kDa, ciano = células pancreáticas marcadas com CFP (camundongos transgênicos MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP). Abreviações: SWIP = janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas; CFP = proteína fluorescente ciano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Capturando a migração celular com SWIP . (A) Imagem estática de um filme de imagem intravital timelapsed do pâncreas em um modelo de PDAC injetado ortotopicamente em camundongos. (B) Imagens estáticas do Vídeo Suplementar S1 mostrando um exemplo de células tumorais em migração coletiva (seta amarela). (C) Imagens estáticas do Vídeo Suplementar S2 mostrando exemplos de migração unicelular de uma célula tumoral (seta amarela) e de um macrófago (seta vermelha). Verde = células tumorais marcadas com dendra2, azul = macrófagos marcados com CFP, vermelho = soro sanguíneo marcado com tetrametilrodamina dextran de 155 kDa. Barras de escala = 50 μm (A), 15 μm (B,C). Abreviações: SWIP = janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas; CFP = proteína fluorescente ciano; ADP = adenocarcinoma pancreático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo Suplementar S1: Filme de imagem intravital com timelapse mostrando células tumorais em migração coletiva correspondente à Figura 6B. Verde = células tumorais marcadas com dendra2, azul = macrófagos marcados com CFP, vermelho = soro sanguíneo marcado com tetrametilrodamina dextran de 155 kDa. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar S2: Filme de imagem intravital com timelapse mostrando células tumorais submetidas a migração unicelular correspondente à Figura 6C. Verde = células tumorais marcadas com dendra2, azul = macrófagos marcados com CFP, vermelho = soro sanguíneo marcado com tetrametilrodamina dextran de 155 kDa. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O protocolo SWIP descrito aqui fornece um método aprimorado de estabilização do tecido pancreático utilizando uma técnica de cesto de ponto cruzado. As janelas de imagem abdominais precoces (AIWs) permitiram imagens intravitais (IVI) de órgãos internos do abdome, mas não limitaram adequadamente o movimento de tecidos moles, como o pâncreas. Em resposta, Park e col. desenvolveram uma janela de imagem do pâncreas (PIW) que incorpora uma prateleira metálica horizontal e permite uma melhor estabilização do tecido pancreático, mantendo contato com a lamínula de vidro. Embora essa abordagem melhore a estabilidade lateral, ela limita a imagem de tumores pancreáticos sólidos porque seu tamanho excede o espaço estreito entre a prateleira e o vidro da cobertura. O SWIP aborda essa questão estabilizando o pâncreas com uma cesta de pontos cruzados, limitando o movimento axial e lateral, além de ser capaz de acomodar tumores sólidos grandes (≤10 mm).

Comparações diretas do SWIP com janelas de imagem prévias, como AIW e PIW, foram realizadas anteriormente¹⁵. Isso é mostrado na Figura 1, adaptada de Du et ^al.15, onde os desvios laterais e axiais foram quantificados por meio do rastreamento de características anatômicas celulares, como núcleos ou vasos sanguíneos. Todas as janelas de imagem exibiram a necessidade de um período de estabilização durante aproximadamente a primeira hora de imagem. Durante esse tempo, observou-se maior grau de movimentação lateral com o PIA e PIW em relação ao SWIP. Um maior desvio axial também foi observado com o PIA e PIW em comparação com o SWIP durante um período de 2 h. No geral, o SWIP apresentou o nível mais baixo de deriva e é adequado para imagens de longo prazo (≤12 h).

Infelizmente, o pâncreas é um tecido altamente espalhador e, como tal, a função de dispersão pontual para o microscópio multifóton usado na IVI é rapidamente degradada com a penetração no tecido. Assim, a profundidade de imagem com qualquer uma das janelas ópticas é limitada a apenas ~30-60 μm. IVI também traz o risco de danos induzidos pela luz para a amostra. Isso pode ser testado no início das sessões de imagem, adquirindo uma série temporal de 100 imagens e procurando sinais de fotoclareamento ou fotodano. Em nosso sistema de microscópio, descobrimos que uma potência máxima de ~15 mW na amostra pode ser usada sem afetar adversamente o tecido.

O protocolo SWIP permite IVI óptico estável, de alta resolução e de célula única do pâncreas murino tanto em condições normais de saúde, quanto em estados patológicos, como pancreatite e ADP. Isso torna o SWIP particularmente útil para imagens com lapso de tempo longo, bem como para a realização de imagens 3D e 4D (3D + tempo) capturando várias fatias z (aproveitando os recursos inerentes de seccionamento óptico de multifótons e microscopia confocal). Ao permitir a visualização in vivo de células únicas e suas interações com os constituintes celulares do pâncreas, a IVI de alta resolução será inestimável para a compreensão dos mecanismos subjacentes às doenças do pâncreas.

Um certo nível de conhecimento técnico é necessário para executar o protocolo SWIP. No entanto, com a prática adequada e atenção às principais etapas, o procedimento pode ser executado com uma alta taxa de sucesso. Para obter imagens do pâncreas maligno, é crucial primeiro ter um tumor implantado com sucesso. Isto é obtido por injeção ortotópica de uma suspensão de células de câncer pancreático murino no pâncreas do camundongo. Uma injeção bem-sucedida é observada quando o parênquima do pâncreas se infla em uma bolha cheia de líquido e foi descrita em detalhes anteriormente²¹. Para garantir o máximo sucesso e sobrevivência, é vital que haja vazamento mínimo ou nenhum da suspensão celular, pois o vazamento reduzirá drasticamente o tamanho potencial do tumor, bem como levará à carcinomatose. Além disso, o pâncreas é um órgão altamente vascularizado, com muitos vasos sanguíneos ramificados. É fundamental evitar a laceração de quaisquer vasos, pois isso causará sangramento e subsequente hematoma no pâncreas e inibirá o crescimento do tumor. Neste modelo, utilizamos uma linhagem celular PDAC singênica derivada de camundongos KPC²⁰. Isso permite a enxertia tumoral em camundongos imunocompetentes. Outras linhagens celulares PDAC singênicas podem ser usadas dependendo da cepa do camundongo usado. Linhagens celulares PDAC humanas também podem ser usadas; no entanto, a cepa de camundongo deve ser imunocomprometida para evitar a rejeição da implantação do tumor.

O tamanho dos tumores submetidos a exames de imagem neste protocolo pode ser modificado conforme a necessidade. Isso pode ser feito usando uma concentração maior de células cancerosas implantadas no pâncreas murino para obter um tumor maior ou estendendo o tempo de crescimento do tumor antes da implantação da janela. Neste estudo, injetamos 10^{a 6} células KPC PDAC e implantamos o SWIP 10-14 dias após, quando os tumores eram palpáveis. Tumores menores e maiores também podem ser acomodados por este protocolo SWIP usando a colocação apropriada do tecido no cesto de pontos cruzados.

A colocação segura da janela de imagem e do pâncreas também é crucial para obter imagens de alta qualidade e limitar os artefatos de movimento. O pâncreas murino normal é muito complacente e propenso ao movimento da respiração e peristaltismo próximo. Para resolver isso e aumentar a estabilidade do pâncreas durante a aquisição de imagens, uma técnica de cesto de ponto cruzado descrita anteriormente é utilizada³¹. A cesta de ponto cruzado é projetada para imitar o uso de ligamentos pelo corpo. Ao embalar o tecido contra a lamínula de vidro e aplicar pressão axial constante, evita o movimento lateral e axial. Ao lidar com tumores sólidos maiores, o ponto de apoio e a direção do ponto cruzado podem ser modificados para melhor acomodar o tamanho e a posição do tumor para um suporte ideal.

Imagens subótimas também podem acontecer quando a moldura da janela é implantada inadequadamente no abdômen do mouse. Uma moldura de janela frouxa pode levar a dificuldades de imagem e artefatos de movimento. Uma sutura apropriada com corda de bolsa pode resolver esse problema, prendendo a moldura da janela ao abdômen através da pele e da parede abdominal. Para evitar dobras excessivas da pele ao apertar o fio da bolsa, os degraus do ponto não devem ser maiores do que 5 mm entre os degraus que são colocados a não mais de 1 mm da borda do tecido, garantindo um ajuste confortável ao redor da moldura da janela. Após a sutura bolsa-corda, colocação do pâncreas no cesto de ponto cruzado e implantação da esquadria, um último passo crítico é a colocação do adesivo dentro do recesso da esquadria. É crucial que, durante essa etapa, nenhum adesivo entre em contato com o tecido pancreático, pois isso danificará o tecido e confundirá as imagens. Uma modificação potencial que também pode impedir que a cola entre em contato com o tecido do pâncreas é colar a tampa de vidro na moldura da janela e permitir que ambos sequem antes da implantação cirúrgica no abdômen.

O SWIP, como todas as técnicas de imagem intravitais, tem limitações em sua capacidade de revelar informações sobre outras células e estruturas no tecido que não são explicitamente marcadas. No entanto, combinar a janela SWIP com repórteres fluorescentes (como epitélios que expressam ECFP e células KPC marcadas com Dendra2 como neste estudo) e controlar estados de proteínas ou células com ferramentas farmacológicas e/ou optogenéticas pode eliminar essas limitações.

Além disso, o projeto da janela SWIP inclui três linhas gravadas na moldura da janela, servindo como marcadores fiduciais para microcartografia para realocar áreas de interesse durante imagens seriadas³⁰. Isso permite localizar o mesmo campo de visão várias vezes, mesmo em tecido não marcado.

Em resumo, o SWIP pode ser usado em tecido pancreático normal saudável, bem como em doenças pancreáticas benignas e malignas, como pancreatite e ADP. A dinâmica unicelular e subcelular pode ser capturada nesses estados usando o SWIP e pode ajudar os pesquisadores a entender eventos fisiológicos importantes, como a disseminação metastática no PDAC. A qualidade e a estabilidade aprimoradas da IVI têm o potencial de fornecer informações valiosas sobre a fisiopatologia e a biologia celular do pâncreas, tornando-a uma ferramenta promissora e benéfica.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].