Stabiliserat fönster för intravital avbildning av bukspottkörteln på möss

Summary

Vi presenterar ett protokoll för kirurgisk implantation av ett stabiliserat kvarliggande optiskt fönster för subcellulär upplösningsavbildning av den murina bukspottkörteln, vilket möjliggör seriella och longitudinella studier av den friska och sjuka bukspottkörteln.

Abstract

Bukspottkörtelns fysiologi och patofysiologi är komplex. Sjukdomar i bukspottkörteln, såsom pankreatit och adenocarcinom i bukspottkörteln (PDAC) har hög sjuklighet och dödlighet. Intravital avbildning (IVI) är en kraftfull teknik som möjliggör högupplöst avbildning av vävnader i både friska och sjuka tillstånd, vilket möjliggör observation av celldynamik i realtid. IVI i den murina bukspottkörteln innebär betydande utmaningar på grund av organets djupa, viscerala och följsamma natur, vilket gör det mycket benäget att skadas och rörelseartefakter.

Här beskrivs processen för implantation av S-tabiliserad W-indow för I-ntravitalavbildning av murina P-ancreas(SWIP). SWIP tillåter IVI av den murina bukspottkörteln i normala friska tillstånd, under omvandlingen från den friska bukspottkörteln till akut pankreatit inducerad av cerulein, och i maligna tillstånd som bukspottkörteltumörer. I kombination med genetiskt märkta celler eller administrering av fluorescerande färgämnen möjliggör SWIP mätning av encells- och subcellulär dynamik (inklusive encells- och kollektiv migration) samt seriell avbildning av samma intresseområde under flera dagar.

Förmågan att fånga tumörcellers migration är av särskild betydelse eftersom den primära orsaken till cancerrelaterad dödlighet i PDAC är den överväldigande metastaserande bördan. Att förstå den fysiologiska dynamiken vid metastasering i PDAC är ett kritiskt ouppfyllt behov och avgörande för att förbättra patientens prognos. Sammantaget ger SWIP förbättrad bildstabilitet och utökar tillämpningen av IVI vid friska sjukdomar i bukspottkörteln och maligna bukspottkörtelsjukdomar.

Introduction

Godartade och elakartade sjukdomar i bukspottkörteln är potentiellt livshotande, med stora luckor i förståelsen av deras patofysiologi. Pankreatit - inflammation i bukspottkörteln - är den tredje stora orsaken till gastrointestinala sjukdomsrelaterade sjukhusinläggningar och återinläggningar i USA och är förknippad med betydande sjuklighet, dödlighet och socioekonomisk börda¹. Pankreasduktalt adenokarcinom (PDAC) rankas som den tredje vanligaste orsaken till cancerrelaterad död² och står för de flesta maligniteter i bukspottkörteln³ och förebådar en dålig 5-årsöverlevnad på endast 11 %². Den främsta orsaken till cancerrelaterad dödlighet i PDAC är överväldigande metastaserande börda. Tyvärr har de flesta patienter metastaserande sjukdom. Att förstå dynamiken i metastasering i PDAC är därför ett kritiskt otillfredsställt behov inom cancerforskningen.

Mekanismerna som ligger till grund för inflammation och bukspottkörtelns metastaser är dåligt kända. En stor bidragande orsak till denna kunskapslucka är oförmågan att observera cellulär dynamik i bukspottkörteln in vivo. Direkt observation av denna cellulära dynamik lovar att avslöja kritiska mål för att utnyttja och förbättra diagnos och behandling av personer med bukspottkörtelsjukdom.

Intravital avbildning (IVI) är en mikroskopiteknik som gör det möjligt för forskare att visualisera och studera biologiska processer i levande djur i realtid. IVI möjliggör högupplöst, direkt visualisering av intracellulär och mikromiljödynamik in vivo och i den biologiska processens naturliga miljö. Därför tillåter IVI in vivo-observation av friska och patologiska processer.

Samtida helkroppsavbildningsmetoder som MRT, PET och CT erbjuder utmärkta bilder av hela organ och kan avslöja patologier, även innan kliniska symtom^{börjar 4}. De kan dock inte uppnå encellsupplösning eller avslöja de tidigaste stadierna av sjukdomen - pankreatit eller malignitet.

Tidigare forskning har använt encellsupplösning IVI för att observera godartade och maligna sjukdomar i hud^5,6, bröst⁷, lunga⁸, lever⁹, hjärna 10 och bukspottkörteltumörer 11^, vilket leder till insikter om mekanismer för sjukdomsprogression ¹². Den murina bukspottkörteln utgör dock betydande hinder för att uppnå encellsupplösning med IVI, främst på grund av dess djupa viscerala läge och höga följsamhet. Dessutom är det ett grenat, diffust fördelat organ i tarmkäxet som ansluter till mjälten, tunntarmen och magen, vilket gör det svårt att komma åt. Vävnaden är också mycket känslig för rörelse orsakad av intilliggande peristaltik och andning. Att minimera bukspottkörtelns rörelser är viktigt för mikroskopi med encellsupplösning, eftersom rörelseartefakter på bara några mikrometer kan göra bilderna suddiga och förvrängda, vilket gör det omöjligt att spåra dynamiken i enskilda celler¹³.

För att utföra IVI måste ett bukavbildningsfönster (AIW) opereras ^9,11. För att implantera AIW kirurgiskt sys en fönsterram av metall in i bukväggen. Därefter fästs det intressanta organet på ramen med cyanoakrylatlim. Även om detta är tillräckligt för vissa stela inre organ (t.ex. lever, mjälte, stela tumörer), äventyras försök att avbilda den friska murina bukspottkörteln av suboptimal lateral och axiell stabilitet på grund av vävnadens följsamma struktur och komplexa arkitektur¹⁴. För att ta itu med denna begränsning utvecklade Park et ^al.14 ett bildfönster som är särskilt utformat för den friska bukspottkörteln. Detta Pancreas Imaging Window (PIW) minimerar påverkan av tarmrörelser och andning genom att integrera en horisontell metallhylla i fönsterkarmen, precis under täckglaset, vilket stabiliserar vävnaden och bibehåller dess kontakt med täckglaset. Även om PIW erbjuder ökad sidostabilitet, fann vi att detta fönster fortfarande visar axiell drift och dessutom förhindrar avbildning av stora solida tumörer på grund av det smala gapet mellan metallhyllan och täckglaset¹⁵.

För att ta itu med dessa begränsningar utvecklade vi Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP), ett implanterbart avbildningsfönster som kan uppnå stabil långtidsavbildning av både den friska och sjuka bukspottkörteln (Figur 1)¹⁵. Här tillhandahåller vi ett omfattande protokoll för det kirurgiska ingrepp som används för att implantera SWIP. Även om det primära målet var att studera de dynamiska mekanismerna som är involverade i metastasering, kan denna metod också användas för att utforska olika aspekter av bukspottkörtelns biologi och patologi.

Protocol

Alla procedurer som beskrivs i detta protokoll har utförts i enlighet med riktlinjer och föreskrifter för användning av ryggradsdjur, inklusive förhandsgodkännande av Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Passivering av fönster

OBS: Passivering av rostfritt stål renar metallen från föroreningar och skapar ett tunt oxidskikt som kraftigt ökar metallens biokompatibilitet med mjuka vävnader, även utöver titan¹⁶.

1. Starta passiveringsprocessen genom att tvätta de optiska fönsterkarmarna med en 1 % (w/v) enzymatiskt aktiv tvättmedelslösning.
2. Sänk ner ramarna i en 5 % (vikt/volym) natriumhydroxidlösning vid 70 °C i 30 minuter i en glasburk.
3. Ta ut ramarna och skölj dem med avjoniserat vatten.
4. Sänk ner ramarna i en 7 % (w/v) citronsyralösning vid 55 °C i 10 minuter i en ny glasburk.
5. Ta bort ramarna och skölj dem med avjoniserat vatten igen.
6. Upprepa steg 1.2 och skölj slutligen fönsterkarmarna med avjoniserat vatten en sista gång.

2. Förberedelse för tumörimplantation eller fönsterkirurgi

OBS: För studier av tumörer i bukspottkörteln måste tumörceller implanteras och tillåtas växa till öppna tumörer. För att visualisera tumörcellerna in vivo rekommenderas att använda celler som har förändrats genetiskt för att uttrycka fluorescerande proteiner som Dendra2. Att använda fluorescerande proteinetiketter som är ljusa kommer att mildra potentiella problem med vävnadsautofluorescens. Andra potentiella fluorescerande proteiner, färgämnen och genetiskt kodade fluorescerande musmodeller som kan användas har diskuterats på andra ställen^17,18. För att förhindra kontaminering av operationsområdet, utför det kirurgiska ingreppet i en huva eller skåp med laminärt flöde och se till att distinkta områden används för förberedelser, kirurgi och återhämtning.

1. Före operationen, sterilisera alla kirurgiska instrument i en autoklav och använd vid behov en varm pärlsterilisator för efterföljande procedurer. Se till att operationen använder en teknik som endast innehåller tips.
2. Slå på den uppvärmda operationsdynan och pärlsterilisatorn och vänta tills den når lämplig driftstemperatur. Värmedynans temperatur bör övervakas med en yttermometer för att undvika potentiella brännskador. Lägg en steril trasa över värmedynan om temperaturen inte kan kontrolleras tillräckligt.
   OBS: Kroppstemperaturen under korta procedurer (≤20 min), såsom tumör- och fönsterimplantation, påverkas minimalt när du använder en uppvärmd kirurgisk dyna. Längre perioder av anestesi, t.ex. under förlängd timelapse-avbildning, kräver dock att musen placeras i en uppvärmd kammare för att bibehålla kroppstemperaturen.
3. Bedöva musen med 5% isofluran i en anestesikammare.
4. Kritiskt steg: Sänk bedövningen till 2 % när musen är medvetslös. Övervaka noggrant anestesinivån och musens vitala värden (t.ex. med hjälp av en pulsoximeter)¹⁹.
5. Placera en liten droppe ögonsmörjmedel på varje öga på musen för att förhindra att hornhinnan torkar ut.
6. Före operationen, applicera hårborttagningskräm generöst på vänster övre del av buken för att ta bort hår. Efter 20 sekunder, använd fuktat silkespapper för att torka bort håret och hårborttagningskrämen. Upprepa processen vid behov tills allt hår har tagits bort från operationsområdet.
7. Injicera 10 μl buprenorfin (0,1 mg/kg) utspätt i 90 μl PBS subkutant för att säkerställa preoperativ analgesi.

3. Implantation av tumör i bukspottkörteln

1. Förbered alikvoter av tumörceller i önskad koncentration (baserat på tumörcellens fördubblingstid). Placera cellsuspensionen i en insulinspruta och lägg den på is. För att följa detta protokoll, använd 10⁶ syngena KPC-tumörceller 20 suspenderade i maximalt 50 μL PBS, enligt det ortotopiska injektionsprotokollet anpassat från Erstad et^al.21
   OBS: Denna cellinje som injicerades i denna koncentration producerade rutinmässigt palperbara eller lämpligt stora tumörer efter 10-14 dagar. Subkloner av denna cellinje och andra cellinjer i bukspottkörteln skulle behöva utvärderas för lämpliga koncentrationer och tidslinjer för att producera tumörer av lämplig storlek).
2. Tvätta händerna med antiseptisk tvål.
3. Ta på dig nya sterila handskar före varje ny operation.
4. Överför musen till den sterila kirurgiska huvan och placera den i en partiell höger lateral decubitusposition.
5. Fäst lemmarna med papperstejp.
   OBS: Korrekt användning av instrumenten är viktigt under hela proceduren. Exempel på hur man håller pincett, Castroviejo-sax och vakuumupptagningsverktyget visas i figur 2A-C.
6. Sterilisera buken med antiseptiskt medel (Figur 2D).
7. Se till att djuret är helt bedövat genom att utföra ett tånyptest.
8. Gör ett 10-15 mm vänster subkostalt snitt i huden med hjälp av en pincett och Castroviejo-sax (Figur 2E).
9. Kontrollera hemostas med hjälp av bomullspinnar eller en injektionspenna när/där det anses nödvändigt.
10. Dela försiktigt den underliggande muskeln med en pincett och Castroviejo-sax för att komma in i bukhinnan (Figur 2F).
11. Använd sterila bomullspinnar för att atraumatiskt externalisera bukspottkörteln och mjälten.
12. Sprid ut bukspottkörteln så att det inte finns några veck (Figur 2G).
13. Identifiera det önskade injektionsstället för tumören i bukspottkörtelns kropp eller svans (bort från blodkärlen).
14. Kritiskt steg: Efter noggrann positionering av bukspottkörteln, använd en pincett för att spänna vävnaden och för in insulinsprutans spets, med avfasningen uppåt, på önskad plats i bukspottkörteln till ett djup av 4-5 mm (Figur 2H).
15. Injicera långsamt tumörcellslösningen. Leta efter en liten bubbla som bekräftar en lyckad injektion (Figur 2I).
16. För försiktigt tillbaka bukspottkörteln till buken utan att störa injektionsbubblan i tumörcellerna (Figur 2J).
17. Använd absorberbara 5-0 polydioxanonsuturer, stäng muskellagret först och sedan huden med avbrutna suturer (Figur 2K-N).
18. Täck snittet med cyanoakrylatlim (Figur 2O) och sätt sedan tillbaka musen i en ren bur under en värmelampa för återhämtning. Administrera antibiotika i dricksvattnet för att förhindra infektion. Övervaka mössen och låt dem återhämta sig helt efter operationen.
    OBS: Antibiotika administreras enligt IACUC-protokollet. Alla djur hålls individuellt.
19. Låt tumören utvecklas i 10-14 dagar tills den är palperbar genom bukväggen.

4. Bukspottkörtelns fönsteroperation

1. När djuren är redo för avbildning påbörjar du fönsterimplantationsoperationen. Börja med att tvätta händerna med antiseptisk tvål.
2. Före varje ny operation, ta på dig nya sterila handskar.
3. På det uppvärmda kirurgiska stativet placerar du musen i höger lateralt decubitusläge för att exponera vänster buk.
4. Förankra musens fram- och bakben i det uppvärmda kirurgiska stadiet kraniellt och kaudalt med hjälp av papperstejp. Se till att mjälten (under huden) är synlig inom det kirurgiska området (Figur 3A).
5. För att bibehålla steriliteten, packa upp alla kirurgiska instrument i huven.
6. Desinficera operationsområdet genom att svabba musens hud med en generös applicering av antiseptiskt medel.
7. Se till att djuret är helt bedövat genom att utföra ett tånyptest.
8. Kritiskt steg: Lyft huden på den vänstra övre kvadranten av buken med en pincett och gör ett ~10 mm cirkulärt snitt i huden och muskulaturen med hjälp av en Castroviejo-sax (Figur 3B,C).
9. Kontrollera blödningen och upprätthåll hemostas med hjälp av bomullspinnar eller brännpennan, där det behövs.
10. Lokalisera bukspottkörteln, som är fäst vid mjälten, och identifiera i vilken riktning bukspottkörteln ligger inom snittet för att bestämma var det stödjande korsstygnet ska placeras.
11. Använd 5-0 silkessutur och placera det första stygnet på önskad plats i muskellagret. Knyt ihop denna ände med 3-5 knop. (Figur 3D,E)
12. Fortsätt att sy direkt tvärs över snittet. Klipp och lämna en svans på ~5 cm (Figur 3F).
13. Upprepa steg 4.11 och 4.12 vinkelrätt mot den första maskan (Figur 3G,H).
14. Kritiskt steg: Lyft försiktigt och placera bukspottkörteln över korsstygnet (Figur 3I,J). Var försiktig så att du inte skadar bukspottkörteln under manipulationen.
15. Kritiskt steg: Använd 5-0 silkessuturen och utför en väsksträngssöm ~1 mm från hålet, omkretsen, sammanflätad huden och muskellagret (Figur 3K).
16. Placera fönsterkarmen så att kanterna på det cirkulära snittet sitter i fönstrets spår (Figur 3L).
17. Fäst det implanterade fönstret genom att knyta fast 5-0 silket.
18. Fyll på 100 μl flytande cyanoakrylatlim i 1 ml sprutan.
19. Torka vävnaden genom att applicera ett känsligt flöde av tryckluft i ~10 s.
20. Spänn fast fönsterkarmen i ytterkanten med en pincett och lyft den försiktigt för att säkerställa att bukspottkörteln separeras från fönsterkarmens underyta.
21. Kritiskt steg: Fördela ett tunt lager flytande cyanoakrylatlim längs fönstrets urtag (Figur 3M). Var noga med att inte få något av limmet på bukspottkörtelvävnaden.
22. Använd vakuumuppsamlare och lyft upp 5 mm täckglaset.
23. Placera försiktigt täckglaset inuti urtaget i mitten av den optiska fönsterkarmen. Håll med lätt tryck och låt cyanoakrylatlimmet stelna (~25 s).
24. Separera täckglaset från vakuumupptagningarna med en pincett.
25. Dra åt korsstygnsstygnen för att fästa bukspottkörteln tätt mot täckglaset (Figur 3N,O). Notera: Dra inte åt korsstygnet för hårt eftersom det kan orsaka skador och ischemi i bukspottkörteln.
26. Klipp av ändarna på suturen.
27. Ta bort tejpen från musen.
28. Stäng av isofluranförångaren.
29. Flytta musen till en ren bur eller direkt till det intravitala mikroskopet.
30. Inhyss djuren individuellt efter fönsteroperation och övervakas tills de är helt återställda.
31. Avbildningen utförs sedan på ett multifotonmikroskop med två lasrar, som vi tidigare har beskrivit^{: 22,23,24} För långa avbildningssessioner placeras musen i en uppvärmd kammare för att bibehålla kroppstemperaturen och förses med stödvätskor enligt IACUC-standarder.

5. Ceruleinbehandling för induktion av pankreatit

1. För att undersöka uppkomsten av pankreatit, behandla friska möss med cerulein efter implantation av SWIP. Se till att mössen fastar i 14-18 timmar och får fritt vatten innan cerulein administreras.
2. Injicera 50 μg/kg cerulein i 100 μl steril 1x DPBS intraperitonealt med 1 timmes intervall i upp till åtta injektioner. Administrera en ekvivalent volym av 1x DPBS ensamt, injicerat intraperitonealt, till kontrollmössen.
3. Efter avbildning offras mössen 24 timmar efter den första injektionen genom cervikal luxation enligt IACUC-standarder.
4. Utför avbildning på ett multifotonmikroskop med två lasrar enligt tidigare beskrivet^22,23,24. För långa bildsessioner, placera musen i en uppvärmd kammare för att bibehålla kroppstemperaturen och förse den med stödjande vätskor enligt IACUC-standarder.

Representative Results

Figur 1, anpassad från Du et ^al.15, visar stillbilder från en time-lapse IVI-film av den murina bukspottkörteln. Viss vävnadsrörelse kan observeras inom den initiala sedimenteringsperioden (första timmen av avbildning, figur 1A). Men med fortsatt avbildning efter denna sedimenteringsperiod (>75 min) observerade vi en ökning av lateral och axiell stabilitet (Figur 1B). Jämförelsen av SWIP-systemets stabilitet med de tidigare AIW- och PIW-avbildningsfönstren visar att alla fönster kräver en inledande period för att sätta sig. SWIP uppvisade dock den lägsta nivån av drift totalt sett och är bäst lämpad för långtidsavbildning (figur 1C-K). Bilderna genererades på ett specialbyggt multifotonmikroskop 24 som lyser vid 880 nm och får en z stack-t-lapse (synfält [FOV] storlek = 340 x 340 μm, pixelstorlek 0,67 μm) med 1,7 min mellan bildrutorna, 11 skivor med en stegstorlek på 2 μm,²⁰ bilddjup och ~1 skiva/s. Lasereffekt och PMT-förstärkningar (Photomultiplier Tube) valdes för att maximera signalen samtidigt som fotoblekning och fotoskador minimeras.

Stegen i de kirurgiska ingreppen som beskriver implantation av bukspottkörteltumör och efterföljande insättning av bukspottkörtelfönstret visas i figur 2 respektive figur 3. Det är viktigt att notera att båda operationerna är överlevnadsoperationer. När bukspottkörteln väl är korrekt implanterad kommer den att förbli placerad mot det optiska fönstret, som nu är integrerat i bukväggen. Detta gör det möjligt för musen att överleva bekvämt och möjliggör kontinuerlig avbildning i upp till 12 timmar, enligt protokollet. Dessutom kan seriell avbildning utföras under flera på varandra följande dagar (upp till protokolltillägget på 2 veckor) för att övervaka regioner av intresse över tid. Intravital avbildning (IVI) kan utföras genom fönstret på ett sätt som liknar andra fönster som tidigare beskrivits^22,25,26.

SWIP kan användas för att undersöka dynamiken vid uppkomsten av akut pankreatit inducerad med hjälp av cerulein. Cerulein är en oligopeptid med struktur och funktion som liknar kolecystokinin (CKK) och används ofta för att experimentellt inducera akut pankreatit hos gnagare²⁷. Behandling med cerulein resulterar i sammandragning av den glatta muskulaturen i mag-tarmkanalen och stimulerar mag- och bukspottkörtelsekret²⁸. Dessutom leder intraperitoneal administrering av cerulein till svullnad och förstoring av bukspottkörteln²⁹.

Figur 4 visar seriell avbildning av bukspottkörteln hos möss efter ceruleinbehandling, med hjälp av SWIP-protokollet. Bukspottkörteln visualiseras med encellsupplösning med hjälp av genetisk fluorescerande märkning (ECFP-märkt epitel-MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgena möss) och administrering av högmolekylära färgämnen (155 kD dextran-TMR) för att definiera lokal vaskulatur, betecknad med de heldragna gula linjerna. Fönsterdesignen, som tidigare använts för murin lungavbildning⁸, inkluderar tre etsade linjer på ramen (figur 4, infälld) som fungerar som fiduciella markörer som möjliggör användning av mikrokartografi³⁰. Mikrokartografi möjliggör seriell avbildning av samma intresseområde i murina bukspottkörteln under flera dagar. Här visualiseras samma lob i bukspottkörteln (gula streckade linjer) på dag 1 och omlokaliseras på dag 2, vilket framgår av närvaron av samma lokala blodkärl (Figur 4). Bilderna togs varje dag som en enda z-stack med 11 skivor och 2 μm stegstorlek vid ~1 skiva/s, tagna vid 880 nm belysning och upplösning på 0,67 μm/pixel (FOV = 340 x 340 μm). Lasereffekt och PMT-förstärkningar valdes för att maximera signalen samtidigt som fotoblekning och fotoskador minimerades.

Förutom seriell avbildning är SWIP väl lämpad för långsiktig longitudinell avbildning, vilket möjliggör noggrann spårning och mätning av dynamiken hos subcellulära strukturer (t.ex. vakuoler) under kontroll- och behandlingsförhållanden. Här är vakuoler regioner där cytoplasmatiska fluorescerande proteiner utesluts, vilket gör att mörka omärkta hål uppstår (Figur 5A). Märkning av vakuoler med hjälp av programvara som ROI Tracker²⁴ möjliggör visualisering av vakuolmotilitet (Figur 5A,B) och kvantifiering av många motilitetsparametrar. Till exempel ökade den genomsnittliga hastigheten för vakuoler i den murina bukspottkörteln med cirka 10 % efter behandling med cerulein för att inducera pankreatit, jämfört med PBS-behandling (0,37 ± 0,07 μm/min jämfört med 0,41 ± 0,09 μm/min, p = 0,02) (Figur 5C). Ceruleinbehandling ökade också den genomsnittliga vridfrekvensen för subcellulära strukturer med 10 % jämfört med PBS-behandling (2,3 ± 0,3 grader/min jämfört med 2,6 ± 0,6 grader/min, p = 0,04) (figur 5F). Det fanns dock ingen signifikant skillnad (p > 0,05) i nettohastighet, riktning eller kumulativ tillryggalagd sträcka mellan ceruleinbehandling och PBS-behandling (figur 5D,E och figur 5G). Bilderna genererades på ett specialbyggt multifotonmikroskop²⁴ som lyste vid 880 nm och fick en z stack-t-lapse (synfältsstorlek = 340 x 340 μm, pixelstorlek 0,67 μm) med 2,9 minuter mellan bildrutorna, 11 skivor med en stegstorlek på 2 μm och ~1 skiva/s.

Slutligen möjliggör SWIP visualisering och infångning av tumörcellers migration. Figur 6A visar en stillbild från en timelapse-film (Supplemental Video S1 och Supplemental Video S2) av migrationen i bukspottkörteln av Dendra-2-märkta KPC-tumörceller som injicerades ortopiskt. Både kollektiv migration av celler i kluster (Figur 6B och Supplemental Video S1) och encellsmigration (Figur 6C och Supplemental Video S2) kan observeras under korta perioder (<1 h). Bilderna genererades på ett specialbyggt multifotonmikroskop 24 som lyste vid 880 nm och fick en 4 x 4 mosaik-z stack-t-lapse med²⁰ % överlappning mellan plattorna (kakelstorlek = 340 x 340 μm), 3,4 min mellan bildrutorna, 3 skivor med en stegstorlek på 5 μm och ~1 skiva/s. Lasereffekt och PMT-förstärkningar valdes för att maximera signalen samtidigt som fotoblekning och fotoskador minimerades.

Figur 1: Förbättrad bildstabilitet tack vare SWIP. (A) Stillbilder från de första 72 minuterna av en timelapse-film av bukspottkörteln som avbildats genom SWIP. Viss axiell men mycket liten sidodrift kan observeras. Skalstaplar = 50 μm. (B) Fortsatt timelapse-avbildning efter 72 minuter visar en hög nivå av axiell och lateral stabilitet. (A,B) Röd = 155 kDa tetrametylrhodamin-dextranmärkt blodserum, cyan = CFP-märkta bukspottkörtelceller (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgena möss) (C-E) Jämförelse av den laterala stabiliteten hos vart och ett av bukspottkörtelns avbildningsfönster under den första timmen av avbildningen för (C) AIW, (D) PIW och (E) SWIP. (F-H) Jämförelse av den laterala stabiliteten hos var och en av bukspottkörtelavbildningarna under de följande 150 minuterna för (F) AIW, (G) PIW och (H) SWIP. Infällningar är inzoomade vyer av motsvarande diagram. (I-K) Jämförelse av den axiella stabiliteten hos vart och ett av pankreasavbildningsfönstren under de första 120 minuterna av avbildningen för (I) AIW, (J) PIW och (K) SWIP. Denna siffra är från Du et al. Open Biology 2022, DOI:10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273. ¹⁵. Förkortningar: SWIP = stabiliserat fönster för intravital avbildning av bukspottkörteln; AIW = fönster för bukröntgen; PIW = fönster för avbildning av bukspottkörteln; CFP = cyanfluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Översikt över operationsprotokollet för ortotopisk injektion av pankreasduktalt adenokarcinomceller (KPC). (A) Illustration av hur man håller kirurgisk pincett. (B) Illustration av hur man håller Castroviejo-saxen. (C) Illustration av hur man håller vakuumupptagningsverktyget. (D) Desinficering av huden. (E) Snitt i huden. (F) Snitt i muskeln. (G) Utspridd bukspottkörtel. H) Stick in nålen på önskat injektionsställe. (I) Injektion av cancercellssuspension som skapar en bubbla (blå pil). (J) Bukspottkörteln återgick till bukhålan. (K,L) Stängning av muskelskiktet med en avbruten silkessutur. (M,N) Stängning av huden med en avbruten silkessutur. (O) Cyanoakrylatlim applicerat på snittet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Översikt över operationsprotokollet för det stabiliserade fönstret för avbildning av bukspottkörteln . A) Identifiering av mjälte och fäst bukspottkörtel. (B,C) Cirkulärt snitt i hud och muskel. Röda streckade linjer i A-C indikerar konturerna av mjälten som kan ses genom bukväggen och huden. (D,E) Första maskan i korsstygnskorgen placeras och knyts i muskellagret (E, gul pil). (F) Stygnen fortsätter till motsatt sida av muskelsnittet och lämnar en svans (vit pil). (G,H) Den andra maskan placeras vinkelrätt mot den första, knyts i ena änden (gula pilar) och lämnar en svans (vita pilar). (I,J) Placering av bukspottkörteln i korsstygnskorgen. (K) Perifer sutur genom muskel och hud. (L) Inplantering av fönsterkarmen. (M) Applicering av lim på fönsterkarmen. (N) Fastsättning av täckglas av glas. (O) Korsstygnets bakändar åtdragna. P) Fullständigt implanterad SWIP. Förkortning: SWIP = stabilized window for intravital imaging of the pancreas. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Mikrokartografi som används för seriell avbildning för att omlokalisera samma intresseområden inom det optiska fönstret. Intravital avbildning av en enda region av murina bukspottkörteln, som visar samma lob flyttad under 2 på varandra följande dagar (D1-D2) med hjälp av mikrokartografi. Gula streckade linjer markerar gränserna för samma lob. De heldragna linjerna markerar samma blodkärl (vilket framgår av närvaron av rödmärkt blodserum i lumen) som identifieras varje dag i följd. Röd = 155 kDa tetrametylrhodamin dextranmärkt blodserum, Cyan = CFP-märkta pankreasceller (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgena möss) (Infälld) Bild av SWIP med repor för mikrokartografi. Användningen av mikrokartografi för att flytta intressanta områden under seriell avbildning är tillåten av de tre etsade linjerna på fönsterkarmen (infälld). Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Subcellulär upplösning och mätning av subcellulär dynamik med SWIP. (A) Enskilda celler (streckade gula konturer) och subcellulära strukturer såsom vakuoler kan visualiseras genom SWIP över tid i murina bukspottkörteln. Exempel på dessa vakuoler indikeras med gula pilar. SWIP gör det alltså möjligt att spåra subcellulära strukturer (färgade konturer och spår överlagrade på fluorescensbilden) över tid. Infälld vy är inzoomad vy av ett gult inramat område som visar tre spårvakuoler. Skalstapel = 50 μm. (B) Banor för subcellulära strukturer, såsom kärnor och vakuoler (markerade i A), efter en förskjutning av koordinaterna till utgångspunkten. Röd streckad linje visar den genomsnittliga nettobanan på 1 h (3,46 μm). Kvantifiering av de dynamiska parametrarna för (C) medelhastighet, (D) nettobana, (E) riktning, (F) genomsnittlig svängfrekvens och (G) kumulativt avstånd. Röd = 155 kDa tetrametylrhodamin-dextran-märkt blodserum, cyan = CFP-märkta bukspottkörtelceller (MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP transgena möss). Förkortningar: SWIP = stabiliserat fönster för intravital avbildning av bukspottkörteln; CFP = cyanfluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Fånga cellmigration med SWIP . (A) En stillbild från en timelapse-film av bukspottkörteln i en ortopiskt injicerad musmodell av PDAC. (B) Stillbilder från kompletterande video S1 som visar ett exempel på tumörceller som genomgår kollektiv migration (gul pil). (C) Stillbilder från Supplemental Video S2 som visar exempel på encellsmigration av en tumörcell (gul pil) och en makrofag (röd pil). Grön = Dendra2-märkta tumörceller, Blå = CFP-märkta makrofager, Röd = 155 kDa tetrametylrhodamin-dextran-märkt blodserum. Skalstreck = 50 μm (A), 15 μm (B,C). Förkortningar: SWIP = stabiliserat fönster för intravital avbildning av bukspottkörteln; CFP = cyanfluorescerande protein; PDAC = adenokarcinom i bukspottkörteln. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande video S1: Timelapse intravital bildfilm som visar tumörceller som genomgår kollektiv migration motsvarande figur 6B. Grön = Dendra2-märkta tumörceller, Blå = CFP-märkta makrofager, Röd = 155 kDa tetrametylrhodamin-dextran-märkt blodserum. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande video S2: Timelapse intravital bildfilm som visar tumörceller som genomgår encellsmigration motsvarande figur 6C. Grön = Dendra2-märkta tumörceller, Blå = CFP-märkta makrofager, Röd = 155 kDa tetrametylrhodamin-dextran-märkt blodserum. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

SWIP-protokollet som beskrivs här ger en förbättrad metod för stabilisering av bukspottkörtelvävnad genom att använda en korsstygnskorgsteknik. Tidiga bukavbildningsfönster (AIW) möjliggjorde intravital avbildning (IVI) av inre organ i buken, men begränsade inte tillräckligt rörelsen av mjukvävnader som bukspottkörteln. Som svar på detta utvecklade Park et al. ett pankreasavbildningsfönster (PIW) som innehåller en horisontell metallhylla och möjliggör förbättrad stabilisering av bukspottkörtelns vävnad samtidigt som kontakten med glaset bibehålls. Även om detta tillvägagångssätt förbättrar sidostabiliteten, begränsar det avbildning av solida bukspottkörteltumörer eftersom deras storlek överstiger det smala utrymmet mellan hyllan och täckglaset. SWIP tar itu med detta problem genom att stabilisera bukspottkörteln med en korsstygnskorg, vilket begränsar både axiell och lateral rörelse, samtidigt som den kan rymma stora (≤10 mm) solida tumörer.

Direkta jämförelser av SWIP med tidigare bildfönster som AIW och PIW genomfördes tidigare¹⁵. Detta visas i figur 1, anpassad från Du et al.15, där laterala och axiella förskjutningar kvantifierades genom att spåra cellulära anatomiska egenskaper som kärnor eller blodkärl. Alla bildfönster uppvisade ett behov av en period av sedimentering under ungefär den första timmen av avbildningen. Under denna tid observerades en högre grad av lateral rörelse med AIW och PIW jämfört med SWIP. En större axiell förskjutning sågs också med AIW och PIW jämfört med SWIP under en 2-timmarsperiod. Sammantaget visade SWIP den lägsta nivån av drift och är lämplig för långtidsavbildning (≤12 timmar).

Dessvärre är bukspottkörteln en vävnad som sprider sig mycket, och därför bryts punktspridningsfunktionen för multifotonmikroskopet som används vid IVI snabbt ned när den tränger in i vävnaden. Således är avbildningsdjupet med något av de optiska fönstren begränsat till endast ~30-60 μm. IVI medför också risk för ljusinducerad skada på provet. Detta kan testas i början av avbildningssessionerna genom att samla in en tidsserie på 100 bilder och leta efter tecken på fotoblekning eller fotoskada. På vårt mikroskopsystem fann vi att en maximal effekt på ~15 mW vid provet kan användas utan att påverka vävnaden negativt.

SWIP-protokollet möjliggör stabil, högupplöst, encellsoptisk IVI av murina bukspottkörteln under både normala friska förhållanden och sjukdomstillstånd som pankreatit och PDAC. Detta gör SWIP särskilt användbar för timelapse-avbildning, såväl som för att utföra 3D- och 4D-avbildning (3D + tid) genom att fånga flera z-skivor (genom att dra nytta av multifoton- och konfokalmikroskopins inneboende optiska sektioneringsmöjligheter). Genom att möjliggöra in vivo-visualisering av enskilda celler och deras interaktioner med de cellulära beståndsdelarna i bukspottkörteln, kommer högupplöst IVI att visa sig vara ovärderlig för att förstå mekanismer som ligger till grund för sjukdomar i bukspottkörteln.

En viss nivå av teknisk expertis krävs för att utföra SWIP-protokollet. Men med rätt övning och uppmärksamhet på viktiga steg kan proceduren utföras med en hög framgångsfrekvens. För att avbilda den maligna bukspottkörteln är det avgörande att först ha en framgångsrikt implanterad tumör. Detta erhålls genom ortotopisk injektion av en suspension av murina pankreascancerceller i bukspottkörteln hos musen. En lyckad injektion observeras när bukspottkörtelns parenkym blåses upp till en vätskefylld bubbla och har beskrivits i detalj tidigare²¹. För att säkerställa maximal framgång och överlevnad är det viktigt att det finns minimalt eller inget läckage av cellsuspensionen, eftersom läckage dramatiskt kommer att minska potentiell tumörstorlek samt leda till karcinomatos. Dessutom är bukspottkörteln ett mycket vaskulariserat organ med många grenade blodkärl. Det är viktigt att undvika att skära sönder några kärl eftersom detta kommer att orsaka blödning och efterföljande hematom i bukspottkörteln och hämma tumörtillväxt. I denna modell har vi använt en syngen PDAC-cellinje härledd från KPC-möss²⁰. Detta möjliggör tumöringrepp i immunkompetenta möss. Andra syngena PDAC-cellinjer kan användas beroende på vilken musstam som används. Humana PDAC-cellinjer kan också användas. Musstammen måste dock vara immunkomprometterad för att undvika avstötning av tumörimplantationen.

Storleken på de tumörer som genomgår avbildning i detta protokoll kan modifieras efter behov. Detta kan åstadkommas genom att använda en högre koncentration av cancerceller implanterade i bukspottkörteln för att få en större tumör eller genom att förlänga tumörens tillväxttid före fönsterimplantation. I denna studie injicerade vi 10⁶ KPC PDAC-celler och implanterade SWIP 10-14 dagar efteråt, när tumörerna var palperbara. Mindre och större tumörer kan också tas emot av detta SWIP-protokoll med hjälp av lämplig placering av vävnaden i korsstygnskorgen.

Säker placering av bildfönstret och bukspottkörteln är också avgörande för att få högkvalitativ avbildning och för att begränsa rörelseartefakter. Den normala murina bukspottkörteln är mycket följsam och benägen att röra sig från andning och närliggande peristaltik. För att ta itu med detta och öka stabiliteten i bukspottkörteln under avbildning används en tidigare beskriven korsstygnskorgsteknik³¹. Korsstygnskorgen är utformad för att efterlikna kroppens användning av ligament. Genom att vagga vävnaden mot glastäcket och applicera konstant axiellt tryck förhindrar det både laterala och axiella rörelser. När det handlar om större solida tumörer kan stödpunkten och riktningen för korsstygnet modifieras för att bäst passa tumörens storlek och position för optimalt stöd.

Suboptimal avbildning kan också inträffa när fönsterkarmen är otillräckligt implanterad i musens buk. En löst monterad fönsterkarm kan leda till bildsvårigheter och rörelseartefakter. En lämplig sutur kan lösa detta problem genom att fästa fönsterkarmen vid buken genom huden och bukväggen. För att undvika överdriven hudveckning när du drar åt handväskan, bör stygnstegen inte vara större än 5 mm mellan stegen som inte placeras mer än 1 mm från vävnadskanten, vilket säkerställer en tät passform runt fönsterkarmen. Efter suturen med snören, bukspottkörtelns placering i korsstygnskorgen och implantationen av fönsterkarmen är ett sista kritiskt steg placeringen av lim i fönsterkarmens urtag. Det är viktigt att inget lim kommer i kontakt med bukspottkörtelvävnaden under detta steg, eftersom detta kommer att skada vävnaden och förvirra avbildningen. En potentiell modifiering som också kan hindra limmet från att komma i kontakt med bukspottkörtelns vävnad är att limma fast glastäcket på fönsterkarmen och låta båda torka innan kirurgisk implantation i buken.

SWIP, liksom alla intravitala avbildningstekniker, har begränsningar i sin förmåga att avslöja information om andra celler och strukturer i vävnaden som inte är explicit märkta. Men genom att kombinera SWIP-fönstret med fluorescerande rapportörer (såsom ECFP-uttryckande epitel och Dendra2-märkta KPC-celler som i denna studie) och kontrollera protein- eller celltillstånd med farmakologiska och/eller optogenetiska verktyg kan dessa begränsningar elimineras.

Dessutom innehåller SWIP-fönsterdesignen tre etsade linjer på fönsterkarmen, som fungerar som fiduciella markörer för mikrokartografi för att omlokalisera intressanta områden under seriell avbildning³⁰. Detta gör det möjligt att lokalisera samma synfält flera gånger, även i omärkt vävnad.

Sammanfattningsvis kan SWIP användas vid normal frisk bukspottkörtelvävnad samt vid godartade och maligna bukspottkörtelsjukdomar som pankreatit och PDAC. Encells- och subcellulär dynamik kan fångas i dessa tillstånd med hjälp av SWIP och kan hjälpa forskare att förstå viktiga fysiologiska händelser som metastatisk spridning i PDAC. Den förbättrade kvaliteten och stabiliteten hos IVI har potential att ge värdefulla insikter i bukspottkörtelns patofysiologi och cellbiologi, vilket gör det till ett lovande och fördelaktigt verktyg.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].