نافذة مستقرة للتصوير داخل الجسم للبنكرياس الفئران

Summary

نقدم بروتوكولا للزرع الجراحي لنافذة بصرية مستقرة للتصوير بدقة تحت الخلوية لبنكرياس الفئران ، مما يسمح بإجراء دراسات تسلسلية وطولية للبنكرياس السليم والمريض.

Abstract

علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية للبنكرياس معقدة. أمراض البنكرياس ، مثل التهاب البنكرياس وسرطان البنكرياس الغدي (PDAC) لها معدلات مراضة ووفيات عالية. التصوير داخل الجسم (IVI) هو تقنية قوية تمكن من التصوير عالي الدقة للأنسجة في كل من الحالات الصحية والمريضة ، مما يسمح بمراقبة ديناميكيات الخلية في الوقت الفعلي. يمثل IVI لبنكرياس الفئران تحديات كبيرة بسبب الطبيعة الحشوية العميقة والمتوافقة للعضو ، مما يجعله عرضة بشدة للتلف والتحف المتحركة.

الموصوفة هنا هي عملية زرع Stabilized Window للتصوير Intravital للفأر Pancreas (SWIP). يسمح SWIP ب IVI لبنكرياس الفئران في الحالات الصحية الطبيعية ، أثناء التحول من البنكرياس السليم إلى التهاب البنكرياس الحاد الناجم عن السيرولين ، وفي الحالات الخبيثة مثل أورام البنكرياس. بالاقتران مع الخلايا الموسومة وراثيا أو إعطاء الأصباغ الفلورية ، يتيح SWIP قياس ديناميكيات الخلية الواحدة وتحت الخلوية (بما في ذلك الخلية المفردة والهجرة الجماعية) بالإضافة إلى التصوير التسلسلي لنفس المنطقة ذات الاهتمام على مدار عدة أيام.

تعتبر القدرة على التقاط هجرة الخلايا السرطانية ذات أهمية خاصة لأن السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في PDAC هو العبء النقيلي الهائل. يعد فهم الديناميات الفسيولوجية للورم الخبيث في PDAC حاجة حرجة لم تتم تلبيتها وحاسمة لتحسين تشخيص المريض. بشكل عام ، يوفر SWIP استقرارا محسنا للتصوير ويوسع تطبيق IVI في البنكرياس السليم وأمراض البنكرياس الخبيثة.

Introduction

من المحتمل أن تكون أمراض البنكرياس الحميدة والخبيثة مهددة للحياة ، مع وجود فجوات كبيرة في فهم الفيزيولوجيا المرضية الخاصة بها. التهاب البنكرياس - التهاب البنكرياس - هو السبب الرئيسي الثالث لدخول المستشفيات وإعادة الدخول إلى المستشفى المرتبط بأمراض الجهاز الهضمي في الولايات المتحدة ويرتبط بالمراضة الكبيرة والوفيات والعبء الاجتماعي والاقتصادي¹. يحتل سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) المرتبة الثالثة كسبب رئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان 2 ، ويمثل معظم الأورام الخبيثة في البنكرياس³ وينذر بمعدل بقاء ضعيف لمدة 5 سنوات يبلغ 11٪ ^{فقط 2}. السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في PDAC هو العبء النقيلي الساحق. لسوء الحظ ، فإن معظم المرضى يعانون من مرض النقيلي. لذلك ، فإن فهم ديناميكيات ورم خبيث في PDAC هو حاجة ماسة لم تتم تلبيتها في مجال أبحاث السرطان.

الآليات التي يقوم عليها الالتهاب والشلال النقيلي للبنكرياس غير مفهومة بشكل جيد. أحد المساهمين الرئيسيين في هذه الفجوة في المعرفة هو عدم القدرة على مراقبة ديناميكيات خلايا البنكرياس في الجسم الحي. تعد المراقبة المباشرة لهذه الديناميات الخلوية بالكشف عن أهداف مهمة للاستفادة من تشخيص وعلاج المصابين بأمراض البنكرياس وتحسينها.

التصوير داخل الجسم (IVI) هو تقنية مجهرية تسمح للباحثين بتصور ودراسة العمليات البيولوجية في الحية في الوقت الفعلي. يسمح IVI بالتصور المباشر عالي الدقة لديناميكيات داخل الخلايا والبيئة الدقيقة في الجسم الحي وداخل البيئة الأصلية للعملية البيولوجية المعنية. لذلك ، يسمح IVI في الجسم الحي بمراقبة العمليات الصحية والمرضية.

توفر طرق التصوير المعاصرة لكامل الجسم مثل التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني والتصوير المقطعي المحوسب مناظر ممتازة للأعضاء بأكملها ويمكن أن تكشف عن الأمراض ، حتى قبل ظهور الأعراض السريرية⁴. ومع ذلك ، فهي غير قادرة على تحقيق حل خلية واحدة أو الكشف عن المراحل المبكرة من مرض التهاب البنكرياس أو الورم الخبيث.

استخدمت الأبحاث السابقة دقة IVI أحادية الخلية لمراقبة الأمراض الحميدة والخبيثة للجلد ^5,6 ، والثدي⁷ ، والرئة⁸ ، والكبد⁹ ، والدماغ 10 ، وأورام البنكرياس 11 ، مما أدى إلى رؤى حول آليات تطور المرض ¹². ومع ذلك ، فإن بنكرياس الفئران يشكل عقبات كبيرة أمام تحقيق دقة الخلية الواحدة باستخدام IVI ، ويرجع ذلك أساسا إلى موقعه الحشوي العميق والامتثال العالي. علاوة على ذلك ، فهو عضو متفرع وموزع بشكل منتشر داخل المساريق يتصل بالطحال والأمعاء الدقيقة والمعدة ، مما يجعل الوصول إليه صعبا. كما أن الأنسجة حساسة للغاية للحركة الناتجة عن التمعج والتنفس المجاورين. يعد تقليل حركة البنكرياس أمرا ضروريا للفحص المجهري أحادي الخلية ، حيث يمكن للقطع الأثرية الحركية حتى بضعة ميكرونات أن تطمس الصور وتشوهها ، مما يجعل تتبع ديناميكيات الخلايا الفردية^{مستحيلا 13}.

لإجراء IVI ، يجب زرع نافذة تصوير البطن (AIW) جراحيا ^9,11. لزرع AIW جراحيا ، يتم خياطة إطار نافذة معدني في جدار البطن. بعد ذلك ، يتم توصيل العضو محل الاهتمام بالإطار باستخدام لاصق cyanoacrylate. في حين أن هذا يكفي لبعض الأعضاء الداخلية الصلبة (مثل الكبد والطحال والأورام الصلبة) ، فإن محاولات تصوير بنكرياس الفئران السليم تتعرض للخطر بسبب الاستقرار الجانبي والمحوري دون المستوى الأمثل بسبب نسيج الأنسجة المتوافق والبنية المعقدة¹⁴. لمعالجة هذا القيد ، طور Park et ^al.14 نافذة تصوير مصممة خصيصا للبنكرياس الصحي. تقلل نافذة تصوير البنكرياس (PIW) من تأثير حركة الأمعاء والتنفس من خلال دمج رف معدني أفقي داخل إطار النافذة ، أسفل غطاء الغطاء مباشرة ، مما يؤدي إلى استقرار الأنسجة والحفاظ على ملامستها لزجاج الغطاء. بينما يوفر PIW ثباتا جانبيا متزايدا ، وجدنا أن هذه النافذة لا تزال توضح الانجراف المحوري وتمنع بالإضافة إلى ذلك تصوير الأورام الصلبة الكبيرة بسبب الفجوة الضيقة بين الرف المعدني وغطاء^{الغطاء 15}.

لمعالجة هذه القيود ، قمنا بتطوير Stabilized Window للتصوير Intravital للفأر Pancreas (SWIP) ، وهي نافذة تصوير قابلة للزرع قادرة على تحقيق تصوير مستقر طويل الأمد لكل من البنكرياس السليم والمريض (الشكل 1) ¹⁵. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا للإجراء الجراحي المستخدم لزرع SWIP. على الرغم من أن الهدف الأساسي كان دراسة الآليات الديناميكية التي ينطوي عليها ورم خبيث ، إلا أنه يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لاستكشاف جوانب مختلفة من بيولوجيا البنكرياس وعلم الأمراض.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الخاصة باستخدام الفقارية ، بما في ذلك الموافقة المسبقة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في كلية ألبرت أينشتاين للطب (IACUC).

1. تخميل النوافذ

ملاحظة: تخميل الفولاذ المقاوم للصدأ ينظف المعدن من الملوثات ويخلق طبقة أكسيد رقيقة تزيد بشكل كبير من التوافق الحيوي للمعدن مع الأنسجة الرخوة ، حتى بعد التيتانيوم¹⁶.

1. ابدأ عملية التخميل عن طريق غسل إطارات النوافذ البصرية بمحلول منظف نشط إنزيميا بنسبة 1٪ (وزن / حجم).
2. اغمر الإطارات في محلول هيدروكسيد الصوديوم 5٪ (وزن / حجم) عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة داخل وعاء زجاجي.
3. أخرج الإطارات واشطفها بالماء منزوع الأيونات.
4. اغمر الإطارات في محلول حامض الستريك بنسبة 7٪ (وزن / حجم) عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق داخل وعاء زجاجي جديد.
5. قم بإزالة الإطارات وشطفها بالماء منزوع الأيونات مرة أخرى.
6. كرر الخطوة 1.2 ، وأخيرا ، اشطف إطارات النوافذ بالماء منزوع الأيونات مرة أخيرة.

2. التحضير لزرع الورم أو جراحة النافذة

ملاحظة: لدراسات أورام البنكرياس ، يجب زرع الخلايا السرطانية والسماح لها بالنمو إلى أورام علنية. لتصور الخلايا السرطانية في الجسم الحي ، يوصى باستخدام الخلايا التي تم تغييرها وراثيا للتعبير عن البروتينات الفلورية مثل Dendra2. سيؤدي استخدام ملصقات البروتين الفلوري الساطعة إلى التخفيف من المشكلات المحتملة المتعلقة بالتألق الذاتي للأنسجة. تمت مناقشة البروتينات الفلورية المحتملة الأخرى والأصباغ ونماذج الفئران الفلورية المشفرة وراثيا التي يمكن استخدامها في مكان آخر^17،18. لمنع تلوث مجال الجراحة ، قم بإجراء العملية الجراحية في غطاء محرك السيارة أو خزانة التدفق الصفحي وتأكد من استخدام مناطق مميزة للتحضير والجراحة والتعافي.

1. قبل الجراحة ، قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف ، وإذا لزم الأمر ، استخدم معقم حبة ساخنة للإجراءات اللاحقة. تأكد من أن الجراحة تستخدم تقنية النصائح فقط.
2. قم بتشغيل الوسادة الجراحية الساخنة ومعقم الخرزة وانتظر حتى تصل إلى درجة حرارة التشغيل المناسبة. يجب مراقبة درجة حرارة وسادة التسخين باستخدام مقياس حرارة سطحي لتجنب الحروق المحتملة. ضع قطعة قماش معقمة فوق وسادة التدفئة إذا كان لا يمكن التحكم في درجة الحرارة بشكل كاف.
   ملاحظة: تتأثر درجة حرارة الجسم أثناء الإجراءات القصيرة (≤20 دقيقة) ، مثل الورم وزرع النافذة ، بشكل ضئيل أثناء استخدام وسادة جراحية ساخنة. ومع ذلك ، تتطلب فترات التخدير الأطول ، مثل التصوير بفاصل زمني ممتد ، وضع الماوس في غرفة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم.
3. تخدير الماوس مع 5 ٪ isoflurane في غرفة التخدير.
4. خطوة حاسمة: خفض التخدير إلى 2٪ بمجرد أن يكون الفأر فاقدا للوعي. راقب بعناية مستوى التخدير والعناصر الحيوية للفأر (على سبيل المثال، باستخدام مقياس التأكسج النبضي)¹⁹.
5. ضع قطرة صغيرة من مزلق العين على كل عين من عيون الفأر لمنع جفاف القرنية.
6. قبل الجراحة ، ضع كريم مزيل الشعر بسخاء على الجزء العلوي الأيسر من البطن لإزالة الشعر. بعد 20 ثانية ، استخدم المناديل الورقية المبللة لمسح الشعر وكريم إزالة الشعر بإحكام. كرر العملية حسب الحاجة حتى تتم إزالة كل الشعر من منطقة الجراحة.
7. حقن 10 ميكرولتر من البوبرينورفين (0.1 ملغ / كغ) مخفف في 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحت الجلد لضمان تسكين ما قبل الجراحة.

3. زرع ورم البنكرياس

1. تحضير حصص الخلايا السرطانية بالتركيز المطلوب (بناء على وقت مضاعفة الخلايا السرطانية). ضع معلق الخلية في حقنة الأنسولين واحتفظ بها على الجليد. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم 10⁶ خلايا سرطانية متزامنة ل KPC 20 معلقة بحد أقصى 50 ميكرولتر من PBS ، باتباع بروتوكول الحقن التقويمي المقتبس من Erstad et^al.21
   ملاحظة: هذا الخط الخلوي الذي يتم حقنه بهذا التركيز ينتج بشكل روتيني أوراما واضحة أو كبيرة بشكل مناسب لمدة 10-14 يوما. يجب تقييم النسخ الفرعية لهذا الخط الخلوي وخطوط خلايا البنكرياس الأخرى للحصول على التركيزات والجداول الزمنية المناسبة لإنتاج أورام ذات حجم مناسب).
2. اغسل يديك باستخدام صابون مطهر.
3. قبل كل عملية جراحية جديدة ، ارتد قفازات معقمة جديدة.
4. نقل الماوس إلى غطاء جراحي معقم ووضعه في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن الجزئي.
5. تأمين الأطراف مع شريط ورقي.
   ملاحظة: الاستخدام السليم للأدوات مهم طوال الإجراء. يتم عرض أمثلة على كيفية حمل الملقط ومقص Castroviejo وأداة التقاط الفراغ في الشكل 2A-C.
6. تعقيم البطن بمطهر (الشكل 2 د).
7. تأكد من تخدير بالكامل عن طريق إجراء اختبار قرصة إصبع القدم.
8. قم بعمل شق تحت الضلع الأيسر 10-15 مم في الجلد باستخدام ملقط ومقص Castroviejo (الشكل 2E).
9. السيطرة على الإرقاء باستخدام مسحات القطن أو قلم الكي عند / عند الضرورة.
10. قسم العضلات الأساسية بعناية بالملقط ومقص Castroviejo لدخول الصفاق (الشكل 2F).
11. باستخدام مسحات القطن المعقمة ، قم بإخراج البنكرياس والطحال بشكل غير مؤلم.
12. قم بتحريك البنكرياس للخارج حتى لا تكون هناك طيات (الشكل 2G).
13. تحديد موقع حقن الورم المطلوب في الجسم أو ذيل البنكرياس (بعيدا عن الأوعية الدموية).
14. الخطوة الحاسمة: بعد تحديد موضع البنكرياس بعناية ، استخدم الملقط لتوفير التوتر للأنسجة وأدخل طرف حقنة الأنسولين ، مع توجيه الشطبة لأعلى ، في الموقع المطلوب للبنكرياس على عمق 4-5 مم (الشكل 2H).
15. حقن ببطء محلول الخلايا السرطانية. ابحث عن فقاعة صغيرة تؤكد الحقن الناجح (الشكل 2I).
16. أعد البنكرياس بعناية إلى البطن دون إزعاج فقاعة حقن الخلايا السرطانية (الشكل 2J).
17. باستخدام خيوط بوليديوكسانون قابلة للامتصاص 5-0 ، أغلق طبقة العضلات أولا ثم الجلد بخيوط متقطعة (الشكل 2K-N).
18. قم بتغطية الشق بغراء cyanoacrylate (الشكل 2O) ، ثم أعد الماوس إلى قفص نظيف أسفل مصباح تسخين للتعافي. تطبيق المضادات الحيوية في مياه الشرب لمنع العدوى. مراقبة الفئران والسماح لهم بالشفاء التام من الجراحة.
    ملاحظة: تدار المضادات الحيوية كما هو مطلوب بموجب بروتوكول IACUC. يتم إيواء جميع بشكل فردي.
19. اسمح للورم بالتطور لمدة 10-14 يوما حتى يصبح واضحا من خلال جدار البطن.

4. جراحة نافذة البنكرياس

1. عندما تكون جاهزة للتصوير ، ابدأ جراحة زرع النافذة. للبدء ، اغسل يديك بالصابون المطهر.
2. قبل كل عملية جراحية جديدة ، ارتد قفازات معقمة جديدة.
3. على الحامل الجراحي الساخن ، ضع الماوس في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن لفضح البطن الأيسر.
4. ثبت الأطراف الأمامية والخلفية للفأرة على المرحلة الجراحية الساخنة بشكل قحفي وذيلي باستخدام شريط ورقي. تأكد من أن الطحال (تحت الجلد) مرئي داخل المجال الجراحي (الشكل 3 أ).
5. للحفاظ على العقم ، قم بفك جميع الأدوات الجراحية في الغطاء.
6. تطهير موقع الجراحة عن طريق مسح جلد الماوس مع تطبيق سخي من مطهر.
7. تأكد من تخدير بالكامل عن طريق إجراء اختبار قرصة إصبع القدم.
8. خطوة حاسمة: ارفع جلد الربع العلوي الأيسر من البطن بالملقط وقم بعمل شق دائري ~ 10 مم في الجلد والعضلات باستخدام مقص Castroviejo (الشكل 3B ، C).
9. السيطرة على النزيف والحفاظ على الارقاء باستخدام مسحات القطن أو قلم الكي، عند الحاجة.
10. حدد موقع البنكرياس ، المتصل بالطحال ، وحدد الاتجاه الذي يضعه البنكرياس داخل الشق لتحديد مكان وضع الغرزة المتقاطعة الداعمة.
11. باستخدام خياطة الحرير 5-0 ، ضع الغرزة الأولى في الموقع المطلوب في طبقة العضلات. اربط هذه النهاية ب 3-5 عقدة. (الشكل 3D ، E)
12. استمر في الغرز مباشرة عبر الشق. قطع وترك ذيل ~ 5 سم (الشكل 3F).
13. كرر الخطوتين 4.11 و 4.12 عموديا على الغرزة الأولى (الشكل 3G ، H).
14. الخطوة الحاسمة: ارفع البنكرياس وضعه برفق فوق الغرزة المتقاطعة (الشكل 3I ، J). احرص على عدم إتلاف البنكرياس أثناء التلاعب.
15. خطوة حاسمة: باستخدام خياطة الحرير 5-0 ، قم بإجراء غرزة سلسلة المحفظة ~ 1 مم من الحفرة ، محيطيا ، متشابكة الجلد وطبقة العضلات (الشكل 3K).
16. ضع إطار النافذة بحيث تستقر حواف الشق الدائري داخل أخدود النافذة (الشكل 3L).
17. اربط النافذة المزروعة عن طريق ربط الحرير 5-0 بإحكام.
18. قم بتحميل 100 ميكرولتر من لاصق cyanoacrylate السائل في حقنة 1 مل.
19. تجفيف الأنسجة عن طريق تطبيق تدفق دقيق من الهواء المضغوط لمدة ~ 10 ثوان.
20. اربط إطار النافذة من حافته الخارجية بالملقط وارفعه برفق لضمان فصل البنكرياس عن السطح السفلي لإطار النافذة.
21. الخطوة الحاسمة: قم بتوزيع طبقة رقيقة من لاصق cyanoacrylate السائل على طول تجويف النافذة (الشكل 3M). تأكد من عدم الحصول على أي من المادة اللاصقة على أنسجة البنكرياس.
22. باستخدام الشاحنات المفرغة من الهواء ، ارفع غطاء الغطاء مقاس 5 مم.
23. ضع غطاء الغطاء بعناية داخل التجويف في وسط إطار النافذة البصري. امسك بضغط خفيف ، مما يسمح للمادة اللاصقة cyanoacrylate بالتثبيت (~ 25 ثانية).
24. افصل غطاء الغطاء عن الشاحنات المفرغة باستخدام الملقط.
25. شد الغرز المتقاطعة لتثبيت البنكرياس بإحكام على غطاء الغطاء (الشكل 3N ، O). ملاحظة: لا تفرط في شد الغرزة المتقاطعة لأنها يمكن أن تسبب تلفا ونقص تروية البنكرياس.
26. قطع نهايات خياطة.
27. قم بإزالة الشريط من الماوس.
28. قم بإيقاف تشغيل مبخر الأيزوفلوران.
29. نقل الماوس إلى قفص نظيف أو مباشرة إلى المجهر داخل الجسم.
30. إيواء بشكل فردي بعد جراحة النافذة ومراقبتها حتى الشفاء التام.
31. ثم يتم إجراء التصوير على مجهر متعدد الفوتونات ثنائي الليزر كما وصفنا سابقا ²²،²³،²⁴ بالنسبة لجلسات التصوير الطويلة ^، يتم وضع الماوس في غرفة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم وتزويده بالسوائل الداعمة وفقا لمعايير IACUC.

5. علاج Cerulein لتحريض التهاب البنكرياس

1. للتحقيق في بداية التهاب البنكرياس ، علاج الفئران السليمة مع cerulein بعد زرع SWIP. تأكد من صيام الفئران لمدة 14-18 ساعة وإعطائها الماء قبل إعطاء السيرولين.
2. حقن 50 ميكروغرام/كغ من السيرولين في 100 ميكرولتر من 1x DPBS المعقم داخل الصفاق على فترات 1 ساعة لمدة تصل إلى ثماني حقن. إدارة حجم مكافئ من 1x DPBS وحده ، عن طريق الحقن داخل الصفاق ، إلى الفئران السيطرة.
3. بعد التصوير ، التضحية بالفئران بعد 24 ساعة من الحقن الأول عن طريق خلع عنق الرحم وفقا لمعايير IACUC.
4. قم بإجراء التصوير على مجهر متعدد الفوتونات ثنائي الليزر كما هو موضح سابقا²²،^23،24. لجلسات التصوير الطويلة ، ضع الماوس في غرفة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم وتزويده بالسوائل الداعمة وفقا لمعايير IACUC.

Representative Results

يوضح الشكل 1 ، المقتبس من Du et ^al.15 ، صورا ثابتة من فيلم IVI بفاصل زمني لبنكرياس الفئران. يمكن ملاحظة بعض حركة الأنسجة خلال فترة الاستقرار الأولية (الساعة الأولى من التصوير ، الشكل 1 أ). ومع ذلك ، مع التصوير المستمر بعد فترة الاستقرار هذه (>75 دقيقة) ، لاحظنا زيادة في الاستقرار الجانبي والمحوري (الشكل 1 ب). تحدد مقارنة استقرار SWIP مع نوافذ التصوير AIW و PIW السابقة أن جميع النوافذ تتطلب فترة أولية للاستقرار. ومع ذلك ، أظهر SWIP أدنى مستوى من الانجراف بشكل عام وهو الأنسب للتصوير طويل المدى (الشكل 1C-K). تم إنشاء الصور على مجهر متعدد الفوتونات مصمم خصيصا 24 يضيء عند 880 نانومتر ويكتسب فاصل z stack-t (مجال الرؤية [FOV] الحجم = 340 × 340 ميكرومتر ، حجم البكسل 0.67 ميكرومتر) مع 1.7 دقيقة بين الإطارات ، و 11 شريحة بحجم خطوة 2 ميكرومتر ، وعمق تصوير²⁰ ، و ~ شريحة واحدة / ثانية. تم اختيار طاقة الليزر ومكاسب أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) لتعظيم الإشارة مع تقليل التبييض الضوئي والتلف الضوئي.

يتم تصوير خطوات العمليات الجراحية التي تصف زرع ورم البنكرياس وإدخال نافذة البنكرياس اللاحق في الشكل 2 والشكل 3 ، على التوالي. الأهم من ذلك ، كلتا العمليات الجراحية هي جراحات البقاء على قيد الحياة. بمجرد زرعه بشكل صحيح ، سيبقى البنكرياس مثبتا على النافذة البصرية ، والتي تم دمجها الآن داخل جدار البطن. يسمح ذلك ببقاء الماوس بشكل مريح ويتيح التصوير المستمر لمدة تصل إلى 12 ساعة ، وفقا لما يسمح به البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء التصوير التسلسلي على مدار عدة أيام متتالية (حتى بدل البروتوكول لمدة 2 أسابيع) لمراقبة المناطق ذات الاهتمام بمرور الوقت. يمكن إجراء التصوير داخل الجسم (IVI) من خلال النافذة بطريقة مشابهة للنوافذ الأخرى الموصوفة سابقا²²،^25،26.

يمكن استخدام SWIP للتحقيق في الديناميات في بداية التهاب البنكرياس الحاد الناجم عن استخدام cerulein. Cerulein هو قليل الببتيد مع بنية ووظيفة مماثلة لتلك الموجودة في كوليسيستوكينين (CKK) ويستخدم على نطاق واسع للحث تجريبيا على التهاب البنكرياس الحاد في القوارض²⁷. العلاج مع cerulein يؤدي إلى تقلص العضلات الملساء في الجهاز الهضمي ويحفز إفرازات المعدة والبنكرياس²⁸. علاوة على ذلك ، يؤدي إعطاء cerulein داخل الصفاق إلى تورم البنكرياس وتضخمه²⁹.

يوضح الشكل 4 التصوير التسلسلي لبنكرياس الفئران بعد العلاج بالسيرولين ، باستخدام بروتوكول SWIP. يتم تصور بنكرياس الفئران بدقة خلية واحدة باستخدام العلامات الفلورية الجينية (ECFP المسمى epithelia-MMTV-iCre / CAG-CAC-ECFP الفئران المعدلة وراثيا) ، وإدارة الأصباغ عالية الوزن الجزيئي (155 كيلو دكتانول ديكستران-TMR) لتحديد الأوعية الدموية المحلية ، التي يشار إليها بالخطوط الصفراء الصلبة. يتضمن تصميم النافذة ، المستخدم سابقا لتصوير رئة الفئران⁸ ، ثلاثة خطوط محفورة على الإطار (الشكل 4 ، أقحم) والتي تعمل كعلامات إيمانية تسمح باستخدام رسم الخرائط الدقيقة³⁰. يسمح التصوير المجهري بالتصوير التسلسلي لنفس المنطقة التي تهم بنكرياس الفئران على مدار عدة أيام. هنا يتم تصور نفس فصيص البنكرياس (الخطوط الصفراء المتقطعة) في اليوم 1 وإعادة توطينه في اليوم 2 ، كما يتضح من وجود نفس الأوعية الدموية المحلية (الشكل 4). تم الحصول على الصور كل يوم كمكدس z واحد مع 11 شريحة وحجم خطوة 2 ميكرومتر عند ~ 1 شريحة / ثانية ، تم التقاطها بإضاءة 880 نانومتر ، ودقة 0.67 ميكرومتر / بكسل (مجال الرؤية = 340 × 340 ميكرومتر). تم اختيار طاقة الليزر ومكاسب PMT لزيادة الإشارة إلى أقصى حد مع تقليل التبييض الضوئي والتلف الضوئي.

بالإضافة إلى التصوير التسلسلي ، فإن SWIP مناسب تماما للتصوير الطولي طويل المدى ، مما يتيح التتبع والقياس الدقيق لديناميكيات الهياكل تحت الخلوية (مثل الفجوات) تحت ظروف التحكم والعلاج. هنا ، الفجوات هي مناطق يتم فيها استبعاد البروتينات الفلورية السيتوبلازمية ، مما يتسبب في ظهور ثقوب داكنة غير مسماة (الشكل 5 أ). يسمح وضع علامات على الفجوات باستخدام برنامج مثل ROI Tracker²⁴ بتصور حركة الفجوة (الشكل 5A ، B) والقياس الكمي للعديد من معلمات الحركة. على سبيل المثال ، زاد متوسط سرعة الفجوات في بنكرياس الفئران بنسبة 10٪ تقريبا بعد العلاج بالسيرولين للحث على التهاب البنكرياس ، مقارنة بعلاج PBS (0.37 ± 0.07 ميكرومتر / دقيقة مقابل 0.41 ± 0.09 ميكرومتر / دقيقة ، p = 0.02) (الشكل 5C). زاد علاج Cerulein أيضا من متوسط تكرار الدوران للهياكل الخلوية الفرعية بنسبة 10٪ مقابل علاج PBS (2.3 ± 0.3 درجة / دقيقة مقابل 2.6 ± 0.6 درجة / دقيقة ، p = 0.04) (الشكل 5F). ومع ذلك ، لم يكن هناك فرق كبير (p > 0.05) في صافي السرعة أو الاتجاه أو المسافة التراكمية المقطوعة بين علاج cerulein وعلاج PBS (الشكل 5D و E والشكل 5G). تم إنشاء الصور على مجهر متعدد الفوتونات مصمم خصيصا²⁴ يضيء عند 880 نانومتر ويكتسب فاصل z stack-t (حجم مجال الرؤية = 340 × 340 ميكرومتر ، حجم البكسل 0.67 ميكرومتر) مع 2.9 دقيقة بين الإطارات ، و 11 شريحة بحجم خطوة 2 ميكرومتر ، و ~ 1 شريحة / ثانية.

أخيرا ، يتيح SWIP تصور والتقاط هجرة الخلايا السرطانية. يوضح الشكل 6 أ لقطة من فيلم بفاصل زمني (فيديو تكميلي S1 وفيديو تكميلي S2) للهجرة داخل البنكرياس لخلايا ورم KPC المسماة Dendra-2 والتي تم حقنها بشكل تقويمي. يمكن ملاحظة كل من الهجرة الجماعية للخلايا في مجموعات (الشكل 6B والفيديو التكميلي S1) وهجرة الخلية الواحدة (الشكل 6C والفيديو التكميلي S2) على مدى فترات قصيرة (<1 ساعة). تم إنشاء الصور على مجهر متعدد الفوتونات مصمم خصيصا 24 يضيء عند 880 نانومتر ويكتسب انقضاء 4 × 4 فسيفساء-z stack-t مع تداخل بنسبة²⁰٪ بين البلاط (حجم البلاط = 340 × 340 ميكرومتر) ، 3.4 دقيقة بين الإطارات ، 3 شرائح بحجم خطوة 5 ميكرومتر ، و ~ 1 شريحة / ثانية. تم اختيار طاقة الليزر ومكاسب PMT لزيادة الإشارة إلى أقصى حد مع تقليل التبييض الضوئي والتلف الضوئي.

الشكل 1: تحسين استقرار التصوير بسبب SWIP. (أ) لقطات ثابتة من خلال أول 72 دقيقة من فيلم الفاصل الزمني للبنكرياس الذي تم تصويره من خلال SWIP. يمكن ملاحظة بعض الانجراف المحوري ولكن القليل جدا من الانجراف. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) يظهر التصوير المستمر بلقطات متتابعة بعد 72 دقيقة مستوى عاليا من الاستقرار المحوري والجانبي. (أ، ب) أحمر = 155 كيلو دالتون رباعي ميثيل رودامين مصل الدم المسمى ديكستران ، سماوي = خلايا البنكرياس الموسومة ب CFP (MMTV-ICre / cag-cac-ecfp الفئران المعدلة وراثيا) (C-E) مقارنة الاستقرار الجانبي لكل من نوافذ تصوير البنكرياس خلال الساعة الأولى من التصوير ل (C) AIW و (D) PIW و (E) SWIP. (ف-ح) مقارنة الاستقرار الجانبي لكل من تصوير البنكرياس خلال ال 150 دقيقة اللاحقة ل (F) AIW و (G) PIW و (H) SWIP. الأجزاء الداخلية هي طرق عرض مكبرة للمخططات المقابلة. (I-K) مقارنة الاستقرار المحوري لكل من نوافذ تصوير البنكرياس لأول 120 دقيقة من التصوير ل (I) AIW و (J) PIW و (K) SWIP. هذا الرقم مأخوذ من Du et al. Open Biology 2022 ، DOI: 10.1098 / rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8 / rsob.210273. ¹⁵. الاختصارات: SWIP = نافذة مستقرة للتصوير داخل البنكرياس ؛ AIW = نافذة تصوير البطن. PIW = نافذة تصوير البنكرياس. CFP = بروتين الفلورسنت السماوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: نظرة عامة على بروتوكول الجراحة للحقن التقويمي لخلايا الورم الغدي القنوي البنكرياسي (KPC). (أ) توضيح لكيفية الإمساك بالملقط الجراحي. (ب) توضيح لكيفية حمل مقص كاستروفيجو. (ج) توضيح لكيفية حمل أداة التقاط الفراغ. د: تعقيم الجلد. ه: شق في الجلد. (و) شق في العضلات. (ز) البنكرياس المفلطح. (ح) إدخال إبرة في موقع الحقن المطلوب. (I) حقن معلق الخلايا السرطانية مما يخلق فقاعة (سهم أزرق). (ي) عاد البنكرياس إلى التجويف البريتوني. (ك ، ل) إغلاق طبقة العضلات بخياطة حريرية متقطعة. (م، ن) إغلاق الجلد بخياطة حريرية متقطعة. (O) غراء Cyanoacrylate المطبق على الشق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: نظرة عامة على بروتوكول جراحة النافذة المستقرة لتصوير البنكرياس. أ: تحديد الطحال والبنكرياس الملتصق. (ب، ج) شق دائري في الجلد والعضلات. تشير الخطوط الحمراء المتقطعة في A-C إلى الخطوط العريضة للطحال التي يمكن رؤيتها من خلال جدار البطن والجلد. (د، ه) الغرزة الأولى من سلة عبر غرزة وضعت ومربوطة في طبقة العضلات (E ، السهم الأصفر). (F) تستمر الغرزة إلى الجانب المقابل من شق العضلات ، تاركة ذيلا (سهم أبيض). (ز ، ح) غرزة ثانية وضعت عموديا على الأول ، مربوطة في نهاية واحدة (الأسهم الصفراء) وترك ذيل (الأسهم البيضاء). (ط، ي) وضع البنكرياس في سلة الغرزة المتقاطعة. ك: خياطة خيطية محيطية عبر العضلات والجلد. (L) زرع إطار النافذة. (م) تطبيق الغراء على إطار النافذة. (ن) إرفاق زلة غطاء زجاجي. (س) تشديد نهايات ذيل الغرزة المتقاطعة. (P) SWIP المزروعة بالكامل. اختصار: SWIP = نافذة مستقرة للتصوير داخل الجسم للبنكرياس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التصوير المجهري المستخدم في التصوير التسلسلي لإعادة تحديد موضع الاهتمام نفسه داخل النافذة البصرية. التصوير داخل الجسم لمنطقة واحدة من البنكرياس الفئران ، ويظهر نفس الفصيص الذي تم نقله على مدار يومين متتاليين (D1-D2) باستخدام رسم الخرائط الدقيقة. تحدد الخطوط الصفراء المتقطعة حدود الفصيص نفسه. تبرز الخطوط الصلبة نفس الأوعية الدموية (كما يتضح من وجود مصل الدم المسمى باللون الأحمر داخل التجويف) الذي يتم تحديده كل يوم متتالي. أحمر = 155 كيلو دالتون رباعي ميثيل رودامين مصل الدم المسمى ديكستران ، سماوي = خلايا البنكرياس المسمى CFP (MMTV-ICre / cag-cac-ecfp الفئران المعدلة وراثيا) (أقحم) صورة SWIP مع خدوش لرسم الخرائط الدقيقة. يسمح باستخدام رسم الخرائط الدقيقة لنقل المناطق ذات الأهمية أثناء التصوير التسلسلي من خلال الخطوط الثلاثة المحفورة على إطار النافذة (أقحم). قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: الدقة تحت الخلوية وقياس الديناميات دون الخلوية باستخدام SWIP. (أ) يمكن تصور الخلايا المفردة (الخطوط العريضة الصفراء المتقطعة) والتراكيب تحت الخلوية مثل الفجوات العصارية من خلال SWIP بمرور الوقت في بنكرياس الفئران. يشار إلى أمثلة على هذه الفجوات بواسطة الأسهم الصفراء. وبالتالي يسمح SWIP بتتبع الهياكل دون الخلوية (الخطوط العريضة الملونة والمسارات المتراكبة على الصورة الفلورية) بمرور الوقت. الجزء الداخلي هو عرض مكبرة لمنطقة مربعة صفراء تظهر ثلاث فجوات مجنزرة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) مسارات الهياكل تحت الخلوية ، مثل النوى والفجوات (مظللة في A) ، بعد تحول الإحداثيات إلى نقطة الأصل. يظهر الخط الأحمر المتقطع متوسط المسار الصافي في 1 ساعة (3.46 ميكرومتر). القياس الكمي للمعلمات الديناميكية ل (C) متوسط السرعة ، (D) المسار الصافي ، (E) الاتجاه ، (F) متوسط تردد الدوران ، و (G) المسافة التراكمية. أحمر = 155 كيلو دالتون مصل الدم المسمى رباعي ميثيل رودامين ديكستران ، سماوي = خلايا البنكرياس المصنفة CFP (MMTV-ICre / CAG-CAC-ECFP الفئران المعدلة وراثيا). الاختصارات: SWIP = نافذة مستقرة للتصوير داخل البنكرياس ؛ CFP = بروتين الفلورسنت السماوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: التقاط هجرة الخلايا باستخدام SWIP . (أ) صورة ثابتة من فيلم تصوير داخل الجسم للبنكرياس في نموذج فأر محقون بشكل متعامد من PDAC. (B) صور ثابتة من الفيديو التكميلي S1 تظهر مثالا على الخلايا السرطانية التي تمر بهجرة جماعية (سهم أصفر). (C) صور ثابتة من الفيديو التكميلي S2 تظهر أمثلة على هجرة خلية ورمية وحيدة (سهم أصفر) وبلاعم (سهم أحمر). الأخضر = الخلايا السرطانية المسمى Dendra2 ، الأزرق = الضامة المسمى CFP ، الأحمر = 155 كيلو دالتون رباعي ميثيل رودامين ديكستران مصل الدم. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر (أ) ، 15 ميكرومتر (ب ، ج). الاختصارات: SWIP = نافذة مستقرة للتصوير داخل البنكرياس ؛ CFP = بروتين الفلورسنت السماوي ؛ PDAC = سرطان البنكرياس الغدي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيديو التكميلي S1: فيلم تصوير داخل الجسم بفاصل زمني يظهر الخلايا السرطانية التي تخضع للهجرة الجماعية المقابلة للشكل 6B. الأخضر = الخلايا السرطانية المسمى Dendra2 ، الأزرق = الضامة المسمى CFP ، الأحمر = 155 كيلو دالتون رباعي ميثيل رودامين ديكستران مصل الدم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي S2: فيلم تصوير داخل الجسم بفاصل زمني يظهر الخلايا السرطانية التي تخضع لهجرة خلية واحدة المقابلة للشكل 6C. الأخضر = الخلايا السرطانية المسمى Dendra2 ، الأزرق = الضامة المسمى CFP ، الأحمر = 155 كيلو دالتون رباعي ميثيل رودامين ديكستران مصل الدم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

يوفر بروتوكول SWIP الموصوف هنا طريقة محسنة لتثبيت أنسجة البنكرياس من خلال استخدام تقنية سلة الغرزة المتقاطعة. مكنت نوافذ تصوير البطن المبكرة (AIWs) من التصوير داخل الجسم (IVI) للأعضاء الداخلية للبطن ولكنها لم تحد بشكل كاف من حركة الأنسجة الرخوة مثل البنكرياس. استجابة لذلك ، طور Park et al. نافذة تصوير البنكرياس (PIW) التي تتضمن رفا معدنيا أفقيا وتسمح بتحسين استقرار أنسجة البنكرياس مع الحفاظ على ملامسة الغطاء الزجاجي. في حين أن هذا النهج يحسن الاستقرار الجانبي ، فإنه يحد من تصوير أورام البنكرياس الصلبة لأن حجمها يتجاوز المساحة الضيقة بين الرف وغطاء الزجاج. يعالج SWIP هذه المشكلة عن طريق تثبيت البنكرياس بسلة غرزة متقاطعة ، مما يحد من الحركة المحورية والجانبية ، مع القدرة أيضا على استيعاب الأورام الصلبة الكبيرة (≤10 مم).

أجريت مقارنات مباشرة ل SWIP مع نوافذ التصوير السابقة مثل AIW و PIW سابقا¹⁵. يظهر هذا في الشكل 1 ، المقتبس من Du et al.15 ، حيث تم قياس التحولات الجانبية والمحورية من خلال تتبع السمات التشريحية الخلوية مثل النوى أو الأوعية الدموية. أظهرت جميع نوافذ التصوير الحاجة إلى فترة من الاستقرار خلال الساعة الأولى تقريبا من التصوير. خلال هذا الوقت ، لوحظت درجة أعلى من الحركة الجانبية مع AIW و PIW مقارنة ب SWIP. كما شوهد تحول محوري أكبر مع AIW و PIW مقارنة ب SWIP على مدى فترة 2 ساعة. بشكل عام ، أظهر SWIP أدنى مستوى من الانجراف وهو مناسب للتصوير طويل المدى (≤12 ساعة).

لسوء الحظ ، فإن البنكرياس هو نسيج شديد التشتت ، وعلى هذا النحو ، فإن وظيفة انتشار النقطة للمجهر متعدد الفوتونات المستخدم في IVI تتحلل بسرعة مع اختراق الأنسجة. وبالتالي ، فإن عمق التصوير مع أي من النوافذ البصرية يقتصر على ~ 30-60 ميكرومتر فقط. يحمل IVI أيضا خطر التلف الناجم عن الضوء للعينة. يمكن اختبار ذلك في بداية جلسات التصوير من خلال الحصول على سلسلة زمنية من 100 صورة والبحث عن علامات التبييض الضوئي أو التلف الضوئي. في نظام المجهر الخاص بنا ، وجدنا أنه يمكن استخدام طاقة قصوى تبلغ ~ 15 ميجاوات في العينة دون التأثير سلبا على الأنسجة.

يسمح بروتوكول SWIP ب IVI بصري مستقر وعالي الدقة وحيد الخلية لبنكرياس الفئران في كل من الظروف الصحية الطبيعية ، وكذلك الحالات المريضة مثل التهاب البنكرياس و PDAC. هذا يجعل SWIP مفيدا بشكل خاص للتصوير بفاصل زمني طويل ، وكذلك لأداء التصوير ثلاثي الأبعاد و 4D (3D + time) عن طريق التقاط شرائح z متعددة (الاستفادة من قدرات التقسيم البصري المتأصلة في الفحص المجهري متعدد الفوتونات والمجهر متحد البؤر). من خلال تمكين التصور في الجسم الحي للخلايا المفردة وتفاعلاتها مع المكونات الخلوية للبنكرياس ، سيثبت IVI عالي الدقة أنه لا يقدر بثمن لفهم الآليات الكامنة وراء أمراض البنكرياس.

مستوى معين من الخبرة الفنية ضروري لتنفيذ بروتوكول SWIP. ومع ذلك ، مع الممارسة المناسبة والاهتمام بالخطوات الرئيسية ، يمكن تنفيذ الإجراء بمعدل نجاح مرتفع. لتصوير البنكرياس الخبيث ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك أولا ورم مزروع بنجاح. يتم الحصول على هذا عن طريق الحقن التقويمي لتعليق خلايا سرطان البنكرياس الفئران في بنكرياس الفأر. لوحظ الحقن الناجح عندما تنتفخ حمة البنكرياس إلى فقاعة مملوءة بالسوائل وقد تم وصفها بالتفصيل سابقا²¹. لضمان أقصى قدر من النجاح والبقاء على قيد الحياة ، من الضروري أن يكون هناك تسرب ضئيل أو معدوم لتعليق الخلية ، لأن التسرب سيقلل بشكل كبير من حجم الورم المحتمل ويؤدي إلى الإصابة بالسرطان. بالإضافة إلى ذلك ، البنكرياس هو عضو شديد الأوعية الدموية ، مع العديد من الأوعية الدموية المتفرعة. من الأهمية بمكان تجنب تمزق أي أوعية لأن هذا سيؤدي إلى نزيف وورم دموي لاحق في البنكرياس ويمنع نمو الورم. في هذا النموذج ، استخدمنا خط خلية PDAC متزامن مشتق من فئران^{KPC 20}. هذا يسمح بتطعيم الورم في الفئران ذات الكفاءة المناعية. يمكن استخدام خطوط خلايا PDAC التركيبية الأخرى اعتمادا على سلالة الماوس المستخدم. يمكن أيضا استخدام خطوط خلايا PDAC البشرية. ومع ذلك ، يجب أن تكون سلالة الفأر محصنة لتجنب رفض زرع الورم.

يمكن تعديل حجم الأورام التي تخضع للتصوير في هذا البروتوكول حسب الحاجة. يمكن تحقيق ذلك باستخدام تركيز أعلى من الخلايا السرطانية المزروعة في بنكرياس الفئران للحصول على ورم أكبر أو عن طريق تمديد وقت نمو الورم قبل زرع النافذة. في هذه الدراسة ، قمنا بحقن 10⁶ خلايا PDAC KPC وزرعنا SWIP بعد 10-14 يوما ، عندما كانت الأورام واضحة. يمكن أيضا استيعاب الأورام الأصغر والأكبر بواسطة بروتوكول SWIP هذا باستخدام الموضع المناسب للأنسجة في سلة الغرزة المتقاطعة.

يعد الوضع الآمن لنافذة التصوير والبنكرياس أمرا بالغ الأهمية أيضا للحصول على تصوير عالي الجودة والحد من آثار الحركة. البنكرياس الفأر الطبيعي متوافق للغاية وعرضة للحركة من التنفس والتمعج القريب. لمعالجة هذا وزيادة استقرار البنكرياس أثناء التصوير ، يتم استخدام تقنية سلة عبر غرزة وصفت سابقا³¹. تم تصميم سلة الغرز المتقاطعة لتقليد استخدام الجسم للأربطة. من خلال احتضان الأنسجة ضد الغطاء الزجاجي وتطبيق ضغط محوري ثابت ، فإنه يمنع الحركة الجانبية والمحورية. عند التعامل مع الأورام الصلبة الكبيرة ، يمكن تعديل نقطة الدعم واتجاه الغرزة المتقاطعة لاستيعاب حجم الورم وموضعه بشكل أفضل للحصول على الدعم الأمثل.

يمكن أن يحدث التصوير دون المستوى الأمثل أيضا عندما يتم زرع إطار النافذة بشكل غير كاف في بطن الماوس. يمكن أن يؤدي إطار النافذة غير المجهز بشكل فضفاض إلى صعوبات في التصوير وعناصر الحركة. يمكن لخيط المحفظة المناسب معالجة هذه المشكلة عن طريق تثبيت إطار النافذة في البطن من خلال الجلد وجدار البطن. لتجنب الطي المفرط للجلد عند شد خيط المحفظة ، يجب ألا تزيد درجات الغرز عن 5 مم بين الخطوات التي لا يتم وضعها على بعد 1 مم من حافة الأنسجة ، مما يضمن ملاءمة مريحة حول إطار النافذة. بعد خياطة خيط المحفظة ، ووضع البنكرياس في سلة الغرزة المتقاطعة ، وزرع إطار النافذة ، تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة الأخيرة في وضع مادة لاصقة داخل تجويف إطار النافذة. من الأهمية بمكان أنه خلال هذه الخطوة ، لا تلامس أي مادة لاصقة أنسجة البنكرياس لأن ذلك سيؤدي إلى إتلاف الأنسجة وإرباك التصوير. التعديل المحتمل الذي يمكن أن يمنع الغراء من ملامسة أنسجة البنكرياس هو لصق الغطاء الزجاجي بإطار النافذة والسماح لكليهما بالجفاف قبل الزرع الجراحي في البطن.

SWIP ، مثل جميع تقنيات التصوير داخل الحيوية ، لديها قيود في قدرتها على الكشف عن معلومات حول الخلايا والهياكل الأخرى في الأنسجة التي لم يتم تصنيفها صراحة. ومع ذلك ، فإن الجمع بين نافذة SWIP ومراسلي الفلورسنت (مثل ظهارة التعبير عن ECFP وخلايا KPC التي تحمل علامة Dendra2 كما في هذه الدراسة) والتحكم في حالات البروتين أو الخلايا باستخدام الأدوات الدوائية و / أو البصرية الوراثية يمكن أن يزيل هذه القيود.

بالإضافة إلى ذلك ، يتضمن تصميم نافذة SWIP ثلاثة خطوط محفورة على إطار النافذة ، تعمل كعلامات إيمانية لرسم الخرائط الدقيقة لإعادة توطين مناطق الاهتمام أثناء التصوير التسلسلي³⁰. يتيح ذلك تحديد موقع نفس مجال الرؤية عدة مرات ، حتى في الأنسجة غير المميزة.

باختصار ، يمكن استخدام SWIP في أنسجة البنكرياس السليمة الطبيعية وكذلك في أمراض البنكرياس الحميدة والخبيثة مثل التهاب البنكرياس و PDAC. يمكن التقاط ديناميكيات الخلية الواحدة وشبه الخلوية في هذه الحالات باستخدام SWIP ويمكن أن تساعد الباحثين على فهم الأحداث الفسيولوجية المهمة مثل الانتشار النقيلي في PDAC. إن الجودة المحسنة واستقرار IVI لديها القدرة على توفير رؤى قيمة في الفيزيولوجيا المرضية وبيولوجيا الخلية للبنكرياس ، مما يجعلها أداة واعدة ومفيدة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].