Summary
我们提出了一种手术植入稳定留置光学窗口的方案，用于小鼠胰腺的亚细胞分辨率成像，允许对健康和患病胰腺进行连续和纵向研究。
Abstract
胰腺的生理学和病理生理学很复杂。胰腺疾病，如胰腺炎和胰腺癌（PDAC）的发病率和死亡率都很高。活体成像 （IVI） 是一种强大的技术，能够对健康和患病状态的组织进行高分辨率成像，从而可以实时观察细胞动力学。由于器官的深层内脏和顺应性，小鼠胰腺的 IVI 带来了重大挑战，这使得它极易受到损伤和运动伪影。
这里描述的是植入用于小鼠 Pancreas （SWIP） 的 Intravital 成像的 S稳定 W禀露的过程。SWIP允许小鼠胰腺在正常健康状态下，在从健康胰腺转变为蔚蓝诱导的急性胰腺炎期间，以及在胰腺肿瘤等恶性状态下进行IVI。结合基因标记的细胞或荧光染料的给药，SWIP可以测量单细胞和亚细胞动力学（包括单细胞和集体迁移），以及在多天内对同一感兴趣区域进行连续成像。
捕获肿瘤细胞迁移的能力尤为重要，因为 PDAC 中癌症相关死亡的主要原因是压倒性的转移负担。了解 PDAC 转移的生理动力学是一项关键的未满足需求，对于改善患者预后至关重要。总体而言，SWIP提供了更好的成像稳定性，并扩大了IVI在健康胰腺和恶性胰腺疾病中的应用。
Introduction
良性和恶性胰腺疾病可能危及生命，对其病理生理学的理解存在相当大的差距。胰腺炎（胰腺炎症）是美国胃肠道疾病相关住院和再入院的第三大原因，与大量发病率、死亡率和社会经济负担相关1.胰腺导管腺癌 （PDAC） 是癌症相关死亡的第三大原因 2，占大多数胰腺恶性肿瘤3，预示着 5 年生存率仅为 11%2。PDAC癌症相关死亡的主要原因是压倒性的转移负担。不幸的是，大多数患者表现为转移性疾病。因此，了解PDAC转移的动态是癌症研究领域中一个关键的未满足需求。
炎症和胰腺转移级联反应的机制知之甚少。造成这种知识差距的一个主要因素是无法在 体内观察胰腺细胞动力学。对这些细胞动力学的直接观察有望揭示关键靶点，以利用和改善胰腺疾病患者的诊断和治疗。
活体成像 （IVI） 是一种显微镜技术，使研究人员能够实时可视化和研究活体动物的生物过程。IVI允许在 体内 和所讨论的生物过程的天然环境中对细胞内和微环境动力学进行高分辨率、直接的可视化。因此，IVI允许对健康和病理过程 进行体内 观察。
MRI、PET 和 CT 等现代全身成像方式提供了整个器官的极好视图，甚至可以在临床症状出现之前揭示病理4.然而，它们无法达到单细胞分辨率或揭示疾病的早期阶段——胰腺炎或恶性肿瘤。
先前的研究使用单细胞分辨率 IVI 观察皮肤5,6、乳腺7、肺8、肝9、脑 10 和胰腺肿瘤 11 的良性和恶性疾病，从而深入了解疾病进展的机制 12。然而，小鼠胰腺对使用 IVI 实现单细胞分辨率构成了重大障碍，这主要是由于其深脏位置和高依从性。此外，它是肠系膜内一个分支的、弥漫分布的器官，与脾脏、小肠和胃相连，使其难以进入。该组织对邻近蠕动和呼吸引起的运动也高度敏感。最小化胰腺的运动对于单细胞分辨率显微镜至关重要，因为即使是几微米的运动伪影也会使图像模糊和扭曲，从而无法跟踪单个细胞的动态13.
要进行 IVI，必须通过手术植入腹部成像窗口 （AIW） 9,11。为了通过手术植入 AIW，将金属窗框缝合到腹壁中。之后，使用氰基丙烯酸酯粘合剂将感兴趣的器官连接到框架上。虽然这对于一些刚性内脏器官（例如肝脏、脾脏、刚性肿瘤）来说已经足够了，但由于组织的顺应质地和复杂的结构，对健康小鼠胰腺进行成像的尝试会受到次优横向和轴向稳定性的影响14.为了解决这一局限性，Park等人[14]开发了一种专门为健康胰腺设计的成像窗口。该胰腺成像窗口 （PIW） 通过在盖玻片下方的窗框内加入一个水平金属架子，稳定组织并保持其与盖玻片的接触，最大限度地减少肠道运动和呼吸的影响。虽然 PIW 提供了更高的横向稳定性，但我们发现该窗口仍然表现出轴向漂移，并且由于金属架和Coverslip 15 之间的狭窄间隙，还阻止了大型实体瘤的成像。
为了解决这些局限性，我们开发了用于小鼠 Pancreas 的 Intravital 成像的 S稳定 Window （SWIP），这是一种植入式成像窗口，能够实现健康和患病胰腺的稳定长期成像（图 1）15。在这里，我们为用于植入 SWIP 的外科手术提供了全面的方案。虽然主要目的是研究转移的动态机制，但这种方法也可用于探索胰腺生物学和病理学的各个方面。
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Protocol
本协议中描述的所有程序均已按照脊椎动物使用的指南和规定执行，包括阿尔伯特爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的事先批准。
1.窗户的钝化
注意：不锈钢的钝化可以清除金属中的污染物并形成一层薄的氧化层，从而大大提高金属与软组织的生物相容性，甚至超过钛16。
- 通过用 1% （w/v） 酶活性洗涤剂溶液清洗光学窗框来开始钝化过程。
- 将框架浸没在70°C的5%（w / v）氢氧化钠溶液中30分钟。
- 取出镜框并用去离子水冲洗。
- 将框架浸入55°C的7%（w / v）柠檬酸溶液中10分钟。
- 取下框架并再次用去离子水冲洗。
- 重复步骤1.2，最后，最后一次用去离子水冲洗窗框。
2.肿瘤植入或视窗手术的准备
注意：对于胰腺肿瘤的研究，必须植入肿瘤细胞并允许其生长成明显的肿瘤。为了在体内观察肿瘤细胞，建议使用经过基因改变以表达荧光蛋白（如Dendra2）的细胞。使用明亮的荧光蛋白标记物将减轻组织自发荧光的潜在问题。其他可能使用的荧光蛋白、染料和基因编码的荧光小鼠模型已在别处讨论过 17,18。为防止手术区域受到污染，请在罩或层流柜中进行外科手术，并确保使用不同的区域进行准备、手术和恢复。
- 手术前，在高压灭菌器中对所有手术器械进行消毒，如有必要，使用热珠灭菌器进行后续手术。确保手术采用仅提示技术。
- 打开加热的手术垫和珠子消毒器，等待其达到合适的工作温度。加热垫温度应使用表面温度计监测，以避免潜在的灼伤。如果温度无法充分控制，请将无菌布放在加热垫上。
注意：使用加热的手术垫时，短期手术（≤20 分钟）期间的体温（例如肿瘤和窗口植入）受到的影响最小。然而，较长时间的麻醉，例如在延长的延时成像期间，需要将小鼠置于加热室中以保持体温。 - 在麻醉室中用5%异氟烷麻醉小鼠。
- 关键步骤：一旦小鼠失去知觉，将麻醉降低到 2%。仔细监测麻醉水平和小鼠的生命体征（例如，使用脉搏血氧仪）19。
- 在小鼠的每只眼睛上滴一小滴眼部润滑剂，以防止角膜干燥。
- 手术前，将脱毛膏大量涂抹在左上腹部以去除毛发。20秒后，用湿纸巾用力擦去毛发和脱毛膏。根据需要重复该过程，直到从手术区域去除所有毛发。
- 皮下注射 10 μL 在 90 μL PBS 中稀释的丁丙诺啡 （0.1 mg/kg），以确保术前镇痛。
3.胰腺肿瘤植入术
- 制备所需浓度的肿瘤细胞等分试样（基于肿瘤细胞倍增时间）。将细胞悬浮液放入胰岛素注射器中，并将其保持在冰上。为了遵循该方案，使用106 个同基因KPC肿瘤细胞20 悬浮在最多50μL的PBS中，遵循改编自Erstad等人的原位注射方案21
注意：以该浓度注射的该细胞系通常会在 10-14 天内产生可触及或适当大的肿瘤。需要评估该细胞系和其他胰腺细胞系的亚克隆，以产生适当大小的肿瘤。 - 用消毒肥皂洗手。
- 在每次新手术之前，戴上新的无菌手套。
- 将鼠标转移到无菌手术罩上，并将其置于部分右侧卧位。
- 用纸胶带固定四肢。
注意： 在整个过程中正确使用仪器很重要。图 2A-C 显示了如何握住镊子、Castroviejo 剪刀和真空拾取工具的示例。 - 用消毒剂对腹部进行消毒（图2D）。
- 通过进行脚趾捏合测试确保动物完全麻醉。
- 使用镊子和Castroviejo剪刀在皮肤上做一个10-15毫米的左肋下切口（图2E）。
- 必要时/必要时使用棉签或烧灼笔控制止血。
- 用镊子和卡斯特罗维霍剪刀小心地分开下面的肌肉以进入腹膜（图2F）。
- 使用无菌棉签，对胰腺和脾脏进行无创伤外化。
- 将胰腺张开，这样就不会有褶皱（图2G）。
- 确定胰腺体或尾部（远离血管）中所需的肿瘤注射部位。
- 关键步骤：仔细定位胰腺后，使用镊子为组织提供张力，并将胰岛素注射器尖端插入胰腺的所需部位，斜面朝上，深度为4-5毫米（图2H）。
- 缓慢注射肿瘤细胞溶液。寻找确认注射成功的小气泡（图2I）。
- 小心地将胰腺放回腹部，不要干扰肿瘤细胞注射气泡（图2J）。
- 使用可吸收的5-0聚二恶烷酮缝合线，首先闭合肌肉层，然后用间断缝合线闭合皮肤（图2K-N）。
- 用氰基丙烯酸酯胶覆盖切口（图2O），然后将鼠标放回加热灯下的干净笼子中进行恢复。在饮用水中使用抗生素以预防感染。监测小鼠并让它们从手术中完全恢复。
注意：抗生素按照 IACUC 方案的要求给药。所有动物都是单独饲养的。 - 让肿瘤发展 10-14 天，直到可以通过腹壁触及。
4. 胰腺窗手术
- 当动物准备好进行成像时，开始窗户植入手术。首先，用消毒肥皂洗手。
- 每次新手术前，请戴上新的无菌手套。
- 在加热的手术架上，将鼠标置于右侧卧位，露出左腹部。
- 使用纸胶带将小鼠的前肢和后肢固定在加热的手术台的颅骨和尾部。确保脾脏（皮下）在手术区域内可见（图3A）。
- 为保持无菌，请打开引擎盖中的所有手术器械。
- 通过用大量防腐剂擦拭小鼠的皮肤来对手术部位进行消毒。
- 通过进行脚趾捏合测试确保动物完全麻醉。
- 关键步骤：用镊子抬起腹部左上象限的皮肤，并使用Castroviejo剪刀在皮肤和肌肉组织上做一个~10毫米的圆形切口（图3B，C）。
- 必要时使用棉签或烧灼笔控制出血并维持止血。
- 定位附着在脾脏上的胰腺，并确定胰腺在切口内的位置，以决定支撑十字绣的放置位置。
- 使用 5-0 丝线，将第一针放在肌肉层的所需位置。用 3-5 节打结。（图3D，E）
- 继续直接缝合切口。剪下并留下~5厘米的尾巴（图3F）。
- 重复步骤4.11和4.12，垂直于第一针（图3G，H）。
- 关键步骤：轻轻抬起胰腺并将其放置在十字绣上（图3I，J）。注意不要在操作过程中损坏胰腺。
- 关键步骤：使用 5-0 真丝缝合线，在距离孔 ~1 毫米处进行荷包绳缝合，圆周方向，交错皮肤和肌肉层（图 3K）。
- 定位窗框，使圆形切口的边缘位于窗口的凹槽内（图3L）。
- 通过牢牢系住 5-0 真丝来固定植入的窗户。
- 将 100 μL 液体氰基丙烯酸酯粘合剂加载到 1 mL 注射器中。
- 通过施加微妙的压缩空气流~10秒来干燥组织。
- 用镊子扣住窗框的外边缘，轻轻抬起，以确保胰腺与窗框的下表面分离。
- 关键步骤：沿着窗户的凹槽分配一层薄薄的液态氰基丙烯酸酯粘合剂（图3M）。确保不要让任何粘合剂沾到胰腺组织上。
- 使用真空拾取器，提起 5 毫米盖玻片。
- 小心地将盖玻片放在光学窗框中央的凹槽内。轻轻按压，让氰基丙烯酸酯粘合剂凝固（~25 秒）。
- 使用镊子将盖玻片与真空拾取器分开。
- 拧紧十字绣缝合线，将胰腺紧贴盖玻片（图3N，O）。注意：不要将十字绣拧得过紧，因为它会对胰腺造成损伤和缺血。
- 切开缝合线的末端。
- 从鼠标上撕下胶带。
- 关闭异氟烷蒸发器。
- 将小鼠重新安置到干净的笼子中或直接转移到活体显微镜上。
- 在窗户手术后单独饲养动物，并监测它们直到完全康复。
- 然后，如前所述，在双激光多光子显微镜上进行成像 22,23,24 对于长时间的成像会话，将鼠标放置在加热室中以保持体温，并按照 IACUC 标准提供支持液。
5.蔚蓝素治疗胰腺炎的诱导
- 为了研究胰腺炎的发作，在植入SWIP后用蔚蓝素治疗健康小鼠。确保小鼠禁食14-18小时，并在蔚蓝给药 前随意给予 水。
- 在100μL无菌1x DPBS中腹膜内注射50μg/ kg蔚蓝素，间隔1小时，最多注射8次。单独向对照小鼠施用等量的1x DPBS，腹膜内注射。
- 成像后，按照IACUC标准，在第一次注射后24小时通过宫颈脱位处死小鼠。
- 如前所述在双激光多光子显微镜上进行成像22,23,24。对于长时间的成像过程，将鼠标放在加热的腔室中以保持体温，并按照 IACUC 标准为其提供支持液体。
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Representative Results
图 1 改编自 Du 等人 15，显示了小鼠胰腺延时 IVI 电影的图像静止图像。在初始沉降期（成像的第一个小时，图1A）内可以观察到一些组织运动。然而，在这个稳定期（>75分钟）之后继续成像，我们观察到横向和轴向稳定性的增加（图1B）。将 SWIP 的稳定性与之前的 AIW 和 PIW 成像窗口进行比较，可以确定所有窗口都需要初始期来建立。然而，SWIP总体上表现出最低的漂移水平，最适合长期成像（图1C-K）。图像是在定制的多光子显微镜24 上生成的，以 880 nm 的波长照明并获得 z 堆栈 t 延移（视场 [FOV] 尺寸 = 340 x 340 μm，像素尺寸 0.67 μm），帧间间隔 1.7 分钟，11 个切片，步长为 2 μm，成像深度为 20，成像深度为 ~1 个切片/秒。选择激光功率和光电倍增管 （PMT） 增益以最大限度地提高信号，同时最大限度地减少光漂白和光损伤。
描述胰腺肿瘤植入和随后胰腺窗插入的外科手术步骤分别如图 2 和图 3 所示。重要的是，这两项手术都是生存手术。一旦正确植入，胰腺将保持与光学窗口的对接，光学窗口现在集成在腹壁内。这允许小鼠舒适地存活，并能够在协议允许的情况下连续成像长达 12 小时。此外，可以在连续多天（最多 2 周的协议允许）内进行连续成像，以随着时间的推移监测感兴趣的区域。活体成像 （IVI） 可以通过窗口以类似于先前描述的其他窗口的方式进行22,25,26。
SWIP 可用于研究使用 cerulein 诱导的急性胰腺炎发作时的动态。蔚蓝是一种寡肽，其结构和功能与胆囊收缩素 （CKK） 相似，广泛用于实验诱导啮齿动物急性胰腺炎27。用蔚蓝素治疗导致胃肠道平滑肌收缩并刺激胃和胰腺分泌物28。此外，腹膜内施用蔚蓝素会导致胰腺肿胀和肿大29.
图 4 显示了使用 SWIP 协议对蔚蓝素处理后小鼠胰腺的连续成像。使用遗传荧光标记（ECFP标记的上皮-MMTV-iCre / CAG-CAC-ECFP转基因小鼠）和施用高分子量染料（155kD葡聚糖-TMR）以单细胞分辨率观察小鼠胰腺，以定义局部脉管系统，用黄色实线表示。以前用于小鼠肺成像的窗口设计8，包括框架上的三条蚀刻线（图4，插图），它们充当允许使用显微制图30的基准标记。显微制图允许在多天内对小鼠胰腺的同一感兴趣区域进行连续成像。在这里，相同的胰腺小叶（黄色虚线）在第 1 天可见，并在第 2 天重新定位，如存在相同的局部血管所证明的那样（图 4）。每天以 11 个切片和 2 μm 步长以 ~1 切片/秒的速度采集图像，在 880 nm 照明下拍摄，分辨率为 0.67 μm/像素 （FOV = 340 x 340 μm）。选择激光功率和 PMT 增益是为了最大限度地提高信号，同时最大限度地减少光漂白和光损伤。
除了连续成像外，SWIP还非常适合长期纵向成像，能够在控制和治疗条件下准确跟踪和测量亚细胞结构（如液泡）的动力学。在这里，液泡是细胞质荧光蛋白被排除在外的区域，导致出现黑色的未标记孔（图5A）。使用ROI Tracker24等软件标记液泡，可以可视化液泡运动（图5A，B）和量化许多运动参数。例如，与PBS处理相比，用蔚蓝处理诱发胰腺炎后，小鼠胰腺中液泡的平均速度增加了约10%（0.37±0.07μm/min与0.41±0.09μm/min，p = 0.02）（图5C）。与PBS处理相比，蔚蓝处理还使亚细胞结构的平均转动频率增加了10%（2.3±0.3度/分钟与2.6±0.6度/分钟，p = 0.04）（图5F）。然而，蔚蓝处理和PBS处理之间的净速度、方向性或累积行进距离没有显着差异（p>0.05）（图5D，E和图5G）。图像是在定制的多光子显微镜24 上生成的，以 880 nm 的波长照明并获得 z 堆叠 t 延移（FOV 尺寸 = 340 x 340 μm，像素尺寸 0.67 μm），帧间间隔为 2.9 分钟，11 个切片，步长为 2 μm，~1 片/秒。
最后，SWIP能够可视化和捕获肿瘤细胞迁移。图6A显示了延时电影（补充视频S1和补充视频S2）的静止图像，该视频显示了原位注射的Dendra-2标记的KPC肿瘤细胞在胰腺内的迁移。可以在短时间内（<1小时）观察到簇中细胞的集体迁移（图6B和补充视频S1）和单细胞迁移（图6C和补充视频S2）。 图像是在定制的多光子显微镜24 上生成的，在 880 nm 下照明，并获得 4 x 4 马赛克-z 堆叠 t 误差，瓷砖之间重叠 20%（瓷砖尺寸 = 340 x 340 μm），帧之间 3.4 分钟，3 个切片，步长为 5 μm，~1 片/秒。选择激光功率和 PMT 增益是为了最大限度地提高信号，同时最大限度地减少光漂白和光损伤。
图 1：SWIP 提高了成像的稳定性。 （A） 通过 SWIP 成像的胰腺延时电影的前 72 分钟内的剧照。可以观察到一些轴向漂移，但横向漂移很小。比例尺 = 50 μm。 （B） 72 分钟后继续延时成像显示出高水平的轴向和横向稳定性。（甲，乙）红色 = 155 kDa 四甲基罗丹明葡聚糖标记的血清，青色 = CFP 标记的胰腺细胞（MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP 转基因小鼠）（C-E） （C） AIW、（D） PIW 和 （E） SWIP 成像第一个小时内每个胰腺成像窗口的横向稳定性比较。（F-H）在随后的 150 分钟内比较 （F） AIW、（G） PIW 和 （H） SWIP 的每个胰腺成像的横向稳定性。插图是相应绘图的放大视图。（I-K）比较 （I） AIW、（J） PIW 和 （K） SWIP 成像前 120 分钟每个胰腺成像窗口的轴向稳定性。该图来自 Du et al. Open Biology 2022， DOI：10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273。15.缩写：SWIP = 用于胰腺活体成像的稳定窗口;AIW = 腹部影像学窗口;PIW = 胰腺成像窗口;CFP = 青色荧光蛋白。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：胰腺导管腺癌细胞 （KPC） 原位注射的手术方案概述 。 （A） 如何握住手术钳的图示。（B） 如何握住卡斯特罗维霍剪刀的插图。（C） 如何握住真空拾取工具的图示。（D） 对皮肤进行消毒。（E） 皮肤切口。（F） 肌肉切口。（G） 张开的胰腺。（H） 将针头插入所需的注射部位。（I） 注射癌细胞悬液，形成气泡（蓝色箭头）。（J） 胰腺返回腹膜腔。（K，L）用间断的丝线缝合肌肉层。（男，北）用间断的丝线缝合皮肤。（O）氰基丙烯酸酯胶涂在切口上。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：用于胰腺成像的稳定窗手术方案概述 。 （A） 脾脏和附着胰腺的鉴定。（乙，三）皮肤和肌肉的圆形切口。A-C 中的红色虚线表示可以通过腹壁和皮肤看到的脾脏轮廓。（D，E）将十字绣篮的第一针放置并绑在肌肉层中（E，黄色箭头）。（F） 继续缝合到肌肉切口的另一侧，留下一条尾巴（白色箭头）。（G，H）第二针垂直于第一针，一端系好（黄色箭头），留下尾巴（白色箭头）。（I，J）将胰腺放入十字绣篮中。（K） 通过肌肉和皮肤的环向荷包绳缝合。（L） 窗框的植入。（M） 在窗框上涂胶。（N） 玻璃盖玻片的附着。（O） 十字绣的尾端收紧。（P） 完全植入的 SWIP。缩写：SWIP = 用于胰腺活体成像的稳定窗口。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：用于连续成像的显微制图，用于在光学窗口内重新定位相同的感兴趣区域。使用显微制图术对小鼠胰腺的单个区域进行活体成像，显示连续 2 天 （D1-D2） 内移动的同一小叶。黄色虚线勾勒出同一小叶的边界。实线突出显示了连续每天识别的相同血管（如管腔内存在红色标记的血清所证明的那样）。红色 = 155 kDa 四甲基罗丹明葡聚糖标记的血清，青色 = CFP 标记的胰腺细胞（MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP 转基因小鼠）（插图）带有划痕的 SWIP 图像，用于显微制图。在连续成像期间使用显微制图来重新定位感兴趣的区域是由窗口框架（插图）上的三条蚀刻线允许的。比例尺 = 50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：使用 SWIP 测量亚细胞分辨率和亚细胞动力学 。 （A）单细胞（黄色虚线轮廓）和亚细胞结构（如液泡）可以通过SWIP在小鼠胰腺中随时间推移而可视化。这些液泡的例子用黄色箭头表示。因此，SWIP允许随时间推移跟踪亚细胞结构（彩色轮廓和覆盖在荧光图像上的轨迹）。插图是黄色框区域的放大视图，显示了三个跟踪的液泡。比例尺 = 50 μm。 （B） 亚细胞结构的轨迹，例如细胞核和液泡（在 A 中突出显示），在坐标移动到原点后。红色虚线表示 1 小时 （3.46 μm） 内的平均净路径。（C）平均速度、（D）净路径、（E）方向性、（F）平均转弯频率和（G）累积距离的动态参数的量化。红色 = 155 kDa 四甲基罗丹明葡聚糖标记的血清，青色 = CFP 标记的胰腺细胞（MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP 转基因小鼠）。缩写：SWIP = 用于胰腺活体成像的稳定窗口;CFP = 青色荧光蛋白。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：使用 SWIP 捕获细胞迁移 。 （A） PDAC直立注射小鼠模型中胰腺延时活体成像电影的静止图像。（B） 来自补充视频 S1 的静止图像，显示了肿瘤细胞进行集体迁移的示例（黄色箭头）。（C） 来自补充视频 S2 的静止图像，显示了肿瘤细胞（黄色箭头）和巨噬细胞（红色箭头）的单细胞迁移示例。绿色 = Dendra2 标记的肿瘤细胞，蓝色 = CFP 标记的巨噬细胞，红色 = 155 kDa 四甲基罗丹明葡聚糖标记的血清。比例尺 = 50 μm （A）， 15 μm （B，C）。缩写：SWIP = 用于胰腺活体成像的稳定窗口;CFP = 青色荧光蛋白;PDAC = 胰腺癌。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充视频S1：延时活体成像电影，显示肿瘤细胞经历集体迁移，对应于 图6B。 绿色 = Dendra2 标记的肿瘤细胞，蓝色 = CFP 标记的巨噬细胞，红色 = 155 kDa 四甲基罗丹明葡聚糖标记的血清。 请点击这里下载此文件。
补充视频S2：延时活体成像电影，显示肿瘤细胞经历与 图6C相对应的单细胞迁移。 绿色 = Dendra2 标记的肿瘤细胞，蓝色 = CFP 标记的巨噬细胞，红色 = 155 kDa 四甲基罗丹明葡聚糖标记的血清。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
这里描述的SWIP协议通过利用十字绣篮技术提供了一种改进的胰腺组织稳定方法。早期的腹部成像窗口 （AIW） 能够对腹部内脏器官进行活体成像 （IVI），但不能充分限制胰腺等软组织的运动。作为回应，Park等人开发了一种胰腺成像窗口（PIW），该窗口包含一个水平金属架子，可以提高胰腺组织的稳定性，同时保持与玻璃盖玻片的接触。虽然这种方法提高了横向稳定性，但它限制了实体胰腺肿瘤的成像，因为它们的大小超出了架子和盖玻片之间的狭窄空间。SWIP通过用十字绣篮稳定胰腺，限制轴向和横向运动，同时还能够容纳大（≤10毫米）实体瘤来解决这个问题。
SWIP 与以前的成像窗口（如 AIW 和 PIW）的直接比较是在之前进行的15。如 图 1 所示，改编自 Du 等人 15，其中通过跟踪细胞解剖特征（如细胞核或血管）来量化横向和轴向位移。所有成像窗口在成像的第一个小时内都表现出需要一段时间的稳定。在此期间，与 SWIP 相比，AIW 和 PIW 观察到更高程度的横向移动。在 2 小时内，与 SWIP 相比，AIW 和 PIW 也观察到更大的轴向偏移。总体而言，SWIP的漂移水平最低，适用于长期成像（≤12小时）。
不幸的是，胰腺是一种高度散射的组织，因此，IVI中使用的多光子显微镜的点扩散功能随着渗透到组织中而迅速退化。因此，任何光学窗口的成像深度都限制在~30-60μm。 IVI还存在光致损坏样品的风险。这可以通过获取 100 张图像的时间序列并寻找光漂白或光损伤的迹象在成像会话开始时进行测试。在我们的显微镜系统上，我们发现可以在样品上使用~15 mW的最大功率，而不会对组织产生不利影响。
SWIP 协议允许在正常健康条件下以及胰腺炎和 PDAC 等疾病状态下对小鼠胰腺进行稳定、高分辨率的单细胞光学 IVI。这使得SWIP特别适用于长时间延时成像，以及通过捕获多个z切片（利用多光子和共聚焦显微镜固有的光学切片功能）来执行3D和4D（3D+时间）成像。通过实现单细胞及其与胰腺细胞成分相互作用的 体内 可视化，高分辨率 IVI 将被证明对于了解胰腺疾病的潜在机制非常宝贵。
执行 SWIP 协议需要一定程度的技术专长。但是，通过适当的练习和对关键步骤的关注，该程序可以以很高的成功率执行。要对恶性胰腺进行成像，首先要成功植入肿瘤。这是通过将小鼠胰腺癌细胞的悬浮液原位注射到小鼠的胰腺中获得的。当胰腺的薄壁组织膨胀成充满液体的气泡时，观察到成功的注射，并且之前已经详细描述了21。为了确保最大的成功和生存，细胞悬液的泄漏极少甚至没有，因为泄漏将大大减小潜在的肿瘤大小并导致癌变。此外，胰腺是一个高度血管化的器官，有许多分支血管。避免撕裂任何血管至关重要，因为这会导致胰腺出血和随后的血肿并抑制肿瘤生长。在该模型中，我们使用了源自 KPC 小鼠20 的同基因 PDAC 细胞系。这允许在免疫功能正常的小鼠中植入肿瘤。可以使用其他同基因PDAC细胞系，具体取决于所用小鼠的品系。也可以使用人PDAC细胞系;然而，小鼠品系必须免疫受损，以避免肿瘤植入的排斥反应。
在该方案中接受成像的肿瘤的大小可以根据需要进行修改。这可以通过使用更高浓度的癌细胞植入小鼠胰腺来获得更大的肿瘤或延长窗口植入前肿瘤的生长时间来实现。在这项研究中，我们注射了 106 个 KPC PDAC 细胞，并在 10-14 天后植入 SWIP，此时肿瘤可触及。该SWIP方案也可以通过将组织适当放置到十字绣篮中来容纳较小和较大的肿瘤。
成像窗口和胰腺的安全放置对于获得高质量成像和限制运动伪影也至关重要。正常的小鼠胰腺非常顺从，容易因呼吸和附近的蠕动而移动。为了解决这个问题并在成像时增加胰腺的稳定性，使用了先前描述的十字绣篮技术31。十字绣篮子旨在模仿身体对韧带的使用。通过将组织固定在玻璃盖玻片上并施加恒定的轴向压力，它可以防止横向和轴向运动。在处理较大的实体瘤时，可以修改十字绣的支撑点和方向，以最好地适应肿瘤的大小和位置，以获得最佳支撑。
当窗框未充分植入小鼠腹部时，也可能发生次优成像。安装松散的窗框会导致成像困难和运动伪影。适当的钱包缝合线可以通过皮肤和腹壁将窗框固定到腹部来解决这个问题。为避免在收紧钱包绳时过度折叠皮肤，距离组织边缘不超过 5 毫米的步骤之间的缝合步骤不应大于 1 毫米，以确保紧贴窗框。在荷包绳缝合、将胰腺放入十字绣篮中并植入窗框之后，最后一个关键步骤是在窗框的凹槽内放置粘合剂。至关重要的是，在此步骤中，不要粘合剂接触胰腺组织，因为这会损坏组织并混淆成像。一种潜在的修改也可以防止胶水接触胰腺组织，方法是将玻璃盖玻片粘在窗框上，并在手术植入腹部之前让两者干燥。
与所有活体成像技术一样，SWIP在揭示组织中未明确标记的其他细胞和结构信息的能力方面存在局限性。然而，将SWIP窗口与荧光报告基因（如本研究中表达ECFP的上皮细胞和Dendra2标记的KPC细胞）相结合，并使用药理学和/或光遗传学工具控制蛋白质或细胞状态可以消除这些限制。
此外，SWIP窗口设计包括窗口框上的三条蚀刻线，用作微制图的基准标记，以在连续成像30期间重新定位感兴趣的区域。这样可以多次定位相同的视野，即使在未标记的组织中也是如此。
综上所述，SWIP可用于正常健康的胰腺组织以及胰腺炎和PDAC等良恶性胰腺疾病。使用SWIP可以在这些状态下捕获单细胞和亚细胞动力学，并可以帮助研究人员了解重要的生理事件，例如PDAC中的转移播散。IVI质量和稳定性的提高有可能为胰腺的病理生理学和细胞生物学提供有价值的见解，使其成为一种有前途和有益的工具。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
Evelyn Lipper 慈善基金会、Gruss-Lipper 生物光子学中心、癌症研究综合成像计划、NIH T-32 奖学金 （CA200561） 和国防部胰腺癌研究计划 （PCARP） 资助PA210223P1。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
| 5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
| 28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
| Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
| Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
| Cyano acrylate - Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
| Cyano acrylate - Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
| DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
| Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
| Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
| Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
| Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
| Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
| Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |
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