Summary
우리는 쥐 췌장의 세포 내 해상도 이미징을 위한 안정화된 유치 광학 창의 외과적 이식을 위한 프로토콜을 제시하여 건강한 췌장과 병든 췌장에 대한 연속 및 종단 연구를 가능하게 합니다.
Abstract
췌장의 생리학과 병태생리학은 복잡합니다. 췌장염 및 췌장 선암(PDAC)과 같은 췌장 질환은 이환율과 사망률이 높습니다. 생체 내 영상(IVI)은 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 조직의 고해상도 이미징을 가능하게 하는 강력한 기술로, 세포 역학을 실시간으로 관찰할 수 있습니다. 쥐 췌장의 IVI는 장기의 깊은 내장 및 순응적 특성으로 인해 손상과 움직임 인공물이 발생하기 쉽기 때문에 심각한 문제를 안고 있습니다.
여기에 설명된 것은 쥐 P안장(SWIP)의 Intravital 이미징을 위한 Stabilized Window의 이식 과정입니다. SWIP는 건강한 췌장에서 세룰레인에 의해 유발된 급성 췌장염으로 변하는 동안, 그리고 췌장 종양과 같은 악성 상태에서 쥐 췌장의 IVI를 허용합니다. SWIP는 유전적으로 표지된 세포 또는 형광 염료 투여와 함께 단일 세포 및 세포 내 역학(단일 세포 및 집단 이동 포함)을 측정할 수 있을 뿐만 아니라 여러 날에 걸쳐 동일한 관심 영역의 연속 이미징을 가능하게 합니다.
PDAC에서 암 관련 사망률의 주요 원인은 압도적인 전이성 부담이기 때문에 종양 세포 이동을 포착하는 능력이 특히 중요합니다. PDAC에서 전이의 생리학적 역학을 이해하는 것은 중요한 미충족 요구이며 환자 예후를 개선하는 데 매우 중요합니다. 전반적으로 SWIP는 향상된 영상 안정성을 제공하고 건강한 췌장 및 악성 췌장 질환에서 IVI의 적용을 확대합니다.
Introduction
양성 및 악성 췌장 질환은 잠재적으로 생명을 위협할 수 있으며, 병태생리학에 대한 이해에 상당한 격차가 있습니다. 췌장염(췌장 염증)은 미국에서 위장 질환 관련 입원 및 재입원의 세 번째 주요 원인이며 상당한 이환율, 사망률 및 사회경제적 부담과 관련이 있다1. 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인으로 꼽히는췌관 선암(PDAC)은 대부분의 췌관 악성 종양3을차지하며3 5년 생존율이 11%에 불과하다2. PDAC에서 암 관련 사망률의 주요 원인은 압도적인 전이성 부담입니다. 불행히도 대부분의 환자는 전이성 질환을 가지고 있습니다. 따라서 PDAC에서 전이의 역학을 이해하는 것은 암 연구 분야에서 중요한 미충족 요구입니다.
염증과 췌장의 전이성 연쇄 작용을 뒷받침하는 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 이러한 지식 격차의 주요 원인은 생체 내에서 췌장 세포 역학을 관찰할 수 없다는 것입니다. 이러한 세포 역학을 직접 관찰하면 췌장 질환 환자의 진단 및 치료를 활용하고 개선할 수 있는 중요한 표적을 밝힐 수 있습니다.
생체 내 영상(IVI)은 연구원들이 살아있는 동물의 생물학적 과정을 실시간으로 시각화하고 연구할 수 있는 현미경 기술입니다. IVI는 생체 내 및 해당 생물학적 과정의 기본 환경 내에서 세포 내 및 미세환경 역학을 고해상도로 직접 시각화할 수 있습니다. 따라서 IVI는 건강한 과정과 병리학적 과정에 대한 생체 내 관찰을 허용한다.
MRI, PET, CT와 같은 현대의 전신 영상 기법은 전체 장기를 잘 볼 수 있으며 임상 증상이 나타나기 전에도 병리를 밝힐 수 있다4. 그러나 그들은 단일 세포 분해능을 얻거나 질병-췌장염 또는 악성 종양의 초기 단계를 밝힐 수 없습니다.
이전 연구에서는 단세포 분해능 IVI를 사용하여 피부 5,6, 유방7, 폐8, 간 9, 뇌10, 췌장 종양11의 양성 및 악성 질환을 관찰하여 질병 진행 기전을 규명했다12. 그러나 쥐 췌장은 IVI를 사용하여 단세포 분해능을 달성하는 데 상당한 장애물이 되는데, 이는 주로 깊은 내장 위치와 높은 순응도로 인해 발생합니다. 더욱이 장간막은 장간막 내에서 비장, 소장, 위와 연결되는 분지화되어 확산되어 분포된 기관으로 접근하기 어렵습니다. 조직은 또한 인접한 연동 운동과 호흡으로 인한 움직임에 매우 민감합니다. 췌장의 움직임을 최소화하는 것은 단일 세포 해상도 현미경 검사에 필수적인데, 몇 미크론의 움직임 아티팩트도 이미지를 흐리게 하고 왜곡할 수 있어 개별 세포의 역학을 추적하는 것이 불가능하기 때문입니다13.
IVI를 시행하기 위해서는 복부 영상창(AIW)을 외과적으로 이식해야 한다 9,11. AIW를 외과적으로 이식하기 위해 금속 창틀을 복벽에 봉합합니다. 그 후, 관심 기관은 시아 노 아크릴레이트 접착제를 사용하여 프레임에 부착됩니다. 일부 경직된 내부 장기(예: 간, 비장, 경직 종양)에는 이것으로 충분하지만, 건강한 쥐 췌장을 이미징하려는 시도는 조직의 순응적인 질감과 복잡한 구조로 인해 차선의 측면 및 축 안정성으로 인해 손상됩니다14. 이러한 한계를 해결하기 위해 Park 등[14]은 건강한 췌장을 위해 특별히 설계된 이미징 창을 개발했습니다. 이 췌장 영상 창(PIW)은 커버슬립 바로 아래의 창틀 내에 수평 금속 선반을 통합하여 조직을 안정화하고 커버 유리와의 접촉을 유지함으로써 장 운동과 호흡의 영향을 최소화합니다. PIW는 향상된 측면 안정성을 제공하지만, 이 창은 여전히 축 방향 드리프트를 나타내며 금속 선반과 커버슬립 사이의 좁은 간격으로 인해 큰 고형 종양의 이미징을 추가로 방지한다는 것을 발견했습니다15.
이러한 한계를 해결하기 위해 건강한 췌장과 병든 췌장 모두에 대한 안정적인 장기 이미징을 달성할 수 있는 이식형 이미징 창인 SWIP( Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas)를 개발했습니다(그림 1)15. 여기에서는 SWIP를 이식하는 데 사용되는 수술 절차에 대한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다. 주요 목적은 전이와 관련된 동적 메커니즘을 연구하는 것이었지만 이 방법은 췌장 생물학 및 병리학의 다양한 측면을 탐구하는 데에도 사용할 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 사전 승인을 포함하여 척추동물 사용에 대한 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 창문의 패시베이션
알림: 스테인리스강의 패시베이션은 금속의 오염 물질을 청소하고 얇은 산화물 층을 생성하여 티타늄16을 능가하는 연조직과의 금속의 생체 적합성을 크게 증가시킵니다.
- 광학 창틀을 1%(w/v) 효소 활성 세제 용액으로 세척하여 패시베이션 과정을 시작합니다.
- 유리병 안에 70°C의 5%(w/v) 수산화나트륨 용액에 프레임을 30분 동안 담그십시오.
- 프레임을 꺼내 탈이온수로 헹굽니다.
- 프레임을 55°C의 7%(w/v) 구연산 용액에 새 유리병 안에 10분 동안 담그십시오.
- 프레임을 제거하고 탈이온수로 다시 헹굽니다.
- 1.2단계를 반복하고 마지막으로 마지막으로 탈이온수로 창틀을 헹굽니다.
2. 종양 이식 또는 창문 수술을 위한 준비
참고: 췌장 종양 연구의 경우 종양 세포를 이식하고 명백한 종양으로 자라도록 해야 합니다. 생체 내에서 종양 세포를 시각화하려면 Dendra2와 같은 형광 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 밝은 형광 단백질 라벨을 사용하면 조직 자가형광과 관련된 잠재적인 문제를 완화할 수 있습니다. 사용될 수 있는 다른 잠재적인 형광 단백질, 염료, 및 유전적으로 인코딩된 형광 마우스 모델은 다른 곳에서 논의되었다17,18. 수술 부위의 오염을 방지하려면 후드 또는 층류 캐비닛에서 수술 절차를 수행하고 준비, 수술 및 회복을 위해 별도의 영역이 사용되는지 확인하십시오.
- 수술 전에 모든 수술 기구를 오토클레이브에서 멸균하고 필요한 경우 후속 절차를 위해 핫 비드 멸균기를 사용하십시오. 수술이 팁만 사용하는 기술을 사용하는지 확인하십시오.
- 가열된 수술용 패드와 비드 멸균기의 전원을 켜고 적절한 작동 온도에 도달할 때까지 기다립니다. 가열 패드 온도는 잠재적인 화상을 방지하기 위해 표면 온도계로 모니터링해야 합니다. 온도를 적절하게 제어할 수 없는 경우 가열 패드 위에 멸균 천을 놓습니다.
알림: 종양 및 창문 이식과 같은 짧은 절차(≤20분) 중 체온은 가열된 수술 패드를 사용하는 동안 최소한의 영향을 받습니다. 그러나 장시간 타임랩스 이미징과 같이 더 오랜 기간 동안 마취하려면 체온을 유지하기 위해 마우스를 가열된 챔버에 넣어야 합니다. - 마취실에서 5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다.
- 중요 단계: 마우스가 의식을 잃으면 마취를 2%로 낮춥니다. 마취 수준과 쥐의 바이탈을 주의 깊게 모니터링합니다(예: 맥박 산소 측정기 사용)19.
- 각막 건조를 방지하기 위해 쥐의 각 눈에 눈 윤활제를 소량 떨어뜨립니다.
- 수술 전 왼쪽 상복부에 제모 크림을 넉넉하게 발라 제모를 제거합니다. 20초 후 물에 적신 티슈를 사용하여 모발과 제모 크림을 단단히 닦아냅니다. 수술 부위에서 모든 머리카락이 제거될 때까지 필요에 따라 이 과정을 반복합니다.
- 수술 전 진통을 위해 PBS 90μL에 희석한 부프레노르핀 10μL(0.1mg/kg)를 피하 주사합니다.
3. 췌장 종양 이식
- 원하는 농도로 종양 세포의 부분 표본을 준비합니다(종양 세포 배가시간 기준). 세포 현탁액을 인슐린 주사기에 넣고 얼음 위에 보관합니다. 이 프로토콜을 따르기 위해, Erstad et al.21에서 채택된 orthotopic 주입 프로토콜에 따라 최대 50μL의 PBS에 현탁된 106개의 syngeneic KPC 종양 세포20을 사용합니다
참고: 이 농도로 주입된 이 세포주는 10-14일까지 만져질 수 있거나 적절하게 큰 종양을 일상적으로 생성했습니다. 이 세포주 및 다른 췌장 세포주의 서브클론은 적절한 크기의 종양을 생성하기 위해 적절한 농도와 타임라인에 대해 평가되어야 합니다. - 소독 비누를 사용하여 손을 씻으십시오.
- 새로운 수술을 받기 전에 새로운 멸균 장갑을 착용하십시오.
- 마우스를 멸균 수술 후드로 옮기고 부분적인 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다.
- 종이 테이프로 팔다리를 고정합니다.
알림: 절차 전반에 걸쳐 기기를 올바르게 사용하는 것이 중요합니다. 집게, Castroviejo 가위 및 진공 픽업 도구를 잡는 방법의 파일은 그림 2A-C에 나와 있습니다. - 소독제로 복부를 소독합니다(그림 2D).
- 발가락 꼬집기 테스트를 수행하여 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
- 집게와 Castroviejo 가위를 사용하여 피부에 10-15mm의 왼쪽 늑골 밑 절개를 만듭니다(그림 2E).
- 필요하다고 판단되는 경우 면봉이나 소작 펜을 사용하여 지혈을 조절합니다.
- 집게와 Castroviejo 가위로 아래 근육을 조심스럽게 나누어 복막에 들어갑니다(그림 2F).
- 멸균 면봉을 사용하여 췌장과 비장을 비외상적으로 외부화합니다.
- 주름이 생기지 않도록 췌장을 벌립니다(그림 2G).
- 췌장의 몸 또는 꼬리(혈관에서 멀어짐)에서 원하는 종양 주사 부위를 식별합니다.
- 중요한 단계: 췌장을 조심스럽게 배치한 후 겸자를 사용하여 조직에 장력을 가하고 경사가 위쪽을 향하도록 인슐린 주사기 팁을 췌장의 원하는 부위에 4-5mm 깊이로 삽입합니다(그림 2H).
- 종양 세포 용액을 천천히 주입합니다. 성공적인 주입을 확인하는 작은 기포를 찾습니다(그림 2I).
- 종양 세포 주입 기포를 건드리지 않고 조심스럽게 췌장을 복부로 되돌립니다(그림 2J).
- 흡수성 5-0 폴리디옥사논 봉합사를 사용하여 먼저 근육층을 닫은 다음 단속된 봉합사로 피부를 닫습니다(그림 2K-N).
- 절개 부위를 시아노아크릴레이트 접착제로 덮은 다음(그림 2O) 회복을 위해 가열 램프 아래의 깨끗한 케이지에 마우스를 다시 넣습니다. 감염을 예방하기 위해 식수에 항생제를 투여하십시오. 쥐를 모니터링하고 수술 후 완전히 회복할 수 있도록 합니다.
알림: 항생제는 IACUC 프로토콜에서 요구하는 대로 투여됩니다. 모든 동물은 개별적으로 수용됩니다. - 종양이 복벽을 통해 만져질 수 있을 때까지 10-14일 동안 종양이 자라도록 두십시오.
4. 췌장 창 수술
- 동물이 이미징할 준비가 되면 창문 이식 수술을 시작합니다. 먼저 소독 비누로 손을 씻으십시오.
- 새로운 수술을 받기 전에 새 멸균 장갑을 착용하십시오.
- 가열된 수술용 스탠드에서 마우스를 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓아 왼쪽 복부를 노출시킵니다.
- 종이 테이프를 사용하여 쥐의 앞다리와 뒷다리를 가열된 수술 단계에 두개골과 꼬리로 고정합니다. 비장(피부 아래)이 수술 필드 내에서 보이는지 확인합니다(그림 3A).
- 멸균 상태를 유지하려면 후드에 있는 모든 수술 기구의 포장을 풉니다.
- 소독약을 넉넉하게 바르고 쥐의 피부를 면봉으로 닦아 수술 부위를 소독합니다.
- 발가락 꼬집기 테스트를 수행하여 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
- 임계 단계: 집게로 복부 왼쪽 상부 사분면의 피부를 들어 올리고 Castroviejo 가위를 사용하여 피부와 근육계를 ~10mm 원형으로 절개합니다(그림 3B,C).
- 출혈을 조절하고 필요한 경우 면봉이나 소작기를 사용하여 지혈을 유지합니다.
- 비장에 부착된 췌장의 위치를 파악하고 절개 부위 내에서 췌장이 놓여 있는 방향을 식별하여 지지 십자수를 배치해야 하는 위치를 결정합니다.
- 5-0 실크 봉합사를 사용하여 첫 번째 스티치를 근육층의 원하는 위치에 놓습니다. 이 끝을 3-5 노트로 묶습니다. (그림 3D,E)
- 절개 부위를 직접 꿰매십시오. ~ 5cm의 꼬리를 자르고 남겨 둡니다 (그림 3F).
- 첫 번째 스티치에 수직으로 4.11 및 4.12 단계를 반복합니다 (그림 3G, H).
- 중요 단계: 췌장을 부드럽게 들어 올려 십자수 위에 놓습니다(그림 3I,J). 조작 중에 췌장이 손상되지 않도록 주의하십시오.
- 중요한 단계: 5-0 실크 봉합사를 사용하여 구멍에서 ~1mm 떨어진 곳에서 피부와 근육층을 원주형으로 꿰매는 지갑 끈 스티치를 수행합니다(그림 3K).
- 원형 절개의 가장자리가 창의 홈 안에 안착되도록 창틀을 배치합니다(그림 3L).
- 이식 된 창을 5-0 실크로 단단히 묶어 고정하십시오.
- 100μL의 액체 시아노아크릴레이트 접착제를 1mL 주사기에 넣습니다.
- ~10초 동안 섬세한 압축 공기 흐름을 적용하여 조직을 건조시킵니다.
- 창틀의 바깥쪽 가장자리를 집게로 잡고 부드럽게 들어 올려 창틀 밑면에서 췌장이 분리되도록 합니다.
- 중요한 단계: 창의 홈을 따라 액체 시아노아크릴레이트 접착제를 얇게 디스펜싱합니다(그림 3M). 췌장 조직에 접착제가 묻지 않도록 하십시오.
- 진공 픽업을 사용하여 5mm 커버슬립을 들어 올립니다.
- 광학 창틀 중앙의 홈에 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다. 시아노아크릴레이트 접착제가 굳을 수 있도록 가벼운 압력으로 유지합니다(~25초).
- 집게를 사용하여 진공 픽업에서 커버슬립을 분리합니다.
- 십자수 봉합사를 조여 췌장을 커버슬립에 꼭 맞게 고정합니다(그림 3N,O). 참고 : 십자수는 췌장에 손상과 허혈을 일으킬 수 있으므로 너무 세게 조이지 마십시오.
- 봉합사의 끝을 자릅니다.
- 마우스에서 테이프를 벗겨냅니다.
- 이소플루란 기화기를 끕니다.
- 마우스를 깨끗한 케이지로 옮기거나 생체 내 현미경으로 직접 옮깁니다.
- 창문 수술 후 동물을 개별적으로 수용하고 완전히 회복될 때까지 모니터링하십시오.
- 그런 다음 이미징은 이전에 설명한 대로 22,23,24 긴 이미징 세션의 경우 마우스를 가열된 챔버에 넣어 체온을 유지하고 IACUC 표준에 따라 보조 유체를 제공합니다.
5. 췌장염 유도를 위한 세룰레인 치료
- 췌장염의 발병을 조사하려면 SWIP를 이식한 후 건강한 쥐에게 세룰레인을 투여합니다. 쥐가 14-18 시간 동안 금식되고 세룰레인 투여 전에 ad libitum 물을 주는지 확인하십시오.
- 멸균 1x DPBS 100μL에 세룰레인 50μg/kg을 1시간 간격으로 복강내로 최대 8회 주입합니다. 동일한 부피의 1x DPBS만 투여하고 복강내로 주사하여 대조군 마우스에 투여합니다.
- 이미징 후 IACUC 표준에 따라 자궁 경부 탈구에 의한 첫 번째 주사 후 24시간 후에 마우스를 희생합니다.
- 앞서 설명한 대로 22,23,24에서 2레이저 다광자 현미경에서 이미징을 수행합니다. 긴 이미징 세션의 경우 마우스를 가열된 챔버에 넣어 체온을 유지하고 IACUC 표준에 따라 보조 유체를 제공합니다.
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Representative Results
그림 1은 Du et al.15에서 발췌한 것으로, 쥐 췌장의 IVI 타임랩스 동영상의 이미지 스틸을 보여줍니다. 일부 조직 움직임은 초기 안정화 기간(이미징 첫 시간, 그림 1A) 내에 관찰할 수 있습니다. 그러나 이 안정화 기간(>75분) 이후에도 이미징을 계속하면 측면 및 축 안정성이 증가하는 것을 관찰할 수 있습니다(그림 1B). SWIP의 안정성을 이전 AIW 및 PIW 이미징 창과 비교하면 모든 창에 초기 정착 기간이 필요하다는 것을 알 수 있습니다. 그러나 SWIP는 전반적으로 가장 낮은 수준의 드리프트를 나타내며 장기 이미징에 가장 적합합니다(그림 1C-K). 이미지는 880nm에서 조명하고 프레임 간 1.7분, 2μm 단계 크기의 11개 슬라이스, 20개의 이미징 깊이 및 ~1개의 슬라이스/s를 획득하는 맞춤형 다광자 현미경24에서 생성되었습니다. 레이저 출력과 광전자 증배관(PMT) 게인은 광표백과 광손상을 최소화하면서 신호를 최대화하기 위해 선택되었습니다.
췌장 종양 이식 및 후속 췌장 창 삽입을 설명하는 수술 절차의 단계는 각각 그림 2 및 그림 3에 설명되어 있습니다. 중요한 것은 두 수술 모두 생존 수술이라는 것입니다. 올바르게 이식되면 췌장은 이제 복벽 내에 통합된 광학 창에 부착된 상태로 유지됩니다. 이를 통해 마우스의 편안한 생존이 가능하며 프로토콜에서 허용하는 대로 최대 12시간 동안 연속 이미징이 가능합니다. 또한 연속 이미징을 여러 연속(최대 2주의 프로토콜 허용치)에 걸쳐 수행하여 시간 경과에 따른 관심 영역을 모니터링할 수 있습니다. 생체 내 영상(IVI)은 앞서 설명한 다른 창과 유사한 방식으로 창을 통해 수행될 수있다 22,25,26.
SWIP는 세룰레인을 사용하여 유발된 급성 췌장염 발병 시 역학을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 세룰레인(Cerulein)은 콜레시스토키닌(cholecystokinin, CKK)과 유사한 구조와 기능을 가진 올리고펩타이드(oligopeptide)이며, 설치류에서 급성 췌장염을 실험적으로 유발하는 데 널리 사용된다27. 세룰레인을 이용한 치료는 위장관의 평활근 수축을 일으켜 위와 췌장 분비물을 자극한다28. 또한, 세룰레인의 복강내 투여는 췌장 부종과 비대를 유발한다29.
그림 4는 SWIP 프로토콜을 사용하여 세룰레인 처리 후 쥐 췌장의 연속 이미징을 보여줍니다. 쥐 췌장은 유전자 형광 표지(ECFP 표지 상피-MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP 형질전환 마우스) 및 고분자량 염료(155kD dextran-TMR)의 투여를 사용하여 단일 세포 해상도로 시각화하여 노란색 실선으로 표시된 국소 혈관 조직을 정의합니다. 이전에 쥐 폐 영상(murine lung imaging)8에 사용되었던 창 디자인은 프레임(그림 4, 삽입물) 상에 3개의 에칭된 선들을 포함하며, 이는 마이크로카토그래피(microcartography)(30)의 사용을 가능하게 하는 기준 마커(fiducial marker)로서 작용한다. Microcartography는 여러 날에 걸쳐 쥐 췌장의 동일한 관심 영역을 연속적으로 이미징할 수 있습니다. 여기에서 췌장의 동일한 소엽(노란색 점선)은 1일차에 시각화되고 2일차에 재편재화되며, 이는 동일한 국소 혈관의 존재에 의해 입증됩니다(그림 4). 이미지는 880nm 조명에서 촬영한 ~1 slice/s에서 11개의 슬라이스 및 2μm 단계 크기의 단일 z-스택으로 매일 획득했으며 0.67μm/픽셀(FOV = 340 x 340μm)의 해상도로 촬영했습니다. 레이저 출력과 PMT 이득은 광표백과 광손상을 최소화하면서 신호를 최대화하기 위해 선택되었습니다.
연속 이미징 외에도 SWIP는 장기 종방향 이미징에 매우 적합하며, 제어 및 처리 조건에서 세포 내 구조(예: 액포)의 역학을 정확하게 추적하고 측정할 수 있습니다. 여기서 액포는 세포질 형광 단백질이 배제되어 표지되지 않은 어두운 구멍이 나타나는 영역입니다(그림 5A). ROI Tracker24와 같은 소프트웨어를 사용하여 액포를 마킹하면 액포 운동성을 시각화하고(그림 5A,B) 수많은 운동성 매개변수를 정량화할 수 있습니다. 예를 들어, 췌장염을 유발하기 위해 세룰레인으로 처리한 후 쥐 췌장에서 액포의 평균 속도는 PBS 치료에 비해 약 10% 증가했습니다(0.37 ± 0.07μm/min 대 0.41 ± 0.09μm/min, p = 0.02)(그림 5C). 세룰레인 처리는 또한 PBS 처리에 비해 세포 내 구조의 평균 회전 빈도를 10% 증가시켰습니다(2.3 ± 0.3deg/min 대 2.6 ± 0.6deg/min, p = 0.04)(그림 5F). 그러나, 세룰레인 처리와 PBS 처리 사이의 순 속도, 방향성 또는 누적 이동 거리에는 유의한 차이(p > 0.05)가 없었다(그림 5D, E 및 그림 5G). 이미지는 880nm에서 조명하고 프레임 간 2.9분, 2μm 단계 크기의 슬라이스 11개 및 ~1슬라이스/s로 z stack-t lapse(FOV 크기 = 340 x 340μm, 픽셀 크기 0.67μm)를 획득하는 맞춤형 다광자 현미경(24)에서 생성되었습니다.
마지막으로, SWIP를 사용하면 종양 세포 이동을 시각화하고 캡처할 수 있습니다. 그림 6A는 정형외과 주사를 맞은 Dendra-2 표지된 KPC 종양 세포의 췌장 내 이동을 담은 타임랩스 동영상(Supplemental Video S1 및 Supplemental Video S2)의 스틸을 보여줍니다. 클러스터에서 세포의 집단 이동(그림 6B 및 보충 비디오 S1)과 단일 세포 이동(그림 6C 및 보충 비디오 S2)은 짧은 기간(<1시간)에 걸쳐 관찰할 수 있습니다. 이미지는 880nm에서 조명하고 타일 간 20% 중첩(타일 크기 = 340 x 340μm), 프레임 간 3.4분, 5μm 단계 크기의 슬라이스 3개, ~1슬라이스/s로 4 x 4 모자이크-z 스택-t 랩스를 획득하는 맞춤형 다광자 현미경(24)에서 생성되었습니다. 레이저 출력과 PMT 이득은 광표백과 광손상을 최소화하면서 신호를 최대화하기 위해 선택되었습니다.
그림 1: SWIP로 인한 이미징 안정성 향상. (A) SWIP를 통해 촬영한 췌장의 타임랩스 동영상의 처음 72분 이내의 스틸. 일부 축 방향 드리프트는 관찰할 수 있지만 측면 드리프트는 거의 관찰할 수 없습니다. 스케일 바 = 50 μm. (B) 72분 후에도 계속된 타임랩스 이미징은 높은 수준의 축 및 측면 안정성을 보여줍니다. (ᅡ,ᄂ) 적색 = 155kDa 테트라메틸로다민 덱스트란 표지 혈청, 청록색 = CFP 표지 췌장 세포(MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP 형질전환 마우스) (C-E) (C) AIW, (D) PIW 및 (E) SWIP에 대한 이미징의 첫 번째 시간 동안 각 췌장 이미징 창의 측면 안정성 비교. (FH) (F) AIW, (G) PIW 및 (H) SWIP에 대한 후속 150분 동안 각 췌장 영상의 측면 안정성 비교. 삽입은 해당 플롯의 확대된 보기입니다. (I-K) (I) AIW, (J) PIW 및 (K) SWIP에 대한 이미징의 처음 120분 동안 각 췌장 이미징 창의 축 안정성 비교. 이 수치는 Du et al. Open Biology 2022, DOI:10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273에서 발췌한 것입니다. 15. 약어: SWIP = 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창; AIW = 복부 영상 창; PIW = 췌장 영상 창; CFP = 청록색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 췌관 선암 세포(KPC)의 정형외과 주사 수술 프로토콜 개요. (A) 수술용 겸자를 잡는 방법의 그림. (B) Castroviejo 가위를 잡는 방법의 그림. (C) 진공 픽업 도구를 잡는 방법에 대한 그림. (D) 피부 살균. (E) 피부 절개. (F) 근육 절개. (G) 췌장이 펼쳐져 있습니다. (H) 원하는 주사 부위에 바늘을 삽입합니다. (I) 암세포 현탁액을 주입하여 기포(파란색 화살표)를 생성합니다. (J) 췌장이 복막강으로 돌아왔다. (케이, 엘) 중단된 실크 봉합사로 근육층을 닫습니다. (엠,N) 중단된 실크 봉합사로 피부를 닫습니다. (O) 절개부에 적용된 시아노아크릴레이트 접착제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 췌장 이미징을 위한 안정화된 창의 수술 프로토콜 개요 . (A) 비장과 부착된 췌장의 식별. (나,씨) 피부와 근육을 원형으로 절개합니다. A-C의 빨간색 점선은 복벽과 피부를 통해 볼 수 있는 비장의 윤곽을 나타냅니다. (디,이) 십자수 바구니의 첫 번째 스티치를 근육 층에 배치하고 묶습니다 (E, 노란색 화살표). (F) 근육 절개 부위의 반대쪽까지 스티치를 계속하여 꼬리 (흰색 화살표)를 남깁니다. (지,H) 두 번째 스티치는 첫 번째 스티치에 수직으로 배치되어 한쪽 끝(노란색 화살표)에 묶여 꼬리(흰색 화살표)를 남깁니다. (나,J) 십자수 바구니에 췌장 배치. (K) 근육과 피부를 통한 원주 지갑 끈 봉합. (L) 창틀의 이식. (M) 창틀에 접착제 도포. (N) 유리 커버슬립의 부착. (O) 십자수의 꼬리 끝이 조여졌습니다. (P) 완전히 이식된 SWIP. 약어: SWIP = 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 광학 창 내에서 동일한 관심 영역을 재편소화하기 위해 연속 이미징에 사용되는 Microcartography. 쥐 췌장의 단일 부위에 대한 생체 내 이미징, 마이크로 지도 제작을 사용하여 연속 2일(D1-D2)에 걸쳐 재배치된 동일한 소엽을 보여줍니다. 노란색 점선은 동일한 소엽의 경계를 나타냅니다. 실선은 동일한 혈관(내강 내에 빨간색으로 표시된 혈액 혈청의 존재로 입증됨)을 강조 표시합니다. 빨간색 = 155kDa 테트라메틸로다민 덱스트란 표지 혈청, 청록색 = CFP 표지 췌장 세포(MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP 형질전환 마우스)(삽입) 마이크로지도 제작을 위한 스크래치가 있는 SWIP 이미지. 연속 이미징 중에 관심 영역을 재배치하기 위해 마이크로 지도 제작을 사용하는 것은 창틀(삽입물)에 있는 세 개의 에칭된 선에 의해 허용됩니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: SWIP를 사용한 세포 내 분해능 및 세포 내 역학 측정. (A) 단일 세포(노란색 점선 윤곽선) 및 액포와 같은 세포 내 구조는 쥐 췌장에서 시간이 지남에 따라 SWIP를 통해 시각화할 수 있습니다. 이러한 액포의 예는 노란색 화살표로 표시됩니다. 따라서 SWIP를 사용하면 시간 경과에 따른 세포 내 구조(형광 이미지에 겹쳐진 컬러 윤곽선 및 트랙)를 추적할 수 있습니다. 삽입은 추적된 3개의 액포를 보여주는 노란색 상자 영역의 확대 보기입니다. 척도 막대 = 50 μm. (B) 원점으로 좌표를 이동한 후의 핵 및 액포(A에서 강조 표시)와 같은 세포 내 구조의 궤적. 빨간색 점선은 1시간(3.46μm)의 평균 순 경로를 나타냅니다. (C) 평균 속도, (D) 순 경로, (E) 방향성, (F) 평균 회전 빈도 및 (G) 누적 거리의 동적 매개변수를 정량화합니다. 적색 = 155kDa 테트라메틸로다민 덱스트란 표지 혈청, 청록색 = CFP 표지 췌장 세포(MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP 형질전환 마우스). 약어: SWIP = 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창; CFP = 청록색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: SWIP를 사용한 세포 이동 캡처 . (A) PDAC의 정형외피소적으로 주입된 마우스 모델에서 췌장의 타임랩스 생체 내 이미징 동영상의 정지 이미지. (B) 집단 이동을 겪고 있는 종양 세포의 예를 보여주는 보충 비디오 S1 의 스틸 이미지(노란색 화살표). (C) 종양 세포(노란색 화살표)와 대식세포(빨간색 화살표)의 단세포 이동의 예를 보여주는 보충 비디오 S2 의 스틸 이미지. 녹색 = Dendra2 표지 종양 세포, 파란색 = CFP 표지 대식세포, 빨간색 = 155kDa 테트라메틸로다민 덱스트란 표지 혈청. 스케일 바 = 50μm(A), 15μm(B,C). 약어: SWIP = 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창; CFP = 청록색 형광 단백질; PDAC = 췌장 선암. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S1: 그림 6B에 해당하는 집단 이동을 겪는 종양 세포를 보여주는 타임랩스 생체 내 이미징 동영상. 녹색 = Dendra2 표지 종양 세포, 파란색 = CFP 표지 대식세포, 빨간색 = 155kDa 테트라메틸로다민 덱스트란 표지 혈청. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S2: 그림 6C에 해당하는 단일 세포 이동을 겪는 종양 세포를 보여주는 타임랩스 생체 내 이미징 동영상. 녹색 = Dendra2 표지 종양 세포, 파란색 = CFP 표지 대식세포, 빨간색 = 155kDa 테트라메틸로다민 덱스트란 표지 혈청. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 SWIP 프로토콜은 십자수 바스켓 기술을 활용하여 췌장 조직 안정화의 개선된 방법을 제공합니다. 초기 복부 영상 창(AIW)은 복부 내부 장기의 생체 내 영상(IVI)을 가능하게 했지만 췌장과 같은 연조직의 움직임을 적절하게 제한하지 못했습니다. 이에 대응하여 Park et al.은 수평 금속 선반을 통합하고 유리 커버슬립과의 접촉을 유지하면서 췌장 조직의 안정화를 개선할 수 있는 췌장 이미징 창(PIW)을 개발했습니다. 이 접근법은 측면 안정성을 향상시키지만, 고형 췌장 종양의 크기가 선반과 커버 유리 사이의 좁은 공간을 초과하기 때문에 이미징을 제한합니다. SWIP는 십자수 바스켓으로 췌장을 안정화하고 축 방향 및 측면 이동을 모두 제한하는 동시에 큰(≤10mm) 고형 종양을 수용할 수 있도록 하여 이 문제를 해결합니다.
SWIP를 AIW 및 PIW와 같은 이전 이미징 창과 직접 비교한 것은이전에 15였습니다. 이는 Du et al.15에서 발췌한 그림 1에 나타나 있으며, 여기서 측면 및 축 이동은 핵이나 혈관과 같은 세포 해부학적 특징을 추적하여 정량화되었습니다. 모든 이미징 창은 이미징의 약 첫 시간 동안 안정화 기간이 필요했습니다. 이 기간 동안 SWIP에 비해 AIW 및 PIW에서 더 높은 수준의 측면 이동이 관찰되었습니다. AIW 및 PIW는 2시간 동안 SWIP와 비교하여 더 큰 축 이동도 관찰되었습니다. 전반적으로 SWIP는 가장 낮은 수준의 드리프트를 표시했으며 장기 이미징(≤12시간)에 적합합니다.
안타깝게도 췌장은 산란이 심한 조직이기 때문에 IVI에 사용되는 다광자 현미경의 점 확산 기능은 조직 침투에 따라 급격히 저하됩니다. 따라서 광학 창을 사용한 이미징 깊이는 ~30-60μm로 제한됩니다. IVI는 또한 빛에 의한 샘플 손상의 위험을 수반합니다. 이는 이미징 세션을 시작할 때 100개의 이미지로 구성된 시계열을 획득하고 광표백 또는 광손상의 징후를 찾아 테스트할 수 있습니다. 현미경 시스템에서 우리는 조직에 악영향을 미치지 않고 샘플에서 ~15mW의 최대 전력을 사용할 수 있음을 발견했습니다.
SWIP 프로토콜은 췌장염 및 PDAC와 같은 질병 상태뿐만 아니라 정상적인 건강 상태에서도 쥐 췌장의 안정적인 고해상도 단일 세포 광학 IVI를 허용합니다. 따라서 SWIP는 긴 타임랩스 이미징뿐만 아니라 여러 z 슬라이스를 캡처하여 3D 및 4D(3D + 시간) 이미징을 수행하는 데 특히 유용합니다(다광자 및 컨포칼 현미경의 고유한 광학 절편 기능 활용). 고분해능 IVI는 단일 세포 및 췌장의 세포 구성 요소와의 상호 작용에 대한 생체 내 시각화를 가능하게 함으로써 췌장 질환의 기저에 있는 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요한 것으로 입증될 것입니다.
SWIP 프로토콜을 수행하려면 일정 수준의 기술 전문 지식이 필요합니다. 그러나 적절한 연습과 주요 단계에 주의를 기울이면 높은 성공률로 절차를 실행할 수 있습니다. 악성 췌장을 영상화하려면 먼저 종양이 성공적으로 이식되어야 합니다. 이것은 쥐의 췌장에 쥐 췌장암 세포의 현탁액을 orthotopic 주사하여 얻습니다. 성공적인 주입은 췌장의 실질이 액체로 채워진 거품으로 팽창할 때 관찰되며, 이전에 상세히 기술된 바 있다21. 최대한의 성공과 생존을 보장하기 위해서는 세포 현탁액의 누출을 최소화하거나 전혀 하지 않는 것이 중요한데, 누출은 잠재적인 종양 크기를 극적으로 감소시키고 암종증으로 이어질 수 있기 때문입니다. 또한 췌장은 혈관이 많이 분지된 기관입니다. 혈관이 찢어지면 췌장에 출혈과 그에 따른 혈종이 생기고 종양 성장을 억제할 수 있으므로 혈관을 찢지 않는 것이 중요합니다. 이 모델에서는 KPC 마우스(20)에서 유래한 합성 PDAC 세포주를 사용하였다. 이를 통해 면역력이 있는 마우스에서 종양 생착이 가능합니다. 다른 합성 PDAC 세포주는 사용되는 마우스의 균주에 따라 사용될 수 있다. 인간 PDAC 세포주도 사용할 수 있습니다. 그러나, 마우스 균주는 종양 이식의 거부 반응을 피하기 위해 면역이 손상되어야 합니다.
이 프로토콜에서 이미징을 받는 종양의 크기는 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 이는 쥐 췌장에 더 높은 농도의 암세포를 이식하여 더 큰 종양을 얻거나 창문 이식 전에 종양의 성장 시간을 연장함으로써 달성할 수 있습니다. 이 연구에서는 10개의KPC PDAC 세포를 6개 주입하고 종양이 만져질 수 있는 10-14일 후에 SWIP를 이식했습니다. 더 작고 더 큰 종양은 십자수 바스켓에 조직을 적절하게 배치하여 이 SWIP 프로토콜에 의해 수용될 수도 있습니다.
이미징 창과 췌장을 안전하게 배치하는 것도 고품질 이미징을 얻고 모션 아티팩트를 제한하는 데 중요합니다. 정상적인 쥐 췌장은 매우 순응적이며 호흡과 근처의 연동 운동으로 인해 움직이기 쉽습니다. 이를 해결하고 이미징하는 동안 췌장의 안정성을 증가시키기 위해, 앞서 설명한 십자수 바스켓 기법이 활용된다31. 십자수 바스켓은 신체의 인대 사용을 모방하도록 설계되었습니다. 유리 커버슬립에 조직을 고정하고 일정한 축 방향 압력을 가함으로써 측면 및 축 방향 이동을 모두 방지합니다. 더 큰 고형 종양을 다룰 때 최적의 지지를 위해 종양의 크기와 위치를 가장 잘 수용하도록 십자수의 지지점과 방향을 수정할 수 있습니다.
최적이 아닌 이미징은 창틀이 마우스의 복부에 부적절하게 이식된 경우에도 발생할 수 있습니다. 느슨하게 장착된 창틀은 이미징 문제와 모션 아티팩트를 유발할 수 있습니다. 적절한 지갑 끈 봉합사는 피부와 복벽을 통해 창틀을 복부에 고정하여 이 문제를 해결할 수 있습니다. 지갑 끈을 조일 때 피부가 과도하게 접히는 것을 방지하려면 티슈 가장자리에서 5mm 이하로 배치된 단계 사이의 스티치 단계가 1mm를 넘지 않아야 창틀 주위에 꼭 맞도록 해야 합니다. 지갑 끈 봉합, 십자수 바구니에 췌장 배치, 창틀 이식 후 마지막으로 중요한 단계는 창틀의 홈에 접착제를 배치하는 것입니다. 이 단계에서 접착제가 췌장 조직에 접촉하지 않는 것이 중요한데, 이는 조직을 손상시키고 영상을 혼란스럽게 할 수 있기 때문입니다. 접착제가 췌장 조직에 닿지 않도록 할 수 있는 잠재적인 수정은 유리 커버슬립을 창틀에 붙이고 복부에 외과적으로 이식하기 전에 둘 다 건조되도록 하는 것입니다.
SWIP는 모든 생체 내 이미징 기술과 마찬가지로 명시적으로 라벨링되지 않은 조직의 다른 세포 및 구조에 대한 정보를 밝히는 능력에 한계가 있습니다. 그러나 SWIP 창을 형광 리포터(예: 본 연구에서와 같이 ECFP 발현 상피 및 Dendra2 표지된 KPC 세포)와 결합하고 약리학 및/또는 광유전학 도구로 단백질 또는 세포 상태를 제어하면 이러한 제한을 제거할 수 있습니다.
또한, SWIP 윈도우 디자인은 윈도우 프레임 상에 3개의 에칭된 라인들을 포함하며, 이는 연속 이미징(30) 동안에 관심의 영역을 재편소화하기 위한 마이크로카토그래피(microcartography)를 위한 기준 마커 역할을 한다. 이를 통해 표시가 없는 조직에서도 동일한 시야를 여러 번 찾을 수 있습니다.
요약하면, SWIP는 췌장염 및 PDAC와 같은 양성 및 악성 췌장 질환뿐만 아니라 정상적인 건강한 췌장 조직에도 사용할 수 있습니다. SWIP를 사용하여 이러한 상태에서 단일 세포 및 하위 세포 역학을 캡처할 수 있으며 연구원이 PDAC의 전이성 전파와 같은 중요한 생리학적 사건을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. IVI의 향상된 품질과 안정성은 췌장의 병태생리학 및 세포생물학에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 이는 유망하고 유익한 도구가 될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
Evelyn Lipper Charitable Foundation, Gruss-Lipper Biophotonics Center, Integrated Imaging Program for Cancer Research, NIH T-32 Fellowship(CA200561) 및 국방부 췌장암 연구 프로그램(PCARP) 보조금 PA210223P1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
| 5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
| 28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
| Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
| Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
| Cyano acrylate - Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
| Cyano acrylate - Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
| DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
| Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
| Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
| Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
| Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
| Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
| Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |
References
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