Ventana estabilizada para la obtención de imágenes intravitales del páncreas murino

Summary

Presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanente estabilizada para la obtención de imágenes de resolución subcelular del páncreas murino, que permite realizar estudios seriados y longitudinales del páncreas sano y enfermo.

Abstract

La fisiología y la fisiopatología del páncreas son complejas. Las enfermedades del páncreas, como la pancreatitis y el adenocarcinoma de páncreas (PDAC, por sus siglas en inglés) tienen una alta morbilidad y mortalidad. La obtención de imágenes intravitales (IVI) es una técnica potente que permite obtener imágenes de alta resolución de tejidos tanto en estado sano como enfermo, lo que permite observar en tiempo real la dinámica celular. La IVI del páncreas murino presenta desafíos significativos debido a la naturaleza visceral profunda y distensible del órgano, lo que lo hace muy propenso a daños y artefactos de movimiento.

Aquí se describe el proceso de implantación de la Window Stabilizada para laobtención de imágenes intravitales de las Pancreas murinas (SWIP). El SWIP permite la IVI del páncreas murino en estados normales de salud, durante la transformación del páncreas sano a pancreatitis aguda inducida por ceruleína, y en estados malignos como los tumores pancreáticos. Junto con células marcadas genéticamente o la administración de colorantes fluorescentes, el SWIP permite la medición de la dinámica de una sola célula y subcelular (incluida la migración unicelular y colectiva), así como la obtención de imágenes en serie de la misma región de interés durante varios días.

La capacidad de capturar la migración de las células tumorales es de particular importancia, ya que la causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer en el PDAC es la abrumadora carga metastásica. La comprensión de la dinámica fisiológica de la metástasis en el PDAC es una necesidad crítica no satisfecha y crucial para mejorar el pronóstico del paciente. En general, el SWIP proporciona una mejor estabilidad de la imagen y amplía la aplicación de IVI en el páncreas sano y las enfermedades malignas del páncreas.

Introduction

Las enfermedades pancreáticas benignas y malignas son potencialmente mortales, con lagunas considerables en la comprensión de su fisiopatología. La pancreatitis (inflamación del páncreas) es la tercera causa principal de ingresos y reingresos hospitalarios relacionados con enfermedades gastrointestinales en los EE. UU. y se asocia con una morbilidad, mortalidad^{y carga} socioeconómica sustanciales. Clasificado como la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer 2, el adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC) representa la mayoría de las neoplasias malignas de páncreas³ y presagia una baja tasa de supervivencia a 5 años de solo el 11 %². La principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer en el PDAC es la abrumadora carga metastásica. Desafortunadamente, la mayoría de los pacientes presentan enfermedad metastásica. Por lo tanto, la comprensión de la dinámica de la metástasis en el PDAC es una necesidad crítica no satisfecha en el campo de la investigación del cáncer.

Los mecanismos que sustentan la inflamación y la cascada metastásica del páncreas son poco conocidos. Uno de los principales factores que contribuyen a esta brecha de conocimiento es la incapacidad de observar la dinámica celular pancreática in vivo. La observación directa de estas dinámicas celulares promete revelar objetivos críticos para aprovechar y mejorar el diagnóstico y el tratamiento de las personas con enfermedad pancreática.

La imagen intravital (IVI) es una técnica de microscopía que permite a los investigadores visualizar y estudiar los procesos biológicos en animales vivos en tiempo real. IVI permite la visualización directa y de alta resolución de la dinámica intracelular y microambiental in vivo y dentro del entorno nativo del proceso biológico en cuestión. Por lo tanto, IVI permite la observación in vivo de procesos sanos y patológicos.

Las modalidades contemporáneas de imágenes de cuerpo entero, como la resonancia magnética, la tomografía por emisión de positrones y la tomografía computarizada, ofrecen excelentes vistas de órganos completos y pueden revelar patologías, incluso antes de la aparición de los síntomas clínicos⁴. Sin embargo, no son capaces de lograr una resolución de una sola célula o revelar las primeras etapas de la enfermedad: pancreatitis o neoplasia maligna.

Investigaciones anteriores han utilizado IVI de resolución unicelular para observar enfermedades benignas y malignas de la piel^5,6, la mama⁷, el pulmón⁸, el hígado⁹, el cerebro 10 y los tumores pancreáticos 11^, lo que ha llevado a comprender los mecanismos de progresión de la enfermedad ¹². Sin embargo, el páncreas murino presenta obstáculos significativos para lograr la resolución de una sola célula mediante IVI, principalmente debido a su ubicación visceral profunda y su alta distensibilidad. Además, es un órgano ramificado y de distribución difusa dentro del mesenterio que se conecta con el bazo, el intestino delgado y el estómago, lo que dificulta su acceso. El tejido también es muy sensible al movimiento causado por el peristaltismo adyacente y la respiración. Minimizar el movimiento del páncreas es esencial para la microscopía de resolución unicelular, ya que los artefactos de movimiento de incluso unas pocas micras pueden desenfocar y distorsionar las imágenes, lo que^{hace imposible el} seguimiento de la dinámica de las células individuales.

Para la realización de la IVI se debe implantar quirúrgicamente una ventana de imagen abdominal (AIW) ^9,11. Para implantar quirúrgicamente el AIW, se sutura un marco de ventana de metal en la pared abdominal. Posteriormente, el órgano de interés se fija al marco mediante adhesivo de cianoacrilato. Si bien esto es suficiente para algunos órganos internos rígidos (p. ej., hígado, bazo, tumores rígidos), los intentos de obtener imágenes del páncreas murino sano se ven comprometidos por una estabilidad lateral y axial subóptima debido a la textura dócil del tejido y a la arquitectura compleja¹⁴. Para hacer frente a esta limitación, Park et ^al.14 desarrollaron una ventana de imagen diseñada específicamente para el páncreas sano. Esta ventana de imágenes de páncreas (PIW) minimiza la influencia del movimiento intestinal y la respiración al incorporar un estante metálico horizontal dentro del marco de la ventana, justo debajo del cubreobjetos, estabilizando el tejido y manteniendo su contacto con el cubreobjetos. Si bien el PIW ofrece una mayor estabilidad lateral, descubrimos que esta ventana aún muestra deriva axial y, además, evita la obtención de imágenes de tumores sólidos grandes debido al estrecho espacio entre el estante metálico y el cubreobjetos¹⁵.

Para hacer frente a estas limitaciones, desarrollamos el Window Stabilizado para laobtención de imágenes intravitales de las Páncreasmurinas (SWIP), una ventana de imagen implantable capaz de lograr una imagen estable a largo plazo tanto del páncreas sano como del enfermo (Figura 1)¹⁵. Aquí, proporcionamos un protocolo completo para el procedimiento quirúrgico utilizado para implantar el SWIP. Aunque el objetivo principal era estudiar los mecanismos dinámicos implicados en la metástasis, este método también puede utilizarse para explorar diversos aspectos de la biología y la patología del páncreas.

Protocol

Todos los procedimientos descritos en este protocolo se han realizado de acuerdo con las pautas y regulaciones para el uso de animales vertebrados, incluida la aprobación previa del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Albert Einstein.

1. Pasivación de ventanas

NOTA: La pasivación del acero inoxidable limpia el metal de contaminantes y crea una fina capa de óxido que aumenta en gran medida la biocompatibilidad del metal con los tejidos blandos, incluso más allá de la del titanio¹⁶.

1. Comience el proceso de pasivación lavando los marcos ópticos de las ventanas con una solución de detergente enzimáticamente activa al 1% (p/v).
2. Sumerja los marcos en una solución de hidróxido de sodio al 5% (p/v) a 70 °C durante 30 minutos dentro de un frasco de vidrio.
3. Saque los marcos y enjuáguelos con agua desionizada.
4. Sumerja los marcos en una solución de ácido cítrico al 7% (p/v) a 55 °C durante 10 minutos dentro de un frasco de vidrio nuevo.
5. Retire los marcos y enjuáguelos nuevamente con agua desionizada.
6. Repita el paso 1.2 y, finalmente, enjuague los marcos de las ventanas con agua desionizada por última vez.

2. Preparación para la implantación de tumores o cirugía de ventana

NOTA: Para los estudios de tumores pancreáticos, las células tumorales deben implantarse y dejarse crecer hasta convertirse en tumores manifiestos. Para visualizar las células tumorales in vivo, se recomienda utilizar células que han sido alteradas genéticamente para expresar proteínas fluorescentes como Dendra2. El uso de etiquetas de proteínas fluorescentes que sean brillantes mitigará los posibles problemas con la autofluorescencia tisular. Otras posibles proteínas fluorescentes, colorantes y modelos de ratones fluorescentes codificados genéticamente que pueden ser utilizados han sido discutidos en otro lugar^17,18. Para evitar la contaminación del campo operatorio, realice el procedimiento quirúrgico en una campana o cabina de flujo laminar y asegúrese de que se utilicen áreas distintas para la preparación, la cirugía y la recuperación.

1. Antes de la cirugía, esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en un autoclave y, si es necesario, use un esterilizador de perlas calientes para los procedimientos posteriores. Asegúrese de que la cirugía emplee una técnica de solo puntas.
2. Encienda la almohadilla quirúrgica calefactada y el esterilizador de perlas y espere a que alcance la temperatura de funcionamiento adecuada. La temperatura de la almohadilla térmica debe controlarse con un termómetro de superficie para evitar posibles quemaduras. Coloque un paño estéril sobre la almohadilla térmica si la temperatura no se puede controlar adecuadamente.
   NOTA: La temperatura corporal durante procedimientos cortos (≤20 min), como la implantación de tumores y ventanas, se ve mínimamente afectada mientras se usa una almohadilla quirúrgica caliente. Sin embargo, los períodos más largos de anestesia, como durante las imágenes de lapso de tiempo prolongado, requieren que el mouse se coloque en una cámara calentada para mantener la temperatura corporal.
3. Anestesiar al ratón con isoflurano al 5% en una cámara de anestesia.
4. Paso crítico: Bajar la anestesia al 2% una vez que el ratón esté inconsciente. Controle cuidadosamente el nivel de anestesia y los signos vitales del ratón (p. ej., usando un oxímetro de pulso)¹⁹.
5. Coloque una pequeña gota de lubricante ocular en cada ojo del ratón para evitar que se seque la córnea.
6. Antes de la cirugía, aplique crema depilatoria generosamente en la parte superior izquierda del abdomen para eliminar el vello. Después de 20 segundos, use papel de seda humedecido para limpiar firmemente el vello y la crema depilatoria. Repita el proceso según sea necesario hasta que se elimine todo el vello del área quirúrgica.
7. Inyectar 10 μL de buprenorfina (0,1 mg/kg) diluido en 90 μL de PBS por vía subcutánea para asegurar la analgesia preoperatoria.

3. Implantación de tumores de páncreas

1. Preparar alícuotas de células tumorales a la concentración deseada (en función del tiempo de duplicación de las células tumorales). Coloque la suspensión celular en una jeringa de insulina y manténgala en hielo. Para seguir este protocolo, se utilizaron 10⁶ células tumorales KPC singénicas 20 suspendidas en un máximo de 50 μL de PBS, siguiendo el protocolo de inyección ortotópica adaptado de Erstad et^al.21
   NOTA: Esta línea celular inyectada a esta concentración producía rutinariamente tumores palpables o apropiadamente grandes a los 10-14 días. Los subclones de esta línea celular y de otras líneas celulares pancreáticas tendrían que ser evaluados para determinar las concentraciones y los plazos adecuados para producir tumores de tamaño adecuado).
2. Lávese las manos con jabón antiséptico.
3. Antes de cada nueva cirugía, póngase guantes estériles nuevos.
4. Transfiera el ratón a la campana quirúrgica estéril y colóquelo en una posición de decúbito lateral derecho parcial.
5. Asegure las extremidades con cinta adhesiva.
   NOTA: El uso adecuado de los instrumentos es importante durante todo el procedimiento. En la Figura 2A-C se muestran ejemplos de cómo sujetar fórceps, tijeras Castroviejo y la herramienta de recogida de vacío.
6. Esterilizar el abdomen con un antiséptico (Figura 2D).
7. Asegúrese de que el animal esté completamente anestesiado realizando una prueba de pellizco en los dedos de los pies.
8. Realizar una incisión subcostal izquierda de 10-15 mm en la piel con pinzas y tijeras Castroviejo (Figura 2E).
9. Controle la hemostasia con hisopos de algodón o un bolígrafo de cauterización cuando/donde se considere necesario.
10. Divida cuidadosamente el músculo subyacente con fórceps y tijeras Castroviejo para introducir el peritoneo (Figura 2F).
11. Con hisopos de algodón estériles, externalice el páncreas y el bazo de forma atraumática.
12. Extienda el páncreas para que no queden pliegues (Figura 2G).
13. Identificar el sitio deseado para la inyección del tumor en el cuerpo o la cola del páncreas (lejos de los vasos sanguíneos).
14. Paso crítico: Después de colocar cuidadosamente el páncreas, use fórceps para proporcionar tensión al tejido e inserte la punta de la jeringa de insulina, con el bisel hacia arriba, en el sitio deseado del páncreas a una profundidad de 4-5 mm (Figura 2H).
15. Inyecte lentamente la solución de células tumorales. Busque una pequeña burbuja que confirme que la inyección se ha realizado correctamente (Figura 2I).
16. Regrese con cuidado el páncreas al abdomen sin alterar la burbuja de inyección de células tumorales (Figura 2J).
17. Usando suturas absorbibles de polidioxanona 5-0, cierre primero la capa muscular y luego la piel con suturas interrumpidas (Figura 2K-N).
18. Cubra la incisión con pegamento de cianoacrilato (Figura 2O), luego regrese el ratón a una jaula limpia debajo de una lámpara de calefacción para su recuperación. Administre antibióticos en el agua potable para prevenir infecciones. Monitoree a los ratones y permita que se recuperen por completo de la cirugía.
    NOTA: Los antibióticos se administran según lo requerido por el protocolo de la IACUC. Todos los animales se alojan individualmente.
19. Deje que el tumor se desarrolle durante 10 a 14 días hasta que sea palpable a través de la pared abdominal.

4. Cirugía de ventana de páncreas

1. Cuando los animales estén listos para la toma de imágenes, comience la cirugía de implantación de ventana. Para empezar, lávese las manos con jabón antiséptico.
2. Antes de cada nueva cirugía, póngase guantes estériles nuevos.
3. En el soporte quirúrgico calefactado, coloque el ratón en la posición de decúbito lateral derecho para exponer el abdomen izquierdo.
4. Ancla las extremidades delanteras y traseras del ratón a la etapa quirúrgica calentada craneal y caudalmente con cinta de papel. Asegúrese de que el bazo (debajo de la piel) sea visible dentro del campo quirúrgico (Figura 3A).
5. Para mantener la esterilidad, desempaque todos los instrumentos quirúrgicos en la campana.
6. Desinfecte el sitio quirúrgico frotando la piel del ratón con una aplicación generosa de antiséptico.
7. Asegúrese de que el animal esté completamente anestesiado realizando una prueba de pellizco en los dedos de los pies.
8. Paso crítico: Levantar la piel del cuadrante superior izquierdo del abdomen con pinzas y hacer una incisión circular de ~10 mm en la piel y la musculatura con unas tijeras Castroviejo (Figura 3B,C).
9. Controle el sangrado y mantenga la hemostasia con hisopos de algodón o la pluma de cauterización, cuando sea necesario.
10. Localice el páncreas, que está unido al bazo, e identifique la dirección en la que se encuentra el páncreas dentro de la incisión para decidir dónde se debe colocar el punto de cruz de soporte.
11. Con una sutura de seda 5-0, coloque el primer punto en el lugar deseado de la capa muscular. Amarre este extremo con 3-5 nudos. (Figura 3D,E)
12. Continúe suturando directamente a través de la incisión. Corta y deja una cola de ~5 cm (Figura 3F).
13. Repita los pasos 4.11 y 4.12 perpendicularmente al primer punto (Figura 3G, H).
14. Paso crítico: Levante suavemente y coloque el páncreas sobre el punto de cruz (Figura 3I, J). Tenga cuidado de no dañar el páncreas durante la manipulación.
15. Paso crítico: Usando la sutura de seda 5-0, realice una puntada de cuerda de bolsa a ~ 1 mm del orificio, circunferencialmente, entrelazando la piel y la capa muscular (Figura 3K).
16. Coloque el marco de la ventana de modo que los bordes de la incisión circular queden asentados dentro de la ranura de la ventana (Figura 3L).
17. Cierre la ventana implantada atando firmemente la seda 5-0.
18. Cargue 100 μL de adhesivo líquido de cianoacrilato en la jeringa de 1 mL.
19. Seque el tejido aplicando un delicado flujo de aire comprimido durante ~10 s.
20. Sujete el marco de la ventana por su borde exterior con pinzas y levántelo suavemente para asegurar la separación del páncreas de la superficie inferior del marco de la ventana.
21. Paso crítico: Dispense una capa delgada de adhesivo líquido de cianoacrilato a lo largo del hueco de la ventana (Figura 3M). Asegúrese de que el adhesivo no entre en contacto con el tejido del páncreas.
22. Con los recogedores de vacío, levante el cubreobjetos de 5 mm.
23. Coloque con cuidado el cubreobjetos dentro del hueco en el centro del marco de la ventana óptica. Sosténgalo con una ligera presión, permitiendo que el adhesivo de cianoacrilato se asiente (~25 s).
24. Separe el cubreobjetos de los recogedores de vacío con unas pinzas.
25. Apriete las suturas de punto de cruz para asegurar el páncreas cómodamente al cubreobjetos (Figura 3N, O). Nota: No apriete demasiado el punto de cruz, ya que puede causar daños e isquemia en el páncreas.
26. Corta los extremos de la sutura.
27. Quita la cinta del ratón.
28. Apague el vaporizador de isoflurano.
29. Reubique el ratón en una jaula limpia o directamente en el microscopio intravital.
30. Aloje a los animales individualmente después de la cirugía de ventana y vigílelos hasta que se recuperen por completo.
31. A continuación, la obtención de imágenes se lleva a cabo en un microscopio multifotónico de dos láseres, como hemos descrito anteriormente.22,23,24 Para largas sesiones de obtención de imágenes^, el ratón se coloca en una cámara calentada para mantener la temperatura corporal y se le proporcionan fluidos de apoyo según las normas de la IACUC^.

5. Tratamiento con ceruleína para la inducción de pancreatitis

1. Para investigar la aparición de la pancreatitis, se debe tratar a ratones sanos con ceruleína después de la implantación del SWIP. Asegúrese de que los ratones estén en ayunas durante 14-18 h y se les administre agua ad libitum antes de la administración de cerulína.
2. Inyectar 50 μg/kg de ceruleína en 100 μL de DPBS 1x estéril por vía intraperitoneal a intervalos de 1 h durante un máximo de ocho inyecciones. Administrar un volumen equivalente de 1x DPBS solo, inyectado por vía intraperitoneal, a los ratones de control.
3. Después de las imágenes, sacrifique a los ratones 24 horas después de la primera inyección por luxación cervical según los estándares de la IACUC.
4. Realice imágenes en un microscopio multifotónico de dos láseres como se describió anteriormente^22,23,24. Para sesiones de imágenes prolongadas, coloque el mouse en una cámara calentada para mantener la temperatura corporal y proporcionarle líquidos de apoyo según los estándares de IACUC.

Representative Results

La Figura 1, adaptada de Du et ^al.15, muestra imágenes fijas de una película IVI de lapso de tiempo del páncreas murino. Se puede observar algún movimiento tisular dentro del período de asentamiento inicial (primera hora de la imagen, Figura 1A). Sin embargo, con la continuación de las imágenes después de este período de asentamiento (>75 min), observamos un aumento de la estabilidad lateral y axial (Figura 1B). La comparación de la estabilidad del SWIP con las ventanas de imágenes AIW y PIW anteriores identifica que todas las ventanas requieren un período inicial para la sedimentación. Sin embargo, el SWIP mostró el nivel más bajo de deriva en general y es el más adecuado para la obtención de imágenes a largo plazo (Figura 1C-K). Las imágenes se generaron en un microscopio multifotónico²⁴ hecho a medida que iluminaba a 880 nm y adquiría un lapso de pila z (tamaño del campo de visión [FOV] = 340 x 340 μm, tamaño de píxel 0,67 μm) con 1,7 min entre fotogramas, 11 cortes con un tamaño de paso de 2 μm, 20 de profundidad de imagen y ~1 corte/s. Se eligieron la potencia del láser y las ganancias del tubo fotomultiplicador (PMT) para maximizar la señal y minimizar el fotoblanqueo y el fotodaño.

Los pasos de los procedimientos quirúrgicos que describen la implantación del tumor de páncreas y la posterior inserción de la ventana pancreática se describen en la Figura 2 y la Figura 3, respectivamente. Es importante destacar que ambas cirugías son cirugías de supervivencia. Una vez correctamente implantado, el páncreas permanecerá expuesto a la ventana óptica, que ahora está integrada dentro de la pared abdominal. Esto permite una supervivencia cómoda del ratón y permite la obtención de imágenes continuas durante un máximo de 12 horas, según lo permitido por el protocolo. Además, las imágenes en serie se pueden realizar durante varios días consecutivos (hasta el límite de protocolo de 2 semanas) para monitorear las regiones de interés a lo largo del tiempo. La imagen intravital (IVI) puede realizarse a través de la ventana de forma similar a otras ventanas descritas anteriormente^22,25,26.

El SWIP se puede utilizar para investigar la dinámica al inicio de la pancreatitis aguda inducida con ceruleína. La cerulinina es un oligopéptido con estructura y función similar a la de la colecistoquinina (CKK) y es ampliamente utilizado para inducir experimentalmente pancreatitis aguda en roedores²⁷. El tratamiento con ceruleína provoca la contracción del músculo liso en el tracto gastrointestinal y estimula las secreciones gástricas y pancreáticas²⁸. Además, la administración intraperitoneal de ceruleína conduce a la hinchazón y agrandamiento del páncreas²⁹.

En la figura 4 se muestran imágenes seriadas del páncreas murino después del tratamiento con ceruleína, utilizando el protocolo SWIP. El páncreas murino se visualiza con una resolución de una sola célula utilizando el marcaje genético fluorescente (ratones transgénicos epiteliano-MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP marcados con ECFP) y la administración de colorantes de alto peso molecular (155 kD dextrano-TMR) para definir la vasculatura local, denotada por las líneas amarillas sólidas. El diseño de la ventana, utilizado anteriormente para la imagen del pulmón murino⁸, incluye tres líneas grabadas en el marco (Figura 4, recuadro) que actúan como marcadores de referencia que permiten el uso de la microcartografía³⁰. La microcartografía permite obtener imágenes seriadas de la misma región de interés del páncreas murino durante varios días. Aquí el mismo lóbulo del páncreas (líneas discontinuas amarillas) se visualiza en el día 1 y se relocaliza en el día 2, como lo demuestra la presencia de los mismos vasos sanguíneos locales (Figura 4). Las imágenes se adquirieron cada día como una sola pila z con 11 cortes y un tamaño de paso de 2 μm a ~ 1 corte/s, tomadas con una iluminación de 880 nm y una resolución de 0,67 μm/píxel (FOV = 340 x 340 μm). Se eligieron la potencia del láser y las ganancias de PMT para maximizar la señal y minimizar el fotoblanqueo y el fotodaño.

Además de las imágenes en serie, el SWIP es muy adecuado para la obtención de imágenes longitudinales a largo plazo, lo que permite el seguimiento y la medición precisos de la dinámica de las estructuras subcelulares (como las vacuolas) en condiciones de control y tratamiento. Aquí, las vacuolas son regiones donde se excluyen las proteínas fluorescentes citoplasmáticas, lo que hace que aparezcan agujeros oscuros sin marcar (Figura 5A). El marcado de vacuolas mediante software como ROI Tracker²⁴, permite la visualización de la motilidad de la vacuola (Figura 5A, B) y la cuantificación de numerosos parámetros de motilidad. Por ejemplo, la velocidad media de las vacuolas en el páncreas murino aumentó aproximadamente un 10% tras el tratamiento con ceruleína para inducir pancreatitis, en comparación con el tratamiento con PBS (0,37 ± 0,07 μm/min frente a 0,41 ± 0,09 μm/min, p = 0,02) (Figura 5C). El tratamiento con ceruleína también aumentó la frecuencia media de giro de las estructuras subcelulares en un 10% frente al tratamiento con PBS (2,3 ± 0,3 grados/min frente a 2,6 ± 0,6 grados/min, p = 0,04) (Figura 5F). Sin embargo, no hubo diferencias significativas (p > 0,05) en la velocidad neta, la direccionalidad o la distancia acumulada recorrida entre el tratamiento con ceruleína y el tratamiento con PBS (Figura 5D, E y Figura 5G). Las imágenes se generaron en un microscopio multifotónico²⁴ hecho a medida que iluminaba a 880 nm y adquiría un lapso z stack-t (tamaño del campo de visión = 340 x 340 μm, tamaño de píxel 0,67 μm) con 2,9 min entre fotogramas, 11 cortes con un tamaño de paso de 2 μm y ~1 corte/s.

Por último, el SWIP permite la visualización y captura de la migración de células tumorales. La Figura 6A muestra un fotograma de una película de lapso de tiempo (Video Suplementario S1 y Video Suplementario S2) de la migración dentro del páncreas de células tumorales KPC marcadas con Dendra-2 que se inyectaron ortotópicamente. Tanto la migración colectiva de células en grupos (Figura 6B y Video Suplementario S1) como la migración de una sola célula (Figura 6C y Video Suplementario S2) se pueden observar durante períodos cortos (<1 h). Las imágenes se generaron en un microscopio multifotónico 24 hecho a medida que iluminaba a 880 nm y adquiría un lapso de pila mosaico-z de 4 x 4 con un²⁰% de superposición entre mosaicos (tamaño de mosaico = 340 x 340 μm), 3,4 min entre marcos, 3 cortes con un tamaño de paso de 5 μm y ~ 1 corte / s. Se eligieron la potencia del láser y las ganancias de PMT para maximizar la señal y minimizar el fotoblanqueo y el fotodaño.

Figura 1: Mejora de la estabilidad de las imágenes gracias al SWIP. (A) Imágenes fijas de los primeros 72 minutos de una película timelapse del páncreas fotografiada a través del SWIP. Se puede observar algo de deriva axial pero muy poca deriva lateral. Barras de escala = 50 μm. (B) Las imágenes de lapso de tiempo continuadas después de 72 min muestran un alto nivel de estabilidad axial y lateral. (A,B) Rojo = 155 kDa de suero sanguíneo marcado con tetrametilrodamina dextrano, cian = células pancreáticas marcadas con CFP (MMTV-ICre/CAG-CAC-ECFP ratones transgénicos) (C-E) Comparación de la estabilidad lateral de cada una de las ventanas de imágenes del páncreas durante la primera hora de obtención de imágenes para el (C) AIW, (D) PIW y (E) SWIP. (F-H) Comparación de la estabilidad lateral de cada una de las imágenes del páncreas durante los siguientes 150 min para el (F) AIW, (G) PIW y (H) SWIP. Los recuadros son vistas ampliadas de los trazados correspondientes. (I-K) Comparación de la estabilidad axial de cada una de las ventanas de imágenes del páncreas durante los primeros 120 minutos de imágenes para el (I) AIW, (J) PIW y (K) SWIP. Esta cifra es de Du et al. Open Biology 2022, DOI:10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273. ¹⁵. Abreviaturas: SWIP = ventana estabilizada para la obtención de imágenes intravitales del páncreas; AIW = ventana de imagen abdominal; PIW = ventana de imágenes del páncreas; CFP = proteína cian fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Descripción general del protocolo quirúrgico de inyección ortotópica de células de adenocarcinoma ductal pancreático (KPC). (A) Ilustración de cómo sujetar las pinzas quirúrgicas. (B) Ilustración de cómo sujetar las tijeras Castroviejo. (C) Ilustración de cómo sujetar la herramienta de recogida de vacío. (D) Higienización de la piel. (E) Incisión en la piel. (F) Incisión en el músculo. (G) Páncreas extendido. (H) Inserción de la aguja en el sitio deseado de inyección. (I) Inyección de suspensión de células cancerosas creando una burbuja (flecha azul). (J) El páncreas regresó a la cavidad peritoneal. (K,L) Cierre de la capa muscular con una sutura de seda interrumpida. (M,N) Cierre de la piel con una sutura de seda interrumpida. (O) Pegamento de cianoacrilato aplicado a la incisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resumen del protocolo quirúrgico de la Ventana Estabilizada para la Obtención de Imágenes del Páncreas . (A) Identificación del bazo y el páncreas adherido. (B,C) Incisión circular en la piel y el músculo. Las líneas discontinuas rojas en A-C indican el contorno del bazo que se puede ver a través de la pared abdominal y la piel. (D,E) Primer punto de la cesta de punto de cruz colocado y atado en la capa muscular (E, flecha amarilla). (F) La puntada se continúa hacia el lado opuesto de la incisión muscular, dejando una cola (flecha blanca). (G,H) Segundo punto colocado perpendicular al primero, atado en un extremo (flechas amarillas) y dejando una cola (flechas blancas). (I,J) Colocación del páncreas en la canasta de punto de cruz. (K) Sutura circunferencial de la cuerda de la bolsa a través del músculo y la piel. (L) Implantación del marco de la ventana. (M) Aplicación de pegamento al marco de la ventana. (N) Fijación de cubreobjetos de vidrio. (O) Extremos de la cola del punto de cruz apretados. (P) SWIP completamente implantado. Abreviatura: SWIP = ventana estabilizada para la obtención de imágenes intravitales del páncreas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Microcartografía utilizada para la obtención de imágenes en serie para relocalizar las mismas áreas de interés dentro de la ventana óptica. Imagen intravital de una sola región del páncreas murino, que muestra el mismo lóbulo reubicado durante 2 días consecutivos (D1-D2) mediante microcartografía. Las líneas discontinuas amarillas delinean los límites del mismo lóbulo. Las líneas continuas resaltan los mismos vasos sanguíneos (como lo demuestra la presencia de suero sanguíneo marcado en rojo dentro del lumen) identificados cada día consecutivo. Rojo = 155 kDa de suero sanguíneo marcado con tetrametilrodamina dextrano, cian = células pancreáticas marcadas con CFP (ratones transgénicos MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP) (Recuadro) Imagen del SWIP con arañazos para microcartografía. El uso de la microcartografía para reubicar regiones de interés durante la obtención de imágenes en serie está permitido por las tres líneas grabadas en el marco de la ventana (recuadro). Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Resolución subcelular y medición de la dinámica subcelular mediante SWIP. (A) Las células individuales (contornos amarillos discontinuos) y las estructuras subcelulares, como las vacuolas, se pueden visualizar a través del SWIP a lo largo del tiempo en el páncreas murino. Ejemplos de estas vacuolas se indican con flechas amarillas. Por lo tanto, el SWIP permite el seguimiento de las estructuras subcelulares (contornos coloreados y pistas superpuestas en la imagen de fluorescencia) a lo largo del tiempo. El recuadro es una vista ampliada de un área de caja amarilla que muestra tres vacuolas rastreadas. Barra de escala = 50 μm. (B) Trayectorias de estructuras subcelulares, como núcleos y vacuolas (resaltadas en A), después de un desplazamiento de coordenadas hasta el punto de origen. La línea discontinua roja muestra la trayectoria media de la red en 1 h (3,46 μm). Cuantificación de los parámetros dinámicos de (C) velocidad media, (D) trayectoria neta, (E) direccionalidad, (F) frecuencia media de giro y (G) distancia acumulada. Rojo = suero sanguíneo marcado con tetrametilrodamina dextrano de 155 kDa, cian = células pancreáticas marcadas con CFP (ratones transgénicos MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP). Abreviaturas: SWIP = ventana estabilizada para la obtención de imágenes intravitales del páncreas; CFP = proteína cian fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Captura de la migración celular con SWIP . (A) Una imagen fija de una película de imágenes intravitales de lapso de tiempo del páncreas en un modelo de ratón de PDAC inyectado ortotópicamente. (B) Imágenes fijas del Video Suplementario S1 que muestran un ejemplo de células tumorales que experimentan una migración colectiva (flecha amarilla). (C) Imágenes fijas del video suplementario S2 que muestran ejemplos de migración de una sola célula de una célula tumoral (flecha amarilla) y un macrófago (flecha roja). Verde = células tumorales marcadas con Dendra2, Azul = macrófagos marcados con CFP, Rojo = suero sanguíneo marcado con tetrametilrodamina dextrano de 155 kDa. Barras de escala = 50 μm (A), 15 μm (B,C). Abreviaturas: SWIP = ventana estabilizada para la obtención de imágenes intravitales del páncreas; CFP = proteína cian fluorescente; PDAC = adenocarcinoma de páncreas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video Suplementario S1: Vídeo de imágenes intravitales timelapse que muestra células tumorales en proceso de migración colectiva correspondiente a la Figura 6B. Verde = células tumorales marcadas con Dendra2, Azul = macrófagos marcados con CFP, Rojo = suero sanguíneo marcado con tetrametilrodamina dextrano de 155 kDa. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video Suplementario S2: Vídeo de imágenes intravitales de lapso de tiempo que muestra células tumorales sometidas a una migración de células individuales correspondiente a la Figura 6C. Verde = células tumorales marcadas con Dendra2, Azul = macrófagos marcados con CFP, Rojo = suero sanguíneo marcado con tetrametilrodamina dextrano de 155 kDa. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El protocolo SWIP descrito aquí proporciona un método mejorado de estabilización del tejido pancreático mediante la utilización de una técnica de canasta de punto de cruz. Las primeras ventanas de imágenes abdominales (AIW, por sus siglas en inglés) permitieron la obtención de imágenes intravitales (IVI, por sus siglas en inglés) de los órganos internos del abdomen, pero no limitaron adecuadamente el movimiento de los tejidos blandos, como el páncreas. En respuesta, Park et al. desarrollaron una ventana de imágenes del páncreas (PIW, por sus siglas en inglés) que incorpora un estante metálico horizontal y permite una mejor estabilización del tejido del páncreas mientras mantiene el contacto con el cubreobjetos de vidrio. Si bien este abordaje mejora la estabilidad lateral, limita las imágenes de los tumores pancreáticos sólidos porque su tamaño excede el espacio estrecho entre el estante y el cubreobjetos. El SWIP aborda este problema estabilizando el páncreas con una canasta de punto de cruz, lo que limita el movimiento axial y lateral, al mismo tiempo que puede acomodar tumores sólidos grandes (≤10 mm).

Previamente se realizaron comparaciones directas del SWIP con ventanas de imagen previas, como AIW y PIW,¹⁵. Esto se muestra en la Figura 1, adaptada de Du et ^al.15, donde se cuantificaron los desplazamientos laterales y axiales mediante el seguimiento de características anatómicas celulares como núcleos o vasos sanguíneos. Todas las ventanas de imágenes mostraron la necesidad de un período de asentamiento durante aproximadamente la primera hora de la toma de imágenes. Durante este tiempo, se observó un mayor grado de movimiento lateral con el AIW y el PIW en comparación con el SWIP. También se observó un mayor desplazamiento axial con el AIW y el PIW en comparación con el SWIP durante un período de 2 h. En general, el SWIP mostró el nivel más bajo de deriva y es adecuado para la obtención de imágenes a largo plazo (≤12 h).

Desafortunadamente, el páncreas es un tejido altamente disperso y, como tal, la función de dispersión puntual para el microscopio multifotónico utilizado en IVI se degrada rápidamente con la penetración en el tejido. Por lo tanto, la profundidad de imagen con cualquiera de las ventanas ópticas está limitada a solo ~30-60 μm. IVI también conlleva el riesgo de daño inducido por la luz a la muestra. Esto se puede probar al comienzo de las sesiones de imágenes adquiriendo una serie temporal de 100 imágenes y buscando signos de fotoblanqueo o fotodaño. En nuestro sistema de microscopio, descubrimos que se puede utilizar una potencia máxima de ~15 mW en la muestra sin afectar negativamente al tejido.

El protocolo SWIP permite una IVI óptica estable, de alta resolución y de una sola célula del páncreas murino tanto en condiciones normales de salud como en estados enfermos como pancreatitis y PDAC. Esto hace que el SWIP sea particularmente útil para la obtención de imágenes de lapso de tiempo prolongado, así como para la realización de imágenes 3D y 4D (3D + tiempo) mediante la captura de múltiples cortes z (aprovechando las capacidades inherentes de seccionamiento óptico de la microscopía multifotónica y confocal). Al permitir la visualización in vivo de células individuales y sus interacciones con los constituyentes celulares del páncreas, la IVI de alta resolución resultará invaluable para comprender los mecanismos subyacentes a las enfermedades del páncreas.

Se necesita un cierto nivel de experiencia técnica para realizar el protocolo SWIP. Sin embargo, con la práctica adecuada y la atención a los pasos clave, el procedimiento se puede ejecutar con una alta tasa de éxito. Para obtener imágenes del páncreas maligno, es crucial tener primero un tumor implantado con éxito. Esto se obtiene mediante la inyección ortotópica de una suspensión de células de cáncer de páncreas murino en el páncreas del ratón. Una inyección exitosa se observa cuando el parénquima del páncreas se infla en una burbuja llena de líquido y ha sido descrita en detalle anteriormente²¹. Para garantizar el máximo éxito y supervivencia, es vital que haya una fuga mínima o nula de la suspensión celular, ya que la fuga reducirá drásticamente el tamaño potencial del tumor y conducirá a la carcinomatosis. Además, el páncreas es un órgano altamente vascularizado, con muchos vasos sanguíneos ramificados. Es fundamental evitar la laceración de cualquier vaso, ya que esto causará sangrado y hematoma posterior en el páncreas e inhibirá el crecimiento del tumor. En este modelo, hemos utilizado una línea celular PDAC singénica derivada de ratones KPC²⁰. Esto permite el injerto tumoral en ratones inmunocompetentes. Se pueden utilizar otras líneas celulares PDAC singénicas dependiendo de la cepa del ratón utilizado. También se pueden utilizar líneas celulares PDAC humanas; Sin embargo, la cepa de ratón debe estar inmunocomprometida para evitar el rechazo de la implantación del tumor.

El tamaño de los tumores sometidos a imágenes en este protocolo se puede modificar según sea necesario. Esto se puede lograr mediante el uso de una mayor concentración de células cancerosas implantadas en el páncreas murino para obtener un tumor más grande o mediante la extensión del tiempo de crecimiento del tumor antes de la implantación de la ventana. En este estudio, inyectamos 10⁶ células PDAC KPC e implantamos el SWIP 10-14 días después, cuando los tumores eran palpables. Los tumores más pequeños y más grandes también pueden ser acomodados por este protocolo SWIP utilizando la colocación adecuada del tejido en la canasta de punto de cruz.

La colocación segura de la ventana de imágenes y el páncreas también es crucial para obtener imágenes de alta calidad y limitar los artefactos de movimiento. El páncreas murino normal es muy dócil y propenso al movimiento de la respiración y el peristaltismo cercano. Para abordar esto y aumentar la estabilidad del páncreas durante la toma de imágenes, se utiliza una técnica de canasta de punto de cruz descrita anteriormente³¹. La canasta de punto de cruz está diseñada para imitar el uso de ligamentos del cuerpo. Al acunar el tejido contra el cubreobjetos de vidrio y aplicar una presión axial constante, evita el movimiento lateral y axial. Cuando se trata de tumores sólidos más grandes, el punto de apoyo y la dirección del punto de cruz se pueden modificar para adaptarse mejor al tamaño y la posición del tumor para un soporte óptimo.

Las imágenes subóptimas también pueden ocurrir cuando el marco de la ventana se implanta inadecuadamente en el abdomen del ratón. Un marco de ventana poco ajustado puede provocar dificultades en la obtención de imágenes y artefactos de movimiento. Una sutura adecuada puede abordar este problema asegurando el marco de la ventana al abdomen a través de la piel y la pared abdominal. Para evitar el pliegue excesivo de la piel al apretar la cuerda del bolso, los pasos de puntada no deben ser superiores a 5 mm entre los escalones que se colocan a no más de 1 mm del borde del tejido, asegurando un ajuste perfecto alrededor del marco de la ventana. Después de la sutura de la cuerda del bolso, la colocación del páncreas en la canasta de punto de cruz y la implantación del marco de la ventana, un último paso crítico es la colocación del adhesivo dentro del hueco del marco de la ventana. Es crucial que durante este paso, ningún adhesivo entre en contacto con el tejido pancreático, ya que esto dañará el tejido y confundirá las imágenes. Una posible modificación que también puede evitar que el pegamento entre en contacto con el tejido del páncreas es pegar el cubreobjetos de vidrio al marco de la ventana y dejar que ambos se sequen antes de la implantación quirúrgica en el abdomen.

El SWIP, al igual que todas las técnicas de imagen intravital, tiene limitaciones en su capacidad para revelar información sobre otras células y estructuras en el tejido que no están marcadas explícitamente. Sin embargo, la combinación de la ventana SWIP con reporteros fluorescentes (como los epitelios que expresan ECFP y las células KPC marcadas con Dendra2 como en este estudio) y el control de los estados de las proteínas o células con herramientas farmacológicas y/u optogenéticas puede eliminar estas limitaciones.

Además, el diseño de la ventana SWIP incluye tres líneas grabadas en el marco de la ventana, que sirven como marcadores de referencia para la microcartografía para relocalizar las áreas de interés durante la obtención de imágenes en serie³⁰. Esto permite localizar el mismo campo de visión varias veces, incluso en tejido no marcado.

En resumen, el SWIP se puede utilizar en tejido pancreático sano normal, así como en enfermedades pancreáticas benignas y malignas como la pancreatitis y el PDAC. La dinámica unicelular y subcelular se puede capturar en estos estados utilizando el SWIP y puede ayudar a los investigadores a comprender eventos fisiológicos importantes, como la diseminación metastásica en PDAC. La mejora de la calidad y la estabilidad de la IVI tienen el potencial de proporcionar información valiosa sobre la fisiopatología y la biología celular del páncreas, lo que la convierte en una herramienta prometedora y beneficiosa.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].