Summary
Bottherapie via endochondrale ossificatie door het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel geproduceerd uit mesenchymale stamcellen heeft het potentieel om de nadelen van conventionele therapieën te omzeilen. Hyaluronzuurhydrogels zijn effectief bij het opschalen van uniform gedifferentieerde kraakbeentransplantaten en bij het creëren van geïntegreerd bot met vascularisatie tussen gefuseerde transplantaten in vivo.
Abstract
Conventionele botregeneratietherapie met mesenchymale stamcellen (MSC's) is moeilijk toe te passen op botdefecten die groter zijn dan de kritische grootte, omdat het geen mechanisme heeft om angiogenese te induceren. Het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel vervaardigd uit MSC's induceert angiogenese en botvorming in vivo via endochondrale ossificatie (ECO). Daarom kan deze ECO-gemedieerde benadering in de toekomst een veelbelovende botregeneratietherapie zijn. Een belangrijk aspect van de klinische toepassing van deze ECO-gemedieerde benadering is het opstellen van een protocol voor het voorbereiden van voldoende kraakbeen om te worden geïmplanteerd om het botdefect te herstellen. Het is vooral niet praktisch om een enkele massa getransplanteerd kraakbeen te ontwerpen van een grootte die overeenkomt met de vorm van het eigenlijke botdefect. Daarom moet het te transplanteren kraakbeen de eigenschap hebben om integraal bot te vormen wanneer meerdere stukken worden geïmplanteerd. Hydrogels kunnen een aantrekkelijk hulpmiddel zijn voor het opschalen van weefselgemanipuleerde transplantaten voor endochondrale ossificatie om aan klinische vereisten te voldoen. Hoewel veel natuurlijk afgeleide hydrogels de vorming van MSC-kraakbeen in vitro en ECO in vivo ondersteunen, moet het optimale steigermateriaal om aan de behoeften van klinische toepassingen te voldoen nog worden bepaald. Hyaluronzuur (HA) is een cruciaal onderdeel van de extracellulaire matrix van het kraakbeen en is een biologisch afbreekbaar en biocompatibel polysacharide. Hier laten we zien dat HA-hydrogels uitstekende eigenschappen hebben om in vitro differentiatie van MSC-gebaseerd kraakbeenweefsel te ondersteunen en de endochondrale botvorming in vivo te bevorderen.
Introduction
Autoloog bot is nog steeds de gouden standaard voor het repareren van botdefecten als gevolg van trauma, aangeboren afwijkingen en chirurgische resectie. Autogene bottransplantatie heeft echter aanzienlijke beperkingen, waaronder donorpijn, risico op infectie en beperkt botvolume dat kan worden geïsoleerd van de patiënten 1,2,3,4. Er zijn tal van biomaterialen ontwikkeld als botvervangers, waarbij natuurlijke of synthetische polymeren worden gecombineerd met gemineraliseerde materialen zoals calciumfosfaat of hydroxyapatiet 5,6. Botvorming in deze gemanipuleerde materialen wordt meestal bereikt met behulp van het gemineraliseerde materiaal als priming-materiaal om stamcellen rechtstreeks te laten differentiëren in osteoblasten via het intramembraanossificatieproces (IMO)7. Dit proces mist de angiogene stap, wat resulteert in onvoldoende in vivo vascularisatie van het transplantaat na implantatie 8,9,10, en daarom zijn benaderingen met een dergelijk proces mogelijk niet optimaal voor de behandeling van grote botdefecten 11.
Strategieën die worden toegepast om het endochondrale ossificatieproces (ECO) te recapituleren, een aangeboren mechanisme in skeletogenese tijdens de ontwikkeling, blijken aanzienlijke problemen te overwinnen die verband houden met traditionele IMO-gebaseerde benaderingen. In ECO geven chondrocyten in het kraakbeensjabloon vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) af, die vasculaire infiltratie en remodellering van het kraakbeensjabloon in bot bevordert12. De ECO-gemedieerde benadering van osteogenese via kraakbeenremodellering en angiogenese, die ook wordt geactiveerd tijdens fractuurherstel, maakt gebruik van kunstmatig gecreëerd kraakbeenweefsel afgeleid van MSC's als primingmateriaal. Chondrocyten kunnen hypoxie bij botdefecten verdragen, angiogenese induceren en een vasculairvrij kraakbeentransplantaat omzetten in angiogeen weefsel. Talrijke studies hebben gemeld dat op MSC gebaseerde kraakbeentransplantaten in vivo bot genereren door een dergelijk ECO-programma te implementeren 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Een essentiële vereiste voor de klinische toepassing van deze ECO-gemedieerde benadering is hoe de gewenste hoeveelheid kraakbeentransplantaat in een klinische setting kan worden bereid. Het bereiden van klinisch kraakbeen van een grootte die past bij het werkelijke botdefect is niet praktisch. Daarom moet transplantaatkraakbeen integraal bot vormen wanneer meerdere fragmenten worden geïmplanteerd22. Hydrogels kunnen een aantrekkelijk hulpmiddel zijn voor het opschalen van weefselgemanipuleerde transplantaten voor endochondrale ossificatie. Veel natuurlijk afgeleide hydrogels ondersteunen de vorming van MSC-kraakbeen in vitro en ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Het optimale ondersteuningsmateriaal om aan de klinische toepassingsvereisten te voldoen, is echter onbepaald gebleven. Hyaluronzuur (HA) is een biologisch afbreekbaar en biocompatibel polysacharide dat aanwezig is in de extracellulaire matrix van kraakbeen33. HA interageert met MSC's via oppervlaktereceptoren zoals CD44 om chondrogene differentiatie te ondersteunen 25,26,28,30,31,32,34. Bovendien bevorderen HA-steigers IMO-gemedieerde osteogene differentiatie van menselijke tandpulpstamcellen35, en scaffolds in combinatie met collageen bevorderen ECO-gemedieerde osteogenese36,37.
Hier presenteren we een methode voor het bereiden van HA-hydrogels met behulp van beenmerg-afgeleide volwassen menselijke MSC's en hun gebruik voor hypertrofische chondrogenese in vitro en daaropvolgende endochondrale ossificatie in vivo38. We vergeleken de eigenschappen van HA met die van collageen, een materiaal dat veel wordt toegepast in botweefselengineering met MSC's en een bruikbaar materiaal voor het opschalen van kunstmatige transplantaten voor endochondrale ossificatie17. In een immuungecompromitteerd muismodel werden HA- en collageenconstructen gezaaid met menselijke MSC's geëvalueerd op in vivo ECO-potentieel door subcutane implantatie. De resultaten tonen aan dat HA-hydrogels uitstekend geschikt zijn als steiger voor MSC's om kunstmatige kraakbeentransplantaten te maken die botvorming door middel van ECO mogelijk maken.
Het protocol is opgedeeld in twee stappen. Eerst worden constructen van menselijke MSC's gezaaid op hyaluronzuurhydrogel bereid en gedifferentieerd tot hypertrofisch kraakbeen in vitro. Vervolgens worden de gedifferentieerde constructen subcutaan geïmplanteerd in een naaktmodel om endochondrale ossificatie in vivo te induceren (Figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol maakt gebruik van mannelijke naaktmuizen van 4 weken oud. Huisvest vier muizen in een kooi onder een licht/donker-cyclus van 12 uur bij 22−24 °C en een relatieve luchtvochtigheid van 50%−70%. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Tokyo Medical and Dental University (goedkeurings-ID: A2019-204C, A2020-116A en A2021-121A).
1. Bereiding van buffers en reagentia
- Bereid mesenchymale stamcelgroeimedium (MSC-groeimedium) voor door de supplementenkit van MSC-groeimedium toe te voegen aan MSC-basale media en bewaar deze bij 4 °C.
- Bereid Dulbecco's Modified Eagle Medium en Ham's F12 (DMEM/F-12) medium door 10% foetaal runderserum (FBS), 50 μg/ml gentamicine, 200 μM L-alanyl-L-glutamine en 1 ng/ml basisch fibroblastische groeifactor aan het medium toe te voegen en bewaar het bij 4 °C.
- Bereid chondrogenisch medium door vlak voor gebruik 1% ITS-G-supplement, 0,12% runderserumalbumine, 50 μg/ml gentamicine, 0,35 mM L-proline, 100 nM dexamethason en 10 ng/ml TGF-β3 aan DMEM toe te voegen.
- Bereid hypertrofisch medium door vlak voor gebruik 10 mM β-glycerofosfaat, 0,12% runderserumalbumine, 10 nM dexamethason, 200 μM ascorbaat-2-fosfaat, 50 nM L-thyroxine, 50 μg/ml gentamycine en 50 pg/ml IL-1β aan DMEM toe te voegen.
- Bestrijk een kweekschaal met 24 wells met 200 μl gesmolten paraffine voorverwarmd op 60 °C. Laat op kamertemperatuur staan tot de paraffine is uitgehard.
2. Uitbreiding van menselijke MSC's
OPMERKING: Voorafgaand aan de start van de experimenten moeten MSC's met een hoog potentieel voor MSC-chondrogenese worden geselecteerd in micromassacultuur zoals beschreven in17.
- Kweek volgens de instructies van de fabrikant primaire MSC's uit menselijk beenmerg (passage 2) met MSC-groeimedium in een schaal van 10 cm met een dichtheid van 5 x 103 cellen/cm2 bij 37 °C in 5% CO2 en 95% bevochtigde luchtincubator.
- Vervang het medium elke 2-3 dagen. Zodra de cellen 80%-90% confluentie hebben bereikt, zuigt u het medium uit de celkweekschaal op met behulp van een vacuümpomp, wast u met 5 ml PBS en zuigt u de oplossing vervolgens op met een vacuümpomp.
- Voeg 1 ml 0,05% trypsine/0,02% EDTA-oplossing toe aan het gerecht. Incubeer de schaal 5-10 min op 37 °C.
- Voeg 1 ml MSC-groeimedium toe om de enzymatische reactie te stoppen. Breng de celsuspensie over in een buisje van 50 ml.
- Combineer de celsuspensie van andere gerechten in de tube van 50 ml en bewaar deze op ijs.
- Gebruik de cellenteller om de cellen te tellen door 10 μL van de celsuspensie te mengen met 10 μL 0,4% trypan blue stain.
- Centrifugeer de resterende celsuspensie bij 220 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatans en voeg cryopreservatie-oplossing toe in een concentratie van 1,0 x 106 cellen per ml.
- Doseer 1 ml van de celsuspensie in elke cryobuis en bewaar deze gedurende 12 uur bij -80 °C voordat deze wordt overgebracht naar vloeibare stikstof. Voor dit protocol worden de resulterende bevroren voorraden (passage 3) gebruikt.
- Zaai voor de experimenten de gevulde MSC's in een schaal van 10 cm met een dichtheid van 5 x 103 cellen/cm2. Kweekcellen tot 80%-90% confluent (passage 4) in DMEM/F-12 medium.
3. Bereiding van MSC-ingekapselde hydrogels
- Trypsiniseer de cellen en bereid de celsuspensie voor zoals beschreven in de stappen 2.3 - 2.6.
- Om 10 constructen te maken (2,5 x 10 5 cellen per construct), aliquoteert u de celsuspensie met 2,5 x 106 cellen in een microbuis van1,5 ml.
- Centrifugeer de suspensie op 220 x g gedurende 3 minuten, verwijder het supernatans met een vacuümpomp en bewaar het op ijs.
- Breng de met thiol gemodificeerd hyaluronzuur (HA), thiolreactieve crosslinker, polyethyleenglycoldiacrylaat en ontgaste waterflessen op kamertemperatuur.
- Voeg onder steriele omstandigheden 1,0 ml ontgast water toe aan de HA-bevattende fles (zie instructies van de fabrikant) met behulp van een injectiespuit met een naald.
- Vortex af en toe opwarmen tot 37 °C totdat de oplossing helder is en vervolgens op ijs plaatsen. Het duurt minder dan 30 minuten voordat de vaste stoffen volledig zijn opgelost.
- Voeg onder steriele omstandigheden 0,5 ml ontgast water toe aan de crosslinkerfles met behulp van een spuit met een naald. Los op door meerdere keren om te keren en leg ze vervolgens op ijs.
- Voeg 120 μl van de opgeloste HA-oplossing toe aan de gealiquoteerde celpellet (2,5 x 106 cellen). Resuspendeer de celpellet door heen en weer te pipetteren.
- Voeg 30 μL van de opgeloste crosslinkeroplossing toe aan het buisje met het HA en de cellen (stap 3.8) en combineer door op het buisje te tikken en draai het dan kort naar beneden. Combineer de HA-oplossing en de crosslinker-oplossing in een verhouding van 4:1.
- Laat 15 μl van de gecombineerde oplossing met MSC's (2,5 x 10,5 cellen) op de met paraffine beklede plaat met 24 putjes vallen en laat deze gedurende 30 minuten stollen bij 37 °C (figuur 2). Bereid vanwege de hoge viscositeit ten minste 10% meer van het cel/hydrogelmengsel dan nodig is.
OPMERKING: De kenmerken van de hydrogel zijn eerder beschreven39.
4. Voorwaarden voor in-vitrodifferentiatie
- Voeg 0,5 ml chondrogenisch differentiatiemedium toe aan een constructie van MSC-gezaaide HA-hydrogels. Vervang het medium elke 2-3 dagen.
- Schakel na 3 weken over op hypertrofisch differentiatiemedium (0,5 ml per putje) en kweek de constructen nog eens 2 weken.
5. In vivo implantatie van MSC's
- Na in totaal 5 weken in-vitrokweek, implanteert u de constructen subcutaan in de rug van naakte muizen zoals eerder beschreven38,40.
- Weeg muizen en dien een combinatie-anestheticum toe dat is bereid met 0,75 mg/kg lichaamsgewicht (lichaamsgewicht) medetomidine, 4,0 mg/kg lichaamsgewicht midazolam en 5,0 mg/kg lichaamsgewicht butorfanol via intraperitoneale injectie zoals beschreven38.
- Bevestig adequate anesthesie door immobiliteit voor chirurgische stimuli en controleer de ademhalingsdiepte door langzame, regelmatige borstbewegingen en een goede zuurstoftoevoer door de kleur van het roze slijmvlies periodiek tijdens de operatie. Gebruik veterinaire zalf op de ogen om uitdroging tijdens anesthesie te voorkomen.
- Plaats de muis op een steriel chirurgisch laken in buikligging, steriliseer de incisieplaats met 50 ppm hypochloorzuur water (pH 5,0; HAW), en plaats een geperforeerd chirurgisch laken over de muis.
NOTITIE: Steriliseer alle chirurgische materialen in een autoclaaf, ethyleenoxidegas of HAW. De chirurgen moeten hun vingers wassen en operatiejassen en handschoenen dragen. - Maak met een schaar twee 5 mm lange huidincisies met een tussenruimte van 2 cm in de schouder- en heupgebieden langs de middellijn van de wervelkolom.
- Steek een spatel onderhuids door de incisie om een onderhuidse zak te creëren.
- Steek twee tot drie constructies (elk ~15 μL, stap 5.1) met een pincet in elke zak. HA-constructies die in dezelfde zak worden geïmplanteerd, zijn zeer vaak vatbaar voor fusie. Om fusie te voorkomen, steekt u één HA-constructie in elke zak.
- Sluit de incisies met 4-0 gevlochten zijden hechtingen. Injecteer de muis met een antagonist voor anesthetica bereid met 0,75 mg/kg lichaamsgewicht atipamezol zoals beschreven38.
- Terwijl de muizen herstellen van anesthesie, plaatst u de muizen in steriele herstelkooien met steriel vloerbeddengoed zonder voedsel- en waterflessen en bewaakt u continu de lichaamstemperatuur, hartslag en ademhaling.
- Laat de muizen niet onbeheerd achter totdat ze weer voldoende bij bewustzijn zijn om sternale lighouding te behouden. Breng de dieren na volledig herstel terug naar de fokkamer met de andere dieren.
- Controleer de dieren tijdens de genezingsperiode om de paar dagen op mogelijke complicaties. Euthanaseer de muizen door kooldioxide-inhalatie met weinig lijden 4 en 8 weken na implantatie.
- Snijd de huid op de getransplanteerde plaatsen in en verwijder de geïmplanteerde constructies met een pincet. Fixeer de constructen gedurende 16 uur in 4% paraformaldehyde en onderwerp ze vervolgens aan analyse.
6. Statistische analyse
- Rapporteer kwantitatieve gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Voer statistische analyses uit met behulp van commerciële software.
- Gebruik de Student's t-toets of eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest om significante verschillen tussen groepen vast te stellen. p<0,05 en p<0,01 duiden op significante verschillen tussen twee groepen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MSC-ingekapselde HA-hydrogels werden gekweekt in chondrogenisch medium aangevuld met TGFβ3, een inductor van chondrogenese41 (stap 4.1). We vergeleken de eigenschappen van HA met die van collageen, waarvan is aangetoond dat het effectief is bij het maken van op MSC gebaseerde kunstmatige kraakbeentransplantaten voor endochondrale ossificatie, zoals eerder beschreven38. Ongedifferentieerde MSC's werden niet opgenomen als negatieve controles in deze studie omdat is aangetoond dat ongedifferentieerde MSC's gemineraliseerde oppervlakken nodig hebben als priming-substraat om bot te genereren door osteogene differentiatie (d.w.z. intramembraanossificatie)7.
De grootte van de hyaluronzuurhydrogels veranderde niet gedurende de in-vitrocultuurperiode , zoals beoordeeld op basis van diameters gemeten onder een omgekeerde microscoop, terwijl de collageenhydrogels die voor vergelijking werden gebruikt, kort na het begin van de kweek begonnen te krimpen. Om het verschil in grootte tussen de HA- en collageenconstructen na in-vitrokweek te verminderen, werden het aantal MSC's en het volume van de gel die werd gebruikt om de HA-hydrogels te maken, gehalveerd in vergelijking met die voor de collageenhydrogels. Het natte gewicht van de HA-constructen na 3 weken kraakbeenkweek was echter 4x zwaarder dan dat van de collageenconstructen.
Chondrogene en hypertrofische differentiatie in vitro.
Na chondrogene differentiatie (in week 3 van de in-vitrokweek ), gesulfateerde glycosaminoglycanen (sGAG)-positief (Safranine O/snelle groene kleuring; Figuur 3A) en type II collageen-positieve extracellulaire matrix werd waargenomen in beide constructen, wat aangeeft dat zowel HA als collageenhydrogels chondrogenese ondersteunden. In vergelijking met het collageenconstruct was de verdeling van sGAG, type II collageen (Col II) en type X collageen (Col X) echter homogener door het weefsel in de HA-constructen. Verschillen tussen de twee constructen waren ook duidelijk in de celmorfologie: cellen met een chondrocytachtige afgeronde morfologie waren verdeeld over het weefsel in de HA-constructen. In de collageenconstructen vertoonden cellen in de periferie echter een heterogene morfologie, variërend van onregelmatig/uitgerekt tot afgeronde morfologie. In overeenstemming hiermee was de gemiddelde rondheid van cellen in de HA-constructen hoger dan in de collageenconstructen, zowel in de periferie als in de centrale regio's (respectievelijk 34% versus 77,6% (p<0,01) en 78,3% versus 100% (p<0,05); Figuur 3B). Na 5 weken kweek werd calciumafzetting gedetecteerd aan de buitenranden in beide constructen (alizarinerood; Figuur 3C). Bovendien werd de expressie van chondrogene (Sox-9, aggrecan (ACAN), Col II), hypertrofische (Col X, matrix metallopeptidase 13 (MMP-13)), en osteogene (type I collageen (Col I), botsialoproteïne (BSP), osteocalcine (OCN)) markers14 gedetecteerd door kwantitatieve real-time RT-PCR, wat de progressie van chondrogene en hypertrofische differentiatie tijdens in vitro kweek bevestigt (Figuur 4).
Endochondrale ossificatie van subcutaan geïmplanteerde constructen in vivo.
Er werden onderhuidse pockets gemaakt op de rug van naakte muizen en twee tot drie constructen werden in elke pocket geïmplanteerd na hypertrofische differentiatie (in week 5 van de in-vitrokweek). 4 of 8 weken na implantatie waren alle HA-constructen aan elkaar bevestigd in de geïmplanteerde pockets (tabel 1). In de collageenconstructies werd adhesie waargenomen in 60% van de pockets, terwijl in de overige pockets de grafts onafhankelijk van elkaar waren. Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) toonde aan dat in beide constructen 8 weken na implantatie osteoïde weefsel met lamellaire morfologie werd gevormd in de buitenste regionen van de constructen (Figuur 5Aa,f). sGAG-kleuring verdween in de HA-constructen, wat wijst op het verlies van hun kraakbeenfenotype (Figuur 5Ah). In beide constructen werd een beenmergcomponent met hematopoëtische cellen en vetweefsel gevormd tussen het binnenste kraakbeen en de buitenste osteoïde weefsels. In alle HA-constructen waren de botweefsels van de gefuseerde constructen verbonden en omgeven door gewrichtsvezelig weefsel en beenmerg dat zich ontwikkelde langs de ruimte tussen de twee aanhangende constructen, wat aangeeft dat meerdere HA-constructen de neiging hebben om geïntegreerd botweefsel te vormen (Figuur 5Ag). De aangehechte collageenconstructen waren op dezelfde manier geïntegreerd in twee van de drie gefuseerde gevallen, maar in het derde geval was het botweefsel van de twee constructen niet verbonden (Tabel 1 en Figuur 5Ab). In beide constructen werden vaten geïdentificeerd door CD31-positieve endotheelcellen42 waargenomen in het beenmerg (figuren 5Ad,i), en de binnenste kraakbeengebieden waren omgeven door TRAP-positieve meerkernige cellen van de osteoclastlijn, wat aangeeft dat kraakbeenweefsel onderhevig was aan remodellering (figuren 5Ae,j).
Mineraal werd afgezet in het buitenste osteoïde gebied in zowel HA- als collageenconstructen (Figuur 5B). Hoewel de totale mineraaldichtheid van het nieuwe bot vergelijkbaar was tussen HA- en collageenconstructen, was het mineraalvolume significant hoger in de HA-constructen dan dat in de collageenconstructen, wat een weerspiegeling kan zijn van het feit dat HA-hydrogels niet krimpten tijdens in-vitrokweek , wat resulteerde in grotere constructen dan collageenhydrogels (Figuur 5C, D).
Figuur 1: Experimenteel ontwerp. De eerste stap van dit protocol is het inkapselen van verlengde MSC's in HA-hydrogels om chondrogene en hypertrofische differentiatie in vitro te bevorderen. Constructen worden gekweekt in chondrogene differentiatiecondities gedurende 3 weken, gevolgd door nog eens 2 weken in hypertrofische differentiatiecondities. De tweede stap van dit protocol is het subcutaan implanteren van de constructen in naakte muizen in week 5 van de in-vitrokweek om gedurende 8 weken endochondrale ossificatie in vivo te ondergaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bereiding van MSC's-gezaaide hydrogels. Druppel gemodificeerde HA/crosslinker-oplossing met MSC's op een met paraffine beklede plaat met 24 putjes en laat gedurende 30 minuten stollen bij 37 °C. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Histologische en immunohistochemische analyse van HA- en collageenconstructen na in-vitrokweek 22. (A) Constructen na 3 weken (3W) in-vitrokweek werden gekleurd voor sGAG (safranine O/fast green), type II collageen (Col II) en type X collageen (Col X). (B) De gemiddelde circulariteitswaarden van cellen na 3 weken in-vitrokweek (n = 5). Open en grijze balken duiden respectievelijk op collageen- en HA-constructen. Groepen zonder gemeenschappelijke letter zijn statistisch verschillend (a versus b, p<0,01; b versus c, p<0,05). (C) Constructen na 5 weken (5W) in-vitrokweek werden gekleurd voor calcium (alizarinerood). Alle foto's zijn gemaakt met dezelfde vergroting (schaalbalk: 200 μm). Een overzicht met een lage vergroting van het gehele weefsel wordt weergegeven in de inzetstukken (schaalbalk: 1 mm). Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest, werd gebruikt om significante verschillen tussen groepen vast te stellen. Dit cijfer is gewijzigd van38. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Genexpressie-analyse van HA- en collageenconstructen na 3 en 5 weken in-vitrokweek. (A) Chondrogene en hypertrofische markers. (B) Osteogene markers. De waarden worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) (n = 3). Niet-gedifferentieerde MSC's brachten hoge niveaus van Col I en MMP-13 en lage niveaus van Sox-9 en Col X tot expressie; ze hebben niet uitgedrukt (#) ACAN, Col II, BSP en OCN. Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Dit cijfer is gewijzigd van38. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Immunohistochemische analyse en verkalking van HA- en collageenconstructen na implantatie na 8 weken. (A) Constructen werden gekleurd voor hematoxyline en eosine (H&E, a, b, f en g), safranine O/Fast Green (c en h), endotheelcellen (Cluster of Differentiation 31, CD31) (d en i) en tartraatresistente zure fosfatase (TRAP, e en j). (a en f) Overzicht van de gehele weefsels (schaalbalk = 500 μm). H&E, safranine O, CD31: schaalbalk = 200 μm; TRAP: schaalbalk = 50 μm. Pijlen geven CD31-positieve endotheelcellen aan. Afkortingen: c = binnenlijk kraakbeenweefsel; o = uitwendig osteoïde weefsel. (B) MicroCT (μCT) beeldvorming van collageen- en HA-constructen (hoofd- en inzetbeeldschaalbalken = 2 mm). (C,D) De totale mineraaldichtheid (C) en het volume (D) van HA en collageen constructen (n = 4). ** geeft significante verschillen aan; blz <0,01. Per groep werden vier constructen geanalyseerd met behulp van μCT. Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De t-toets van de student werd gebruikt om significante verschillen tussen groepen vast te stellen. Dit cijfer is gewijzigd van38. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Strategie voor het faciliteren van ECO's met behulp van op HA gebaseerd kunstmatig kraakbeen. Schematisch diagram van ossificatie en beenmergontwikkeling zonder en met fragmentatie (μ-pellets) van geïmplanteerde HA-constructen. (A) HA-hydrogels hebben een uitstekende fusieneiging om een geïntegreerd bot te vormen met vascularisatie en beenmergontwikkeling tussen gefuseerde transplantaten in vivo. Het resulterende geïmplanteerde weefsel bleef echter zelfs 8 weken na implantatie overwegend in kraakbeentoestand. (B) Gezien de neiging van HA-constructen om samen te smelten om geïntegreerd bot te vormen, kan het verwerken van HA-constructen tot μ-pellets de remodelleringssnelheid van getransplanteerd weefsel versnellen en botvorming bevorderen. Het microniseren van de constructen vergroot het oppervlak, wat de resorptie van kraakbeenweefsel en de vorming van botweefsel kan bevorderen en kan ook angiogenese en beenmergontwikkeling bevorderen vanwege de grotere ruimte voor infiltratie van gastheercellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Hydrogel | Experimenten | Nageleefd | Verenigd | % Verenigd |
| Collageen | 5 | 3 | 2 | 40 |
| HA | 5 | 5 | 5 | 100 |
Tabel 1: Unificatiesnelheid wanneer meerdere constructen in een enkele pocket werden geïmplanteerd. Twee of drie constructen werden subcutaan geïmplanteerd in een enkele zak. Constructen werden 4 of 8 weken na implantatie geoogst en histologisch onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van geschikte steigermaterialen die de overgang van hypertrofisch kraakbeen naar bot bevorderen, is een veelbelovende benadering om op MSC gebaseerde gemanipuleerde hypertrofische kraakbeentransplantaten op te schalen en botdefecten van klinisch significante grootte te behandelen. Hier laten we zien dat HA een uitstekend steigermateriaal is om de differentiatie van MSC-gebaseerd hypertrofisch kraakbeenweefsel in vitro te ondersteunen en om endochondrale botvorming in vivo te bevorderen 38. Bovendien werd in vivo aangetoond dat HA-constructen de fusie van meerdere constructen die in dezelfde zak zijn geïmplanteerd, vergemakkelijken om een enkel geïntegreerd bot te vormen. Omdat de interactie van MSC's met steigermaterialen een aanzienlijke invloed heeft op kraakbeen en hypertrofische chondrogenese, is het selecteren van geschikt steigermateriaal voor ECO's belangrijk voor het genereren van klinisch effectieve weefselgemanipuleerde kraakbeentransplantaten. Cellen ingebed in HA-hydrogels vertonen uniform een afgeronde morfologie die kenmerkend is voor chondrocyten van het centrum naar de periferie, wat aangeeft dat hyaluronzuur een omgeving biedt die bevorderlijk is voor uniforme kraakbeenvorming in de hydrogel21,30. In tegenstelling tot HA interageert collageen met MSC's via integrinebindingsequenties (RGD's); de persistentie van deze interactie verhindert echter dat MSC's verder differentiëren in de chondrogene route43, wat de niet-typische chondrocytcelmorfologie kan verklaren die prominent aanwezig is in de periferie van collageenconstructies.
Als meerdere transplantaten zich verenigen om één bot te vormen, kan deze ECO-gemedieerde benadering worden uitgebreid naar meer klinisch relevante botdefecten. Wanneer meerdere op MSC gebaseerde en steigervrije hypertrofische kraakbeensoorten werden toegepast op een enkel botdefect, werd gemeld dat de kraakbeentransplantaten integreerden met het botdefect. Aangrenzende grafts integreerden echter niet met elkaar22. De hier gepresenteerde aanpak kan een mogelijke oplossing bieden om deze beperking te overwinnen. In vergelijking met collageenconstructen hadden meerdere transplantaten van HA-constructen een grotere neiging om samen te smelten om een enkel bot te vormen. Bovendien werd beenmerg gevormd tussen gefuseerde HA-constructen, wat verband kan houden met het feit dat HA uniforme kraakbeendifferentiatie door de hydrogel ondersteunt, omdat hypertrofisch kraakbeen VEGF afscheidt en een omgeving biedt voor de hematopoëtische stamcelniche bij de ontwikkeling van beenmerg44.
De sleutel tot een succesvol experiment met dit protocol is de kwaliteit van MSC's. Het is aan te raden om vooraf te bevestigen dat de te gebruiken MSC's een voldoende hoog chondrogene differentiatiepotentieel hebben. Ten tweede mag de grootte van elke constructie niet te groot zijn. Onze ervaring is dat het volume van een enkel construct beperkt is tot 10-15 μL. Grotere constructen kunnen resulteren in onvoldoende penetratie van zuurstof en voedingsstoffen in de constructen, wat leidt tot necrose en slechte differentiatie in het midden van de constructen. Daarom moet de geldikte worden verminderd om de penetratie van zuurstof en voedingsstoffen te verbeteren. Om de dikte van de gel te verminderen, kan het nuttig zijn om dunne gels te maken op het poreuze membraan van Transwell-inzetstukken14,45. Als alternatief, omdat HA-constructen de neiging hebben om te fuseren en geïntegreerd bot te vormen, kan het voldoende zijn om veel kleinere constructen te implanteren in plaats van een enkel groot construct, zoals hieronder wordt besproken.
Beperkingen van deze studie zijn onder meer de noodzaak om de remodelleringssnelheid van de geïmplanteerde weefsels te versnellen om botvorming te vergemakkelijken. Het geïmplanteerde gemanipuleerde weefsel bleef zelfs 8 weken na implantatie voornamelijk in een hypertrofische verkalkte kraakbeentoestand. Bij botvorming via de ECO-route spelen van de gastheer afgeleide cellen een cruciale rol bij het bevorderen van ECO16,46. Van het bieden van extra kanalen in hypertrofische kraakbeentransplantaten is gemeld dat het vasculaire invasie en transplantaatmineralisatie in vivo bevordert20. Dergelijke kanalen dienen als kanalen voor de infiltratie van gastheercellen, waaronder osteoblasten, osteoclasten en hematopoëtische precursoren, om nieuw weefsel binnen het construct te vormen. Als alternatief is gemeld dat meerdere kleine fibrine-ingekapselde pellets (μ-pellets) bestaande uit chondrogene gedifferentieerde MSC's kunnen worden geïmplanteerd om geïntegreerd botte vormen 47. Het verwerken van HA-constructen tot μ-pellets zou het oppervlak omgeven door TRAP-positieve osteoclasten kunnen vergroten, waardoor de remodelleringssnelheid van kraakbeenweefsel wordt bevorderd en de osteogenese wordt verbeterd (Figuur 6)21,48. Bovendien zou implantatie van μ-pellets de infiltratieruimte van gastheercellen vergroten, waardoor angiogenese en beenmergontwikkeling worden vergemakkelijkt en integrale botvorming wordt gegenereerd met overvloedige vascularisatie. Dus, gezien de neiging van HA-constructen om te fuseren en geïntegreerd bot te creëren, kan deze μ-geconstrueerde botregeneratiestrategie het ECO-proces van hypertrofische kraakbeentransplantaten met behulp van HA-hydrogels versnellen.
Concluderend zijn HA-hydrogels effectief in het opschalen van weefsel-gemanipuleerde transplantaten met minder cellen en gels dan collageenhydrogels. Bovendien hebben HA-hydrogels een uitstekende fusiegevoeligheid en produceren ze geïntegreerd bot met vascularisatie en beenmergontwikkeling tussen gefuseerde transplantaten. Daarom kan modificatie van HA-constructen om de infiltratie van gastheercellen en de hermodellering van transplantaten te bevorderen, leiden tot de ontwikkeling van implanteerbare materialen die de vascularisatie en de ontwikkeling van beenmerg verder kunnen bevorderen. Met verdere optimalisatie zou deze aanpak een veelbelovend alternatief kunnen zijn voor de huidige bottherapieën in de maxillofaciale en orthopedische chirurgie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (subsidienrs. JP19K10259 en 22K10032 naar MAI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
| Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
| Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
| basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
| bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
| Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
| dexamethasone | Merck | D8893 | |
| Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| Dormicum | Astellas Pharma | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
| Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
| Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
| HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
| IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
| ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
| L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
| L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
| L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
| MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
| paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
| PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
| TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
| Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
| Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
| β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |
References
- Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
- Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
- Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
- Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A.
- Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
- Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D.
- Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
- Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
- Kronenberg, H. M.
- Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
- Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
- Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
- Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
- Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
- Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
- van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
- Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
- Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
- Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
- Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
- Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
- Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
- Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
- Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
- Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
- Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton's jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
- Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
- Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
- Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
- La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
- Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O'Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
- Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
- Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
- Zarembinski, T., Skardal, A. Hydrogels - Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
- Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
- Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
- Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
- Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
- Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
- Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).
