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Biology

Formación ósea integrada a través de la osificación endocondral in vivo utilizando células madre mesenquimales

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65573
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,3
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Summary

La terapia ósea a través de la osificación endocondral mediante la implantación de tejido cartilaginoso artificial producido a partir de células madre mesenquimales tiene el potencial de eludir los inconvenientes de las terapias convencionales. Los hidrogeles de ácido hialurónico son eficaces para escalar injertos de cartílago uniformemente diferenciados, así como para crear hueso integrado con vascularización entre injertos fusionados in vivo.

Abstract

La terapia convencional de regeneración ósea con células madre mesenquimales (MSC) es difícil de aplicar a defectos óseos más grandes que el tamaño crítico porque no tiene un mecanismo para inducir la angiogénesis. La implantación de tejido cartilaginoso artificial fabricado a partir de MSC induce la angiogénesis y la formación ósea in vivo a través de la osificación endocondral (ECO). Por lo tanto, este enfoque mediado por ECO puede ser una terapia de regeneración ósea prometedora en el futuro. Un aspecto importante de la aplicación clínica de este enfoque mediado por ECO es el establecimiento de un protocolo para preparar suficiente cartílago para ser implantado para reparar el defecto óseo. Especialmente no es práctico diseñar una sola masa de cartílago injertado de un tamaño que se ajuste a la forma del defecto óseo real. Por lo tanto, el cartílago a trasplantar debe tener la propiedad de formar hueso de forma integral cuando se implantan múltiples piezas. Los hidrogeles pueden ser una herramienta atractiva para ampliar los injertos de ingeniería tisular para la osificación endocondral con el fin de cumplir con los requisitos clínicos. Aunque muchos hidrogeles de origen natural apoyan la formación de cartílago MSC in vitro y ECO in vivo, aún no se ha determinado el material de andamio óptimo para satisfacer las necesidades de las aplicaciones clínicas. El ácido hialurónico (AH) es un componente crucial de la matriz extracelular del cartílago y es un polisacárido biodegradable y biocompatible. Aquí, demostramos que los hidrogeles de HA tienen excelentes propiedades para apoyar la diferenciación in vitro del tejido cartilaginoso basado en MSC y promover la formación de hueso endocondral in vivo.

Introduction

El hueso autólogo sigue siendo el estándar de oro para reparar defectos óseos debidos a traumatismos, defectos congénitos y resección quirúrgica. Sin embargo, el injerto óseo autógeno tiene limitaciones significativas, incluyendo dolor del donante, riesgo de infección y volumen óseo limitado que puede ser aislado de los pacientes 1,2,3,4. Se han desarrollado numerosos biomateriales como sustitutos óseos, combinando polímeros naturales o sintéticos con materiales mineralizados como el fosfato cálcico o la hidroxiapatita 5,6. La formación ósea en estos materiales de ingeniería generalmente se logra utilizando el material mineralizado como material de cebado para permitir que las células madre se diferencien directamente en osteoblastos a través del proceso de osificación intramembrana (IMO)7. Este proceso carece de la etapa angiogénica, lo que resulta en una vascularización in vivo insuficiente del injerto después de la implantación 8,9,10 y, por lo tanto, los abordajes que utilizan dicho proceso pueden no ser óptimos para el tratamiento de grandes defectos óseos 11.

Se ha demostrado que las estrategias aplicadas para recapitular el proceso de osificación endocondral (ECO), un mecanismo innato en la esquelectogénesis durante el desarrollo, superan problemas significativos asociados con los enfoques tradicionales basados en OMI. En la ECO, los condrocitos de la plantilla del cartílago liberan el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que promueve la infiltración vascular y la remodelación de la plantilla del cartílago en el hueso12. El enfoque mediado por ECO para la osteogénesis a través de la remodelación del cartílago y la angiogénesis, que también se activa durante la reparación de fracturas, utiliza tejido cartilaginoso creado artificialmente derivado de MSC como material de cebado. Los condrocitos pueden tolerar la hipoxia en defectos óseos, inducir angiogénesis y convertir un injerto de cartílago libre vascular en tejido angiogénico. Numerosos estudios han reportado que los injertos de cartílago basados en MSC generan hueso in vivo mediante la implementación de un programa ECO de este tipo 13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Un requisito esencial para la aplicación clínica de este enfoque ecomediado es cómo preparar la cantidad deseada de injerto de cartílago en un entorno clínico. Preparar cartílago clínico de un tamaño que se ajuste al defecto óseo real no es práctico. Por lo tanto, el cartílago del injerto debe formar hueso integralmente cuando se implantan múltiples fragmentos22. Los hidrogeles pueden ser una herramienta atractiva para ampliar los injertos de ingeniería tisular para la osificación endocondral. Muchos hidrogeles de origen natural favorecen la formación de cartílago MSC in vitro y ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; sin embargo, aún no se ha determinado el material de soporte óptimo para cumplir con los requisitos de la aplicación clínica. El ácido hialurónico (AH) es un polisacárido biodegradable y biocompatible presente en la matriz extracelular del cartílago33. El AH interactúa con las MSC a través de receptores de superficie como CD44 para apoyar la diferenciación condrogénica 25,26,28,30,31,32,34. Además, los andamios de AH promueven la diferenciación osteogénica mediada por IMO de las células madre de la pulpa dental humana35, y los andamios combinados con colágeno promueven la osteogénesis mediada por ECO36,37.

En este trabajo se presenta un método para la preparación de hidrogeles de AH utilizando MSCs humanas adultas derivadas de la médula ósea y su uso para la condrogénesis hipertrófica in vitro y la posterior osificación endocondral in vivo38. Comparamos las características del AH con las del colágeno, un material ampliamente aplicado en la ingeniería de tejidos óseos con MSCs y un material útil para el escalado de injertos artificiales para la osificación endocondral17. En un modelo de ratón inmunodeprimido, se evaluó el potencial de ECO in vivo de las construcciones de AH y colágeno sembradas con MSC humanas mediante implantación subcutánea. Los resultados muestran que los hidrogeles de HA son excelentes como andamio para que las MSC creen injertos de cartílago artificial que permitan la formación de hueso a través de ECO.

El protocolo se divide en dos pasos. En primer lugar, se preparan construcciones de MSC humanas sembradas en hidrogel de hialuronano y se diferencian en cartílago hipertrófico in vitro. A continuación, las construcciones diferenciadas se implantan por vía subcutánea en un modelo desnudo para inducir la osificación endocondral in vivo (Figura 1).

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Protocol

Este protocolo utiliza ratones machos desnudos de 4 semanas de edad. Aloje cuatro ratones en una jaula bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 22−24 °C y 50%−70% de humedad relativa. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica y Dental de Tokio (ID de aprobación: A2019-204C, A2020-116A y A2021-121A).

1. Preparación de tampones y reactivos

  1. Prepare el medio de crecimiento de células madre mesenquimales (medio de crecimiento MSC) añadiendo el kit de suplemento de medio de crecimiento MSC al medio basal MSC y guárdelo a 4 °C.
  2. Prepare el medio Eagle Modificado de Dulbecco y el medio F12 de Ham (DMEM/F-12) añadiendo al medio un 10% de suero fetal bovino (FBS), 50 μg/ml de gentamicina, 200 μM de L-alanil-L-glutamina y 1 ng/ml de factor de crecimiento fibroblástico básico al medio y guárdelo a 4 °C.
  3. Prepare el medio condrogénico añadiendo un suplemento de ITS-G al 1%, albúmina sérica bovina al 0,12%, 50 μg/ml de gentamicina, 0,35 mM de L-prolina, 100 nM de dexametasona y 10 ng/ml de TGF-β3 al DMEM justo antes de su uso.
  4. Prepare el medio hipertrófico añadiendo 10 mM de β-glicerofosfato, albúmina sérica bovina al 0,12%, 10 nM de dexametasona, 200 μM de ascorbato-2-fosfato, 50 nM de L-tiroxina, 50 μg/ml de gentamicina y 50 pg/ml de IL-1β al DMEM justo antes de su uso.
  5. Rebozar una placa de cultivo de 24 pocillos con 200 μL de parafina derretida precalentada a 60 °C. Deje reposar a temperatura ambiente hasta que la parafina esté firme.

2. Expansión de las MSC humanas

NOTA: Antes de comenzar los experimentos, las MSC con un alto potencial de condrogénesis de MSC deben seleccionarse en microcultivos masivos como se describe en17.

  1. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, cultive MSC primarias derivadas de la médula ósea humana (pasaje 2) con medio de crecimiento MSC en una placa de 10 cm a una densidad de 5 x 103 células/cm2 a 37 °C en una incubadora de aire humidificado al 5% de CO2 y al 95%.
  2. Cambie el medio cada 2-3 días. Una vez que las células alcancen el 80%-90% de confluencia, aspire el medio de la placa de cultivo celular con una bomba de vacío, lave con 5 ml de PBS y luego aspire la solución con una bomba de vacío.
  3. Agregue 1 ml de solución de tripsina al 0,05 % / EDTA al 0,02 % a la placa. Incubar la placa durante 5-10 min a 37 °C.
  4. Agregue 1 ml de medio de crecimiento MSC para detener la reacción enzimática. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 ml.
  5. Combine la suspensión celular de otros platos en el tubo de 50 ml y manténgalo en hielo.
  6. Utilice el contador de células para contar las células mezclando 10 μl de la suspensión celular con 10 μl de tinción de azul de tripano al 0,4 %.
  7. Centrifugar la suspensión celular restante a 220 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y agregue la solución de criopreservación a una concentración de 1.0 x 106 células por ml.
  8. Dispense 1 ml de la suspensión celular en cada criotubo y almacene a -80 °C durante 12 h antes de transferirlo a nitrógeno líquido. Las existencias congeladas resultantes (pasaje 3) se utilizan para este protocolo.
  9. Para los experimentos, siembre las MSC almacenadas en un plato de 10 cm a una densidad de 5 x 103 células/cm2. Cultivar células hasta que confluyan al 80%-90% (paso 4) en medio DMEM/F-12.

3. Preparación de hidrogeles encapsulados en MSC

  1. Tripsinar las células y preparar la suspensión celular como se describe en los pasos 2.3 a 2.6.
  2. Para hacer 10 construcciones (2,5 x 10 5 células por construcción), alícuota la suspensión celular que contiene 2,5 x 106 células en un microtubo de1,5 ml.
  3. Centrifugar la suspensión a 220 x g durante 3 min, eliminar el sobrenadante con una bomba de vacío y mantenerla en hielo.
  4. Lleve el ácido hialurónico (HA) modificado con tiol, el reticulante reactivo al tiol, el diacrilato de polietilenglicol y las botellas de agua desgasificada a temperatura ambiente.
  5. En condiciones estériles, agregue 1.0 ml de agua desgasificada a la botella que contiene HA (consulte las instrucciones del fabricante) con una jeringa con una aguja.
  6. El vórtice se calienta ocasionalmente a 37 °C hasta que la solución se vuelve clara, luego colóquelo en hielo. Los sólidos tardan menos de 30 minutos en disolverse por completo.
  7. En condiciones estériles, agregue 0,5 ml de agua desgasificada a la botella de reticulación con una jeringa con una aguja. Disolver invirtiendo varias veces, luego colocar sobre hielo.
  8. Añadir 120 μL de la solución de AH disuelta al gránulo de célula alícuota (2,5 x 106 células). Vuelva a suspender el gránulo celular pipeteando hacia adelante y hacia atrás.
  9. Agregue 30 μL de la solución reticulante disuelta al tubo que contiene el AH y las células (paso 3.8) y combine golpeando el tubo, y luego gire hacia abajo brevemente. Combine la solución de alta disponibilidad y la solución de reticulación en una proporción de 4:1.
  10. Dejar caer 15 μL de la solución combinada que contiene MSC (2,5 x 105 células) sobre la placa de 24 pocillos recubierta de parafina y dejar que se solidifique a 37 °C durante 30 min (Figura 2). Debido a la alta viscosidad, prepare al menos un 10% más de la mezcla de celda / hidrogel de lo necesario.
    NOTA: Las características del hidrogel han sido descritas anteriormente39.

4. Condiciones de diferenciación in vitro

  1. Agregue 0,5 mL de medio de diferenciación condrogénico a una construcción de hidrogeles de AH sembrados con MSC. Cambie el medio cada 2-3 días.
  2. Después de 3 semanas, cambie a un medio de diferenciación hipertrófico (0,5 ml por pocillo) y cultive los constructos durante 2 semanas más.

5. Implantación in vivo de MSCs

  1. Después de un total de 5 semanas de cultivo in vitro, implantar las construcciones por vía subcutánea en la espalda de ratones desnudos como se describió anteriormente38,40.
  2. Pesar ratones y administrar un anestésico combinado preparado con 0,75 mg/kg de peso corporal (p.v.) de medetomidina, 4,0 mg/kg de p.v. midazolam y 5,0 mg/kg de p.v. butorfanol mediante inyección intraperitoneal como se describe38.
  3. Confirmar la anestesia adecuada mediante la inmovilidad a los estímulos quirúrgicos y controlar la profundidad respiratoria mediante movimientos torácicos lentos y regulares y el suministro adecuado de oxígeno por el color de la mucosa rosada periódicamente durante la operación. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad durante la anestesia.
  4. Coloque el ratón sobre un paño quirúrgico estéril en posición prona, esterilice el sitio de la incisión con 50 ppm de agua ácida hipoclorosa (pH 5.0; HAW) y coloque un paño quirúrgico perforado sobre el ratón.
    NOTA: Esterilice todos los materiales quirúrgicos en un autoclave, gas de óxido de etileno o HAW. Los cirujanos deben lavarse los dedos y usar batas quirúrgicas y guantes.
  5. Haga dos incisiones en la piel de 5 mm de largo separadas por 2 cm en las áreas de los hombros y la cadera a lo largo de la línea central de la columna vertebral con unas tijeras.
  6. Inserte una espátula por vía subcutánea a través de la incisión para crear una bolsa subcutánea.
  7. Inserte dos o tres construcciones (~15 μL cada una, paso 5.1) en cada bolsillo con fórceps. Las construcciones de AH implantadas en el mismo bolsillo son propensas a la fusión con mucha frecuencia. Para evitar la fusión, inserte una construcción de AH en cada bolsillo.
  8. Cierre las incisiones con suturas de seda trenzada 4-0. Inyectar al ratón un antagonista de los anestésicos preparado con 0,75 mg/kg de p.v. de atipamezol como se describe38.
  9. Mientras los ratones se recuperan de la anestesia, colóquelos en jaulas de recuperación estériles que contengan ropa de cama estéril en el piso sin botellas de comida y agua y controle continuamente la temperatura corporal, el pulso y la respiración.
  10. No deje a los ratones desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Después de la recuperación completa, regrese a los animales a la sala de cría con los otros animales.
  11. Monitoree a los animales cada dos días durante el período de curación para detectar posibles complicaciones. Eutanasiar a los ratones por inhalación de dióxido de carbono con poco sufrimiento a las 4 y 8 semanas después de la implantación.
  12. Incidir la piel en los sitios injertados y retirar las construcciones implantadas con fórceps. Fijar los constructos en paraformaldehído al 4% durante 16 h y luego someterlos a análisis.

6. Análisis estadístico

  1. Reporte los datos cuantitativos como media ± desviación estándar (DE). Realizar análisis estadísticos utilizando software comercial.
  2. Utilice la prueba t de Student o ANOVA de un factor seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para determinar diferencias significativas entre los grupos. P<0.05 y P<0.01 indican diferencias significativas entre dos grupos.

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Representative Results

Los hidrogeles de AH encapsulados en MSC se cultivaron en medio condrogénico suplementado con TGFβ3, un inductor de la condrogénesis41 (paso 4.1). Comparamos las propiedades del AH con las del colágeno, que ha demostrado ser eficaz en la creación de injertos de cartílago artificial basados en MSC para la osificación endocondral, como se describió anteriormente38. Las MSC indiferenciadas no se incluyeron como controles negativos en este estudio porque se ha demostrado que las MSC indiferenciadas requieren superficies mineralizadas como sustrato de cebado para generar hueso por diferenciación osteogénica (es decir, osificación intramembrana)7.

El tamaño de los hidrogeles de hialuronano no cambió a lo largo del período de cultivo in vitro , según se juzgó en función de los diámetros medidos bajo un microscopio invertido, mientras que los hidrogeles de colágeno utilizados para la comparación comenzaron a reducirse poco después de que comenzara el cultivo. Para reducir la diferencia de tamaño entre las construcciones de AH y colágeno después del cultivo in vitro , el número de MSC y el volumen del gel utilizado para crear los hidrogeles de AH se redujeron a la mitad en comparación con los utilizados para los hidrogeles de colágeno. Sin embargo, el peso húmedo de las construcciones de AH después de 3 semanas de cultivo de cartílago fue 4 veces más pesado que el de las construcciones de colágeno.

Diferenciación condrogénica e hipertrófica in vitro.
Después de la diferenciación condrogénica (en la semana 3 de cultivo in vitro ), glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) positivos (Safranina O/tinción verde rápida; Figura 3A) y se observó una matriz extracelular positiva para colágeno tipo II en ambos constructos, lo que indica que tanto el HA como los hidrogeles de colágeno apoyaron la condrogénesis. Sin embargo, en comparación con el constructo de colágeno, la distribución de sGAG, colágeno tipo II (Col II) y colágeno tipo X (Col X) fue más homogénea en todo el tejido en los constructos de AH. Las diferencias entre los dos constructos también fueron evidentes en la morfología celular: las células con una morfología redondeada similar a la de los condrocitos se distribuyeron por todo el tejido en los constructos de AH. Sin embargo, en las construcciones de colágeno, las células de la periferia mostraron una morfología heterogénea, que va desde una morfología irregular/estirada hasta una morfología redondeada. De acuerdo con esto, la redondez promedio de las células en los constructos de AH fue mayor que en los constructos de colágeno, tanto en la periferia como en las regiones centrales (34% vs. 77,6% (p<0,01) y 78,3% vs. 100% (p<0,05), respectivamente; Figura 3B). A las 5 semanas de cultivo, se detectó depósito de calcio en los bordes externos de ambos constructos (rojo de alizarina; Figura 3C). Además, se detectó la expresión de marcadores condrogénicos (Sox-9, agrecano (ACAN), Col II), hipertróficos (Col X, metalopéptidasa de matriz 13 (MMP-13)) y osteogénicos (colágeno tipo I (Col I), sialoproteína ósea (BSP), osteocalcina (OCN))14 mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real, lo que confirma la progresión de la diferenciación condrogénica e hipertrófica durante el cultivo in vitro (Figura 4).

Osificación endocondral de construcciones implantadas subcutáneamente in vivo.
Se crearon bolsas subcutáneas en la espalda de ratones desnudos, y se implantaron de dos a tres construcciones en cada bolsa después de la diferenciación hipertrófica (en la semana 5 del cultivo in vitro ). A las 4 u 8 semanas después de la implantación, todas las construcciones de AH se unieron entre sí en las bolsas implantadas (Tabla 1). En las construcciones de colágeno, se observó adhesión en el 60% de las bolsas, mientras que en las bolsas restantes, los injertos fueron independientes entre sí. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) reveló que en ambos constructos, a las 8 semanas después de la implantación, se formó tejido osteoide con morfología laminar en las regiones externas de los constructos (Figura 5Aa, f). La tinción de sGAG desapareció en las construcciones de AH, lo que indica la pérdida de su fenotipo cartilaginoso (Figura 5Ah). En ambas construcciones, se formó un componente de médula ósea que contenía células hematopoyéticas y tejido adiposo entre el cartílago interno y los tejidos osteoides. En todas las construcciones de AH, los tejidos óseos de las construcciones fusionadas estaban conectados y rodeados por tejido fibroso articular y médula ósea desarrollada a lo largo del espacio entre las dos construcciones adherentes, lo que indica que múltiples construcciones de AH tienden a formar tejido óseo integrado (Figura 5Ag). Los constructos de colágeno adheridos se integraron de manera similar en dos de los tres casos fusionados, pero en el tercer caso, el tejido óseo de los dos constructos no estaba conectado (Tabla 1 y Figura 5Ab). En ambas construcciones, se observaron vasos identificados por células endoteliales CD31 positivas42 en la médula ósea (Figuras 5Ad, i), y las regiones internas del cartílago estaban rodeadas por células multinucleadas positivas para TRAP del linaje de los osteoclastos, lo que indica que el tejido cartilaginoso estaba sujeto a remodelación (Figuras 5Ae, j).

El mineral se depositó en la región osteoide externa tanto en las construcciones de AH como en las de colágeno (Figura 5B). Si bien la densidad mineral total del hueso nuevo fue similar entre las construcciones de AH y colágeno, el volumen mineral fue significativamente mayor en las construcciones de AH que en las construcciones de colágeno, lo que puede reflejar el hecho de que los hidrogeles de AH no se encogieron durante el cultivo in vitro , lo que resultó en construcciones más grandes que los hidrogeles de colágeno (Figura 5C, D).

Figure 1
Figura 1: Diseño experimental. El primer paso de este protocolo es encapsular las MSC expandidas en hidrogeles de AH para promover la diferenciación condrogénica e hipertrófica in vitro. Los constructos se cultivan en condiciones de diferenciación condrogénica durante 3 semanas, seguidas de 2 semanas adicionales en condiciones de diferenciación hipertrófica. El segundo paso de este protocolo es implantar subcutáneamente las construcciones en ratones desnudos en la semana 5 de cultivo in vitro para someterlos a osificación endocondral in vivo durante 8 semanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Preparación de hidrogeles sembrados con MSC. Deje caer una solución modificada de HA/reticulante que contenga MSC en una placa de 24 pocillos recubierta de parafina y deje que se solidifique a 37 °C durante 30 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis histológico e inmunohistoquímico de las construcciones de AH y colágeno después de un cultivo in vitro 22. (A) Los constructos a las 3 semanas (3W) de cultivo in vitro se tiñeron para sGAG (safranina O/verde rápido), colágeno tipo II (Col II) y colágeno tipo X (Col X). (B) Los valores medios de circularidad de las células a las 3 semanas de cultivo in vitro (n = 5). Las barras abiertas y grises indican las construcciones de colágeno y HA, respectivamente. Los grupos sin una letra común son estadísticamente diferentes (a versus b, p<0.01; b versus c, p<0.05). (C) Los constructos a las 5 semanas (5W) de cultivo in vitro se tiñeron de calcio (rojo de alizarina). Todas las imágenes fueron capturadas con el mismo aumento (barra de escala: 200 μm). En los recuadros se muestra una visión general de todos los tejidos con pocos aumentos (barra de escala: 1 mm). Las barras de error representan la media ± la desviación estándar (DE). Se utilizó el ANOVA de un factor seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para determinar las diferencias significativas entre los grupos. Esta cifra ha sido modificada de38. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis de la expresión génica de las construcciones de AH y colágeno a las 3 y 5 semanas de cultivo in vitro. (A) Marcadores condrogénicos e hipertróficos. (B) Marcadores osteogénicos. Los valores se presentan como media ± desviación estándar (DE) (n = 3). Las MSC indiferenciadas expresaron altos niveles de Col I y MMP-13 y bajos niveles de Sox-9 y Col X; no expresaron (#) ACAN, Col II, BSP y OCN. Las barras de error representan la media ± la desviación estándar (DE). Esta cifra ha sido modificada de38. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Análisis inmunohistoquímico y calcificación de construcciones de AH y colágeno post-implantación a las 8 semanas. (A) Los constructos se tiñeron para hematoxilina y eosina (H&E, a, b, f y g), safranina O/Fast Green (c y h), células endoteliales (Cluster of Differentiation 31, CD31) (d e i) y fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP, e y j). (a y f) Vista general de todos los tejidos (barra de escala = 500 μm). H&E, safranina O, CD31: barra de escala = 200 μm; TRAMPA: barra de escala = 50 μm. Las flechas indican células endoteliales CD31 positivas. Abreviaturas: c = tejido cartilaginoso interno; o = tejido osteoide externo. (B) Imágenes de microCT (μCT) de construcciones de colágeno y HA (barras de escala de imagen principal e insertada = 2 mm). (C,D) La densidad mineral total (C) y el volumen (D) de las construcciones de AH y colágeno (n = 4). ** indica diferencias significativas; p <0,01. Se analizaron cuatro constructos por grupo utilizando μCT. Las barras de error representan la media ± la desviación estándar (DE). Se utilizó la prueba t de Student para determinar diferencias significativas entre los grupos. Esta cifra ha sido modificada de38. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Estrategia para facilitar las ECO utilizando cartílago artificial a base de AH. Diagrama esquemático de osificación y desarrollo de la médula ósea sin y con fragmentación (μ-gránulos) de construcciones de AH implantadas. (A) Los hidrogeles de AH tienen una excelente tendencia a la fusión para formar un hueso integrado con vascularización y desarrollo de la médula entre los injertos fusionados in vivo. Sin embargo, el tejido implantado resultante permaneció predominantemente en un estado de cartílago incluso 8 semanas después de la implantación. (B) Dada la tendencia de las construcciones de HA a fusionarse para formar hueso integrado, el procesamiento de construcciones de HA en gránulos de μ puede acelerar la tasa de remodelación del tejido trasplantado y promover la formación de hueso. La micronización de las construcciones aumenta el área de superficie, lo que puede promover la reabsorción del tejido cartilaginoso y la formación de tejido óseo y también puede promover la angiogénesis y el desarrollo de la médula ósea debido al mayor espacio para la infiltración de la célula huésped. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Hidrogel Experimentos Adherido Unido % Unidos
Colágeno 5 3 2 40
JA 5 5 5 100

Tabla 1: Tasa de unificación cuando se implantaron múltiples constructos en un solo bolsillo. Dos o tres construcciones se implantaron por vía subcutánea en un solo bolsillo. Los constructos se recolectaron 4 u 8 semanas después de la implantación y se examinaron histológicamente.

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Discussion

El uso de materiales de andamiaje apropiados que promuevan la transición del cartílago hipertrófico al hueso es un enfoque prometedor para ampliar los injertos de cartílago hipertrófico diseñados basados en MSC y tratar defectos óseos de tamaño clínicamente significativo. Aquí, mostramos que el AH es un excelente material de andamiaje para apoyar la diferenciación del tejido cartilaginoso hipertrófico basado en MSC in vitro y para promover la formación de hueso endocondral in vivo38. Además, in vivo, se demostró que las construcciones de HA facilitan la fusión de múltiples construcciones implantadas en el mismo bolsillo para formar un único hueso integrado. Debido a que la interacción de las MSC con los materiales de los andamios afecta significativamente al cartílago y a la condrogénesis hipertrófica, la selección del material de andamio adecuado para los ECO es importante para generar injertos de cartílago de ingeniería tisular clínicamente eficaces. Las células incluidas en hidrogeles de AH exhiben uniformemente una morfología redondeada característica de los condrocitos desde el centro hacia la periferia, lo que indica que el hialuronano proporciona un ambiente propicio para la formación uniforme de cartílago en todo el hidrogel21,30. A diferencia del AH, el colágeno interactúa con las MSC a través de secuencias de unión a integrinas (RGD); sin embargo, la persistencia de esta interacción impide que las MSC se diferencien aún más en la vía condrogénica43, lo que puede explicar la morfología celular de condrocitos atípica que es prominente en la periferia de las construcciones de colágeno.

Si varios injertos se unen para formar un solo hueso, este enfoque mediado por ECO puede extenderse a defectos óseos clínicamente más relevantes. Cuando se aplicaron múltiples cartílagos hipertróficos basados en MSC y libres de andamios a un solo defecto óseo, se informó que los injertos de cartílago se integraron con el defecto óseo. Sin embargo, los injertos adyacentes no se integraron entre sí22. El enfoque que aquí se presenta puede ofrecer una posible solución para superar esta limitación. En comparación con las construcciones de colágeno, los injertos múltiples de construcciones de HA tenían una mayor tendencia a fusionarse para formar un solo hueso. Además, la médula ósea se formó entre construcciones fusionadas de AH, lo que puede estar relacionado con el hecho de que el AH apoya la diferenciación uniforme del cartílago en todo el hidrogel porque el cartílago hipertrófico secreta VEGF y proporciona un entorno para el nicho de células madre hematopoyéticas en el desarrollo de la médula ósea 44.

La clave para el éxito de un experimento con este protocolo es la calidad de las MSC, por lo que se recomienda confirmar de antemano que las MSC que se van a utilizar tienen un potencial de diferenciación condrogénico suficientemente alto. En segundo lugar, el tamaño de cada construcción no debe ser demasiado grande. En nuestra experiencia, el volumen de un solo constructo está limitado a 10-15 μL. Los constructos más grandes pueden resultar en una penetración insuficiente de oxígeno y nutrientes en los constructos, lo que lleva a necrosis y una diferenciación deficiente en el centro de los constructos. Por lo tanto, es necesario reducir el espesor del gel para mejorar la penetración de oxígeno y nutrientes. Con el fin de reducir el espesor del gel, puede ser útil crear geles delgados en la membrana porosa de los insertos Transwell14,45. Alternativamente, debido a que las construcciones de HA tienden a fusionarse y formar hueso integrado, puede ser adecuado implantar muchas construcciones más pequeñas en lugar de una sola construcción grande, como se discute a continuación.

Entre las limitaciones de este estudio se encuentra la necesidad de acelerar la tasa de remodelación de los tejidos implantados para facilitar la formación ósea. El tejido de ingeniería implantado permaneció principalmente en un estado de cartílago calcificado hipertrófico incluso 8 semanas después de la implantación. En la formación ósea a través de la vía ECO, las células derivadas del huésped desempeñan un papel fundamental en la promoción de ECO16,46. Se ha reportado que la provisión de canales adicionales en injertos de cartílago hipertrófico promueve la invasión vascular y la mineralización del injerto in vivo20. Dichos canales sirven como conductos para la infiltración de las células huésped, incluidos los osteoblastos, los osteoclastos y los precursores hematopoyéticos, para formar nuevo tejido dentro de la construcción. Alternativamente, se ha reportado que se pueden implantar múltiples gránulos pequeños encapsulados en fibrina (μ-gránulos) compuestos de MSC diferenciadas condrogénicas para formar hueso integrado47. El procesamiento de construcciones de AH en gránulos de μ podría aumentar el área de superficie rodeada de osteoclastos TRAP positivos, promoviendo así la tasa de remodelación del tejido cartilaginoso y mejorando la osteogénesis (Figura 6)21,48. Además, la implantación de μ-pellets aumentaría el espacio de infiltración de las células huésped, facilitando así la angiogénesis y el desarrollo de la médula ósea y generando una formación ósea integral con abundante vascularización. Por lo tanto, teniendo en cuenta la tendencia de las construcciones de AH a fusionarse y crear hueso integrado, esta estrategia de regeneración ósea construida con μ puede acelerar el proceso ECO de los injertos de cartílago hipertrófico utilizando hidrogeles de HA.

En conclusión, los hidrogeles de HA son eficaces para ampliar los injertos de ingeniería tisular con menos células y geles que los hidrogeles de colágeno. Además, los hidrogeles de AH tienen una excelente sensibilidad a la fusión y producen hueso integrado con vascularización y desarrollo de la médula entre los injertos fusionados. Por lo tanto, la modificación de las construcciones de AH para promover la infiltración de la célula huésped y la remodelación del injerto puede conducir al desarrollo de materiales implantables que pueden promover aún más la vascularización y el desarrollo de la médula ósea. Con una mayor optimización, este enfoque podría ser una alternativa prometedora a las terapias óseas actuales en cirugía maxilofacial y ortopédica.

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Disclosures

Los autores han declarado que no existen intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Este trabajo contó con el apoyo de una subvención para la investigación científica (KAKENHI) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (subvención nos. JP19K10259 y 22K10032 al MAI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical  209-16941
Antisedan Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate Nacalai Tesque 13571-14
Bambanker GC Lymphotec CS-02-001
basic fibroblastic growth factor Reprocell RCHEOT002 
bovine serum albumin FUJIFILM Wako Pure Chemical  012-23881 7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10283
dexamethasone Merck D8893
Domitor Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium Merck D6429 high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Merck D6421
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
Gentamicin sulfate FUJIFILM Wako Pure Chemical  1676045  10 mg/mL
Haccpper Generator TechnoMax CH-400-5QB 50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit Merck HYS020
IL-1ß PeproTech AF-200-01B
ITS-G supplement FUJIFILM Wako Pure Chemical  090-06741 ×100
L-Alanyl-L-Glutamine FUJIFILM Wako Pure Chemical  016-21841 200mmol/L (×100)
L-proline Nacalai Tesque 29001-42
L-Thyroxine Merck T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		 Lonza PT-3001
paraffin FUJIFILM Wako Pure Chemical  165-13375
PBS / pH7.4 100ml Medicago 09-2051-100
TGF-β3  Proteintech HZ-1090
Vetorphale Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate FUJIFILM Wako Pure Chemical  048-34332

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Formación ósea integrada a través de la osificación endocondral <em>in vivo</em> utilizando células madre mesenquimales
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Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., Ikeda, M. A. Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (197), e65573, doi:10.3791/65573 (2023).

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