Summary
Die Knochentherapie über endochondrale Ossifikation durch Implantation von künstlichem Knorpelgewebe aus mesenchymalen Stammzellen hat das Potenzial, die Nachteile konventioneller Therapien zu umgehen. Hyaluronsäure-Hydrogele sind wirksam bei der Skalierung gleichmäßig differenzierter Knorpeltransplantate sowie bei der Schaffung von integriertem Knochen mit Vaskularisierung zwischen fusionierten Transplantaten in vivo.
Abstract
Die konventionelle Knochenregenerationstherapie mit mesenchymalen Stammzellen (MSCs) ist bei Knochendefekten, die größer als die kritische Größe sind, schwierig anzuwenden, da sie keinen Mechanismus zur Induktion der Angiogenese hat. Die Implantation von künstlichem Knorpelgewebe, das aus MSCs hergestellt wird, induziert die Angiogenese und Knochenbildung in vivo durch endochondrale Ossifikation (ECO). Daher könnte dieser ECO-vermittelte Ansatz in Zukunft eine vielversprechende Knochenregenerationstherapie sein. Ein wichtiger Aspekt der klinischen Anwendung dieses ECO-vermittelten Ansatzes ist die Erstellung eines Protokolls zur Vorbereitung von genügend Knorpel für die Implantation zur Reparatur des Knochendefekts. Insbesondere ist es nicht praktikabel, eine einzelne Masse aus transplantiertem Knorpel in einer Größe zu entwerfen, die der Form des tatsächlichen Knochendefekts entspricht. Daher muss der zu transplantierende Knorpel die Eigenschaft haben, bei der Implantation mehrerer Stücke Knochen integral zu bilden. Hydrogele können ein attraktives Werkzeug für die Skalierung von Tissue-Engineering-Transplantaten für die endochondrale Ossifikation sein, um den klinischen Anforderungen gerecht zu werden. Obwohl viele natürlich gewonnene Hydrogele die MSC-Knorpelbildung in vitro und ECO in vivo unterstützen, muss das optimale Gerüstmaterial für die Anforderungen klinischer Anwendungen noch bestimmt werden. Hyaluronsäure (HA) ist ein entscheidender Bestandteil der extrazellulären Matrix des Knorpels und ist ein biologisch abbaubares und biokompatibles Polysaccharid. Hier zeigen wir, dass HA-Hydrogele hervorragende Eigenschaften haben, um die in vitro Differenzierung von MSC-basiertem Knorpelgewebe zu unterstützen und die endochondrale Knochenbildung in vivo zu fördern.
Introduction
Autologer Knochen ist nach wie vor der Goldstandard für die Reparatur von Knochendefekten aufgrund von Traumata, angeborenen Defekten und chirurgischer Resektion. Die autogene Knochentransplantation hat jedoch erhebliche Einschränkungen, einschließlich Spenderschmerzen, Infektionsrisiko und begrenztes Knochenvolumen, das von den Patienten isoliert werden kann 1,2,3,4. Als Knochenersatz wurden zahlreiche Biomaterialien entwickelt, die natürliche oder synthetische Polymere mit mineralisierten Materialien wie Kalziumphosphat oder Hydroxylapatitkombinieren 5,6. Die Knochenbildung in diesen technischen Materialien wird in der Regel durch die Verwendung des mineralisierten Materials als Priming-Material erreicht, damit sich Stammzellen durch den Intramembran-Ossifikationsprozess (IMO) direkt in Osteoblasten differenzierenkönnen 7. Bei diesem Prozess fehlt der angiogene Schritt, was zu einer unzureichenden In-vivo-Vaskularisierung des Transplantats nach der Implantation führt 8,9,10, und daher sind Ansätze, die ein solches Verfahren verwenden, möglicherweise nicht optimal für die Behandlung großer Knochendefekte 11.
Es hat sich gezeigt, dass Strategien, die zur Rekapitulation des endochondralen Ossifikationsprozesses (ECO), einem angeborenen Mechanismus der Skelettgenese während der Entwicklung, angewendet werden, erhebliche Probleme überwinden, die mit traditionellen IMO-basierten Ansätzen verbunden sind. Bei ECO setzen Chondrozyten in der Knorpelschablone den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) frei, der die vaskuläre Infiltration und den Umbau der Knorpelschablone in Knochen fördert12. Der ECO-vermittelte Ansatz zur Osteogenese über Knorpelumbau und Angiogenese, der auch bei der Frakturreparatur aktiviert wird, verwendet künstlich erzeugtes Knorpelgewebe, das aus MSCs gewonnen wird, als Priming-Material. Chondrozyten können Hypoxie bei Knochendefekten tolerieren, Angiogenese induzieren und ein gefäßfreies Knorpeltransplantat in angiogenes Gewebe umwandeln. Zahlreiche Studien haben berichtet, dass MSC-basierte Knorpeltransplantate Knochen in vivo erzeugen, indem sie ein solches ECO-Programm implementieren 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Eine wesentliche Voraussetzung für die klinische Anwendung dieses ECO-vermittelten Ansatzes ist die Herstellung der gewünschten Menge an Knorpeltransplantaten in einem klinischen Umfeld. Die Herstellung von klinischem Knorpel in einer Größe, die zum tatsächlichen Knochendefekt passt, ist nicht praktikabel. Daher muss Transplantatknorpel Knochen integral bilden, wenn mehrere Fragmente implantiert werden22. Hydrogele können ein attraktives Werkzeug für die Skalierung von Tissue-Engineering-Transplantaten für die endochondrale Ossifikation sein. Viele natürlich gewonnene Hydrogele unterstützen die MSC-Knorpelbildung in vitro und ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Das optimale Trägermaterial, um die Anforderungen der klinischen Anwendung zu erfüllen, ist jedoch noch nicht festgelegt. Hyaluronsäure (HA) ist ein biologisch abbaubares und biokompatibles Polysaccharid, das in der extrazellulären Matrix des Knorpelsvorkommt 33. HA interagiert mit MSCs über Oberflächenrezeptoren wie CD44, um die chondrogene Differenzierung zu unterstützen 25,26,28,30,31,32,34. Darüber hinaus fördern HA-Scaffolds die IMO-vermittelte osteogene Differenzierung von Stammzellen der menschlichen Zahnpulpa35 und Scaffolds in Kombination mit Kollagen die ECO-vermittelte Osteogenese36,37.
In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Herstellung von HA-Hydrogelen unter Verwendung von aus dem Knochenmark gewonnenen adulten humanen MSCs vor und ihre Verwendung für die hypertrophe Chondrogenese in vitro und die anschließende endochondrale Ossifikation in vivo38. Wir verglichen die Eigenschaften von HA mit denen von Kollagen, einem Material, das im Bone Tissue Engineering mit MSCs weit verbreitet ist und ein nützliches Material für die Skalierung künstlicher Transplantate für die endochondrale Ossifikation ist17. In einem immungeschwächten Mausmodell wurden HA- und Kollagenkonstrukte, die mit humanen MSCs ausgesät waren, durch subkutane Implantation auf ihr in vivo ECO-Potenzial untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass HA-Hydrogele hervorragend als Gerüst für MSCs geeignet sind, um künstliche Knorpeltransplantate herzustellen, die die Knochenbildung durch ECO ermöglichen.
Das Protokoll gliedert sich in zwei Schritte. Zunächst werden Konstrukte von humanen MSCs, die auf Hyaluron-Hydrogel ausgesät sind, hergestellt und in vitro zu hypertrophem Knorpel differenziert. Als nächstes werden die differenzierten Konstrukte subkutan in ein Nacktmodell implantiert, um eine endochondrale Ossifikation in vivo zu induzieren (Abbildung 1).
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Protocol
Bei diesem Protokoll werden 4 Wochen alte männliche Nacktmäuse verwendet. Halten Sie vier Mäuse in einem Käfig unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 22−24 °C und 50%−70% relativer Luftfeuchtigkeit. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Tokyo Medical and Dental University genehmigt wurden (Zulassungs-ID: A2019-204C, A2020-116A und A2021-121A).
1. Herstellung von Puffern und Reagenzien
- Bereiten Sie mesenchymales Stammzellwachstumsmedium (MSC-Wachstumsmedium) vor, indem Sie das Ergänzungskit des MSC-Wachstumsmediums zu MSC-Basalmedien hinzufügen und bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium und Ham's F12 (DMEM/F-12) Medium vor, indem Sie dem Medium 10 % fötales Kälberserum (FBS), 50 μg/ml Gentamicin, 200 μM L-Alanyl-L-Glutamin und 1 ng/ml basischen fibroblastischen Wachstumsfaktor hinzufügen und bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie chondrogenes Medium vor, indem Sie DMEM kurz vor der Anwendung 1 % ITS-G-Ergänzung, 0,12 % Rinderserumalbumin, 50 μg/ml Gentamicin, 0,35 mM L-Prolin, 100 nM Dexamethason und 10 ng/ml TGF-β3 hinzufügen.
- Bereiten Sie hypertrophes Medium vor, indem Sie 10 mM β-Glycerophosphat, 0,12 % Rinderserumalbumin, 10 nM Dexamethason, 200 μM Ascorbat-2-phosphat, 50 nM L-Thyroxin, 50 μg/ml Gentamycin und 50 pg/ml IL-1β zu DMEM kurz vor der Anwendung hinzufügen.
- Eine 24-Well-Kulturschale mit 200 μl geschmolzenem Paraffin bestreichen, das auf 60 °C vorgewärmt wurde. Bei Raumtemperatur stehen lassen, bis das Paraffin fest geworden ist.
2. Ausbreitung humaner MSCs
ANMERKUNG: Vor Beginn der Experimente sollten MSCs mit einem hohen Potenzial für die MSC-Chondrogenese in Mikro-Massenkultur ausgewählt werden, wie in17 beschrieben.
- Gemäß den Anweisungen des Herstellers sind primäre MSCs aus menschlichem Knochenmark (Passage 2) mit MSC-Wachstumsmedium in einer 10-cm-Schale mit einer Dichte von 5 x 103 Zellen/cm2 bei 37 °C in einem 5 % CO2 und 95 % befeuchteten Luftinkubator zu kultivieren.
- Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreicht haben, wird das Medium mit einer Vakuumpumpe aus der Zellkulturschale abgesaugt, mit 5 ml PBS gewaschen und dann die Lösung mit einer Vakuumpumpe abgesaugt.
- 1 ml 0,05 % Trypsin/0,02 % EDTA-Lösung in die Schale geben. Die Schale 5-10 min bei 37 °C inkubieren.
- Fügen Sie 1 ml MSC-Wachstumsmedium hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Die Zellsuspension wird in ein 50-ml-Röhrchen überführt.
- Mischen Sie die Zellsuspension aus anderen Schalen in das 50-ml-Röhrchen und bewahren Sie es auf Eis auf.
- Verwenden Sie den Zellzähler, um die Zellen zu zählen, indem Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl 0,4%iger Trypanblaufärbung mischen.
- Die verbleibende Zellsuspension wird bei 220 x g für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie Kryokonservierungslösung in einer Konzentration von 1,0 x 106 Zellen pro ml hinzu.
- Geben Sie 1 ml der Zellsuspension in jedes Kryoröhrchen und lagern Sie es 12 Stunden lang bei -80 °C, bevor Sie in flüssigen Stickstoff übergehen. Die daraus resultierenden gefrorenen Bestände (Passage 3) werden für dieses Protokoll verwendet.
- Für die Versuche werden die vorrätigen MSCs in einer 10-cm-Schale mit einer Dichte von 5 x 103 Zellen/cm2 ausgesät. Kultur der Zellen bis zu 80%-90% konfluent (Passage 4) in DMEM/F-12 Medium.
3. Herstellung von MSC-verkapselten Hydrogelen
- Trypsinisieren Sie die Zellen und bereiten Sie die Zellsuspension vor, wie in den Schritten 2.3 - 2.6 beschrieben.
- Um 10 Konstrukte (2,5 x 10 5 Zellen pro Konstrukt) herzustellen, wird die Zellsuspension mit 2,5 x 106 Zellen in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen aliquotiert.
- Die Suspension wird 3 min lang bei 220 x g zentrifugiert, der Überstand mit einer Vakuumpumpe entfernt und auf Eis gelegt.
- Bringen Sie die Thiol-modifizierte Hyaluronsäure (HA), den Thiol-reaktiven Vernetzer, das Polyethylenglykoldiacrylat und die entgasten Wasserflaschen auf Raumtemperatur.
- Unter sterilen Bedingungen 1,0 ml entgastes Wasser mit einer Spritze mit einer Nadel in die HA-haltige Flasche (siehe Herstellerangaben) geben.
- Gelegentlich auf 37 °C erwärmen, bis die Lösung klar ist, dann auf Eis legen. Es dauert weniger als 30 Minuten, bis sich die Feststoffe vollständig aufgelöst haben.
- Geben Sie unter sterilen Bedingungen 0,5 ml entgastes Wasser mit einer Spritze mit einer Nadel in die Vernetzerflasche. Durch mehrmaliges Umkehren auflösen, dann auf Eis legen.
- 120 μl der gelösten HA-Lösung werden zu dem aliquotierten Zellpellet (2,5 x 106 Zellen) gegeben. Resuspendieren Sie das Zellpellet durch Hin- und Herpipettieren.
- 30 μl der gelösten Vernetzerlösung in das Röhrchen mit HA und Zellen geben (Schritt 3.8) und durch Klopfen auf das Röhrchen vermischen und dann kurz abschleudern. Kombinieren Sie die HA-Lösung und die Vernetzerlösung im Verhältnis 4:1.
- Geben Sie 15 μl der kombinierten Lösung mit MSCs (2,5 x 105 Zellen) auf die paraffinbeschichtete 24-Well-Platte und lassen Sie sie bei 37 °C 30 Minuten lang erstarren (Abbildung 2). Aufgrund der hohen Viskosität müssen Sie mindestens 10 % der Zell-/Hydrogelmischung als nötig herstellen.
ANMERKUNG: Die Eigenschaften des Hydrogels wurden bereits beschrieben39.
4. In-vitro-Differenzierungsbedingungen
- Geben Sie 0,5 ml chondrogenes Differenzierungsmedium zu einem Konstrukt aus MSC-besiedelten HA-Hydrogelen. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.
- Wechseln Sie nach 3 Wochen auf ein hypertrophes Differenzierungsmedium (0,5 ml pro Well) und kultivieren Sie die Konstrukte für weitere 2 Wochen.
5. In-vivo-Implantation von MSCs
- Nach insgesamt 5 Wochen In-vitro-Kultur werden die Konstrukte subkutan in den Rücken von Nacktmäusen implantiert, wie zuvor beschrieben38,40.
- Mäuse werden gewogen und ein Kombinationsanästhetikum verabreicht, das mit 0,75 mg/kg Körpergewicht (Körpergewicht) Medetomidin, 4,0 mg/kg Körpergewicht Midazolam und 5,0 mg/kg Körpergewicht Butorphanol durch intraperitoneale Injektion hergestellt wurde, wie beschrieben38.
- Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesie durch Immobilität gegenüber chirurgischen Reizen und überwachen Sie die Atemtiefe durch langsame, regelmäßige Brustbewegungen und die richtige Sauerstoffversorgung durch die Farbe der rosa Schleimhaut regelmäßig während der Operation. Verwenden Sie eine Veterinärsalbe auf den Augen, um Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern.
- Legen Sie die Maus auf ein steriles OP-Tuch in Bauchlage, sterilisieren Sie die Inzisionsstelle mit 50 ppm hypochlorigem saurem Wasser (pH 5,0; HAW) und legen Sie ein perforiertes OP-Tuch über die Maus.
HINWEIS: Sterilisieren Sie alle chirurgischen Materialien in einem Autoklaven, Ethylenoxidgas oder HAW. Die Chirurgen sollten sich die Finger waschen und OP-Kittel und Handschuhe tragen. - Mit einer Schere zwei 5 mm lange Hautschnitte im Abstand von 2 cm im Schulter- und Hüftbereich entlang der Mittellinie der Wirbelsäule machen.
- Führen Sie einen Spatel subkutan durch den Schnitt ein, um eine subkutane Tasche zu schaffen.
- Führen Sie zwei bis drei Konstrukte (je ~15 μl, Schritt 5.1) mit einer Pinzette in jede Tasche ein. HA-Konstrukte, die in dieselbe Tasche implantiert werden, neigen sehr häufig zur Fusion. Um eine Verschmelzung zu verhindern, setzen Sie ein HA-Konstrukt in jede Tasche ein.
- Verschließen Sie die Schnitte mit 4-0 geflochtenen Seidennähten. Der Maus wird ein Anästhetikumsantagonist injiziert, das mit 0,75 mg/kg Körpergewicht Atipamezol wie beschrieben hergestellt wurde38.
- Während sich die Mäuse von der Narkose erholen, setzen Sie die Mäuse in sterile Aufwachkäfige mit steriler Einstreu ohne Futter und Wasserflaschen und überwachen Sie kontinuierlich Körpertemperatur, Puls und Atmung.
- Lassen Sie die Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt haben, um das Brustbein zu halten. Nach vollständiger Genesung bringen Sie die Tiere mit den anderen Tieren in den Zuchtraum zurück.
- Überwachen Sie die Tiere während der Heilungsphase alle paar Tage auf mögliche Komplikationen. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Inhalation von Kohlendioxid mit wenig Leiden 4 und 8 Wochen nach der Implantation.
- Schneiden Sie die Haut an den transplantierten Stellen ein und entfernen Sie die implantierten Konstrukte mit einer Pinzette. Fixieren Sie die Konstrukte 16 h lang in 4%igem Paraformaldehyd und unterziehen Sie sie anschließend einer Analyse.
6. Statistische Analyse
- Geben Sie quantitative Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) an. Führen Sie statistische Analysen mit kommerzieller Software durch.
- Verwenden Sie den Student's t-Test oder die unidirektionale ANOVA, gefolgt von dem Tukey-Test für mehrere Vergleiche, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zu ermitteln. p<0,05 und p<0,01 deuten auf signifikante Unterschiede zwischen zwei Gruppen hin.
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Representative Results
MSC-verkapselte HA-Hydrogele wurden in chondrogenem Medium kultiviert, das mit TGFβ3, einem Induktor der Chondrogenese41 , ergänzt wurde (Schritt 4.1). Wir verglichen die Eigenschaften von HA mit denen von Kollagen, das sich als wirksam bei der Herstellung von MSC-basierten künstlichen Knorpeltransplantaten für die endochondrale Ossifikation erwiesen hat, wie zuvor beschrieben38. Undifferenzierte MSCs wurden nicht als Negativkontrollen in diese Studie einbezogen, da gezeigt wurde, dass undifferenzierte MSCs mineralisierte Oberflächen als Priming-Substrat benötigen, um Knochen durch osteogene Differenzierung (d. h. Intramembran-Ossifikation) zu erzeugen7.
Die Größe der Hyaluron-Hydrogele änderte sich während der gesamten In-vitro-Kulturzeit nicht, wie anhand der unter einem inversen Mikroskop gemessenen Durchmesser beurteilt wurde, während die für den Vergleich verwendeten Kollagenhydrogele kurz nach Beginn der Kultur zu schrumpfen begannen. Um den Größenunterschied zwischen den HA- und Kollagenkonstrukten nach der In-vitro-Kultur zu verringern, wurden die Anzahl der MSCs und das Volumen des Gels, das zur Herstellung der HA-Hydrogele verwendet wurde, im Vergleich zu denen, die für die Kollagenhydrogele verwendet wurden, halbiert. Allerdings war das Nassgewicht der HA-Konstrukte nach 3 Wochen Knorpelkultur 4x schwerer als das der Kollagenkonstrukte.
Chondrogene und hypertrophe Differenzierung in vitro.
Nach chondrogener Differenzierung (in Woche 3 der In-vitro-Kultur ) wurden sulfatierte Glykosaminoglykane (sGAG)-positive (Safranin O/schnelle grüne Färbung; Abbildung 3A) und in beiden Konstrukten wurde eine kollagenpositive extrazelluläre Matrix vom Typ II beobachtet, was darauf hindeutet, dass sowohl HA- als auch Kollagenhydrogele die Chondrogenese unterstützten. Im Vergleich zum Kollagenkonstrukt war die Verteilung von sGAG, Typ-II-Kollagen (Col II) und Typ-X-Kollagen (Col X) in den HA-Konstrukten jedoch homogener im gesamten Gewebe. Unterschiede zwischen den beiden Konstrukten zeigten sich auch in der Zellmorphologie: In den HA-Konstrukten waren Zellen mit einer Chondrozyten-ähnlichen, abgerundeten Morphologie über das Gewebe verteilt. In den Kollagenkonstrukten zeigten die Zellen in der Peripherie jedoch eine heterogene Morphologie, die von unregelmäßiger/gestreckter bis hin zu abgerundeter Morphologie reichte. In Übereinstimmung damit war die durchschnittliche Rundheit der Zellen in den HA-Konstrukten höher als in den Kollagenkonstrukten, sowohl in den peripheren als auch in den zentralen Regionen (34 % versus 77,6 % (p<0,01) bzw. 78,3 % vs. 100 % (p<0,05); Abbildung 3B). Nach 5 Wochen Kultur wurde in beiden Konstrukten eine Kalziumablagerung an den äußeren Rändern nachgewiesen (Alizarinrot; Abbildung 3C). Darüber hinaus wurde die Expression von chondrogenen (Sox-9, aggrecan (ACAN), Col II), hypertrophen (Col X, Matrix-Metallopeptidase 13 (MMP-13)) und osteogenen (Typ I Kollagen (Col I), Knochensialoprotein (BSP), Osteocalcin (OCN)) Markern14 mittels quantitativer real-time RT-PCR nachgewiesen, was das Fortschreiten der chondrogenen und hypertrophen Differenzierung während der In-vitro-Kultur bestätigt (Abbildung 4).
Endochondrale Ossifikation von subkutan implantierten Konstrukten in vivo.
Subkutane Taschen wurden auf dem Rücken von Nacktmäusen erzeugt, und zwei bis drei Konstrukte wurden nach hypertropher Differenzierung (in Woche 5 der In-vitro-Kultur) in jede Tasche implantiert. 4 bis 8 Wochen nach der Implantation waren alle HA-Konstrukte in den implantierten Taschen aneinander gebunden (Tabelle 1). In den Kollagenkonstrukten wurde eine Adhäsion in 60% der Taschen beobachtet, während in den restlichen Taschen die Transplantate unabhängig voneinander waren. Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) zeigte, dass in beiden Konstrukten 8 Wochen nach der Implantation Osteoidgewebe mit lamellärer Morphologie in den äußeren Regionen der Konstrukte gebildet wurde (Abbildung 5Aa,f). Die sGAG-Färbung verschwand in den HA-Konstrukten, was auf den Verlust ihres Knorpelphänotyps hindeutet (Abbildung 5Ah). In beiden Konstrukten wurde zwischen dem inneren Knorpel und dem äußeren Osteoidgewebe eine Knochenmarkkomponente gebildet, die hämatopoetische Zellen und Fettgewebe enthält. In allen HA-Konstrukten waren die Knochengewebe der fusionierten Konstrukte miteinander verbunden und von Gelenkfasergewebe und Knochenmark umgeben, die sich entlang des Raums zwischen den beiden adhärenten Konstrukten entwickelten, was darauf hindeutet, dass mehrere HA-Konstrukte dazu neigen, integriertes Knochengewebe zu bilden (Abbildung 5Ag). Die anhaftenden Kollagenkonstrukte waren in zwei der drei fusionierten Fälle in ähnlicher Weise integriert, aber im dritten Fall war das Knochengewebe der beiden Konstrukte nicht miteinander verbunden (Tabelle 1 und Abbildung 5Ab). In beiden Konstrukten wurden Gefäße, die durch CD31-positive Endothelzellen42 identifiziert wurden, im Knochenmark beobachtet (Abbildungen 5Ad,i), und die inneren Knorpelregionen waren von TRAP-positiven mehrkernigen Zellen der Osteoklastenlinie umgeben, was darauf hindeutet, dass Knorpelgewebe einem Umbau unterworfen war (Abbildungen 5Ae,j).
Das Mineral wurde sowohl in HA- als auch in Kollagenkonstrukten in der äußeren Osteoidregion abgelagert (Abbildung 5B). Während die Gesamtmineraldichte des neuen Knochens zwischen HA- und Kollagenkonstrukten ähnlich war, war das Mineralvolumen in den HA-Konstrukten signifikant höher als in den Kollagenkonstrukten, was die Tatsache widerspiegeln könnte, dass HA-Hydrogele während der In-vitro-Kultur nicht schrumpften, was zu größeren Konstrukten als Kollagenhydrogele führte (Abbildung 5C, D).
Abbildung 1: Versuchsplanung. Der erste Schritt dieses Protokolls besteht darin, expandierte MSCs in HA-Hydrogele einzukapseln, um die chondrogene und hypertrophe Differenzierung in vitro zu fördern. Die Konstrukte werden 3 Wochen lang unter chondrogenen Differenzierungsbedingungen kultiviert, gefolgt von weiteren 2 Wochen unter hypertrophen Differenzierungsbedingungen. Der zweite Schritt dieses Protokolls besteht darin, die Konstrukte in Woche 5 der In-vitro-Kultur subkutan in Nacktmäuse zu implantieren, um sie 8 Wochen lang in vivo einer endochondralen Ossifikation zu unterziehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Herstellung von MSCs-besiedelten Hydrogelen. Modifizierte HA/Vernetzer-Lösung, die MSCs enthält, auf eine paraffinbeschichtete 24-Well-Platte tropfen und bei 37 °C 30 Minuten erstarren lassen . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Histologische und immunhistochemische Analyse von HA- und Kollagenkonstrukten nach In-vitro-Kultur 22. (A) Konstrukte nach 3 Wochen (3W) In-vitro-Kultur wurden auf sGAG (Safranin O/fast green), Typ-II-Kollagen (Col II) und Typ-X-Kollagen (Col X) gefärbt. (B) Die durchschnittlichen Zirkularitätswerte der Zellen nach 3 Wochen In-vitro-Kultur (n = 5). Offene und graue Balken zeigen Kollagen- bzw. HA-Konstrukte an. Gruppen ohne gemeinsamen Buchstaben sind statistisch unterschiedlich (a versus b, p<0,01; b versus c, p<0,05). (C) Konstrukte nach 5 Wochen (5W) In-vitro-Kultur wurden auf Kalzium (Alizarinrot) gefärbt. Alle Bilder wurden mit der gleichen Vergrößerung aufgenommen (Maßstab: 200 μm). Eine Übersicht über das gesamte Gewebe mit geringer Vergrößerung wird in den Einschüben angezeigt (Maßstabsleiste: 1 mm). Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar. Die einseitige ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest, wurde verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zu bestimmen. Diese Zahl wurde von38 auf 38 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Genexpressionsanalyse von HA- und Kollagenkonstrukten nach 3 und 5 Wochen In-vitro-Kultur. (A) Chondrogene und hypertrophe Marker. (B) Osteogene Marker. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) (n = 3) dargestellt. Undifferenzierte MSCs exprimierten hohe Konzentrationen von Col I und MMP-13 und niedrige Konzentrationen von Sox-9 und Col X; sie drückten (#) ACAN, Col II, BSP und OCN nicht aus. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar. Diese Zahl wurde von38 auf 38 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Immunhistochemische Analyse und Verkalkung von HA- und Kollagenkonstrukten nach 8 Wochen . (A) Die Konstrukte wurden für Hämatoxylin und Eosin (H&E, a, b, f und g), Safranin O/Fast Green (c und h), Endothelzellen (Cluster of Differentiation 31, CD31) (d und i) und Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP, e und j) gefärbt. (a und f) Übersicht über das gesamte Gewebe (Skalenbalken = 500 μm). H&E, Safranin O, CD31: Maßstabsbalken = 200 μm; TRAP: Maßstabsbalken = 50 μm. Pfeile zeigen CD31-positive Endothelzellen an. Abkürzungen: c = inneres Knorpelgewebe; o = äußeres Osteoidgewebe. (B) MikroCT (μCT)-Bildgebung von Kollagen- und HA-Konstrukten (Haupt- und Nebenbildmaßstabsbalken = 2 mm). (C,D) Die Gesamtmineraldichte (C) und das Gesamtvolumen (D) von HA- und Kollagenkonstrukten (n = 4). ** weist auf signifikante Unterschiede hin; p <0,01. Pro Gruppe wurden vier Konstrukte mittels μCT analysiert. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar. Der Student's t-Test wurde verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zu ermitteln. Diese Zahl wurde von38 auf 38 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Strategie zur Erleichterung von ECOs mit künstlichem Knorpel auf HA-Basis. Schematische Darstellung der Ossifikation und Knochenmarkentwicklung ohne und mit Fragmentierung (μ-Pellets) von implantierten HA-Konstrukten. (A) HA-Hydrogele haben eine ausgezeichnete Fusionstendenz zur Bildung eines integrierten Knochens mit Vaskularisierung und Knochenmarkentwicklung zwischen fusionierten Transplantaten in vivo. Das so entstandene implantierte Gewebe verblieb jedoch auch 8 Wochen nach der Implantation überwiegend im Knorpelzustand. (B) Angesichts der Tendenz von HA-Konstrukten, zu integriertem Knochen zu verschmelzen, kann die Verarbeitung von HA-Konstrukten zu μ-Pellets die Umbaurate von transplantiertem Gewebe beschleunigen und die Knochenbildung fördern. Die Mikronisierung der Konstrukte vergrößert die Oberfläche, was die Resorption von Knorpelgewebe und die Bildung von Knochengewebe fördern kann und aufgrund des erhöhten Platzes für die Infiltration von Wirtszellen auch die Angiogenese und die Knochenmarkentwicklung fördern kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Hydrogel | Experimente | Angehängt | Vereinigt | % Vereinigte Staaten |
| Kollagen | 5 | 3 | 2 | 40 |
| HA | 5 | 5 | 5 | 100 |
Tabelle 1: Vereinheitlichungsrate, wenn mehrere Konstrukte in eine einzige Tasche implantiert wurden. Zwei oder drei Konstrukte wurden subkutan in eine einzige Tasche implantiert. Die Konstrukte wurden 4 oder 8 Wochen nach der Implantation entnommen und histologisch untersucht.
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Discussion
Die Verwendung geeigneter Gerüstmaterialien, die den Übergang vom hypertrophen Knorpel zum Knochen fördern, ist ein vielversprechender Ansatz, um MSC-basierte hypertrophe Knorpeltransplantate zu skalieren und Knochendefekte klinisch signifikanter Größe zu behandeln. Hier zeigen wir, dass HA ein hervorragendes Gerüstmaterial ist, um die Differenzierung von MSC-basiertem hypertrophem Knorpelgewebe in vitro zu unterstützen und die endochondrale Knochenbildung in vivo zu fördern 38. Darüber hinaus wurde in vivo gezeigt, dass HA-Konstrukte die Fusion mehrerer Konstrukte, die in dieselbe Tasche implantiert wurden, erleichtern, um einen einzigen integrierten Knochen zu bilden. Da die Wechselwirkung von MSCs mit Gerüstmaterialien den Knorpel und die hypertrophe Chondrogenese erheblich beeinflusst, ist die Auswahl geeigneter Gerüstmaterialien für ECOs wichtig, um klinisch wirksame Tissue-Engineering-Knorpeltransplantate zu erzeugen. Zellen, die in HA-Hydrogele eingebettet sind, weisen einheitlich eine abgerundete Morphologie auf, die für Chondrozyten vom Zentrum bis zur Peripherie charakteristisch ist, was darauf hindeutet, dass Hyaluronsäure eine Umgebung bietet, die einer gleichmäßigen Knorpelbildung im gesamten Hydrogel förderlich ist21,30. Im Gegensatz zu HA interagiert Kollagen mit MSCs über Integrin-Bindungssequenzen (RGDs); Die Persistenz dieser Interaktion verhindert jedoch, dass sich MSCs im chondrogenen Weg43 weiter differenzieren, was für die untypische Chondrozytenzellmorphologie verantwortlich sein könnte, die in der Peripherie von Kollagenkonstrukten vorherrscht.
Wenn sich mehrere Transplantate zu einem einzigen Knochen vereinen, kann dieser ECO-vermittelte Ansatz auf klinisch relevantere Knochendefekte ausgeweitet werden. Wenn mehrere MSC-basierte und gerüstfreie hypertrophe Knorpel auf einen einzelnen Knochendefekt appliziert wurden, wurde berichtet, dass die Knorpeltransplantate in den Knochendefekt integriert waren. Benachbarte Transplantate ließen sich jedoch nicht miteinander integrieren22. Der hier vorgestellte Ansatz könnte eine mögliche Lösung bieten, um diese Einschränkung zu überwinden. Im Vergleich zu Kollagenkonstrukten hatten mehrere Transplantate von HA-Konstrukten eine größere Tendenz, zu einem einzigen Knochen zu verschmelzen. Darüber hinaus wurde Knochenmark zwischen fusionierten HA-Konstrukten gebildet, was damit zusammenhängen könnte, dass HA eine gleichmäßige Knorpeldifferenzierung im gesamten Hydrogel unterstützt, da hypertropher Knorpel VEGF sezerniert und eine Umgebung für die hämatopoetische Stammzellnische in der Knochenmarkentwicklung bietet 44.
Der Schlüssel zu einem erfolgreichen Experiment mit diesem Protokoll ist die Qualität der MSCs. Es wird empfohlen, im Voraus zu bestätigen, dass die zu verwendenden MSCs ein ausreichend hohes chondrogenes Differenzierungspotenzial aufweisen. Zweitens sollte die Größe der einzelnen Konstrukte nicht zu groß sein. Unserer Erfahrung nach ist das Volumen eines einzelnen Konstrukts auf 10-15 μL begrenzt. Größere Konstrukte können zu einer unzureichenden Sauerstoff- und Nährstoffdurchdringung in die Konstrukte führen, was zu Nekrosen und schlechter Differenzierung in der Mitte der Konstrukte führt. Daher muss die Geldicke reduziert werden, um die Sauerstoff- und Nährstoffdurchdringung zu verbessern. Um die Geldicke zu verringern, kann es hilfreich sein, dünne Gele auf der porösen Membran der Transwell-Einsätze14,45 zu erzeugen. Da HA-Konstrukte dazu neigen, zu verschmelzen und integrierten Knochen zu bilden, kann es alternativ ausreichend sein, viele kleinere Konstrukte anstelle eines einzigen großen Konstrukts zu implantieren, wie unten erläutert.
Zu den Einschränkungen dieser Studie gehört die Notwendigkeit, die Umbaurate des implantierten Gewebes zu beschleunigen, um die Knochenbildung zu erleichtern. Das implantierte künstlich hergestellte Gewebe blieb auch 8 Wochen nach der Implantation primär in einem hypertrophen verkalkten Knorpelzustand. Bei der Knochenbildung über den ECO-Signalweg spielen Wirtszellen eine entscheidende Rolle bei der Förderung von ECO16,46. Es wurde berichtet, dass die Bereitstellung zusätzlicher Kanäle in hypertrophen Knorpeltransplantaten die vaskuläre Invasion und die Transplantatmineralisierung in vivo fördert20. Solche Kanäle dienen als Kanäle für die Infiltration von Wirtszellen, einschließlich Osteoblasten, Osteoklasten und hämatopoetischen Vorläufern, um neues Gewebe innerhalb des Konstrukts zu bilden. Alternativ wurde berichtet, dass mehrere kleine Fibrin-eingekapselte Pellets (μ-Pellets), die aus chondrogen differenzierten MSCs bestehen, implantiert werden können, um integrierten Knochen47 zu bilden. Die Verarbeitung von HA-Konstrukten zu μ-Pellets könnte die von TRAP-positiven Osteoklasten umgebene Oberfläche vergrößern und so die Umbaurate von Knorpelgewebe fördern und die Osteogenese verbessern (Abbildung 6)21,48. Darüber hinaus würde die Implantation von μ-Pellets den Infiltrationsraum der Wirtszellen vergrößern, wodurch die Angiogenese und die Knochenmarkentwicklung erleichtert und eine integrale Knochenbildung mit reichlicher Vaskularisierung erzeugt wird. In Anbetracht der Tendenz von HA-Konstrukten, zu verschmelzen und integrierten Knochen zu bilden, kann diese μ-konstruierte Knochenregenerationsstrategie den ECO-Prozess von hypertrophen Knorpeltransplantaten unter Verwendung von HA-Hydrogelen beschleunigen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass HA-Hydrogele bei der Skalierung von Tissue-Engineering-Transplantaten mit weniger Zellen und Gelen wirksam sind als Kollagenhydrogele. Darüber hinaus haben HA-Hydrogele eine ausgezeichnete Fusionsempfindlichkeit und erzeugen integrierten Knochen mit Vaskularisierung und Knochenmarkentwicklung zwischen fusionierten Transplantaten. Daher kann die Modifikation von HA-Konstrukten zur Förderung der Wirtszellinfiltration und des Transplantatumbaus zur Entwicklung implantierbarer Materialien führen, die die Vaskularisierung und Knochenmarkentwicklung weiter fördern können. Bei weiterer Optimierung könnte dieser Ansatz eine vielversprechende Alternative zu aktuellen Knochentherapien in der Mund-, Kiefer- und orthopädischen Chirurgie sein.
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Disclosures
Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) unterstützt (Grant Nr. JP19K10259 und 22K10032 bis MAI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
| Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
| Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
| basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
| bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
| Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
| dexamethasone | Merck | D8893 | |
| Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| Dormicum | Astellas Pharma | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
| Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
| Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
| HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
| IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
| ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
| L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
| L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
| L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
| MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
| paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
| PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
| TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
| Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
| Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
| β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |
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