Summary
Костная терапия с помощью эндохондральной оссификации путем имплантации искусственной хрящевой ткани, полученной из мезенхимальных стволовых клеток, может обойти недостатки традиционных методов лечения. Гидрогели гиалуроновой кислоты эффективны для масштабирования равномерно дифференцированных хрящевых трансплантатов, а также для создания интегрированной кости с васкуляризацией между сросшимися трансплантатами in vivo.
Abstract
Традиционная терапия костной регенерации с использованием мезенхимальных стволовых клеток (МСК) трудно применима к костным дефектам, превышающим критический размер, поскольку она не имеет механизма индуцирования ангиогенеза. Имплантация искусственной хрящевой ткани, изготовленной из МСК, индуцирует ангиогенез и формирование костной ткани in vivo посредством эндохондральной оссификации (ЭКО). Таким образом, этот ЭКО-опосредованный подход может стать многообещающей терапией регенерации костной ткани в будущем. Важным аспектом клинического применения этого ЭКО-опосредованного подхода является создание протокола подготовки достаточного количества хряща для имплантации для восстановления костного дефекта. Особенно непрактично создавать единичную массу трансплантированного хряща такого размера, который соответствует форме фактического костного дефекта. Таким образом, хрящ, подлежащий пересадке, должен обладать свойством формировать кость интегрально при имплантации нескольких частей. Гидрогели могут быть привлекательным инструментом для масштабирования тканеинженерных трансплантатов для эндохондральной оссификации в соответствии с клиническими требованиями. Несмотря на то, что многие гидрогели природного происхождения поддерживают образование хряща МСК in vitro и ECO in vivo, оптимальный материал каркаса для удовлетворения потребностей клинического применения еще предстоит определить. Гиалуроновая кислота (ГК) является важнейшим компонентом хрящевого внеклеточного матрикса и представляет собой биоразлагаемый и биосовместимый полисахарид. Здесь мы показываем, что гидрогели ГК обладают превосходными свойствами поддерживать дифференцировку хрящевой ткани на основе МСК in vitro и способствовать образованию эндохондральной кости in vivo.
Introduction
Аутологичная кость по-прежнему является золотым стандартом для восстановления костных дефектов, вызванных травмами, врожденными дефектами и хирургической резекцией. Однако аутогенная костная пластика имеет существенные ограничения, включая боль донора, риск инфекции и ограниченный объем костной ткани, который может быть выделен у пациентов 1,2,3,4. В качестве заменителей костной ткани были разработаны многочисленные биоматериалы, сочетающие природные или синтетические полимеры с минерализованными материалами, такими как фосфат кальция или гидроксиапатит 5,6. Формирование костной ткани в этих конструкционных материалах обычно достигается с использованием минерализованного материала в качестве грунтовочного материала, позволяющего стволовым клеткам дифференцироваться непосредственно в остеобласты посредством процесса внутримембранного окостенения (ИМО)7. В этом процессе отсутствует ангиогенная стадия, что приводит к недостаточной васкуляризации трансплантата in vivo после имплантации 8,9,10, в связи с чем подходы, использующие такой процесс, могут быть не оптимальными для лечения крупных костных дефектов 11.
Было показано, что стратегии, применяемые для повторения процесса эндохондральной оссификации (ЭКО), врожденного механизма скелетогенеза в процессе развития, позволяют преодолеть значительные проблемы, связанные с традиционными подходами, основанными на ИМО. При ЭКО хондроциты в хрящевой матрице высвобождают сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), который способствует сосудистой инфильтрации и ремоделированию хрящевой матрицы в кость12. ECO-опосредованный подход к остеогенезу через ремоделирование хряща и ангиогенез, который также активируется во время восстановления перелома, использует искусственно созданную хрящевую ткань, полученную из МСК, в качестве грунтовочного материала. Хондроциты могут переносить гипоксию при костных дефектах, индуцировать ангиогенез и превращать бессосудистый хрящевой трансплантат в ангиогенную ткань. Многочисленные исследования показали, что хрящевые трансплантаты на основе МСК генерируют костную ткань in vivo путем реализации такой программы ECO 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Существенным требованием для клинического применения этого ЭКО-опосредованного подхода является подготовка желаемого количества хрящевого трансплантата в клинических условиях. Препарирование клинического хряща такого размера, который соответствует фактическому дефекту кости, нецелесообразно. Таким образом, хрящ трансплантата должен образовывать костную ткань интегрально при имплантации нескольких фрагментов22. Гидрогели могут быть привлекательным инструментом для масштабирования тканеинженерных трансплантатов для эндохондральной оссификации. Многие гидрогели природного происхождения поддерживают образование хряща МСК in vitro и ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Тем не менее, оптимальный вспомогательный материал, отвечающий требованиям клинического применения, остается неопределенным. Гиалуроновая кислота (ГК) представляет собой биоразлагаемый и биосовместимый полисахарид, присутствующий во внеклеточном матриксе хряща33. Гиалуроновая кислота взаимодействует с МСК через поверхностные рецепторы, такие как CD44, поддерживая хондрогенную дифференцировку 25,26,28,30,31,32,34. Кроме того, скаффолды с гиалуроновой кислотой способствуют ИМО-опосредованной остеогенной дифференцировке стволовых клеток пульпы зуба человека35, а скаффолды в сочетании с коллагеном способствуют ЭКО-опосредованному остеогенезу36,37.
В данной работе мы представляем способ получения гидрогелей ГК с использованием МСК взрослого человека, полученных из костного мозга, и их использование для гипертрофического хондрогенеза in vitro и последующей эндохондральной оссификации in vivo38. Мы сравнили характеристики гиалуроновой кислоты с характеристиками коллагена, материала, широко применяемого в инженерии костной ткани с МСК и полезного материала для масштабирования искусственных трансплантатов для эндохондральной оссификации17. В мышиной модели с ослабленным иммунитетом гиалуроновая кислота и коллагеновые конструкции, засеянные человеческими МСК, оценивали потенциал ЭКО in vivo путем подкожной имплантации. Результаты показывают, что гидрогели ГК отлично подходят в качестве каркаса для МСК для создания искусственных хрящевых трансплантатов, которые позволяют формировать костную ткань с помощью ЭКО.
Протокол разделен на два этапа. Сначала готовят конструкции человеческих МСК, засеянных на гиалуроновый гидрогель, и дифференцируют их в гипертрофированный хрящ in vitro. Затем дифференцированные конструкции имплантируются подкожно в обнаженную модель, чтобы индуцировать эндохондральное окостенение in vivo (рис. 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В этом протоколе используются 4-недельные самцы голых мышей. Поместите четырех мышей в клетку при 12-часовом цикле света и темноты при температуре 22−24 °C и относительной влажности 50−70%. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Токийского медицинского и стоматологического университета (идентификатор одобрения: A2019-204C, A2020-116A и A2021-121A).
1. Приготовление буферов и реагентов
- Приготовьте питательную среду для мезенхимальных стволовых клеток (питательную среду МСК), добавив набор питательных сред для выращивания МСК в базальную среду МСК и храните его при температуре 4 °C.
- Приготовьте модифицированную среду Eagle Medium от Dulbecco и среду F12 (DMEM/F-12) от Ham, добавив 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 50 мкг/мл гентамицина, 200 мкМ L-аланил-L-глутамина и 1 нг/мл основного фактора роста фибробластов в среду и храните ее при температуре 4 °C.
- Готовят хондрогенную среду, добавляя 1% добавку ITS-G, 0,12% бычий сывороточный альбумин, 50 мкг/мл гентамицина, 0,35 мМ L-пролина, 100 нМ дексаметазона и 10 нг/мл TGF-β3 непосредственно перед использованием.
- Приготовьте гипертрофическую среду, добавив 10 мМ β-глицерофосфата, 0,12% бычьего сывороточного альбумина, 10 нМ дексаметазона, 200 мкМ аскорбат-2-фосфата, 50 нМ L-тироксина, 50 мкг/мл гентамицина и 50 пг/мл IL-1β непосредственно перед использованием.
- Покройте 24-луночную чашку для культур 200 мкл расплавленного парафина, предварительно нагретого до 60 °C. Дайте постоять при комнатной температуре, пока парафин не застынет.
2. Расширение МСК человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом экспериментов следует отобрать МСК с высоким потенциалом хондрогенеза МСК в культуре микромассы, как описано в17.
- Согласно инструкции производителя, культивируют первичные МСК, полученные из костного мозга человека (пассаж 2) с питательной средой МСК в чашке диаметром 10 см при плотности 5 х 103 клетк/см2 при 37 °С в инкубаторе с содержанием 5%СО2 и 95% увлажненном воздухе.
- Меняйте среду каждые 2-3 дня. Как только клетки достигнут 80%-90% слияния, аспирируйте среду из чашки для клеточных культур с помощью вакуумного насоса, промойте 5 мл PBS, а затем аспирируйте раствор вакуумным насосом.
- Добавьте в блюдо 1 мл 0,05% раствора трипсина/0,02% ЭДТА. Выдерживайте чашку в течение 5-10 минут при температуре 37 °C.
- Добавьте 1 мл питательной среды МСК, чтобы остановить ферментативную реакцию. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл.
- Смешайте клеточную суспензию из других блюд в пробирке объемом 50 мл и держите ее на льду.
- Используйте счетчик клеток для подсчета клеток, смешав 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл 0,4% красителя трипанового синего.
- Центрифугируют оставшуюся клеточную суспензию при 220 x g в течение 3 мин при комнатной температуре. Удалить надосадочную жидкость и добавить раствор для криоконсервации в концентрации 1,0 х 106 клеток на мл.
- Дозируйте 1 мл клеточной суспензии в каждую криопробирку и храните при -80 °C в течение 12 ч, прежде чем перенести в жидкий азот. Полученные замороженные запасы (проход 3) используются для этого протокола.
- Для экспериментов высевают заготовленные МСК в чашку диаметром 10 см с плотностью 5 x 103 клетки/см2. Культивирование клеток до 80%-90% слияния (пассаж 4) в среде DMEM/F-12.
3. Приготовление МСК-инкапсулированных гидрогелей
- Трипсинизируют клетки и готовят клеточную суспензию, как описано в шагах 2.3 - 2.6.
- Чтобы получить 10 конструкций (2,5 x 10 5 клеток на конструкцию), аликвотируют клеточную суспензию, содержащую 2,5 x 106 клеток, в микропробирку объемом1,5 мл.
- Центрифугируйте суспензию при 220 x g в течение 3 мин, удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумного насоса и держите ее на льду.
- Доведите тиол-модифицированную гиалуроновую кислоту (ГК), тиол-реактивный сшиватель, диакрилат полиэтиленгликоля и бутылки с дегазированной водой до комнатной температуры.
- В стерильных условиях с помощью шприца с иглой добавить в флакон, содержащий ГК, 1,0 мл дегазированной воды (см. инструкцию производителя).
- Вихрь периодически прогревают до 37 °C, пока раствор не станет прозрачным, затем помещают на лед. Для полного растворения твердых частиц требуется менее 30 минут.
- В стерильных условиях с помощью шприца с иглой добавить в флакон с сшивателем 0,5 мл дегазированной воды. Растворите, перевернув несколько раз, затем положите на лед.
- Добавьте 120 мкл растворенного раствора гиалуроновой кислоты к аликвотированной клеточной грануле (2,5 x 10,6 клеток). Повторно суспендируйте гранулу клетки, пипетируя вперед и назад.
- Добавьте 30 мкл растворенного раствора сшивающего агента в пробирку, содержащую ГК и клетки (шаг 3.8), и смешайте, постукивая по пробирке, а затем коротко открутите. Комбинируйте раствор ГК и раствор сшивателя в соотношении 4:1.
- Капните 15 мкл комбинированного раствора, содержащего МСК (2,5 x 105 клеток), на покрытую парафином 24-луночную пластину и дайте ему затвердеть при 37 °C в течение 30 мин (рисунок 2). Из-за высокой вязкости приготовьте как минимум на 10% больше смеси клеток и гидрогеля, чем необходимо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристики гидрогеля были описаны ранее39.
4. Условия дифференцировки in vitro
- Добавляют 0,5 мл хондрогенной дифференцировочной среды к конструкции МСК-засеянных гидрогелей ГК. Меняйте среду каждые 2-3 дня.
- Через 3 недели переходят на гипертрофическую дифференцировочную среду (0,5 мл на лунку) и культивируют конструкции еще 2 недели.
5. Имплантация МСК in vivo
- В общей сложности через 5 недель культивирования in vitro имплантируйте конструкции подкожно в спину голых мышей, как описано ранее38,40.
- Взвешивают мышей и вводят комбинированный анестетик, приготовленный из 0,75 мг/кг массы тела (м.т.) медетомидина, 4,0 мг/кг м.т. мидазолама и 5,0 мг/кг м.т. буторфанола путем внутрибрюшинной инъекции, как описано38.
- Периодически во время операции подтверждать адекватную анестезию неподвижностью к хирургическим раздражителям и контролировать глубину дыхания медленными, регулярными движениями грудной клетки и правильным снабжением кислородом по цвету розовой слизистой оболочки. Используйте ветеринарную мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
- Поместите мышь на стерильную хирургическую простыню в положении лежа, простерилизуйте место разреза водой хлорноватистой кислоты с концентрацией 50 ppm (pH 5,0; HAW) и наложите на мышь перфорированную хирургическую простыню.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте все хирургические материалы в автоклаве, в газообразном этиленоксиде или HAW. Хирурги должны мыть пальцы и надевать хирургические халаты и перчатки. - Сделайте два разреза кожи длиной 5 мм на расстоянии 2 см друг от друга в области плеч и бедер вдоль центральной линии позвоночника с помощью ножниц.
- Введите шпатель подкожно через разрез, чтобы создать подкожный карман.
- Вставьте две-три конструкции (~15 мкл каждая, шаг 5.1) в каждый карман с помощью щипцов. Конструкты ГК, имплантированные в один и тот же карман, очень часто склонны к сращению. Чтобы предотвратить сращение, вставьте в каждый карман по одному конструкту ГК.
- Закройте разрезы шелковыми швами 4-0. Вводят мышам антагонист к анестетикам, приготовленным из 0,75 мг/кг массы тела атипамезола, как описанона стр. 38.
- Пока мыши приходят в себя после анестезии, поместите мышей в стерильные клетки для восстановления, содержащие стерильную напольную подстилку без бутылок с едой и водой, и постоянно контролируйте температуру тела, пульс и дыхание.
- Не оставляйте мышей без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания положения грудины. После полного выздоровления верните животных в помещение для разведения вместе с другими животными.
- Наблюдайте за животными каждые пару дней в период заживления на предмет возможных осложнений. Усыпляйте мышей путем вдыхания углекислого газа с небольшими страданиями через 4 и 8 недель после имплантации.
- Надрезают кожу в местах пересадки и щипцами удаляют имплантированные конструкции. Закрепляют конструкции в 4%-ном параформальдегиде в течение 16 ч, а затем подвергают их анализу.
6. Статистический анализ
- Сообщайте количественные данные в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Выполняйте статистический анализ с помощью коммерческого программного обеспечения.
- Используйте t-критерий Стьюдента или односторонний ANOVA, а затем тест множественных сравнений Тьюки, чтобы определить значимые различия между группами. p<0,05 и p<0,01 указывают на значимые различия между двумя группами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
МСК-инкапсулированные гидрогели ГК культивировали в хондрогенной среде с добавлением TGFβ3 – индуктора хондрогенеза41 (стадия 4.1). Мы сравнили свойства ГК со свойствами коллагена, который, как было показано, эффективен при создании искусственных хрящевых трансплантатов на основе МСК для эндохондральной оссификации, как описано ранее38. Недифференцированные МСК не были включены в это исследование в качестве негативного контроля, поскольку было продемонстрировано, что недифференцированные МСК нуждаются в минерализованных поверхностях в качестве грунтовочного субстрата для образования костной ткани путем остеогенной дифференцировки (т.е. внутримембранной оссификации)7.
Размер гиалуроновых гидрогелей не изменялся на протяжении всего периода культивирования in vitro , о чем судили на основе диаметров, измеренных под перевернутым микроскопом, в то время как коллагеновые гидрогели, используемые для сравнения, начали уменьшаться вскоре после начала культивирования. Чтобы уменьшить разницу в размерах между гиалуроновой кислотой и коллагеновыми конструкциями после культивирования in vitro , количество МСК и объем геля, используемого для создания гидрогелей ГК, были уменьшены вдвое по сравнению с теми, которые использовались для коллагеновых гидрогелей. Тем не менее, влажный вес конструкций ГК после 3 недель культивирования хряща был в 4 раза тяжелее, чем у коллагеновых конструкций.
Хондрогенная и гипертрофическая дифференцировка in vitro.
После хондрогенной дифференцировки (на 3-й неделе культивирования in vitro ) сульфатированные гликозаминогликаны (sGAG)-положительные (окрашивание Safranin O/fast green; Рисунок 3А) и коллаген-позитивный внеклеточный матрикс II типа наблюдался в обеих конструкциях, что указывает на то, что как ГК, так и гидрогели коллагена поддерживают хондрогенез. Однако, по сравнению с коллагеновой конструкцией, распределение sGAG, коллагена II типа (Col II) и коллагена типа X (Col X) было более однородным по всей ткани в конструкциях HA. Различия между двумя конструктами были очевидны и в морфологии клеток: клетки с хондроцитарной округлой морфологией были распределены по всей ткани в конструкциях HA. В коллагеновых конструкциях, однако, клетки на периферии показали гетерогенную морфологию, варьирующуюся от неправильной/растянутой до округлой морфологии. В соответствии с этим, средняя округлость клеток в конструкциях ГК была выше, чем в коллагеновых конструкциях, как в периферийной, так и в центральной областях (34% против 77,6% (p<0,01) и 78,3% против 100% (p<0,05), соответственно; Рисунок 3Б). Через 5 недель культивирования выявлено отложение кальция на внешних краях в обеих конструкциях (ализарин красный; Рисунок 3В). Кроме того, методом количественной ОТ-ПЦР в реальном времени была выявлена экспрессия хондрогенных (Sox-9, aggrecan (ACAN), Col II), гипертрофических (Col X, матриксная металлопептидаза 13 (MMP-13)) и остеогенных (коллаген I типа (Col I), костный сиалопротеин (BSP), остеокальцин (OCN)) маркеров14 , что подтверждает прогрессирование хондрогенной и гипертрофической дифференцировки при культивировании in vitro (рис. 4).
Эндохондральное окостенение подкожно имплантированных конструкций in vivo.
На спине голых мышей создавали подкожные карманы, и после гипертрофической дифференцировки (на 5-й неделе культивирования in vitro) в каждый карман имплантировали по два-три конструкта. Через 4 или 8 недель после имплантации все конструкции ГК прикреплялись друг к другу в имплантированных карманах (табл. 1). В коллагеновых конструкциях адгезия наблюдалась в 60% карманов, в то время как в остальных карманах трансплантаты были независимы друг от друга. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) показало, что у обоих конструкций через 8 недель после имплантации формировалась остеоидная ткань с ламеллярной морфологией во внешних областях конструкций (рис. 5Aa,f). Окрашивание sGAG исчезло в конструкциях HA, что указывает на потерю их хрящевого фенотипа (рис. 5Ah). В обеих конструкциях между внутренним хрящом и наружными остеоидными тканями образовался компонент костного мозга, содержащий кроветворные клетки и жировую ткань. Во всех конструкциях ГК костные ткани сросшихся конструкций были соединены и окружены суставной фиброзной тканью и костным мозгом, развившимися вдоль пространства между двумя адгезивными конструкциями, что указывает на то, что множественные конструкции ГК имеют тенденцию образовывать интегрированную костную ткань (рис. 5Ag). Склеенные коллагеновые конструкции были аналогичным образом интегрированы в двух из трех сросшихся случаев, но в третьем случае костная ткань двух конструкций не была связана (табл. 1 и рис. 5Ab). В обоих конструктах в костном мозге наблюдались сосуды, идентифицированные CD31-положительными эндотелиальными клетками42 (рис. 5Ad,i), а внутренние хрящевые области были окружены TRAP-положительными многоядерными клетками линии остеокластов, что указывает на то, что хрящевая ткань подвержена ремоделированию (рис. 5Ae,j).
Минерал депонировался во внешней области остеоида как в конструкциях гиалуроновой кислоты, так и в коллагеновых конструкциях (рис. 5B). В то время как общая минеральная плотность новой кости была одинаковой между конструкциями ГК и коллагена, объем минералов в конструкциях ГК был значительно выше, чем в коллагеновых конструкциях, что может отражать тот факт, что гидрогели ГК не сжимались во время культивирования in vitro , что приводило к более крупным конструкциям, чем гидрогели коллагена (рис. Г).
Рисунок 1: Экспериментальный дизайн. Первым шагом этого протокола является инкапсуляция расширенных МСК в гидрогели ГК для стимулирования хондрогенной и гипертрофической дифференцировки in vitro. Конструкты культивируют в условиях хондрогенной дифференцировки в течение 3 недель, а затем еще 2 недели в условиях гипертрофической дифференцировки. Вторым этапом этого протокола является подкожная имплантация конструкций голым мышам на 5-й неделе культивирования in vitro для прохождения эндохондральной оссификации in vivo в течение 8 недель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Приготовление гидрогелей с посевом МСК. Капните модифицированный раствор ГК/сшивателя, содержащий МСК, на 24-луночный планшет с парафином и дайте ему затвердеть при 37 °C в течение 30 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Гистологический и иммуногистохимический анализ гиалуроновой кислоты и коллагеновых конструкций после культивирования in vitro 22. (A) Конструкции через 3 недели (3W) культуры in vitro окрашивали на sGAG (сафранин O/fast green), коллаген II типа (Col II) и коллаген типа X (Col X). (B) Средние значения циркулярности клеток через 3 недели культивирования in vitro (n = 5). Открытые и серые полосы указывают на коллагеновые и гиалуроновые структуры соответственно. Группы без общей буквы статистически различаются (a против b, p<0,01; b против c, p<0,05). (C) Конструкции через 5 недель (5W) культуры in vitro окрашивали на кальций (ализариновый красный). Все снимки были сделаны с одинаковым увеличением (масштабная линейка: 200 мкм). На врезках показан обзор всей ткани с малым увеличением (масштабная линейка: 1 мм). Столбцы погрешности представляют среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Для определения значимых различий между группами был использован односторонний ANOVA с последующим тестом множественных сравнений Тьюки. Эта цифра была изменена с38. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ экспрессии генов гиалуроновой кислоты и коллагеновых конструкций на 3 и 5 неделях культивирования in vitro. (А) Хондрогенные и гипертрофические маркеры. (Б) Остеогенные маркеры. Значения представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD) (n = 3). Недифференцированные МСК экспрессировали высокие уровни Col I и MMP-13 и низкие уровни Sox-9 и Col X; они не выражали (#) ACAN, Col II, BSP и OCN. Столбцы погрешности представляют среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Эта цифра была изменена с38. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Иммуногистохимический анализ и кальцификация гиалуроновой кислоты и коллагеновых конструкций после имплантации через 8 недель. (A) Конструкции окрашивали на гематоксилин и эозин (H&E, a, b, f и g), сафранин O/Fast Green (c и h), эндотелиальные клетки (кластер дифференцировки 31, CD31) (d и i) и тартрат-резистентную кислую фосфатазу (TRAP, e и j). (А и Ж) Обзор всей ткани (масштабная линейка = 500 мкм). H&E, сафранин O, CD31: масштабная линейка = 200 мкм; ТРЕПП: масштабная линейка = 50 мкм. Стрелками обозначены CD31-положительные эндотелиальные клетки. Сокращения: c = внутренняя хрящевая ткань; o = наружная остеоидная ткань. (B) МикроКТ (мкКТ) визуализация коллагена и конструкций ГК (масштабные линейки основного и врезного изображений = 2 мм). (С,Д) Общая минеральная плотность (C) и объем (D) гиалуроновой кислоты и коллагеновых конструкций (n = 4). ** указывает на существенные различия; стр <0,01. Четыре конструкта были проанализированы в каждой группе с использованием микроКТ. Столбцы погрешности представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Для определения значимых различий между группами использовали t-критерий Стьюдента. Эта цифра была изменена с38. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Стратегия облегчения ЭКО с использованием искусственного хряща на основе ГК. Принципиальная схема окостенения и развития костного мозга без и с фрагментацией (μ-пеллетами) имплантированных конструкций ГК. (А) Гидрогели с гиалуроновой кислотой обладают отличной тенденцией к сращению с образованием интегрированной кости с васкуляризацией и развитием костного мозга между сросшимися трансплантатами in vivo. Однако полученная имплантированная ткань оставалась преимущественно в хрящевом состоянии даже через 8 недель после имплантации. (Б) Учитывая тенденцию конструкций ГК срастаться с образованием интегрированной кости, переработка конструкций ГК в μ-гранулы может ускорить скорость ремоделирования трансплантированной ткани и способствовать формированию костной ткани. Микронизация конструкций увеличивает площадь поверхности, что может способствовать рассасыванию хрящевой ткани и формированию костной ткани, а также может способствовать ангиогенезу и развитию костного мозга из-за увеличения пространства для инфильтрации клеток хозяина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Гидрогель | Эксперименты | Привязаны | Единый | % Объединенные |
| Коллаген | 5 | 3 | 2 | 40 |
| ХА | 5 | 5 | 5 | 100 |
Таблица 1: Скорость унификации, когда несколько конструктов были имплантированы в один карман. Две-три конструкции подкожно имплантировались в один карман. Конструкты собирали через 4 или 8 недель после имплантации и гистологически исследовали.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование соответствующих материалов каркаса, способствующих переходу от гипертрофированного хряща к кости, является перспективным подходом к масштабированию инженерных гипертрофических хрящевых трансплантатов на основе МСК и лечению костных дефектов клинически значимого размера. Здесь мы показываем, что гиалуроновая кислота является отличным материалом для каркаса, поддерживающего дифференцировку гипертрофированной хрящевой ткани на основе МСК in vitro и способствующего образованию эндохондральной кости in vivo38. Кроме того, было показано, что in vivo конструкции ГК способствуют слиянию нескольких конструкций, имплантированных в один и тот же карман, с образованием единой интегрированной кости. Поскольку взаимодействие МСК с материалами каркаса существенно влияет на хрящ и гипертрофический хондрогенез, выбор подходящего материала каркаса для ЭКО важен для получения клинически эффективных тканеинженерных хрящевых трансплантатов. Клетки, встроенные в гидрогели ГК, равномерно демонстрируют округлую морфологию, характерную для хондроцитов от центра к периферии, что указывает на то, что гиалуронан обеспечивает среду, способствующую равномерному образованию хряща по всему гидрогелю21,30. В отличие от ГК, коллаген взаимодействует с МСК через последовательности связывания интегринов (RGD); однако постоянство этого взаимодействия предотвращает дальнейшую дифференцировку МСК в хондрогенном пути43, что может объяснить нетипичную морфологию клеток хондроцитов, которая заметна на периферии коллагеновых конструкций.
Если несколько трансплантатов объединяются в одну кость, этот ЭКО-опосредованный подход может быть распространен на более клинически значимые костные дефекты. При наложении нескольких гипертрофических хрящей на основе МСК и без каркаса на один костный дефект сообщалось, что хрящевые трансплантаты интегрировались с костным дефектом. Однако соседние трансплантаты не интегрировались друг с другом22. Представленный здесь подход может предложить одно из возможных решений для преодоления этого ограничения. По сравнению с коллагеновыми конструкциями, множественные трансплантаты конструктов ГК имели большую тенденцию к слиянию с образованием одной кости. Кроме того, костный мозг формировался между сросшимися конструкциями ГК, что может быть связано с тем, что ГК поддерживает равномерную дифференцировку хряща по всему гидрогелю, поскольку гипертрофированный хрящ секретирует VEGF и обеспечивает среду для ниши гемопоэтических стволовых клеток в развитии костного мозга 44.
Ключом к успешному эксперименту с использованием этого протокола является качество МСК. Рекомендуется заранее подтвердить, что используемые МСК обладают достаточно высоким потенциалом хондрогенной дифференцировки. Во-вторых, размер каждой конструкции не должен быть слишком большим. По нашему опыту, объем одной конструкции ограничен 10-15 мкл. Более крупные конструкции могут привести к недостаточному проникновению кислорода и питательных веществ внутрь конструкций, что приводит к некрозу и плохой дифференцировке в центре конструкций. Поэтому толщину геля необходимо уменьшить, чтобы улучшить проникновение кислорода и питательных веществ. Для уменьшения толщины геля может быть полезно создать тонкие гели на пористой мембране вставок Transwell14,45. В качестве альтернативы, поскольку конструкции ГК имеют тенденцию срастаться и образовывать интегрированную кость, может быть достаточно имплантировать множество меньших конструкций, а не одну большую, как обсуждается ниже.
Ограничения этого исследования включают необходимость ускорения скорости ремоделирования имплантированных тканей для облегчения формирования костной ткани. Имплантированная инженерная ткань оставалась преимущественно в гипертрофированном состоянии кальцинированного хряща даже через 8 недель после имплантации. В формировании костной ткани через путь ECO клетки, полученные от хозяина, играют решающую роль в продвижении ECO16,46. Сообщалось, что обеспечение дополнительных каналов в гипертрофированных хрящевых трансплантатах способствует сосудистой инвазии и минерализации трансплантата in vivo20. Такие каналы служат проводниками для инфильтрации клеток хозяина, включая остеобласты, остеокласты и предшественники кроветворения, для формирования новой ткани внутри конструкции. В качестве альтернативы сообщалось, что несколько небольших фибрин-инкапсулированных гранул (μ-гранул), состоящих из хондрогенных дифференцированных МСК, могут быть имплантированы для формирования интегрированной кости47. Переработка конструктов ГК в μ-гранулы может увеличить площадь поверхности, окруженной TRAP-положительными остеокластами, тем самым способствуя скорости ремоделирования хрящевой ткани и усиливая остеогенез (рис. 6)21,48. Кроме того, имплантация μ-гранул увеличит инфильтрационное пространство клеток хозяина, тем самым способствуя ангиогенезу и развитию костного мозга и генерируя целостное формирование костной ткани с обильной васкуляризацией. Таким образом, учитывая тенденцию конструктов ГК к срастанию и созданию интегрированной кости, эта стратегия регенерации костной ткани, сконструированная μ, может ускорить процесс ЭКО гипертрофированных хрящевых трансплантатов с использованием гидрогелей ГК.
В заключение, гидрогели ГК эффективны в масштабировании тканеинженерных трансплантатов с меньшим количеством клеток и гелей, чем коллагеновые гидрогели. Кроме того, гидрогели ГК обладают отличной чувствительностью к слиянию и создают интегрированную кость с васкуляризацией и развитием костного мозга между сросшимися трансплантатами. Таким образом, модификация конструкций ГК для стимулирования инфильтрации клеток хозяина и ремоделирования трансплантата может привести к разработке имплантируемых материалов, которые могут в дальнейшем способствовать васкуляризации и развитию костного мозга. При дальнейшей оптимизации этот подход может стать многообещающей альтернативой современной костной терапии в челюстно-лицевой и ортопедической хирургии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом на научные исследования (KAKENHI) Японского общества содействия науке (JSPS) (грант No 1). JP19K10259 и 22К10032 в МАИ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
| Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
| Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
| basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
| bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
| Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
| dexamethasone | Merck | D8893 | |
| Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| Dormicum | Astellas Pharma | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
| Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
| Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
| HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
| IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
| ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
| L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
| L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
| L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
| MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
| paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
| PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
| TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
| Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
| Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
| β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |
References
- Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
- Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
- Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
- Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A.
- Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
- Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D.
- Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
- Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
- Kronenberg, H. M.
- Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
- Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
- Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
- Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
- Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
- Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
- van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
- Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
- Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
- Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
- Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
- Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
- Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
- Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
- Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
- Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
- Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton's jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
- Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
- Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
- Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
- La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
- Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O'Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
- Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
- Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
- Zarembinski, T., Skardal, A. Hydrogels - Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
- Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
- Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
- Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
- Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
- Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
- Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).
