Интегрированное формирование костной ткани с помощью эндохондральной оссификации in vivo с использованием мезенхимальных стволовых клеток
Summary
Костная терапия с помощью эндохондральной оссификации путем имплантации искусственной хрящевой ткани, полученной из мезенхимальных стволовых клеток, может обойти недостатки традиционных методов лечения. Гидрогели гиалуроновой кислоты эффективны для масштабирования равномерно дифференцированных хрящевых трансплантатов, а также для создания интегрированной кости с васкуляризацией между сросшимися трансплантатами in vivo.
Abstract
Традиционная терапия костной регенерации с использованием мезенхимальных стволовых клеток (МСК) трудно применима к костным дефектам, превышающим критический размер, поскольку она не имеет механизма индуцирования ангиогенеза. Имплантация искусственной хрящевой ткани, изготовленной из МСК, индуцирует ангиогенез и формирование костной ткани in vivo посредством эндохондральной оссификации (ЭКО). Таким образом, этот ЭКО-опосредованный подход может стать многообещающей терапией регенерации костной ткани в будущем. Важным аспектом клинического применения этого ЭКО-опосредованного подхода является создание протокола подготовки достаточного количества хряща для имплантации для восстановления костного дефекта. Особенно непрактично создавать единичную массу трансплантированного хряща такого размера, который соответствует форме фактического костного дефекта. Таким образом, хрящ, подлежащий пересадке, должен обладать свойством формировать кость интегрально при имплантации нескольких частей. Гидрогели могут быть привлекательным инструментом для масштабирования тканеинженерных трансплантатов для эндохондральной оссификации в соответствии с клиническими требованиями. Несмотря на то, что многие гидрогели природного происхождения поддерживают образование хряща МСК in vitro и ECO in vivo, оптимальный материал каркаса для удовлетворения потребностей клинического применения еще предстоит определить. Гиалуроновая кислота (ГК) является важнейшим компонентом хрящевого внеклеточного матрикса и представляет собой биоразлагаемый и биосовместимый полисахарид. Здесь мы показываем, что гидрогели ГК обладают превосходными свойствами поддерживать дифференцировку хрящевой ткани на основе МСК in vitro и способствовать образованию эндохондральной кости in vivo.
Introduction
Аутологичная кость по-прежнему является золотым стандартом для восстановления костных дефектов, вызванных травмами, врожденными дефектами и хирургической резекцией. Однако аутогенная костная пластика имеет существенные ограничения, включая боль донора, риск инфекции и ограниченный объем костной ткани, который может быть выделен у пациентов 1,2,3,4. В качестве заменителей костной ткани были разработаны многочисленные биоматериалы, сочетающие природные или синтетические полимеры с минерализованными материалами, такими как фосфат кальция или гидроксиапатит 5,6. Формирование костной ткани в этих конструкционных материалах обычно достигается с использованием минерализованного материала в качестве грунтовочного материала, позволяющего стволовым клеткам дифференцироваться непосредственно в остеобласты посредством процесса внутримембранного окостенения (ИМО)7. В этом процессе отсутствует ангиогенная стадия, что приводит к недостаточной васкуляризации трансплантата in vivo после имплантации 8,9,10, в связи с чем подходы, использующие такой процесс, могут быть не оптимальными для лечения крупных костных дефектов 11.
Было показано, что стратегии, применяемые для повторения процесса эндохондральной оссификации (ЭКО), врожденного механизма скелетогенеза в процессе развития, позволяют преодолеть значительные проблемы, связанные с традиционными подходами, основанными на ИМО. При ЭКО хондроциты в хрящевой матрице высвобождают сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), который способствует сосудистой инфильтрации и ремоделированию хрящевой матрицы в кость12. ECO-опосредованный подход к остеогенезу через ремоделирование хряща и ангиогенез, который также активируется во время восстановления перелома, использует искусственно созданную хрящевую ткань, полученную из МСК, в качестве грунтовочного материала. Хондроциты могут переносить гипоксию при костных дефектах, индуцировать ангиогенез и превращать бессосудистый хрящевой трансплантат в ангиогенную ткань. Многочисленные исследования показали, что хрящевые трансплантаты на основе МСК генерируют костную ткань in vivo путем реализации такой программы ECO 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Существенным требованием для клинического применения этого ЭКО-опосредованного подхода является подготовка желаемого количества хрящевого трансплантата в клинических условиях. Препарирование клинического хряща такого размера, который соответствует фактическому дефекту кости, нецелесообразно. Таким образом, хрящ трансплантата должен образовывать костную ткань интегрально при имплантации нескольких фрагментов22. Гидрогели могут быть привлекательным инструментом для масштабирования тканеинженерных трансплантатов для эндохондральной оссификации. Многие гидрогели природного происхождения поддерживают образование хряща МСК in vitro и ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Тем не менее, оптимальный вспомогательный материал, отвечающий требованиям клинического применения, остается неопределенным. Гиалуроновая кислота (ГК) представляет собой биоразлагаемый и биосовместимый полисахарид, присутствующий во внеклеточном матриксе хряща33. Гиалуроновая кислота взаимодействует с МСК через поверхностные рецепторы, такие как CD44, поддерживая хондрогенную дифференцировку 25,26,28,30,31,32,34. Кроме того, скаффолды с гиалуроновой кислотой способствуют ИМО-опосредованной остеогенной дифференцировке стволовых клеток пульпы зуба человека35, а скаффолды в сочетании с коллагеном способствуют ЭКО-опосредованному остеогенезу36,37.
В данной работе мы представляем способ получения гидрогелей ГК с использованием МСК взрослого человека, полученных из костного мозга, и их использование для гипертрофического хондрогенеза in vitro и последующей эндохондральной оссификации in vivo38. Мы сравнили характеристики гиалуроновой кислоты с характеристиками коллагена, материала, широко применяемого в инженерии костной ткани с МСК и полезного материала для масштабирования искусственных трансплантатов для эндохондральной оссификации17. В мышиной модели с ослабленным иммунитетом гиалуроновая кислота и коллагеновые конструкции, засеянные человеческими МСК, оценивали потенциал ЭКО in vivo путем подкожной имплантации. Результаты показывают, что гидрогели ГК отлично подходят в качестве каркаса для МСК для создания искусственных хрящевых трансплантатов, которые позволяют формировать костную ткань с помощью ЭКО.
Протокол разделен на два этапа. Сначала готовят конструкции человеческих МСК, засеянных на гиалуроновый гидрогель, и дифференцируют их в гипертрофированный хрящ in vitro. Затем дифференцированные конструкции имплантируются подкожно в обнаженную модель, чтобы индуцировать эндохондральное окостенение in vivo (рис. 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование соответствующих материалов каркаса, способствующих переходу от гипертрофированного хряща к кости, является перспективным подходом к масштабированию инженерных гипертрофических хрящевых трансплантатов на основе МСК и лечению костных дефектов клинически значимого ра?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом на научные исследования (KAKENHI) Японского общества содействия науке (JSPS) (грант No 1). JP19K10259 и 22К10032 в МАИ).
Materials
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
| Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
| Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
| basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
| bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
| Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
| dexamethasone | Merck | D8893 | |
| Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| Dormicum | Astellas Pharma | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
| Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
| Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
| HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
| IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
| ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
| L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
| L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
| L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
| MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
| paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
| PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
| TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
| Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
| Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
| β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |
References
- Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
- Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
- Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
- Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A. Cell-based bone tissue engineering. PLOS Medicine. 4 (2), e9 (2007).
- Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host’s vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
- Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D. Engineering thick tissues–the vascularisation problem. European Cells and Materials. 14, 1-19 (2007).
- Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
- Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
- Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
- Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
- Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
- Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
- Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
- van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
- Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
- Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
- Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
- Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
- Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
- Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
- Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
- Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
- Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
- Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton’s jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
- Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
- Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
- Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
- La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
- Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O’Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
- Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
- Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
- Zarembinski, T., Skardal, A. . Hydrogels – Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
- Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
- Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
- Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
- Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
- Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
- Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).
