Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تشكيل العظام المتكاملة من خلال التعظم داخل الغضروف في الجسم الحي باستخدام الخلايا الجذعية الوسيطة

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65573
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,3
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Summary

علاج العظام عن طريق التعظم داخل الغضروف عن طريق زرع أنسجة الغضاريف الاصطناعية المنتجة من الخلايا الجذعية الوسيطة لديه القدرة على التحايل على عيوب العلاجات التقليدية. الهلاميات المائية لحمض الهيالورونيك فعالة في توسيع نطاق ترقيع الغضاريف المتمايزة بشكل موحد بالإضافة إلى إنشاء عظام متكاملة مع الأوعية الدموية بين الطعوم المنصهرة في الجسم الحي.

Abstract

من الصعب تطبيق العلاج التقليدي لتجديد العظام باستخدام الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على عيوب العظام الأكبر من الحجم الحرج لأنه لا يحتوي على آلية للحث على تكوين الأوعية. يؤدي زرع أنسجة الغضاريف الاصطناعية المصنعة من MSCs إلى تكوين الأوعية الدموية وتكوين العظام في الجسم الحي عن طريق التعظم داخل الغضروف (ECO). لذلك ، قد يكون هذا النهج بوساطة منظمة التعاون البيئي علاجا واعدا لتجديد العظام في المستقبل. يتمثل أحد الجوانب المهمة للتطبيق السريري لهذا النهج بوساطة ECO في إنشاء بروتوكول لإعداد ما يكفي من الغضروف ليتم زرعه لإصلاح عيب العظام. ليس من العملي بشكل خاص تصميم كتلة واحدة من الغضروف المطعمة بحجم يتوافق مع شكل عيب العظم الفعلي. لذلك ، يجب أن يكون للغضروف المراد زرعه خاصية تكوين العظام بشكل متكامل عند زرع قطع متعددة. قد تكون الهلاميات المائية أداة جذابة لتوسيع نطاق الطعوم المهندسة بالأنسجة من أجل التعظم داخل الغضروف لتلبية المتطلبات السريرية. على الرغم من أن العديد من الهلاميات المائية المشتقة بشكل طبيعي تدعم تكوين غضروف MSC في المختبر و ECO في الجسم الحي ، إلا أن مادة السقالة المثلى لتلبية احتياجات التطبيقات السريرية لم يتم تحديدها بعد. حمض الهيالورونيك (HA) هو عنصر حاسم في مصفوفة الغضروف خارج الخلية وهو عديد السكاريد القابل للتحلل الحيوي والمتوافق حيويا. هنا ، نظهر أن الهلاميات المائية HA لها خصائص ممتازة لدعم التمايز في المختبر لأنسجة الغضاريف القائمة على MSC وتعزيز تكوين العظام داخل الغضروف في الجسم الحي.

Introduction

لا يزال العظم الذاتي هو المعيار الذهبي لإصلاح عيوب العظام بسبب الصدمات والعيوب الخلقية والاستئصال الجراحي. ومع ذلك ، فإن تطعيم العظام الذاتي له قيود كبيرة ، بما في ذلك ألم المتبرع ، وخطر العدوى ، وحجم العظام المحدود الذي يمكن عزله عن المرضى1،2،3،4. تم تطوير العديد من المواد الحيوية كبدائل للعظام ، تجمع بين البوليمرات الطبيعية أو الاصطناعية والمواد المعدنية مثل فوسفات الكالسيوم أو هيدروكسيباتيت 5,6. عادة ما يتم تحقيق تكوين العظام في هذه المواد الهندسية باستخدام المواد المعدنية كمادة أولية للسماح للخلايا الجذعية بالتمايز مباشرة إلى بانيات العظم من خلال عملية التعظم داخل الغشاء (IMO)7. تفتقر هذه العملية إلى الخطوة الوعائية ، مما يؤدي إلى عدم كفاية الأوعية الدموية في الجسم الحي للكسب غير المشروع بعد الزرع8،9،10 ، وبالتالي ، قد لا تكون الطرق التي تستخدم مثل هذه العملية هي الأمثل لعلاج عيوب العظام الكبيرة 11.

وقد ثبت أن الاستراتيجيات المطبقة لتلخيص عملية التعظم داخل الغضروف (ECO) ، وهي آلية فطرية في تكوين الهيكل العظمي أثناء التطور ، تتغلب على المشاكل الكبيرة المرتبطة بالنهج التقليدية القائمة على المنظمة البحرية الدولية. في ECO ، تطلق الخلايا الغضروفية في قالب الغضروف عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ، مما يعزز تسلل الأوعية الدموية وإعادة تشكيل قالب الغضروف إلى العظم12. يستخدم النهج بوساطة ECO لتكوين العظم عن طريق إعادة تشكيل الغضروف وتكوين الأوعية ، والذي يتم تنشيطه أيضا أثناء إصلاح الكسر ، أنسجة غضروفية تم إنشاؤها بشكل مصطنع مشتقة من MSCs كمادة أولية. يمكن للخلايا الغضروفية تحمل نقص الأكسجة في عيوب العظام ، والحث على تكوين الأوعية الدموية ، وتحويل طعم الغضروف الخالي من الأوعية الدموية إلى نسيج وعائي. أفادت العديد من الدراسات أن ترقيع الغضروف القائم على MSC يولد العظام في الجسم الحي من خلال تنفيذ مثل هذا البرنامج ECO 13،14،15،16،17،18،19،20،21.

أحد المتطلبات الأساسية للتطبيق السريري لهذا النهج بوساطة منظمة التعاون البيئي هو كيفية تحضير الكمية المطلوبة من طعم الغضروف في بيئة سريرية. إعداد الغضروف السريري بحجم يناسب عيب العظام الفعلي ليس عمليا. لذلك ، يجب أن يشكل غضروف الكسب غير المشروع العظام بشكل متكامل عند زرع شظايا متعددة22. قد تكون الهلاميات المائية أداة جذابة لتوسيع نطاق الطعوم المهندسة بالأنسجة من أجل التعظم داخل الغضروف. تدعم العديد من الهلاميات المائية المشتقة بشكل طبيعي تكوين غضروف MSC في المختبر و ECO في الجسم الحي23،24،25،26،27،28،29،30،31،32 ؛ ومع ذلك ، ظلت مواد الدعم المثلى لتلبية متطلبات التطبيق السريري غير محددة. حمض الهيالورونيك (HA) هو عديد السكاريد القابل للتحلل الحيوي والمتوافق حيويا الموجود في المصفوفة خارج الخلية للغضروف33. يتفاعل HA مع MSCs عبر مستقبلات سطحية مثل CD44 لدعم التمايز الغضروفي25،26،28،30،31،32،34. بالإضافة إلى ذلك ، تعزز سقالات HA التمايز العظمي بوساطة المنظمة البحرية الدولية للخلايا الجذعية لب الأسنانالبشرية 35 ، والسقالات جنبا إلى جنب مع الكولاجين تعزز تكوين العظم بوساطة ECO-36,37.

هنا ، نقدم طريقة لإعداد الهلاميات المائية HA باستخدام MSCs البشرية البالغة المشتقة من نخاع العظم واستخدامها لتكوين الغضروف الضخامي في المختبر والتعظم داخل الغضروفي اللاحق في الجسم الحي38. قارنا خصائص HA مع خصائص الكولاجين ، وهي مادة مطبقة على نطاق واسع في هندسة أنسجة العظام مع MSCs ومادة مفيدة لتوسيع نطاق الطعوم الاصطناعية للتعظم داخل الغضروف17. في نموذج الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، تم تقييم تركيبات HA والكولاجين المصنفة مع MSCs البشرية لإمكانات ECO في الجسم الحي عن طريق الزرع تحت الجلد. تظهر النتائج أن الهلاميات المائية HA ممتازة كسقالة ل MSCs لإنشاء ترقيع غضروفي اصطناعي يسمح بتكوين العظام من خلال ECO.

ينقسم البروتوكول إلى خطوتين. أولا ، يتم تحضير تركيبات MSCs البشرية المصنفة على هيدروجيل الهيالورونان وتمييزها إلى غضروف ضخامي في المختبر. بعد ذلك ، يتم زرع التركيبات المتمايزة تحت الجلد في نموذج عاري للحث على التعظم داخل الغضروف في الجسم الحي (الشكل 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يستخدم هذا البروتوكول ذكور الفئران العارية البالغة من العمر 4 أسابيع. إيواء أربعة فئران في قفص تحت دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة عند 22-24 درجة مئوية ورطوبة نسبية 50٪ -70٪. أجريت جميع التجارب على وفقا للإرشادات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة طوكيو للطب وطب الأسنان (معرف الموافقة: A2019-204C و A2020-116A و A2021-121A).

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

  1. قم بإعداد وسط نمو الخلايا الجذعية الوسيطة (وسط نمو MSC) عن طريق إضافة مجموعة مكملات وسط نمو MSC إلى الوسائط القاعدية MSC وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. قم بإعداد وسط النسر المعدل من Dulbecco ووسط Ham's F12 (DMEM / F-12) بإضافة 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، و 200 ميكرومتر L-alanyl-L-glutamine ، و 1 نانوغرام / مل عامل نمو ليفي أساسي إلى الوسط وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
  3. قم بإعداد وسط غضروفي عن طريق إضافة 1٪ مكمل ITS-G ، و 0.12٪ ألبومين مصل بقري ، و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، و 0.35 مللي متر من البرولين ، و 100 نانومتر ديكساميثازون ، و 10 نانوغرام / مل TGF-β3 إلى DMEM قبل الاستخدام مباشرة.
  4. تحضير الوسط الضخامي عن طريق إضافة 10 مللي مول β-جليسيروفوسفات ، 0.12٪ ألبومين مصل بقري ، 10 نانومتر ديكساميثازون ، 200 ميكرومتر أسكوربات -2-فوسفات ، 50 نانومتر ل-ثيروكسين ، 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، و 50 بيكوغرام / مل IL-1β إلى DMEM قبل الاستخدام مباشرة.
  5. قم بتغطية طبق استزراع مكون من 24 بئرا ب 200 ميكرولتر من البارافين المذاب المسخن مسبقا على حرارة 60 درجة مئوية. السماح للوقوف في درجة حرارة الغرفة حتى يتم ضبط البارافين.

2. التوسع في MSCs البشرية

ملاحظة: قبل البدء في التجارب ، يجب اختيار MSCs ذات الإمكانات العالية لتكوين غضروف MSC في ثقافة الكتلة الدقيقة كما هو موضح في17.

  1. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، فإن MSCs المشتقة من نخاع العظم البشري الأساسي (الممر 2) مع وسط نمو MSC في طبق 10 سم بكثافة 5 × 103 خلايا / سم 2 عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 و 95٪ حاضنة هواء مرطبة.
  2. تغيير الوسيط كل 2-3 أيام. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -90٪ ، قم بشفط الوسط من طبق زراعة الخلايا باستخدام مضخة تفريغ ، واغسله ب 5 مل من PBS ، ثم استنشاق المحلول بمضخة تفريغ.
  3. أضف 1 مل من محلول 0.05٪ تربسين / 0.02٪ EDTA إلى الطبق. احتضان الطبق لمدة 5-10 دقائق على حرارة 37 درجة مئوية.
  4. أضف 1 مل من وسط نمو MSC لإيقاف التفاعل الأنزيمي. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 50 مل.
  5. امزج تعليق الخلية من الأطباق الأخرى في أنبوب سعة 50 مل واحتفظ به على الجليد.
  6. استخدم عداد الخلية لحساب الخلايا عن طريق خلط 10 ميكرولتر من معلق الخلية مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان بلو وصمة عار.
  7. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية المتبقية في 220 × غرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية وإضافة محلول الحفظ بالتبريد بتركيز 1.0 × 106 خلايا لكل مل.
  8. قم بتوزيع 1 مل من معلق الخلية في كل أنبوب تبريد وخزنه في -80 درجة مئوية لمدة 12 ساعة قبل نقله إلى النيتروجين السائل. وتستخدم المخزونات المجمدة الناتجة (المقطع 3) لهذا البروتوكول.
  9. بالنسبة للتجارب ، قم بزرع MSCs المخزنة في طبق 10 سم بكثافة 5 × 103 خلايا / سم2. خلايا المزرعة حتى 80٪ -90٪ متقاربة (المقطع 4) في وسط DMEM / F-12.

3. إعداد الهلاميات المائية المغلفة MSC

  1. التربسين الخلايا وإعداد تعليق الخلية كما هو موضح في الخطوات 2.3 - 2.6.
  2. لعمل 10 تركيبات (2.5 × 10 5 خلايا لكل بناء) ، قم بقسمة تعليق الخلية الذي يحتوي على 2.5 × 106 خلايا في أنبوب دقيق سعة1.5 مل.
  3. أجهزة الطرد المركزي التعليق عند 220 × جم لمدة 3 دقائق ، وإزالة المادة الطافية بمضخة تفريغ ، والاحتفاظ بها على الجليد.
  4. أحضر حمض الهيالورونيك المعدل بالثيول (HA) ، والتشابك التفاعلي مع الثيول ، والبولي إيثيلين جلايكول دياكريلات ، وزجاجات المياه المنزوعة الغازات إلى درجة حرارة الغرفة.
  5. في ظل ظروف معقمة ، أضف 1.0 مل من الماء المفرغ إلى الزجاجة المحتوية على HA (انظر تعليمات الشركة المصنعة) باستخدام حقنة بإبرة.
  6. ترتفع درجة حرارة الدوامة أحيانا إلى 37 درجة مئوية حتى يصبح المحلول واضحا ، ثم توضع على الجليد. يستغرق أقل من 30 دقيقة حتى تذوب المواد الصلبة تماما.
  7. في ظل ظروف معقمة ، أضف 0.5 مل من الماء المفرغ إلى زجاجة crosslinker باستخدام حقنة بإبرة. تذوب عن طريق التقليب عدة مرات ، ثم توضع على الجليد.
  8. أضف 120 ميكرولتر من محلول HA المذاب إلى حبيبات الخلية المقتبسة (2.5 × 106 خلايا). أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق السحب ذهابا وإيابا.
  9. أضف 30 ميكرولتر من محلول الوصلة المتشابكة المذابة إلى الأنبوب الذي يحتوي على حمض الهيالورونيك والخلايا (الخطوة 3.8) وادمجها عن طريق النقر على الأنبوب ، ثم قم بتدويرها لفترة وجيزة. اجمع بين حل HA وحل الرابط المتشابك بنسبة 4: 1.
  10. قم بإسقاط 15 ميكرولتر من المحلول المدمج الذي يحتوي على MSCs (2.5 × 105 خلايا) على لوحة 24 بئرا المطلية بالبارافين واتركها تتصلب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (الشكل 2). بسبب اللزوجة العالية ، قم بإعداد كمية إضافية بنسبة 10٪ على الأقل من خليط الخلية / الهيدروجيل أكثر من اللازم.
    ملاحظة: تم وصف خصائص الهيدروجيل سابقا39.

4. في ظروف التمايز في المختبر

  1. أضف 0.5 مل من وسط التمايز الغضروفي إلى بنية من الهلاميات المائية HA المصنفة MSC. تغيير الوسيط كل 2-3 أيام.
  2. بعد 3 أسابيع ، قم بالتبديل إلى وسط التمايز الضخامي (0.5 مل لكل بئر) واستزراع التركيبات لمدة 2 أسابيع إضافية.

5. في الجسم الحي زرع MSCs

  1. بعد ما مجموعه 5 أسابيع من الثقافة في المختبر ، قم بزرع التركيبات تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران العارية كما هو موضح سابقا38,40.
  2. وزن الفئران وتطبيق مخدر مركب محضر ب 0.75 مغ/كغ من وزن الجسم ميديتوميدين و4.0 مغ/كغ وزن الجسم ميدازولام و5.0 مغ/كغ من وزن الجسم بوتورفانول عن طريق الحقن داخل الصفاق كما هو موضح38.
  3. تأكيد التخدير الكافي عن طريق الجمود للمنبهات الجراحية ومراقبة عمق الجهاز التنفسي عن طريق حركات الصدر البطيئة والمنتظمة وإمدادات الأكسجين المناسبة بلون الغشاء المخاطي الوردي بشكل دوري أثناء العملية. استخدام مرهم بيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
  4. ضع الماوس على ستارة جراحية معقمة في وضعية الانبطاح ، وقم بتعقيم موقع الشق بماء حمض هيبوكلوروس 50 جزء في المليون (درجة الحموضة 5.0 ؛ HAW) ، ووضع ثنى جراحية مثقبة على الماوس.
    ملاحظة: تعقيم جميع المواد الجراحية في الأوتوكلاف أو غاز أكسيد الإيثيلين أو HAW. يجب على الجراحين غسل أصابعهم وارتداء العباءات الجراحية والقفازات.
  5. قم بعمل شقين جلديين بطول 5 مم بمسافة 2 سم في منطقتي الكتف والورك على طول الخط المركزي للعمود الفقري باستخدام المقص.
  6. أدخل ملعقة تحت الجلد من خلال شق لإنشاء جيب تحت الجلد.
  7. أدخل اثنين إلى ثلاثة تركيبات (~ 15 ميكرولتر لكل منها ، الخطوة 5.1) في كل جيب بالملقط. تركيبات HA المزروعة في نفس الجيب عرضة للاندماج بشكل متكرر. لمنع الانصهار ، أدخل بنية HA واحدة في كل جيب.
  8. أغلق الشقوق بخيوط حريرية مضفرة 4-0. حقن الفأر بمضادات للتخدير المحضرة ب 0.75 مغ/كغ من وزن الجسم أتيباميزول كما هو موضح38.
  9. بينما تتعافى الفئران من التخدير ، ضع الفئران في أقفاص تعافي معقمة تحتوي على فراش أرضي معقم بدون زجاجات طعام وماء ومراقبة درجة حرارة الجسم والنبض والتنفس باستمرار.
  10. لا تترك الفئران دون مراقبة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. بعد الشفاء التام ، أعد إلى غرفة التكاثر مع الأخرى.
  11. راقب كل يومين خلال فترة الشفاء بحثا عن أي مضاعفات محتملة. القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون مع القليل من المعاناة في 4 و 8 أسابيع بعد الزرع.
  12. شق الجلد في المواقع المطعمة وإزالة التركيبات المزروعة بالملقط. إصلاح التركيبات في 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 16 ساعة ثم إخضاعها للتحليل.

6. التحليل الإحصائي

  1. الإبلاغ عن البيانات الكمية كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). إجراء التحليل الإحصائي باستخدام البرامج التجارية.
  2. استخدم اختبار t للطالب أو اختبار ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار المقارنات المتعددة ل Tukey لتحديد الاختلافات المهمة بين المجموعات. يشير P<0.05 و P<0.01 إلى اختلافات كبيرة بين مجموعتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استزراع الهلاميات المائية HA المغلفة MSC في وسط غضروفي مكمل ب TGFβ3 ، وهو محفز لتكوين الغضروف41 (الخطوة 4.1). قارنا خصائص HA مع خصائص الكولاجين ، والتي أثبتت فعاليتها في إنشاء ترقيع غضروفي اصطناعي قائم على MSC للتعظم داخل الغضروف ، كما هو موضح سابقا38. لم يتم تضمين MSCs غير المتمايزة كضوابط سلبية في هذه الدراسة لأنه ثبت أن MSCs غير المتمايزة تتطلب أسطح معدنية كركيزة أولية لتوليد العظام عن طريق التمايز العظمي (أي التعظم داخل الغشاء)7.

لم يتغير حجم الهلاميات المائية الهيالورونان طوال فترة الاستزراع في المختبر ، كما تم الحكم عليه بناء على الأقطار المقاسة تحت المجهر المقلوب ، في حين أن الهلاميات المائية للكولاجين المستخدمة للمقارنة بدأت في الانكماش بعد وقت قصير من بدء الثقافة. لتقليل فرق الحجم بين تركيبات HA والكولاجين بعد الزراعة في المختبر ، تم تقليل عدد MSCs وحجم الجل المستخدم لإنشاء الهلاميات المائية HA إلى النصف مقارنة بتلك المستخدمة في الهلاميات المائية للكولاجين. ومع ذلك ، كان الوزن الرطب لتركيبات HA بعد 3 أسابيع من زراعة الغضاريف أثقل 4 مرات من وزن تركيبات الكولاجين.

التمايز الغضروفي والضخامي في المختبر.
بعد التمايز الغضروفي (في الأسبوع 3 من الثقافة في المختبر ) ، الجليكوزامينوجليكان الكبريتي (sGAG) إيجابي (Safranin O / تلطيخ أخضر سريع ؛ الشكل 3 أ) ولوحظ وجود مصفوفة خارج الخلية إيجابية الكولاجين من النوع الثاني في كلا البنيتين ، مما يشير إلى أن كلا من الهلاميات المائية HA والكولاجين تدعم تكوين الغضروف. ومع ذلك ، بالمقارنة مع بنية الكولاجين ، كان توزيع sGAG والكولاجين من النوع الثاني (Col II) والكولاجين من النوع X (Col X) أكثر تجانسا في جميع أنحاء الأنسجة في تركيبات HA. كانت الاختلافات بين البنائين واضحة أيضا في مورفولوجيا الخلية: تم توزيع الخلايا ذات التشكل المستدير الشبيه بالخلايا الغضروفية في جميع أنحاء الأنسجة في تركيبات HA. ومع ذلك ، في تركيبات الكولاجين ، أظهرت الخلايا الموجودة في المحيط مورفولوجيا غير متجانسة ، تتراوح من مورفولوجيا غير منتظمة / ممتدة إلى مورفولوجيا مستديرة. واتساقا مع ذلك، كان متوسط استدارة الخلايا في تركيبات حمض الهيالورونيك أعلى منه في تركيبات الكولاجين، سواء في المناطق المحيطية أو الوسطى (34٪ مقابل 77.6٪ (p<0.01) و 78.3٪ مقابل 100٪ (p<0.05)، على التوالي. الشكل 3 ب). في 5 أسابيع من الاستزراع ، تم الكشف عن ترسب الكالسيوم عند الحواف الخارجية في كلا البنائين (أحمر أليزارين. الشكل 3 ج). علاوة على ذلك ، تم الكشف عن التعبير عن chondrogenic (Sox-9 ، aggrecan (ACAN) ، Col II) ، الضخامي (Col X ، مصفوفة ميتالوببتيداز 13 (MMP-13)) ، والعظم (الكولاجين من النوع الأول (Col I) ، البروتين السيالي العظمي (BSP) ، أوستيوكالسين (OCN)) علامات14 بواسطة RT-PCR الكمي في الوقت الفعلي ، مما يؤكد تطور التمايز الغضروفي والضخامي أثناء الزراعة في المختبر (الشكل 4).

التعظم داخل الغضروف للتركيبات المزروعة تحت الجلد في الجسم الحي.
تم إنشاء جيوب تحت الجلد على ظهر الفئران العارية ، وتم زرع اثنين إلى ثلاثة هياكل في كل جيب بعد التمايز الضخامي (في الأسبوع 5 من الثقافة في المختبر ). في 4 أو 8 أسابيع بعد الزرع ، تم ربط جميع تركيبات HA ببعضها البعض في الجيوب المزروعة (الجدول 1). في تركيبات الكولاجين ، لوحظ التصاق في 60 ٪ من الجيوب ، بينما في الجيوب المتبقية ، كانت الطعوم مستقلة عن بعضها البعض. كشف تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) أنه في كلا البنائين في 8 أسابيع بعد الزرع ، تم تشكيل الأنسجة العظمية مع مورفولوجيا رقائقي في المناطق الخارجية من التركيبات (الشكل 5Aa، f). اختفى تلطيخ sGAG في تركيبات HA ، مما يشير إلى فقدان النمط الظاهري للغضروف (الشكل 5Ah). في كلا البنائين ، تم تشكيل مكون نخاع العظم الذي يحتوي على خلايا المكونة للدم والأنسجة الدهنية بين الغضروف الداخلي والأنسجة العظمية الخارجية. في جميع تركيبات HA ، كانت الأنسجة العظمية للتركيبات المنصهرة متصلة ومحاطة بأنسجة ليفية مشتركة ونخاع عظمي تم تطويره على طول المسافة بين البنائين الملتصقين ، مما يشير إلى أن تركيبات HA المتعددة تميل إلى تكوين نسيج عظمي متكامل (الشكل 5Ag). تم دمج تركيبات الكولاجين الملتصقة بالمثل في حالتين من الحالات الثلاث المنصهرة ، ولكن في الحالة الثالثة ، لم يكن النسيج العظمي للبنيتين متصلين (الجدول 1 والشكل 5Ab). في كلا البنائين ، لوحظت الأوعية التي تم تحديدها بواسطة الخلايا البطانية الإيجابية CD3142 في نخاع العظم (الأشكال 5Ad,i) ، وكانت مناطق الغضروف الداخلي محاطة بخلايا متعددة النوى إيجابية TRAP من سلالة ناقضة العظم ، مما يشير إلى أن أنسجة الغضاريف كانت عرضة لإعادة البناء (الأشكال 5Ae ، j).

ترسبت المعادن في المنطقة العظمية الخارجية في كل من تركيبات HA والكولاجين (الشكل 5B). في حين أن الكثافة المعدنية الكلية للعظم الجديد كانت متشابهة بين تركيبات HA والكولاجين ، كان حجم المعادن أعلى بكثير في تركيبات HA منه في تركيبات الكولاجين ، مما قد يعكس حقيقة أن الهلاميات المائية HA لم تتقلص أثناء الزراعة في المختبر ، مما أدى إلى تركيبات أكبر من الهلاميات المائية الكولاجين (الشكل 5C ، د).

Figure 1
الشكل 1: التصميم التجريبي. تتمثل الخطوة الأولى من هذا البروتوكول في تغليف MSCs الموسعة في الهلاميات المائية HA لتعزيز التمايز الغضروفي والضخامي في المختبر. يتم استزراع التركيبات في ظروف التمايز الغضروفي لمدة 3 أسابيع ، تليها 2 أسابيع إضافية في ظروف التمايز الضخامي. الخطوة الثانية من هذا البروتوكول هي زرع التركيبات تحت الجلد في الفئران العارية في الأسبوع 5 من الثقافة في المختبر للخضوع للتعظم داخل الغضروف في الجسم الحي لمدة 8 أسابيع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحضير الهلاميات المائية المصنفة ب MSCs. قم بإسقاط محلول HA / crosslinker المعدل الذي يحتوي على MSCs على صفيحة 24 بئرا مغلفة بالبارافين واتركها تتصلب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: التحليل النسيجي والكيميائي المناعي لتركيبات HA والكولاجين بعد الزراعة في المختبر 22. (أ) تم تلطيخ التركيبات في 3 أسابيع (3W) من الثقافة في المختبر من أجل sGAG (سافرانين O / أخضر سريع) ، والكولاجين من النوع الثاني (Col II) ، والكولاجين من النوع X (Col X). (ب) متوسط القيم الدائرية للخلايا في 3 أسابيع من الزراعة في المختبر (ن = 5). تشير الأشرطة المفتوحة والرمادية إلى تركيبات الكولاجين و HA ، على التوالي. تختلف المجموعات التي لا تحتوي على حرف مشترك إحصائيا (a مقابل b ، p<0.01 ؛ b مقابل c ، p<0.05). (ج) تم تلطيخ التركيبات في 5 أسابيع (5W) من الثقافة في المختبر للكالسيوم (أحمر أليزارين). تم التقاط جميع الصور بنفس التكبير (شريط المقياس: 200 ميكرومتر). تظهر نظرة عامة منخفضة التكبير للأنسجة بأكملها في الأجزاء الداخلية (شريط المقياس: 1 مم). تمثل أشرطة الخطأ متوسط الانحراف المعياري ± (SD). تم استخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار المقارنات المتعددة ل Tukey لتحديد الاختلافات ذات الدلالة الجوهرية بين المجموعات. تم تعديل هذا الرقم من38. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل التعبير الجيني لتركيبات HA والكولاجين في 3 و 5 أسابيع من الزراعة في المختبر. (أ) الواسمات الغضروفية والتضخمية. ب: الواسمات العظمية. يتم تقديم القيم كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD) (n = 3). أعربت MSCs غير المتمايزة عن مستويات عالية من العقيد I و MMP-13 ومستويات منخفضة من Sox-9 و Col X ؛ لم يعبروا عن (#) ACAN و Col II و BSP و OCN. تمثل أشرطة الخطأ متوسط الانحراف المعياري ± (SD). تم تعديل هذا الرقم من38. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التحليل الكيميائي المناعي وتكلس حمض الهيالورونيك والكولاجين يبني بعد الزرع في 8 أسابيع. (أ) تم تلطيخ التركيبات للهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E و a و b و f و g) ، والسافرانين O / Fast Green (c و h) ، والخلايا البطانية (مجموعة التمايز 31 ، CD31) (d و i) ، والفوسفاتيز الحمضي المقاوم للطرطرات (TRAP و e و j). (أ و) نظرة عامة على الأنسجة بأكملها (شريط المقياس = 500 ميكرومتر). H&E ، سافرانين O ، CD31: شريط مقياس = 200 ميكرومتر ؛ TRAP: شريط مقياس = 50 ميكرومتر. تشير الأسهم إلى الخلايا البطانية الإيجابية CD31. الاختصارات: c = أنسجة الغضاريف الداخلية. o = النسيج العظمي الخارجي. (B) التصوير بالتصوير المقطعي المحوسب (μCT) للكولاجين وتركيبات HA (أشرطة مقياس الصورة الرئيسية والداخلية = 2 مم). (ج، د) الكثافة المعدنية الكلية (C) والحجم (D) لتركيبات HA والكولاجين (n = 4). ** يشير إلى اختلافات كبيرة؛ ص <0.01. تم تحليل أربعة بنيات لكل مجموعة باستخدام μCT. تمثل أشرطة الخطأ متوسط الانحراف المعياري ± (SD). تم استخدام اختبار t للطالب لتحديد الفروق ذات الدلالة النظرية بين المجموعات. تم تعديل هذا الرقم من38. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: استراتيجية لتسهيل ECOs باستخدام الغضروف الاصطناعي القائم على HA. رسم تخطيطي للتعظم وتطور نخاع العظم بدون ومع تجزئة (μ حبيبات) من تركيبات HA المزروعة. (أ) الهلاميات المائية HA لديها ميل اندماج ممتاز لتشكيل عظم متكامل مع الأوعية الدموية وتطور النخاع بين الطعوم المنصهرة في الجسم الحي. ومع ذلك ، ظل النسيج المزروع الناتج في الغالب في حالة الغضروف حتى بعد 8 أسابيع من الزرع. (ب) نظرا لميل تركيبات HA إلى الاندماج لتشكيل عظام متكاملة ، فإن معالجة تركيبات HA في كريات μ قد تسرع معدل إعادة تشكيل الأنسجة المزروعة وتعزز تكوين العظام. يزيد ميكرون التركيبات من مساحة السطح ، مما قد يعزز ارتشاف أنسجة الغضاريف وتكوين أنسجة العظام وقد يعزز أيضا تكوين الأوعية الدموية وتطور نخاع العظم بسبب زيادة مساحة تسلل الخلايا المضيفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هيدروجيل التجارب التقيد متحد ٪ متحدون
الكولاجين 5 3 2 40
هكتار 5 5 5 100

الجدول 1: معدل التوحيد عند زرع تركيبات متعددة في جيب واحد. تم زرع اثنين أو ثلاثة هياكل تحت الجلد في جيب واحد. تم حصاد التركيبات بعد 4 أو 8 أسابيع من الزرع وفحصها نسيجيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد استخدام مواد السقالة المناسبة التي تعزز الانتقال من الغضروف الضخامي إلى العظام نهجا واعدا لتوسيع نطاق ترقيع الغضروف الضخامي الهندسي القائم على MSC وعلاج عيوب العظام ذات الحجم الكبير سريريا. هنا ، نظهر أن HA هي مادة سقالة ممتازة لدعم تمايز أنسجة الغضاريف الضخامية القائمة على MSC في المختبر ولتعزيز تكوين العظام داخل الغضروف في الجسم الحي38. علاوة على ذلك ، في الجسم الحي ، تبين أن تركيبات HA تسهل اندماج تركيبات متعددة مزروعة في نفس الجيب لتشكيل عظم واحد متكامل. نظرا لأن تفاعل MSCs مع مواد السقالة يؤثر بشكل كبير على الغضروف وتكوين الغضروف الضخامي ، فإن اختيار مادة السقالة المناسبة ل ECOs أمر مهم لتوليد ترقيع غضروفي فعال سريريا من الأنسجة المهندسة. تظهر الخلايا المضمنة في الهلاميات المائية HA بشكل موحد خاصية مورفولوجيا مستديرة للخلايا الغضروفية من المركز إلى المحيط ، مما يشير إلى أن الهيالورونان يوفر بيئة مواتية لتشكيل غضروف موحد في جميع أنحاء الهيدروجيل21,30. على عكس HA ، يتفاعل الكولاجين مع MSCs عبر تسلسلات ربط الإنتغرين (RGDs). ومع ذلك ، فإن استمرار هذا التفاعل يمنع MSCs من مزيد من التمايز في المسارالغضروفي 43 ، والذي قد يفسر مورفولوجيا الخلايا الغضروفية غير النموذجية البارزة في محيط تركيبات الكولاجين.

إذا اتحدت الطعوم المتعددة لتشكيل عظم واحد ، فيمكن توسيع هذا النهج بوساطة ECO ليشمل عيوب العظام ذات الصلة سريريا. عندما تم تطبيق العديد من الغضروف الضخامي القائم على MSC والخالي من السقالات على عيب عظمي واحد ، تم الإبلاغ عن أن ترقيع الغضروف متكامل مع عيب العظام. ومع ذلك ، لم تتكامل الطعوم المجاورة مع بعضها البعض22. قد يوفر النهج المعروض هنا حلا ممكنا للتغلب على هذا القيد. بالمقارنة مع تركيبات الكولاجين ، كان لدى الطعوم المتعددة لتركيبات HA ميل أكبر للاندماج لتشكيل عظم واحد. علاوة على ذلك ، تم تشكيل نخاع العظم بين تركيبات HA المنصهرة ، والتي قد تكون مرتبطة بحقيقة أن HA يدعم تمايز الغضروف المنتظم في جميع أنحاء الهيدروجيل لأن الغضروف الضخامي يفرز VEGF ويوفر بيئة لمكانة الخلايا الجذعية المكونة للدم في تطور نخاع العظم 44.

مفتاح التجربة الناجحة باستخدام هذا البروتوكول هو جودة MSCs. يوصى مسبقا بالتأكد من أن MSCs التي سيتم استخدامها لديها إمكانات تمايز غضروفية عالية بما فيه الكفاية. ثانيا ، يجب ألا يكون حجم كل بناء كبيرا جدا. في تجربتنا ، يقتصر حجم البناء الواحد على 10-15 ميكرولتر. قد تؤدي التركيبات الأكبر إلى عدم كفاية تغلغل الأكسجين والمغذيات في التركيبات ، مما يؤدي إلى نخر وضعف التمايز في مركز البنى. لذلك ، يجب تقليل سمك الجل لتحسين تغلغل الأكسجين والمغذيات. من أجل تقليل سمك الجل ، قد يكون من المفيد إنشاء مواد هلامية رقيقة على الغشاء المسامي لإدراج Transwell14,45. بدلا من ذلك ، نظرا لأن تركيبات HA تميل إلى الاندماج وتشكيل عظام متكاملة ، فقد يكون من المناسب زرع العديد من التركيبات الأصغر بدلا من بناء واحد كبير ، كما هو موضح أدناه.

تشمل قيود هذه الدراسة الحاجة إلى تسريع معدل إعادة تشكيل الأنسجة المزروعة لتسهيل تكوين العظام. بقيت الأنسجة المهندسة المزروعة في المقام الأول في حالة غضروف متكلس تضخمي حتى بعد 8 أسابيع من الزرع. في تكوين العظام عبر مسار ECO ، تلعب الخلايا المشتقة من المضيف دورا مهما في تعزيز ECO16,46. تم الإبلاغ عن توفير قنوات إضافية في ترقيع الغضروف الضخامي لتعزيز غزو الأوعية الدموية وتمعدن الكسب غير المشروع في الجسم الحي20. تعمل هذه القنوات كقنوات لتسلل الخلايا المضيفة ، بما في ذلك بانيات العظم ، والخلايا الآكلة للعظم ، والسلائف المكونة للدم ، لتشكيل أنسجة جديدة داخل البناء. بدلا من ذلك ، تم الإبلاغ عن أنه يمكن زرع العديد من الكريات الصغيرة المغلفة بالفيبرين (μ الكريات) المكونة من MSCs المتمايزة الغضروفية لتشكيل عظممتكامل 47. يمكن أن تؤدي معالجة تركيبات HA إلى كريات μ إلى زيادة مساحة السطح المحاطة بالخلايا الآكلة للعظم الإيجابية ل TRAP ، وبالتالي تعزيز معدل إعادة تشكيل أنسجة الغضاريف وتعزيز تكوين العظم (الشكل 6)21,48. علاوة على ذلك ، فإن زرع كريات μ من شأنه أن يزيد من مساحة تسلل الخلايا المضيفة ، وبالتالي تسهيل تكوين الأوعية الدموية وتطور نخاع العظم وتوليد تكوين عظمي متكامل مع وفرة الأوعية الدموية. وبالتالي ، بالنظر إلى ميل تركيبات HA إلى الاندماج وإنشاء عظام متكاملة ، فإن استراتيجية تجديد العظام التي شيدت μ قد تسرع عملية ECO لترقيع الغضروف الضخامي باستخدام الهلاميات المائية HA.

في الختام ، الهلاميات المائية HA فعالة في توسيع نطاق الطعوم المهندسة بالأنسجة مع عدد أقل من الخلايا والمواد الهلامية من الهلاميات المائية الكولاجين. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع الهلاميات المائية HA بحساسية اندماج ممتازة وتنتج عظاما متكاملة مع الأوعية الدموية وتطور النخاع بين الطعوم المنصهرة. لذلك ، قد يؤدي تعديل تركيبات HA لتعزيز تسلل الخلايا المضيفة وإعادة تشكيل الكسب غير المشروع إلى تطوير مواد قابلة للزرع يمكن أن تزيد من تعزيز الأوعية الدموية وتطور نخاع العظام. مع مزيد من التحسين ، يمكن أن يكون هذا النهج بديلا واعدا لعلاجات العظام الحالية في جراحة الوجه والفكين وجراحة العظام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وقد أعلن أصحاب البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منحة في المعونة للبحث العلمي (KAKENHI) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) (رقم المنحة . JP19K10259 و 22K10032 إلى MAI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical  209-16941
Antisedan Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate Nacalai Tesque 13571-14
Bambanker GC Lymphotec CS-02-001
basic fibroblastic growth factor Reprocell RCHEOT002 
bovine serum albumin FUJIFILM Wako Pure Chemical  012-23881 7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10283
dexamethasone Merck D8893
Domitor Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium Merck D6429 high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Merck D6421
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
Gentamicin sulfate FUJIFILM Wako Pure Chemical  1676045  10 mg/mL
Haccpper Generator TechnoMax CH-400-5QB 50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit Merck HYS020
IL-1ß PeproTech AF-200-01B
ITS-G supplement FUJIFILM Wako Pure Chemical  090-06741 ×100
L-Alanyl-L-Glutamine FUJIFILM Wako Pure Chemical  016-21841 200mmol/L (×100)
L-proline Nacalai Tesque 29001-42
L-Thyroxine Merck T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		 Lonza PT-3001
paraffin FUJIFILM Wako Pure Chemical  165-13375
PBS / pH7.4 100ml Medicago 09-2051-100
TGF-β3  Proteintech HZ-1090
Vetorphale Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate FUJIFILM Wako Pure Chemical  048-34332

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  3. Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
  4. Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
  5. Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  6. Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
  7. Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A. Cell-based bone tissue engineering. PLOS Medicine. 4 (2), e9 (2007).
  8. Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
  9. Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D. Engineering thick tissues--the vascularisation problem. European Cells and Materials. 14, 1-19 (2007).
  10. Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
  11. Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
  12. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
  13. Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
  14. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  15. Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
  16. Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
  17. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  18. Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
  19. van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
  20. Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
  21. Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
  22. Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
  23. Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
  24. Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
  25. Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
  26. Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
  27. Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
  28. Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
  29. Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
  30. Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
  31. Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton's jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
  32. Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
  33. Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
  34. Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
  35. La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
  36. Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O'Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
  37. Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
  38. Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
  39. Zarembinski, T., Skardal, A. Hydrogels - Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
  40. Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
  41. Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
  42. Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
  43. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  44. Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
  45. Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
  46. Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
  47. Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
  48. Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).

Tags

الخلايا الجذعية الوسيطة ، علاج تجديد العظام ، تكوين الأوعية ، التعظم داخل الغضروف ، أنسجة الغضروف الاصطناعي ، عيب العظام ، التطبيق السريري ، البروتوكول ، الهلاميات المائية ، الطعوم المهندسة بالأنسجة ، حمض الهيالورونيك (HA)
تشكيل العظام المتكاملة من خلال التعظم <em>داخل الغضروف في الجسم الحي</em> باستخدام الخلايا الجذعية الوسيطة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., … More

Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., Ikeda, M. A. Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (197), e65573, doi:10.3791/65573 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter