Summary
La terapia ossea tramite ossificazione endocondrale mediante l'impianto di tessuto cartilagineo artificiale prodotto da cellule staminali mesenchimali ha il potenziale per aggirare gli inconvenienti delle terapie convenzionali. Gli idrogel di acido ialuronico sono efficaci nel ridimensionare gli innesti di cartilagine uniformemente differenziati e nel creare osso integrato con vascolarizzazione tra innesti fusi in vivo.
Abstract
La terapia convenzionale di rigenerazione ossea che utilizza cellule staminali mesenchimali (MSC) è difficile da applicare a difetti ossei di dimensioni superiori a quelle critiche perché non ha un meccanismo per indurre l'angiogenesi. L'impianto di tessuto cartilagineo artificiale fabbricato da MSC induce l'angiogenesi e la formazione ossea in vivo tramite ossificazione endocondrale (ECO). Pertanto, questo approccio ECO-mediato potrebbe essere una promettente terapia di rigenerazione ossea in futuro. Un aspetto importante dell'applicazione clinica di questo approccio ECO-mediato è la definizione di un protocollo per la preparazione di una quantità sufficiente di cartilagine da impiantare per riparare il difetto osseo. In particolare, non è pratico progettare una singola massa di cartilagine innestata di dimensioni conformi alla forma del difetto osseo effettivo. Pertanto, la cartilagine da trapiantare deve avere la proprietà di formare integralmente l'osso quando vengono impiantati più pezzi. Gli idrogel possono essere uno strumento interessante per aumentare gli innesti di ingegneria tissutale per l'ossificazione endocondrale per soddisfare i requisiti clinici. Sebbene molti idrogel di derivazione naturale supportino la formazione di cartilagine MSC in vitro e ECO in vivo, il materiale ottimale per lo scaffold per soddisfare le esigenze delle applicazioni cliniche deve ancora essere determinato. L'acido ialuronico (HA) è un componente cruciale della matrice extracellulare della cartilagine ed è un polisaccaride biodegradabile e biocompatibile. Qui, mostriamo che gli idrogel di HA hanno eccellenti proprietà per supportare la differenziazione in vitro del tessuto cartilagineo a base di MSC e promuovere la formazione di osso endocondrale in vivo.
Introduction
L'osso autologo è ancora il gold standard per la riparazione di difetti ossei dovuti a traumi, difetti congeniti e resezione chirurgica. Tuttavia, l'innesto osseo autogeno presenta limitazioni significative, tra cui il dolore del donatore, il rischio di infezione e il volume osseo limitato che può essere isolato dai pazienti 1,2,3,4. Numerosi biomateriali sono stati sviluppati come sostituti ossei, combinando polimeri naturali o sintetici con materiali mineralizzati come il fosfato di calcio o l'idrossiapatite 5,6. La formazione ossea in questi materiali ingegnerizzati viene solitamente ottenuta utilizzando il materiale mineralizzato come materiale di priming per consentire alle cellule staminali di differenziarsi direttamente in osteoblasti attraverso il processo di ossificazione intramembrana (IMO)7. Questo processo manca della fase angiogenica, con conseguente insufficiente vascolarizzazione in vivo dell'innesto dopo l'impianto 8,9,10 e, pertanto, gli approcci che utilizzano tale processo potrebbero non essere ottimali per il trattamento di grandi difetti ossei 11.
Le strategie applicate per ricapitolare il processo di ossificazione endocondrale (ECO), un meccanismo innato nella scheletrogenesi durante lo sviluppo, hanno dimostrato di superare problemi significativi associati agli approcci tradizionali basati sull'IMO. Nell'ECO, i condrociti nel modello di cartilagine rilasciano il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF), che promuove l'infiltrazione vascolare e il rimodellamento del modello di cartilagine nell'osso12. L'approccio ECO-mediato all'osteogenesi attraverso il rimodellamento della cartilagine e l'angiogenesi, che viene attivato anche durante la riparazione delle fratture, utilizza tessuto cartilagineo creato artificialmente derivato da MSC come materiale di priming. I condrociti possono tollerare l'ipossia nei difetti ossei, indurre l'angiogenesi e convertire un innesto di cartilagine senza vascolare in tessuto angiogenico. Numerosi studi hanno riportato che gli innesti di cartilagine a base di MSC generano osso in vivo implementando un tale programma ECO 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Un requisito essenziale per l'applicazione clinica di questo approccio ECO-mediato è come preparare la quantità desiderata di innesto di cartilagine in un contesto clinico. La preparazione di cartilagine clinica di dimensioni che si adattino al difetto osseo effettivo non è pratica. Pertanto, la cartilagine dell'innesto deve formare integralmente l'osso quando vengono impiantati più frammenti22. Gli idrogel possono essere uno strumento interessante per aumentare gli innesti di ingegneria tissutale per l'ossificazione endocondrale. Molti idrogel di derivazione naturale supportano la formazione di cartilagine MSC in vitro e ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Tuttavia, il materiale di supporto ottimale per soddisfare i requisiti dell'applicazione clinica è rimasto indeterminato. L'acido ialuronico (HA) è un polisaccaride biodegradabile e biocompatibile presente nella matrice extracellulare della cartilagine33. L'acido ialuronico interagisce con le MSC tramite recettori di superficie come CD44 per supportare la differenziazione condrogenica 25,26,28,30,31,32,34. Inoltre, gli scaffold HA promuovono la differenziazione osteogenica mediata da IMO delle cellule staminali della polpa dentale umana35 e gli scaffold combinati con il collagene promuovono l'osteogenesi ECO-mediata36,37.
Qui, presentiamo un metodo per la preparazione di idrogel di HA utilizzando MSC umane adulte derivate dal midollo osseo e il loro utilizzo per la condrogenesi ipertrofica in vitro e la successiva ossificazione endocondrale in vivo38. Abbiamo confrontato le caratteristiche dell'HA con quelle del collagene, un materiale ampiamente applicato nell'ingegneria del tessuto osseo con MSC e un materiale utile per scalare gli innesti artificiali per l'ossificazione endocondrale17. In un modello murino immunocompromesso, i costrutti di HA e collagene seminati con MSC umane sono stati valutati per il potenziale ECO in vivo mediante impianto sottocutaneo. I risultati mostrano che gli idrogel di HA sono eccellenti come impalcatura per le MSC per creare innesti di cartilagine artificiale che consentono la formazione ossea attraverso l'ECO.
Il protocollo è diviso in due fasi. In primo luogo, i costrutti di MSC umane seminati su idrogel di acido ialuronico vengono preparati e differenziati in cartilagine ipertrofica in vitro. Successivamente, i costrutti differenziati vengono impiantati per via sottocutanea in un modello nudo per indurre l'ossificazione endocondrale in vivo (Figura 1).
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Protocol
Questo protocollo utilizza topi nudi maschi di 4 settimane. Ospitare quattro topi in una gabbia con un ciclo luce/buio di 12 ore a 22−24 °C e 50%-70% di umidità relativa. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Tokyo Medical and Dental University (ID approvazione: A2019-204C, A2020-116A e A2021-121A).
1. Preparazione di tamponi e reagenti
- Preparare il terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali (terreno di crescita MSC) aggiungendo il kit supplementare di terreno di crescita MSC al terreno basale MSC e conservarlo a 4 °C.
- Preparare il terreno di coltura Dulbecco Modified Eagle e il terreno F12 (DMEM/F-12) di prosciutto aggiungendo il 10% di siero fetale bovino (FBS), 50 μg/mL di gentamicina, 200 μM di L-alanil-L-glutammina e 1 ng/mL di fattore di crescita fibroblastico basico al terreno e conservarlo a 4 °C.
- Preparare il terreno condrogenico aggiungendo l'1% di integratore ITS-G, lo 0,12% di albumina sierica bovina, 50 μg/mL di gentamicina, 0,35 mM di L-prolina, 100 nM di desametasone e 10 ng/mL di TGF-β3 al DMEM appena prima dell'uso.
- Preparare il terreno ipertrofico aggiungendo 10 mM di β-glicerofosfato, albumina sierica bovina allo 0,12%, desametasone 10 nM, 200 μM di ascorbato-2-fosfato, 50 nM di L-tiroxina, 50 μg/mL di gentamicina e 50 pg/mL di IL-1β al DMEM appena prima dell'uso.
- Rivestire una piastra di coltura a 24 pozzetti con 200 μL di paraffina fusa preriscaldata a 60 °C. Lasciare riposare a temperatura ambiente fino a quando la paraffina non si sarà solidificata.
2. Espansione delle MSC umane
NOTA: Prima di iniziare gli esperimenti, le MSC con un alto potenziale di condrogenesi delle MSC devono essere selezionate in micro coltura di massa come descritto alpunto 17.
- Secondo le istruzioni del produttore, coltivare MSC primarie derivate dal midollo osseo umano (passaggio 2) con terreno di coltura MSC in un piatto di 10 cm a una densità di 5 x 103 cellule/cm 2 a 37 °C in incubatrice ad aria umidificata al 5% di CO2 e al 95%.
- Cambiare il terreno ogni 2-3 giorni. Una volta che le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza, aspirare il terreno dal piatto di coltura cellulare utilizzando una pompa a vuoto, lavare con 5 mL di PBS, quindi aspirare la soluzione con una pompa a vuoto.
- Aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina allo 0,05% e EDTA allo 0,02% nel piatto. Incubare la capsula per 5-10 minuti a 37 °C.
- Aggiungere 1 mL di terreno di coltura MSC per fermare la reazione enzimatica. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 50 ml.
- Unire la sospensione cellulare di altre piastre nella provetta da 50 ml e tenerla in ghiaccio.
- Utilizzare il contatore di cellule per contare le cellule mescolando 10 μL di sospensione cellulare con 10 μL di colorante blu tripano allo 0,4%.
- Centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 220 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e aggiungere la soluzione di crioconservazione a una concentrazione di 1,0 x 106 cellule per mL.
- Erogare 1 mL della sospensione cellulare in ciascun criotubo e conservare a -80 °C per 12 ore prima di trasferire in azoto liquido. Per questo protocollo vengono utilizzate le scorte congelate risultanti (passaggio 3).
- Per gli esperimenti, seminare le MSC immagazzinate in un piatto di 10 cm ad una densità di 5 x 103 cellule/cm2. Colture cellulari fino all'80%-90% confluente (passaggio 4) in terreno DMEM/F-12.
3. Preparazione di idrogel incapsulati in MSC
- Tripsinizzare le cellule e preparare la sospensione cellulare come descritto nei passaggi 2.3 - 2.6.
- Per ottenere 10 costrutti (2,5 x 10 5 cellule per costrutto), aliquotare la sospensione cellulare contenente 2,5 x 106 cellule in un microtubo da1,5 mL.
- Centrifugare la sospensione a 220 x g per 3 minuti, rimuovere il surnatante con una pompa a vuoto e tenerlo in ghiaccio.
- Portare a temperatura ambiente l'acido ialuronico (HA) tiolo-modificato, il reticolante tiolo-reattivo, il polietilenglicole diacrilato e le bottiglie d'acqua degassata.
- In condizioni sterili, aggiungere 1,0 mL di acqua degassata al flacone contenente acido ialuronico (vedere le istruzioni del produttore) utilizzando una siringa con un ago.
- Vortice di tanto in tanto riscaldato a 37 °C fino a quando la soluzione diventa limpida, quindi mettere su ghiaccio. Ci vogliono meno di 30 minuti perché i solidi si dissolvano completamente.
- In condizioni sterili, aggiungere 0,5 ml di acqua degassata al flacone reticolante utilizzando una siringa con un ago. Sciogliere capovolgendo più volte, quindi mettere sul ghiaccio.
- Aggiungere 120 μL della soluzione di HA disciolta al pellet cellulare aliquotato (2,5 x 106 cellule). Risospendere il pellet cellulare pipettando avanti e indietro.
- Aggiungere 30 μL della soluzione reticolante disciolta alla provetta contenente l'acido ialuronico e le cellule (passaggio 3.8) e combinare picchiettando la provetta, quindi ruotare brevemente. Combinare la soluzione HA e la soluzione reticolante in un rapporto 4:1.
- Far cadere 15 μL della soluzione combinata contenente MSC (2,5 x 105 cellule) sulla piastra a 24 pozzetti rivestita in paraffina e lasciarla solidificare a 37 °C per 30 minuti (Figura 2). A causa dell'elevata viscosità, preparare almeno il 10% in più della miscela cella/idrogel rispetto al necessario.
NOTA: Le caratteristiche dell'idrogel sono state descritte in precedenza39.
4. Condizioni di differenziazione in vitro
- Aggiungere 0,5 mL di terreno di differenziazione condrogenico a un costrutto di idrogel di HA seminati con MSC. Cambiare il terreno ogni 2-3 giorni.
- Dopo 3 settimane, passare al terreno di differenziazione ipertrofica (0,5 mL per pozzetto) e coltivare i costrutti per altre 2 settimane.
5. Impianto in vivo di MSC
- Dopo un totale di 5 settimane di coltura in vitro, impiantare i costrutti per via sottocutanea nella parte posteriore di topi nudi come descritto in precedenza38,40.
- Pesare i topi e somministrare un anestetico combinato preparato con 0,75 mg/kg di peso corporeo (p.c.) medetomidina, 4,0 mg/kg p.c. midazolam e 5,0 mg/kg p.c. butorfanolo mediante iniezione intraperitoneale come descritto38.
- Confermare un'adeguata anestesia mediante immobilità agli stimoli chirurgici e monitorare la profondità respiratoria mediante movimenti toracici lenti e regolari e un corretto apporto di ossigeno in base al colore della mucosa rosa periodicamente durante l'operazione. Utilizzare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Posizionare il topo su un telo chirurgico sterile in posizione prona, sterilizzare il sito di incisione con 50 ppm di acqua acida ipoclorosa (pH 5,0; HAW) e posizionare un telo chirurgico perforato sul topo.
NOTA: Sterilizzare tutti i materiali chirurgici in autoclave, gas ossido di etilene o HAW. I chirurghi devono lavarsi le dita e indossare camici e guanti chirurgici. - Eseguire due incisioni cutanee lunghe 5 mm a 2 cm di distanza l'una dall'altra nelle zone delle spalle e dei fianchi lungo la linea centrale della colonna vertebrale usando le forbici.
- Inserire una spatola per via sottocutanea attraverso l'incisione per creare una tasca sottocutanea.
- Inserire due o tre costrutti (~15 μL ciascuno, passaggio 5.1) in ciascuna tasca con una pinza. I costrutti di acido ialuronico impiantati nella stessa tasca sono soggetti a fusione molto frequentemente. Per evitare la fusione, inserire un costrutto HA in ciascuna tasca.
- Chiudere le incisioni con suture di seta intrecciata 4-0. Iniettare nel topo un antagonista degli anestetici preparato con 0,75 mg/kg di patipamezolo nel p.c. come descritto38.
- Mentre i topi si riprendono dall'anestesia, metti i topi in gabbie di recupero sterili contenenti lettiera sterile senza cibo e bottiglie d'acqua e monitora continuamente la temperatura corporea, il polso e la respirazione.
- Non lasciare i topi incustoditi fino a quando non hanno ripreso coscienza sufficiente per mantenere l'inquisizione sternale. Dopo il completo recupero, riportare gli animali nella stanza di allevamento con gli altri animali.
- Monitora gli animali ogni due giorni durante il periodo di guarigione per eventuali complicazioni. Sopprimere i topi per inalazione di anidride carbonica con poca sofferenza a 4 e 8 settimane dopo l'impianto.
- Incidere la pelle nei siti innestati e rimuovere i costrutti impiantati con una pinza. Fissare i costrutti in paraformaldeide al 4% per 16 ore e poi sottoporli ad analisi.
6. Analisi statistica
- Riportare i dati quantitativi come media ± deviazione standard (SD). Eseguire analisi statistiche utilizzando software commerciali.
- Utilizzare il test t di Student o l'ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Tukey per determinare differenze significative tra i gruppi. P<0,05 e P<0,01 indicano differenze significative tra i due gruppi.
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Representative Results
Gli idrogel di HA incapsulati in MSC sono stati coltivati in terreno condrogenico integrato con TGFβ3, un induttore della condrogenesi41 (fase 4.1). Abbiamo confrontato le proprietà dell'HA con quelle del collagene, che ha dimostrato di essere efficace nella creazione di innesti di cartilagine artificiale a base di MSC per l'ossificazione endocondrale, come descritto in precedenza38. Le MSC indifferenziate non sono state incluse come controlli negativi in questo studio perché è stato dimostrato che le MSC indifferenziate richiedono superfici mineralizzate come substrato di priming per generare l'osso mediante differenziazione osteogenica (cioè ossificazione intramembrana)7.
Le dimensioni degli idrogel di acido ialuronico non sono cambiate durante il periodo di coltura in vitro , come giudicato in base ai diametri misurati al microscopio invertito, mentre gli idrogel di collagene utilizzati per il confronto hanno iniziato a ridursi subito dopo l'inizio della coltura. Per ridurre la differenza di dimensioni tra i costrutti di acido ialuronico e collagene dopo la coltura in vitro , il numero di MSC e il volume del gel utilizzato per creare gli idrogel di acido ialuronico sono stati dimezzati rispetto a quelli utilizzati per gli idrogel di collagene. Tuttavia, il peso umido dei costrutti HA dopo 3 settimane di coltura della cartilagine era 4 volte più pesante di quello dei costrutti di collagene.
Differenziamento condrogenico e ipertrofico in vitro.
Dopo differenziamento condrogenico (alla settimana 3 di coltura in vitro ), glicosaminoglicani solfatati (sGAG)-positivi (Safranina O/colorazione verde veloce; Figura 3A) e la matrice extracellulare collagene-positiva di tipo II è stata osservata in entrambi i costrutti, indicando che sia l'HA che gli idrogel di collagene supportavano la condrogenesi. Tuttavia, rispetto al costrutto di collagene, la distribuzione di sGAG, collagene di tipo II (Col II) e collagene di tipo X (Col X) era più omogenea in tutto il tessuto nei costrutti HA. Le differenze tra i due costrutti erano evidenti anche nella morfologia cellulare: le cellule con una morfologia arrotondata simile a quella dei condrociti erano distribuite in tutto il tessuto nei costrutti HA. Nei costrutti di collagene, tuttavia, le cellule della periferia hanno mostrato una morfologia eterogenea, che va da una morfologia irregolare/allungata a una morfologia arrotondata. Coerentemente con questo, la rotondità media delle cellule nei costrutti HA era superiore a quella dei costrutti di collagene, sia nella periferia che nelle regioni centrali (34% contro 77,6% (p<0,01) e 78,3% contro 100% (p<0,05), rispettivamente; Figura 3B). A 5 settimane di coltura, è stata rilevata una deposizione di calcio ai bordi esterni in entrambi i costrutti (rosso alizarina; Figura 3C). Inoltre, l'espressione di marcatori condrogenici (Sox-9, aggrecan (ACAN), Col II), ipertrofici (Col X, metallopeptidasi della matrice 13 (MMP-13)) e osteogenici (collagene di tipo I (Col I), sialoproteina ossea (BSP), osteocalcina (OCN))14 è stata rilevata mediante RT-PCR quantitativa in tempo reale, confermando la progressione della differenziazione condrogenica e ipertrofica durante la coltura in vitro (Figura 4).
Ossificazione endocondrale di costrutti impiantati sottocutaneamente in vivo.
Sono state create tasche sottocutanee sul dorso di topi nudi e due o tre costrutti sono stati impiantati in ciascuna tasca dopo la differenziazione ipertrofica (alla settimana 5 di coltura in vitro). A 4 o 8 settimane dall'impianto, tutti i costrutti di acido ialuronico erano attaccati l'uno all'altro nelle tasche impiantate (Tabella 1). Nei costrutti di collagene, l'adesione è stata osservata nel 60% delle tasche, mentre nelle restanti tasche, gli innesti erano indipendenti l'uno dall'altro. La colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) ha rivelato che in entrambi i costrutti, a 8 settimane dall'impianto, si è formato tessuto osteoide con morfologia lamellare nelle regioni esterne dei costrutti (Figura 5Aa,f). La colorazione di sGAG è scomparsa nei costrutti di HA, indicando la perdita del loro fenotipo di cartilagine (Figura 5Ah). In entrambi i costrutti, una componente del midollo osseo contenente cellule ematopoietiche e tessuto adiposo si è formata tra la cartilagine interna e i tessuti osteoidi esterni. In tutti i costrutti di acido ialuronico, i tessuti ossei dei costrutti fusi erano collegati e circondati da tessuto fibroso articolare e midollo osseo sviluppato lungo lo spazio tra i due costrutti aderenti, indicando che più costrutti di acido ialuronico tendono a formare tessuto osseo integrato (Figura 5Ag). I costrutti di collagene aderenti sono stati integrati in modo simile in due dei tre casi fusi, ma nel terzo caso, il tessuto osseo dei due costrutti non era collegato (Tabella 1 e Figura 5Ab). In entrambi i costrutti, i vasi identificati dalle cellule endoteliali CD31-positive42 sono stati osservati nel midollo osseo (Figure 5Ad,i) e le regioni cartilaginee interne erano circondate da cellule multinucleate TRAP-positive del lignaggio degli osteoclasti, indicando che il tessuto cartilagineo era soggetto a rimodellamento (Figure 5Ae,j).
Il minerale è stato depositato nella regione osteoide esterna sia nei costrutti di HA che di collagene (Figura 5B). Mentre la densità minerale totale del nuovo osso era simile tra i costrutti di HA e collagene, il volume minerale era significativamente più alto nei costrutti di HA rispetto a quello nei costrutti di collagene, il che potrebbe riflettere il fatto che gli idrogel di HA non si sono ridotti durante la coltura in vitro , risultando in costrutti più grandi rispetto agli idrogel di collagene (Figura 5C, D).
Figura 1: Disegno sperimentale. Il primo passo di questo protocollo consiste nell'incapsulare le MSC espanse in idrogel di HA per promuovere la differenziazione condrogenica e ipertrofica in vitro. I costrutti vengono coltivati in condizioni di differenziamento condrogenico per 3 settimane, seguite da altre 2 settimane in condizioni di differenziamento ipertrofico. Il secondo passo di questo protocollo consiste nell'impiantare per via sottocutanea i costrutti in topi nudi alla settimana 5 di coltura in vitro per sottoporsi all'ossificazione endocondrale in vivo per 8 settimane. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Preparazione di idrogel con semi di MSC. Far cadere una soluzione modificata di HA/reticolante contenente MSC su una piastra a 24 pozzetti rivestita di paraffina e lasciare solidificare a 37 °C per 30 minuti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi istologica e immunoistochimica di costrutti di HA e collagene dopo coltura in vitro 22. (A) I costrutti a 3 settimane (3W) di coltura in vitro sono stati colorati per sGAG (safranina O/fast green), collagene di tipo II (Col II) e collagene di tipo X (Col X). (B) I valori medi di circolarità delle cellule a 3 settimane di coltura in vitro (n = 5). Le barre aperte e grigie indicano rispettivamente i costrutti di collagene e HA. I gruppi senza una lettera comune sono statisticamente diversi (a contro b, p<0,01; b contro c, p<0,05). (C) I costrutti a 5 settimane (5W) di coltura in vitro sono stati colorati per il calcio (rosso alizarina). Tutte le immagini sono state scattate con lo stesso ingrandimento (barra della scala: 200 μm). Una panoramica a basso ingrandimento di tutti i tessuti è mostrata nei riquadri (barra della scala: 1 mm). Le barre di errore rappresentano la media ± la deviazione standard (SD). L'ANOVA unidirezionale seguita dal test di confronto multiplo di Tukey è stata utilizzata per determinare differenze significative tra i gruppi. Questa cifra è stata modificata da38. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi dell'espressione genica di costrutti di HA e collagene a 3 e 5 settimane di coltura in vitro. (A) Marcatori condrogenici e ipertrofici. (B) Marcatori osteogenici. I valori sono presentati come media ± deviazione standard (SD) (n = 3). Le MSC indifferenziate esprimevano alti livelli di Col I e MMP-13 e bassi livelli di Sox-9 e Col X; non hanno espresso (#) ACAN, Col II, BSP e OCN. Le barre di errore rappresentano la media ± la deviazione standard (SD). Questa cifra è stata modificata da38. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi immunoistochimica e calcificazione dei costrutti di HA e collagene dopo l'impianto a 8 settimane. (A) I costrutti sono stati colorati per l'ematossilina e l'eosina (H&E, a, b, f e g), la safranina O/Fast Green (c e h), le cellule endoteliali (Cluster of Differentiation 31, CD31) (d e i) e la fosfatasi acida resistente ai tartrati (TRAP, e e j). (a e f) Panoramica di tutti i tessuti (barra della scala = 500 μm). H&E, safranina O, CD31: barra della scala = 200 μm; TRAPPOLA: barra graduata = 50 μm. Le frecce indicano le cellule endoteliali CD31-positive. Abbreviazioni: c = tessuto cartilagineo interno; o = tessuto osteoide esterno. (B) Imaging MicroCT (μCT) di costrutti di collagene e HA (barre di scala dell'immagine principale e inserita = 2 mm). (C,D) La densità minerale totale (C) e il volume (D) dei costrutti di HA e collagene (n = 4). ** indica differenze significative; p <0,01. Sono stati analizzati quattro costrutti per gruppo utilizzando μCT. Le barre di errore rappresentano la media ± la deviazione standard (SD). Il test t di Student è stato utilizzato per determinare differenze significative tra i gruppi. Questa cifra è stata modificata da38. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Strategia per facilitare gli ECO utilizzando cartilagine artificiale a base di HA. Diagramma schematico dell'ossificazione e dello sviluppo del midollo osseo senza e con frammentazione (μ-pellet) di costrutti di acido ialuronico impiantati. (A) Gli idrogel di HA hanno un'eccellente tendenza alla fusione per formare un osso integrato con vascolarizzazione e sviluppo del midollo tra innesti fusi in vivo. Il tessuto impiantato risultante, tuttavia, è rimasto prevalentemente in uno stato cartilagineo anche 8 settimane dopo l'impianto. (B) Data la tendenza dei costrutti di acido ialuronico a fondersi per formare osso integrato, la trasformazione dei costrutti di acido ialuronico in pellet di μ può accelerare il tasso di rimodellamento del tessuto trapiantato e promuovere la formazione ossea. La micronizzazione dei costrutti aumenta l'area superficiale, che può promuovere il riassorbimento del tessuto cartilagineo e la formazione di tessuto osseo e può anche promuovere l'angiogenesi e lo sviluppo del midollo osseo a causa dell'aumento dello spazio per l'infiltrazione delle cellule ospiti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Idrogel | Esperimenti | Aderito | Unito | % Unito |
| Collagene | 5 | 3 | 2 | 40 |
| HA | 5 | 5 | 5 | 100 |
Tabella 1: Tasso di unificazione quando più costrutti sono stati impiantati in una singola tasca. Due o tre costrutti sono stati impiantati per via sottocutanea in un'unica tasca. I costrutti sono stati raccolti 4 o 8 settimane dopo l'impianto ed esaminati istologicamente.
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Discussion
L'utilizzo di materiali per scaffold appropriati che promuovono la transizione dalla cartilagine ipertrofica all'osso è un approccio promettente per aumentare gli innesti di cartilagine ipertrofica ingegnerizzati basati su MSC e trattare difetti ossei di dimensioni clinicamente significative. Qui, mostriamo che l'HA è un eccellente materiale per scaffold per supportare la differenziazione del tessuto cartilagineo ipertrofico basato su MSC in vitro e per promuovere la formazione di osso endocondrale in vivo38. Inoltre, in vivo, è stato dimostrato che i costrutti HA facilitano la fusione di più costrutti impiantati nella stessa tasca per formare un unico osso integrato. Poiché l'interazione delle MSC con i materiali dell'impalcatura influisce in modo significativo sulla cartilagine e sulla condrogenesi ipertrofica, la selezione di materiale adatto per l'impalcatura per gli ECO è importante per generare innesti di cartilagine ingegnerizzati tissutale clinicamente efficaci. Le cellule incorporate negli idrogel di HA mostrano uniformemente una morfologia arrotondata caratteristica dei condrociti dal centro alla periferia, indicando che l'acido ialuronico fornisce un ambiente favorevole alla formazione uniforme di cartilaginein tutto l'idrogel 21,30. A differenza dell'acido ialuronico, il collagene interagisce con le MSC tramite sequenze di legame delle integrine (RGD); tuttavia, la persistenza di questa interazione impedisce alle MSC di differenziarsi ulteriormente nella via condrogenica43, il che può spiegare la morfologia non tipica delle cellule condrocitarie che è prominente nella periferia dei costrutti di collagene.
Se più innesti si uniscono per formare un singolo osso, questo approccio ECO-mediato può essere esteso a difetti ossei clinicamente più rilevanti. Quando più cartilagine ipertrofica basata su MSC e senza scaffold sono state applicate a un singolo difetto osseo, è stato riportato che gli innesti di cartilagine si sono integrati con il difetto osseo. Tuttavia, gli innesti adiacenti non si sono integrati tra loro22. L'approccio qui presentato può offrire una possibile soluzione per superare questa limitazione. Rispetto ai costrutti di collagene, gli innesti multipli di costrutti HA avevano una maggiore tendenza a fondersi per formare un singolo osso. Inoltre, il midollo osseo si è formato tra costrutti di HA fusi, il che può essere correlato al fatto che l'HA supporta una differenziazione uniforme della cartilagine in tutto l'idrogel perché la cartilagine ipertrofica secerne VEGF e fornisce un ambiente per la nicchia delle cellule staminali ematopoietiche nello sviluppo del midollo osseo 44.
La chiave per il successo di un esperimento che utilizza questo protocollo è la qualità delle MSC. Si raccomanda di confermare in anticipo che le MSC da utilizzare abbiano un potenziale di differenziazione condrogenica sufficientemente elevato. In secondo luogo, la dimensione di ogni costrutto non dovrebbe essere troppo grande. Nella nostra esperienza, il volume di un singolo costrutto è limitato a 10-15 μL. Costrutti più grandi possono causare un'insufficiente penetrazione di ossigeno e nutrienti nei costrutti, portando a necrosi e scarsa differenziazione al centro dei costrutti. Pertanto, lo spessore del gel deve essere ridotto per migliorare la penetrazione dell'ossigeno e dei nutrienti. Al fine di ridurre lo spessore del gel, può essere utile creare gel sottili sulla membrana porosa degli inserti Transwell14,45. In alternativa, poiché i costrutti HA tendono a fondersi e formare osso integrato, può essere sufficiente impiantare molti costrutti più piccoli piuttosto che un unico grande costrutto, come discusso di seguito.
I limiti di questo studio includono la necessità di accelerare il tasso di rimodellamento dei tessuti impiantati per facilitare la formazione ossea. Il tessuto ingegnerizzato impiantato è rimasto principalmente in uno stato di cartilagine calcificata ipertrofica anche 8 settimane dopo l'impianto. Nella formazione ossea attraverso la via ECO, le cellule derivate dall'ospite svolgono un ruolo fondamentale nella promozione dell'ECO16,46. È stato riportato che la fornitura di canali aggiuntivi negli innesti di cartilagine ipertrofica promuove l'invasione vascolare e la mineralizzazione dell'innesto in vivo20. Tali canali fungono da condotti per l'infiltrazione delle cellule ospiti, inclusi osteoblasti, osteoclasti e precursori ematopoietici, per formare nuovo tessuto all'interno del costrutto. In alternativa, è stato riportato che più piccoli pellet incapsulati in fibrina (μ-pellet) composti da MSC differenziate condrogeniche possono essere impiantati per formare ossointegrato 47. La trasformazione dei costrutti di acido ialuronico in pellet di μ potrebbe aumentare la superficie circondata da osteoclasti positivi a TRAP, promuovendo così il tasso di rimodellamento del tessuto cartilagineo e migliorando l'osteogenesi (Figura 6)21,48. Inoltre, l'impianto di pellet di μ aumenterebbe lo spazio di infiltrazione delle cellule ospiti, facilitando così l'angiogenesi e lo sviluppo del midollo osseo e generando una formazione ossea integrale con abbondante vascolarizzazione. Pertanto, considerando la tendenza dei costrutti HA a fondersi e creare osso integrato, questa strategia di rigenerazione ossea costruita μ può accelerare il processo ECO degli innesti di cartilagine ipertrofica utilizzando idrogel HA.
In conclusione, gli idrogel di acido ialuronico sono efficaci nel ridimensionare gli innesti di ingegneria tissutale con un minor numero di cellule e gel rispetto agli idrogel di collagene. Inoltre, gli idrogel di acido ialuronico hanno un'eccellente sensibilità alla fusione e producono osso integrato con vascolarizzazione e sviluppo midollare tra innesti fusi. Pertanto, la modifica dei costrutti di HA per promuovere l'infiltrazione della cellula ospite e il rimodellamento dell'innesto può portare allo sviluppo di materiali impiantabili che possono promuovere ulteriormente la vascolarizzazione e lo sviluppo del midollo osseo. Con un'ulteriore ottimizzazione, questo approccio potrebbe essere un'alternativa promettente alle attuali terapie ossee in chirurgia maxillo-facciale e ortopedica.
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Disclosures
Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione per la ricerca scientifica (KAKENHI) della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (sovvenzione n. JP19K10259 e 22K10032 a MAI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
| Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
| Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
| basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
| bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
| Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
| dexamethasone | Merck | D8893 | |
| Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| Dormicum | Astellas Pharma | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
| Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
| Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
| HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
| IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
| ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
| L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
| L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
| L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
| MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
| paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
| PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
| TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
| Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
| Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
| β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |
References
- Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
- Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
- Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
- Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A.
- Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
- Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D.
- Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
- Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
- Kronenberg, H. M.
- Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
- Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
- Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
- Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
- Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
- Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
- van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
- Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
- Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
- Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
- Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
- Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
- Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
- Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
- Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
- Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
- Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton's jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
- Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
- Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
- Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
- La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
- Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O'Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
- Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
- Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
- Zarembinski, T., Skardal, A. Hydrogels - Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
- Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
- Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
- Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
- Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
- Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
- Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).
