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Biology

間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65573
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,3
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Summary

間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植して軟骨内骨化術を行う骨治療は、従来の治療法の欠点を回避できる可能性があります。ヒアルロン酸ハイドロゲルは、均一に分化した軟骨移植片のスケールアップや、 in vivoでの融合移植片間の血管新生を伴う統合骨の形成に効果的です。

Abstract

間葉系幹細胞(MSC)を用いた従来の骨再生療法は、血管新生を誘導するメカニズムがないため、臨界サイズ以上の骨欠損への適用が困難でした。間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植すると、軟骨内骨化(ECO)を介して in vivo で血管新生と骨形成が誘導されます。したがって、このECOを介したアプローチは、将来的に有望な骨再生療法になる可能性があります。このECOを介したアプローチの臨床応用の重要な側面は、骨欠損を修復するために移植するのに十分な軟骨を準備するためのプロトコルを確立することです。特に、実際の骨欠損の形状に適合するサイズの移植軟骨の単一の塊を設計することは現実的ではありません。そのため、移植する軟骨は、複数個を移植した際に一体的に骨を形成する性質を持っている必要があります。ハイドロゲルは、軟骨内骨化のための組織工学的移植片をスケールアップして臨床要件を満たすための魅力的なツールである可能性があります。多くの天然由来のハイドロゲルは、 in vitro でのMSC軟骨形成やin vivoでのECO形成をサポートしますが、臨床応用のニーズを満たす最適な足場材料はまだ決定されていません。ヒアルロン酸(HA)は、軟骨の細胞外マトリックスの重要な成分であり、生分解性で生体適合性の多糖類です。本研究では、HAハイドロゲルが間葉系幹細胞ベースの軟骨組織の in vitro 分化をサポートし、 in vivoで軟骨内骨形成を促進する優れた特性を有することを示しました。

Introduction

自家骨は、外傷、先天性欠損、外科的切除による骨欠損を修復するためのゴールドスタンダードです。しかし、自家骨移植には、ドナーの痛み、感染のリスク、患者から分離できる骨量の制限など、重大な制限があります1,2,3,4。天然または合成ポリマーとリン酸カルシウムやハイドロキシアパタイトなどの鉱化材料を組み合わせた骨代替物として、数多くの生体材料が開発されています5,6。これらの人工材料における骨形成は、通常、幹細胞が膜内骨化(IMO)プロセスを通じて骨芽細胞に直接分化することを可能にするプライミング材料として、石灰化材料を使用して達成される7。このプロセスは血管新生ステップを欠いており、移植後の移植片のin vivo血管新生が不十分であり8,9,10、したがって、そのようなプロセスを使用するアプローチは、大きな骨欠損の治療に最適ではない可能性があります11。

発生中の骨格形成における生来のメカニズムである軟骨内骨化(ECO)プロセスを再現するために適用された戦略は、従来のIMOベースのアプローチに関連する重大な問題を克服することが示されています。ECOでは、軟骨テンプレートの軟骨細胞が血管内皮増殖因子(VEGF)を放出し、血管浸潤と軟骨テンプレートの骨へのリモデリングを促進します12。軟骨リモデリングと血管新生による骨形成へのECOを介したアプローチは、骨折修復中にも活性化され、MSCに由来する人工的に作成された軟骨組織をプライミング材料として使用します。軟骨細胞は、骨欠損の低酸素症に耐え、血管新生を誘導し、血管のない軟骨移植片を血管新生組織に変換することができます。MSCベースの軟骨移植片は、そのようなECOプログラムを実施することにより、in vivoで骨を生成することが多くの研究で報告されています13、14、15、16、17、18、19、20、21。

このECOを介したアプローチの臨床応用に不可欠な要件は、臨床現場で必要な量の軟骨移植片を準備する方法です。実際の骨欠損にフィットするサイズの臨床軟骨を作製することは現実的ではありません。したがって、移植軟骨は、複数の断片が移植されるときに骨を一体的に形成する必要があります22。ハイドロゲルは、軟骨内骨化のための組織工学的移植片をスケールアップするための魅力的なツールとなる可能性があります。多くの天然由来のハイドロゲルは、in vitroでのMSC軟骨形成およびin vivoでのECO形成をサポートします23,24,25,26,27,28,29,30,31,32;しかし、臨床応用の要件を満たすための最適な支持材料は未定のままです。ヒアルロン酸(HA)は、軟骨の細胞外マトリックスに存在する生分解性で生体適合性の多糖類である33。HAはCD44などの表面受容体を介してMSCと相互作用し、軟骨形成分化をサポートします25,26,28,30,31,32,34。さらに、HAスキャフォールドはIMOを介したヒト歯髄幹細胞の骨形成分化を促進し35、コラーゲンと組み合わせたスキャフォールドはECOを介した骨形成を促進する36,37。

ここでは、骨髄由来の成人ヒトMSCを用いたHAハイドロゲルの調製方法と、in vitroでの肥大型軟骨形成およびその後のin vivo軟骨内骨化への使用について紹介する38。我々は、HAの特性を、MSCを用いた骨組織工学に広く適用され、軟骨内骨化のための人工移植片のスケールアップに有用な材料であるコラーゲンの特性と比較した17。免疫不全マウスモデルにおいて、ヒトMSCを播種したHAおよびコラーゲンコンストラクトを皮下移植によりin vivo ECOの可能性について評価しました。その結果、HAハイドロゲルは、間葉系幹細胞がECOによる骨形成を可能にする人工軟骨移植片を作るための足場として優れていることが示されました。

プロトコルは2つのステップに分かれています。まず、ヒアルロン酸ハイドロゲル上に播種されたヒト間葉系幹細胞のコンストラクトを調製し、 in vitroで肥厚軟骨に分化させる。次に、分化した構築物をヌードモデルに皮下移植し、 in vivo で軟骨内骨化を誘導します(図1)。

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Protocol

このプロトコルでは、4週齢の雄のヌードマウスを使用します。4匹のマウスをケージに入れ、22〜24°C、相対湿度50%〜70%で12時間の明暗サイクルで飼育します。動物実験は、東京医科歯科大学動物実験委員会が承認したガイドライン(承認ID:A2019-204C、A2020-116A、A2021-121A)に準じて実施しました。

1. 緩衝液および試薬の調製

  1. 間葉系幹細胞増殖培地(MSC増殖培地)をMSC基礎培地にMSC増殖培地のサプリメントキットを添加し、4°Cで保存します。
  2. 10%ウシ胎児血清(FBS)、50 μg/mLゲンタマイシン、200 μM L-アラニル-L-グルタミン、および1 ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子を培地に添加して、ダルベッコ改変イーグル培地およびハムF12(DMEM/F-12)培地を調製し、4°Cで保存します。
  3. 使用直前に、1% ITS-Gサプリメント、0.12%ウシ血清アルブミン、50 μg/mLゲンタマイシン、0.35 mM L-プロリン、100 nMデキサメタゾン、および10 ng/mL TGF-β3をDMEMに添加して、軟骨形成培地を調製します。
  4. 使用直前に、10 mM β-グリセロリン酸、0.12% ウシ血清アルブミン、10 nM デキサメタゾン、200 μM アスコルビン酸-2-リン酸、50 nM L-チロキシン、50 μg/mL ゲンタマイシン、50 pg/mL IL-1β を DMEM に添加して、肥大培地を調製します。
  5. 60°Cに予熱した200μLの溶融パラフィンを24ウェル培養皿にコーティングします。 パラフィンが固まるまで室温で放置します。

2. ヒト間葉系幹細胞の拡大

注:実験を開始する前に、MSC軟骨形成の可能性が高いMSCをマイクロマス培養で選択する必要があります。

  1. 製造業者の指示に従い、初代ヒト骨髄由来MSC(継代2)を、5%CO2および95%加湿空気インキュベーター中で、5×103細胞/cm2の密度で10cmのディッシュにMSC増殖培地で培養する。
  2. 培地は2〜3日ごとに交換してください。細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら、真空ポンプを使用して細胞培養皿から培地を吸引し、5 mLのPBSで洗浄した後、真空ポンプで溶液を吸引します。
  3. 1 mLの0.05%トリプシン/0.02%EDTA溶液を皿に加えます。ディッシュを37°Cで5〜10分間インキュベートします。
  4. MSC増殖培地1 mLを添加して、酵素反応を停止します。細胞懸濁液を50 mLチューブに移します。
  5. 他のディッシュからの細胞懸濁液を50 mLチューブに入れ、氷上に保管します。
  6. セルカウンターを使用して、10 μLの細胞懸濁液と10 μLの0.4%トリパンブルー染色剤を混合して細胞をカウントします。
  7. 残りの細胞懸濁液を220 x g で室温で3分間遠心分離します。上清を除去し、1.0 x 106 細胞/mLの濃度で凍結保存液を添加する。
  8. 細胞懸濁液1 mLを各クライオチューブに分注し、-80°Cで12時間保存してから液体窒素に移します。得られた凍結ストック(継代3)は、このプロトコルに使用されます。
  9. 実験では、ストックしたMSCを10cmの皿に5 x 103 細胞/cm2の密度で播種します。DMEM/F-12培地中で80%〜90%のコンフルエント(継代4)まで細胞を培養します。

3. MSC内包ハイドロゲルの調製

  1. 細胞をトリプシン化し、ステップ2.3〜2.6の説明に従って細胞懸濁液を調製します。
  2. 10個のコンストラクト(コンストラクトあたり2.5 x 10 5細胞)を作製するには、2.5 x 106個の細胞を含む細胞懸濁液を1.5 mLのマイクロチューブに分注します。
  3. 懸濁液を220 x g で3分間遠心分離し、真空ポンプで上清を除去し、氷上に保持します。
  4. チオール変性ヒアルロン酸(HA)、チオール反応性架橋剤、ポリエチレングリコールジアクリレート、脱気したウォーターボトルを室温に戻します。
  5. 無菌条件下で、針付きのシリンジを使用して、1.0 mLの脱気水をHA含有ボトル(製造元の指示を参照)に加えます。
  6. 溶液が透明になるまで時々37°Cに温め、氷の上に置きます。固形物が完全に溶解するのに30分もかかりません。
  7. 無菌条件下で、針付きのシリンジを使用して、0.5 mLの脱気水を架橋剤ボトルに加えます。数回ひっくり返して溶かし、氷の上に置きます。
  8. 溶解したHA溶液120 μLを分注した細胞ペレット(2.5 x 106 細胞)に加えます。細胞ペレットをピペッティングで前後に再懸濁します。
  9. 溶解した架橋剤溶液30 μLをHAと細胞の入ったチューブに加え(ステップ3.8)、チューブを軽くたたいて混ぜ合わせ、短時間スピンダウンします。HA溶液と架橋剤溶液を4:1の比率で組み合わせます。
  10. MSCを含む混合溶液15 μL(2.5 x 105 細胞)をパラフィンコーティングした24ウェルプレートに滴下し、37°Cで30分間固化させます(図2)。粘度が高いため、細胞/ハイドロゲル混合物を必要量より少なくとも10%多く調製してください。
    注:ヒドロゲルの特性は、以前に説明した39。

4. in vitro での分化条件

  1. 0.5 mLの軟骨形成分化培地をMSC播種HAハイドロゲルのコンストラクトに添加します。培地は2〜3日ごとに交換してください。
  2. 3週間後、肥大分化培地(ウェルあたり0.5 mL)に切り替え、コンストラクトをさらに2週間培養します。

5. 間葉系幹細胞の 生体内 移植

  1. 合計5週間のin vitro培養の後、前述のように、構築物をヌードマウスの背中に皮下移植します38,40。
  2. マウスの体重を量り、0.75 mg / kg体重(b.w)のメデトミジン、4.0 mg / kgのb.w.ミダゾラム、および5.0 mg / kgのb.w.ブトルファノールで調製した併用麻酔薬を腹腔内注射で投与します38。
  3. 手術刺激に対して動かないことで適切な麻酔を確認し、ゆっくりとした規則的な胸の動きによる呼吸の深さを監視し、手術中に定期的にピンクの粘膜の色による適切な酸素供給を監視します。麻酔中の乾燥を防ぐために、目に獣医用軟膏を使用してください。
  4. マウスを滅菌手術用ドレープの上に腹臥位で置き、切開部位を50ppmの次亜塩素酸水(pH 5.0;HAW)、穴あき外科用ドレープをマウスの上に置きます。
    注意: すべての手術材料をオートクレーブ、エチレンオキシドガス、またはHAWで滅菌します。外科医は指を洗い、手術用ガウンと手袋を着用する必要があります。
  5. 背骨の中心線に沿って、肩と腰の部分に長さ5mmの皮膚切開を2cm間隔で2つ、ハサミで行います。
  6. 切開部から皮下にヘラを挿入し、皮下ポケットを作ります。
  7. 2〜3つのコンストラクト(各~15 μL、ステップ5.1)を鉗子で各ポケットに挿入します。同じポケットに埋め込まれたHAコンストラクトは、非常に頻繁に癒合する傾向があります。癒着を防ぐため、各ポケットに HA コンストラクトを 1 つずつ挿入します。
  8. 4-0の編組シルク縫合糸で切開部を閉じます。38に記載されているように、0.75 mg / kg b.w.アチパメゾールで調製した麻酔薬にアンタゴニストをマウスに注射します。.
  9. マウスが麻酔から回復するまでの間、マウスを餌や水のボトルを使わずに滅菌床寝具を含む滅菌回復ケージに入れ、体温、脈拍、呼吸を継続的に監視します。
  10. マウスが胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。完全に回復したら、他の動物と一緒に飼育室に戻します。
  11. 治癒期間中、数日ごとに動物を監視して、合併症の可能性がないか確認してください。二酸化炭素を吸入してマウスを安楽死させるが、着床後4週間および8週間でほとんど苦痛を伴わない。
  12. 移植された部位の皮膚を切開し、鉗子で移植された構造物を取り除きます。コンストラクトを4%パラホルムアルデヒドで16時間固定し、分析します。

6. 統計解析

  1. 定量的データを平均±標準偏差 (SD) としてレポートします。市販のソフトウェアを使用して統計分析を実行します。
  2. スチューデントの t検定または一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定を使用して、グループ間の有意差を判断します。p<0.05 と p<0.01 は、2 つのグループ間の有意差を示しています。

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Representative Results

MSCを内包したHAハイドロゲルを、軟骨形成の誘導因子であるTGFβ3を添加した軟骨形成培地で培養した41 (ステップ4.1)。我々は、HAの特性を、前述のように、軟骨内骨化のためのMSCベースの人工軟骨移植片の作成に有効であることが示されているコラーゲンの特性と比較した38。未分化MSCは、骨形成分化(すなわち、膜内骨化)によって骨を生成するためのプライミング基質として石灰化表面を必要とすることが実証されているため、この研究では未分化MSCをネガティブコントロールとして含めませんでした7。

ヒアルロン酸ハイドロゲルのサイズは、倒立顕微鏡で測定した直径から判断すると、 in vitro 培養期間を通して変化しなかったが、比較に用いたコラーゲンハイドロゲルは培養開始後すぐに収縮し始めた。 in vitro 培養後のHAコンストラクトとコラーゲンコンストラクトのサイズ差を小さくするために、HAハイドロゲルの作成に使用したMSCの数とゲルの体積を、コラーゲンハイドロゲルに使用したものと比較して半分にしました。しかし、3週間の軟骨培養後のHAコンストラクトの湿潤重量は、コラーゲンコンストラクトの4倍重かった。

軟骨形成および肥大分化 in vitro.
軟骨形成分化後( in vitro 培養3週目)、硫酸化グリコサミノグリカン(sGAG)陽性(サフラニンO/ファストグリーン染色; 図3A)II型コラーゲン陽性細胞外マトリックスが両方のコンストラクトで観察され、HAとコラーゲンハイドロゲルの両方が軟骨形成を支持していることが示されました。しかし、コラーゲンコンストラクトと比較して、sGAG、II型コラーゲン(Col II)、およびX型コラーゲン(Col X)の分布は、HAコンストラクトの組織全体でより均一でした。2つのコンストラクトの違いは細胞形態にも明らかであり、軟骨細胞のような丸みを帯びた形態を持つ細胞は、HAコンストラクトの組織全体に分布していた。しかし、コラーゲンコンストラクトでは、末梢の細胞は、不規則/伸縮から丸みを帯びた形態まで、不均一な形態を示しました。これと一致して、HAコンストラクトの細胞の平均真円度は、末梢領域と中央領域の両方で、コラーゲンコンストラクトよりも高かった(それぞれ34%対77.6%(p<0.01)および78.3%対100%(p<0.05)。 図3B)。培養5週間で、両方のコンストラクトの外縁にカルシウム沈着が検出されました(アリザリンレッド; 図3C)。さらに、軟骨形成性(Sox-9、アグリカン(ACAN)、Col II)、肥大型性(Col X、マトリックスメタロペプチダーゼ13(MMP-13))、および骨形成性(I型コラーゲン(Col I)、骨シアロタンパク質(BSP)、オステオカルシン(OCN))マーカー14 の発現を定量的リアルタイムRT-PCRで検出し、 in vitro 培養中の軟骨形成および肥大型分化の進行を確認しました(図4)。

in vivoで皮下に移植された構築物の軟骨内骨化。
ヌードマウスの背中に皮下ポケットを作製し、肥大分化後( in vitro 培養5週目)に各ポケットに2〜3個のコンストラクトを移植した。移植後4週間または8週間で、すべてのHAコンストラクトが移植されたポケットに互いに取り付けられました(表1)。コラーゲンコンストラクトでは、60%のポケットで接着が観察されましたが、残りのポケットでは、移植片は互いに独立していました。ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色により、移植後8週間の時点で、両方の構築物において、構築物の外側領域に層状の形態を持つ骨様組織が形成されていることが明らかになりました(図5Aa、f)。HAコンストラクトではsGAG染色が消失し、軟骨表現型の喪失が示されました(図5Ah)。どちらの構築物でも、造血細胞と脂肪組織を含む骨髄成分が、内側の軟骨と外側の骨様組織の間に形成されました。すべてのHAコンストラクトにおいて、融合したコンストラクトの骨組織は、2つの接着コンストラクト間の空間に沿って発達した関節線維組織と骨髄によって接続され、取り囲まれており、複数のHAコンストラクトが統合された骨組織を形成する傾向があることを示しています(図5Ag)。接着したコラーゲンコンストラクトは、融合した3つのケースのうち2つで同様に統合されていましたが、3番目のケースでは、2つのコンストラクトの骨組織は接続されていませんでした(表1 および図5Ab)。いずれのコンストラクトにおいても、CD31陽性の内皮細胞42 によって同定された血管が骨髄で観察され(図5Ad,i)、内軟骨領域は破骨細胞系統のTRAP陽性多核細胞に囲まれており、軟骨組織がリモデリングを受けていることが示された(図5Ae,j)。

ミネラルは、HAコンストラクトとコラーゲンコンストラクトの両方の外側の骨突起領域に沈着しました(図5B)。新しい骨の総ミネラル密度はHAコンストラクトとコラーゲンコンストラクトの間で類似していましたが、ミネラル量はコラーゲンコンストラクトよりもHAコンストラクトの方が有意に高く、これはHAヒドロゲルが in vitro 培養中に収縮せず、コラーゲンハイドロゲルよりもコンストラクトが大きくなったという事実を反映している可能性があります(図5C、D)です。

Figure 1
図1:実験計画。 このプロトコルの最初のステップは、HAヒドロゲルに拡大したMSCをカプセル化して、 in vitroで軟骨形成および肥大微分を促進することです。コンストラクトを軟骨分化条件で3週間培養し、続いて肥大分化条件でさらに2週間培養します。このプロトコルの第2ステップはsubcutaneously生体 外で 文化の5週目に裸のマウスに8週間生体 内の 軟骨化を経るために構造物を埋め込むことである。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:MSC播種ハイドロゲルの調製。 MSCを含む修飾HA/架橋剤溶液をパラフィンコーティングされた24ウェルプレートに滴下し、37°Cで30分間凝固させます 。

Figure 3
図3: in vitro 培養後のHAおよびコラーゲンコンストラクトの組織学的および免疫組織化学的分析22. (A)3週間(3W) のin vitro 培養で、sGAG(サフラニンO/ファストグリーン)、II型コラーゲン(Col II)、およびX型コラーゲン(Col X)について染色しました。(B) in vitro 培養3週間における細胞の平均真円度値(n=5)。開いたバーと灰色のバーは、それぞれコラーゲンとHAコンストラクトを示します。共通の文字を持たないグループは、統計的に異なります(a対b、p<0.01、b対c、p<0.05)。(C)5週間(5W)の in vitro 培養で構築物をカルシウム(アリザリンレッド)で染色しました。すべての写真は同じ倍率(スケールバー:200μm)で撮影されました。組織全体の低倍率の概要が挿入図に表示されます(スケールバー:1 mm)。エラーバーは、標準偏差±平均値を表します。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定を使用して、グループ間の有意差を判断しました。この数字は38 から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:in vitro 培養の3週間および5週間でのHAおよびコラーゲンコンストラクトの遺伝子発現解析 。 (A)軟骨形成マーカーおよび肥大型マーカー。(B)骨形成マーカー。値は、標準偏差 (SD) ±平均値 (n = 3) として表されます。未分化のMSCは、高レベルのCol IおよびMMP-13を発現し、低レベルのSox-9およびCol Xを発現した。ACAN、Col II、BSP、OCNを(#)表現しませんでした。エラーバーは、標準偏差±平均値を表します。この数字は38 から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:8週間後のHAおよびコラーゲンコンストラクトの免疫組織化学的分析と石灰化 。 (a)コンストラクトは、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E、a、b、f、およびg)、サフラニンO/Fast Green(cおよびh)、内皮細胞(Cluster of Differentiation 31、CD31)(dおよびi)、および酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP、eおよびj)について染色しました。(a と f)組織全体の概観(スケールバー=500μm)。H&E、サフラニンO、CD31:スケールバー = 200 μm;TRAP:スケールバー= 50 μm。矢印はCD31陽性の内皮細胞を示す。略語:c =内軟骨組織;o =外側の骨様組織。(B)コラーゲンおよびHAコンストラクトのマイクロCT(μCT)イメージング(メインおよびインセット画像スケールバー= 2 mm)。(C、D)HAおよびコラーゲンコンストラクトの総ミネラル密度(C)と体積(D)(n = 4)。**は有意差を示します。p <0.01。グループごとに4つのコンストラクトをμCTを用いて分析した。 エラーバーは標準偏差±平均を表します。スチューデントのt検定は、グループ間の有意差を決定するために使用されました。この数字は38 から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:HA系人工軟骨を用いたECO促進戦略移植されたHAコンストラクトの断片化(μペレット)の有無にかかわらず、骨化と骨髄の発達の概略図。 (A)HAハイドロゲルは、in vivoで融合したグラフト間で血管新生や骨髄発生を伴う一体型骨を形成する優れた融合傾向を持っています。しかし、得られた移植組織は、移植後8週間でも主に軟骨状態のままでした。(B)HAコンストラクトが融合して統合された骨を形成する傾向があることを考えると、HAコンストラクトをμペレットに加工すると、移植組織のリモデリング速度が加速し、骨形成が促進される可能性があります。コンストラクトを微粉化すると表面積が増加し、軟骨組織の吸収と骨組織の形成が促進され、宿主細胞浸潤のスペースが増加するため、血管新生と骨髄の発達も促進される可能性があります。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

ハイドロゲル 実験 付着 叒 % ユナイテッド
コラーゲン 5 3 2 40
HAの 5 5 5 100

表1:1つのポケットに複数のコンストラクトを埋め込んだ場合の一体化率。 2つまたは3つのコンストラクトが1つのポケットに皮下移植されました。構築物は移植後4週間または8週間で採取され、組織学的に検査されました。

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Discussion

肥厚軟骨から骨への移行を促進する適切な足場材料を使用することは、MSCベースの人工肥厚軟骨移植片をスケールアップし、臨床的に有意なサイズの骨欠損を治療するための有望なアプローチです。本研究では、HAがin vitroでMSCベースの肥大軟骨組織の分化をサポートし、in vivoで軟骨内骨形成を促進する優れた足場材料であることを示しています38。さらに、in vivoでは、HAコンストラクトは、同じポケットに移植された複数のコンストラクトの融合を促進し、単一の統合された骨を形成することが示されました。MSCと足場材料との相互作用は軟骨および肥大型軟骨形成に大きく影響するため、ECOに適した足場材料を選択することは、臨床的に効果的な組織改変軟骨移植片を生成するために重要です。HAハイドロゲルに埋め込まれた細胞は、中心から末梢にかけて軟骨細胞に特徴的な丸みを帯びた形態を均一に示し、ヒアルロン酸がハイドロゲル全体に均一な軟骨形成を助長する環境を提供していることを示している21,30。HAとは異なり、コラーゲンはインテグリン結合配列(RGD)を介してMSCと相互作用します。しかしながら、この相互作用の持続は、MSCが軟骨形成経路43においてさらに分化することを妨げ、これは、コラーゲンコンストラクトの周辺部で顕著である非典型的な軟骨細胞の形態を説明する可能性がある。

複数の移植片が結合して単一の骨を形成する場合、このECOを介したアプローチは、より臨床的に関連性のある骨欠損に拡張できます。1つの骨欠損部に複数のMSC系および足場のない肥厚性軟骨を適用したところ、軟骨移植片が骨欠損と一体化したと報告されています。しかし、隣接する移植片は互いに統合されなかった22。ここで紹介するアプローチは、この制限を克服するための 1 つの可能な解決策を提供する可能性があります。コラーゲンコンストラクトと比較して、HAコンストラクトの複数の移植片は、融合して単一の骨を形成する傾向が大きかった。さらに、骨髄は融合したHAコンストラクトの間に形成されたが、これは、肥厚軟骨がVEGFを分泌し、骨髄発生における造血幹細胞ニッチに環境を提供するため、HAがハイドロゲル全体で均一な軟骨分化をサポートするという事実に関連している可能性がある 44。

このプロトコールを用いた実験の成功の鍵は、MSCの品質です。 使用するMSCが十分に高い軟骨形成分化能を有することを事前に確認することが推奨されます。第 2 に、各コンストラクトのサイズが大きすぎないようにする必要があります。私たちの経験では、単一のコンストラクトの容量は10〜15μLに制限されています。 コンストラクトが大きいと、コンストラクトへの酸素と栄養素の浸透が不十分になり、コンストラクトの中心部での壊死と分化不良につながる可能性があります。そのため、ゲルの厚さを薄くして、酸素と栄養素の浸透を改善する必要があります。ゲルの厚さを薄くするために、トランズウェルインサートの多孔質メンブレン上に薄いゲルを作成することが有用である場合があります14,45。あるいは、HAコンストラクトは融合して統合された骨を形成する傾向があるため、以下で説明するように、単一の大きなコンストラクトではなく、多数の小さなコンストラクトを移植するのが適切である可能性があります。

この研究の限界には、骨形成を促進するために移植された組織のリモデリング速度を加速する必要性が含まれます。移植された人工組織は、移植後8週間でも主に肥厚石灰化軟骨状態のままでした。ECO経路を介した骨形成において、宿主由来細胞はECOの促進に重要な役割を果たします16,46。肥厚軟骨移植片に追加のチャネルを提供することは、in vivoで血管浸潤と移植片の石灰化を促進することが報告されています20。このようなチャネルは、骨芽細胞、破骨細胞、造血前駆体などの宿主細胞の浸潤の導管として機能し、構築物内に新しい組織を形成します。あるいは、軟骨形成分化型MSCからなる複数の小さなフィブリン内包ペレット(μペレット)を移植して、統合された骨を形成することができることが報告されている47。HAコンストラクトをμペレットに加工すると、TRAP陽性破骨細胞に囲まれた表面積が増加し、軟骨組織のリモデリング速度が促進され、骨形成が促進される可能性があります(図6)21,48。さらに、μペレットを移植すると、宿主細胞の浸潤スペースが増加し、血管新生と骨髄の発達が促進され、豊富な血管新生を伴う完全な骨形成が発生します。したがって、HAコンストラクトが融合して統合された骨を作成する傾向を考慮すると、このμ構築された骨再生戦略は、HAハイドロゲルを使用した肥厚軟骨移植のECOプロセスを加速する可能性があります。

結論として、HAハイドロゲルは、コラーゲンハイドロゲルよりも少ない細胞数とゲル数で組織改変移植片のスケールアップに効果的です。さらに、HAハイドロゲルは優れた融合感受性を有し、融合移植片間の血管新生および骨髄発生を伴う統合された骨を生成します。したがって、宿主細胞の浸潤および移植片リモデリングを促進するためのHAコンストラクトの修飾は、血管新生および骨髄発生をさらに促進することができる埋め込み型材料の開発につながる可能性がある。さらなる最適化により、このアプローチは、顎顔面および整形外科手術における現在の骨治療の有望な代替手段になる可能性があります。

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Disclosures

著者らは、競合する利害関係は存在しないと宣言しています。

Acknowledgments

本研究は、日本学術振興会科学研究費助成事業(科研費)の支援を受けて行われました。JP19K10259と 22K10032 を MAI に変更)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical  209-16941
Antisedan Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate Nacalai Tesque 13571-14
Bambanker GC Lymphotec CS-02-001
basic fibroblastic growth factor Reprocell RCHEOT002 
bovine serum albumin FUJIFILM Wako Pure Chemical  012-23881 7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10283
dexamethasone Merck D8893
Domitor Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium Merck D6429 high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Merck D6421
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
Gentamicin sulfate FUJIFILM Wako Pure Chemical  1676045  10 mg/mL
Haccpper Generator TechnoMax CH-400-5QB 50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit Merck HYS020
IL-1ß PeproTech AF-200-01B
ITS-G supplement FUJIFILM Wako Pure Chemical  090-06741 ×100
L-Alanyl-L-Glutamine FUJIFILM Wako Pure Chemical  016-21841 200mmol/L (×100)
L-proline Nacalai Tesque 29001-42
L-Thyroxine Merck T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		 Lonza PT-3001
paraffin FUJIFILM Wako Pure Chemical  165-13375
PBS / pH7.4 100ml Medicago 09-2051-100
TGF-β3  Proteintech HZ-1090
Vetorphale Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate FUJIFILM Wako Pure Chemical  048-34332

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Tags

間葉系幹細胞、骨再生療法、血管新生、軟骨内骨化、人工軟骨組織、骨欠損、臨床応用、プロトコール、ハイドロゲル、組織工学グラフト、ヒアルロン酸(HA)
間葉系幹細胞を用いた <em>In vivo</em> 軟骨内骨化による統合骨形成
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Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., … More

Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., Ikeda, M. A. Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (197), e65573, doi:10.3791/65573 (2023).

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