Summary
Benterapi via endokondral benbildning genom implantation av konstgjord broskvävnad framställd av mesenkymala stamceller har potential att kringgå nackdelarna med konventionella terapier. Hyaluronsyrahydrogeler är effektiva för att skala upp likformigt differentierade brosktransplantat samt skapa integrerat ben med vaskularisering mellan sammansmälta transplantat in vivo.
Abstract
Konventionell benregenereringsterapi med mesenkymala stamceller (MSC) är svår att tillämpa på bendefekter som är större än den kritiska storleken eftersom den inte har någon mekanism för att inducera angiogenes. Implantation av konstgjord broskvävnad tillverkad från MSC inducerar angiogenes och benbildning in vivo via endokondral ossifiering (ECO). Därför kan detta ECO-medierade tillvägagångssätt vara en lovande benregenereringsterapi i framtiden. En viktig aspekt av den kliniska tillämpningen av detta ECO-medierade tillvägagångssätt är att upprätta ett protokoll för att förbereda tillräckligt med brosk som ska implanteras för att reparera bendefekten. Det är särskilt inte praktiskt att konstruera en enda massa ympat brosk av en storlek som överensstämmer med formen på den faktiska bendefekten. Därför måste brosket som ska transplanteras ha egenskapen att bilda ben integrerat när flera bitar implanteras. Hydrogeler kan vara ett attraktivt verktyg för att skala upp vävnadskonstruerade transplantat för endokondral benbildning för att möta kliniska krav. Även om många naturligt framställda hydrogeler stöder MSC-broskbildning in vitro och ECO in vivo, har det optimala ställningsmaterialet för att möta behoven i kliniska tillämpningar ännu inte fastställts. Hyaluronsyra (HA) är en avgörande komponent i broskets extracellulära matris och är en biologiskt nedbrytbar och biokompatibel polysackarid. Här visar vi att HA-hydrogeler har utmärkta egenskaper för att stödja in vitro-differentiering av MSC-baserad broskvävnad och främja endokondral benbildning in vivo.
Introduction
Autologt ben är fortfarande guldstandarden för att reparera bendefekter på grund av trauma, medfödda defekter och kirurgisk resektion. Autogen bentransplantation har dock betydande begränsningar, inklusive donatorsmärta, infektionsrisk och begränsad benvolym som kan isoleras från patienterna 1,2,3,4. Många biomaterial har utvecklats som bensubstitut och kombinerar naturliga eller syntetiska polymerer med mineraliserade material som kalciumfosfat eller hydroxiapatit 5,6. Benbildning i dessa konstruerade material uppnås vanligtvis med hjälp av det mineraliserade materialet som ett primingmaterial för att tillåta stamceller att differentiera direkt till osteoblaster genom intramembranbenbildningsprocessen(IMO) 7. Denna process saknar det angiogena steget, vilket resulterar i otillräcklig in vivo vaskularisering av transplantatet efter implantation 8,9,10, och därför kan metoder som använder en sådan process inte vara optimala för behandling av stora bendefekter 11.
Strategier som används för att rekapitulera den endokondrala benbildningsprocessen (ECO), en medfödd mekanism i skelettbildningen under utvecklingen, har visat sig övervinna betydande problem i samband med traditionella IMO-baserade metoder. I ECO frigör kondrocyter i broskmallen vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), vilket främjar vaskulär infiltration och ombyggnad av broskmallen till ben12. Det ECO-medierade tillvägagångssättet för osteogenes via broskremodellering och angiogenes, som också aktiveras under frakturreparation, använder artificiellt skapad broskvävnad härledd från MSC som primingmaterial. Kondrocyter kan tolerera hypoxi vid bendefekter, inducera angiogenes och omvandla ett kärlfritt brosktransplantat till angiogen vävnad. Många studier har rapporterat att MSC-baserade brosktransplantat genererar ben in vivo genom att implementera ett sådant ECO-program 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Ett viktigt krav för den kliniska tillämpningen av detta ECO-medierade tillvägagångssätt är hur man förbereder den önskade mängden brosktransplantat i en klinisk miljö. Att förbereda kliniskt brosk av en storlek som passar den faktiska bendefekten är inte praktiskt. Därför måste transplantatbrosk bilda ben integrerat när flera fragment implanteras22. Hydrogeler kan vara ett attraktivt verktyg för att skala upp vävnadskonstruerade transplantat för endokondral benbildning. Många naturligt framställda hydrogeler stöder MSC-broskbildning in vitro och ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Det optimala stödmaterialet för att uppfylla de kliniska tillämpningskraven har dock inte fastställts. Hyaluronsyra (HA) är en biologiskt nedbrytbar och biokompatibel polysackarid som finns i den extracellulära matrisen av brosk33. HA interagerar med MSC via ytreceptorer såsom CD44 för att stödja kondrogen differentiering 25,26,28,30,31,32,34. Dessutom främjar HA-stödstrukturer IMO-medierad osteogen differentiering av mänskliga tandpulpastamceller35, och stödstrukturer i kombination med kollagen främjar ECO-medierad osteogenes36,37.
Här presenterar vi en metod för att framställa HA-hydrogeler med hjälp av benmärgshärledda vuxna humana MSC och deras användning för hypertrofisk kondrogenes in vitro och efterföljande endokondral benbildning in vivo38. Vi jämförde egenskaperna hos HA med kollagen, ett material som används i stor utsträckning inom benvävnadsteknik med MSC och ett användbart material för att skala upp artificiella transplantat för endokondral ossifikation17. I en immunsupprimerad musmodell utvärderades HA- och kollagenkonstruktioner sådda med humana MSC för in vivo ECO-potential genom subkutan implantation. Resultaten visar att HA-hydrogeler är utmärkta som en byggnadsställning för MSC för att skapa konstgjorda brosktransplantat som tillåter benbildning genom ECO.
Protokollet är uppdelat i två steg. Först prepareras konstruktioner av humana MSC sådda på hyaluronanhydrogel och differentieras till hypertrofiskt brosk in vitro. Därefter implanteras de differentierade konstruktionerna subkutant i en nakenmodell för att inducera endokondral benbildning in vivo (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll använder 4 veckor gamla nakna hanmöss. Inhys fyra möss i en bur under en 12 timmars ljus/mörker-cykel vid 22−24 °C och 50%−70% relativ luftfuktighet. Alla djurförsök utfördes i enlighet med de riktlinjer som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee of Tokyo Medical and Dental University (godkännande-ID: A2019-204C, A2020-116A och A2021-121A).
1. Beredning av buffertar och reagenser
- Bered mesenkymala stamcellsodlingsmedium (MSC-odlingsmedium) genom att tillsätta MSC-odlingsmediet till MSC:s basalmedium och förvara det vid 4 °C.
- Bered Dulbeccos modifierade Eagle Medium och Hams F12 (DMEM/F-12) medium genom att tillsätta 10 % fetalt bovint serum (FBS), 50 μg/ml gentamicin, 200 μM L-alanyl-L-glutamin och 1 ng/ml basisk fibroblastisk tillväxtfaktor till mediet och förvara det vid 4 °C.
- Bered kondrogeniskt medium genom att tillsätta 1 % ITS-G-tillskott, 0,12 % bovint serumalbumin, 50 μg/ml gentamicin, 0,35 mM L-prolin, 100 nM dexametason och 10 ng/ml TGF-β3 till DMEM strax före användning.
- Bered hypertrofiskt medium genom att tillsätta 10 mM β-glycerofosfat, 0,12 % bovint serumalbumin, 10 nM dexametason, 200 μM askorbat-2-fosfat, 50 nM L-tyroxin, 50 μg/ml gentamycin och 50 pg/ml IL-1β till DMEM strax före användning.
- Täck en odlingsskål med 24 brunnar med 200 μl smält paraffin som förvärmts vid 60 °C. Låt stå i rumstemperatur tills paraffinet har stelnat.
2. Expansion av mänskliga MSC
OBS: Innan experimenten påbörjas bör MSC med hög potential för MSC-kondrogenes väljas i mikromasskultur enligt beskrivningen i17.
- Enligt tillverkarens anvisningar, odla primära humana benmärgsderiverade MSC (passage 2) med MSC-tillväxtmedium i en 10 cm skål med en densitet av 5 x 103 celler/cm2 vid 37 °C i 5 %CO 2 och 95 % fuktad luftinkubator.
- Byt medium var 2-3:e dag. När cellerna når 80%-90% sammanflöde, aspirera mediet från cellodlingsskålen med hjälp av en vakuumpump, tvätta med 5 ml PBS och aspirera sedan lösningen med en vakuumpump.
- Tillsätt 1 ml 0,05 % trypsin/0,02 % EDTA-lösning i skålen. Inkubera skålen i 5-10 minuter vid 37 °C.
- Tillsätt 1 ml MSC-odlingsmedium för att stoppa den enzymatiska reaktionen. Överför cellsuspensionen till ett 50 ml rör.
- Blanda cellsuspensionen från andra rätter i 50 ml-röret och lägg den på is.
- Använd cellräknaren för att räkna cellerna genom att blanda 10 μL av cellsuspensionen med 10 μL 0,4 % trypanblå bets.
- Centrifugera den återstående cellsuspensionen vid 220 x g i 3 minuter vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten och tillsätt kryokonserveringslösning i en koncentration av 1,0 x 106 celler per ml.
- Fördela 1 ml av cellsuspensionen i varje kryorör och förvara vid -80 °C i 12 timmar innan den överförs till flytande kväve. De frysta lager som blir resultatet (passage 3) används för detta protokoll.
- För experimenten, så fröna av de lagrade MSC:erna i en 10 cm skål med en densitet av 5 x 103 celler/cm2. Odla celler till 80%-90% konfluent (passage 4) i DMEM/F-12-medium.
3. Beredning av MSC-inkapslade hydrogeler
- Trypsinisera cellerna och bered cellsuspensionen enligt beskrivningen i steg 2.3 - 2.6.
- För att göra 10 konstrukt (2,5 x 10 5 celler per konstrukt), alikvot cellsuspensionen innehållande 2,5 x 106 celler i ett1,5 ml mikrorör.
- Centrifugera suspensionen vid 220 x g i 3 minuter, avlägsna supernatanten med en vakuumpump och lägg den på is.
- Ta med den tiolmodifierade hyaluronsyran (HA), tiolreaktiva tvärbindaren, polyetylenglykoldiakrylatet och avgasade vattenflaskor till rumstemperatur.
- Under sterila förhållanden, tillsätt 1,0 ml avgasningsvatten till flaskan som innehåller HA (se tillverkarens anvisningar) med hjälp av en spruta med nål.
- Vred då och då till 37 °C tills lösningen blir klar och lägg sedan på is. Det tar mindre än 30 minuter för de fasta ämnena att lösas upp helt.
- Under sterila förhållanden, tillsätt 0.5 ml avgasningsvatten till tvärbindarflaskan med hjälp av en spruta med nål. Lös upp genom att vända upp och ner flera gånger och lägg sedan på is.
- Tillsätt 120 μl av den upplösta HA-lösningen till den alisaliserade cellpelleten (2,5 x 106 celler). Återsuspendera cellpelleten genom att pipettera fram och tillbaka.
- Tillsätt 30 μl av den upplösta tvärbindarlösningen till röret som innehåller HA och cellerna (steg 3.8) och blanda genom att knacka på röret och centrifugera sedan kort. Kombinera HA-lösningen och tvärbindarlösningen i förhållandet 4:1.
- Droppa 15 μl av den kombinerade lösningen innehållande MSC (2,5 x 105 celler) på den paraffinbelagda 24-hålsplattan och låt den stelna vid 37 °C i 30 minuter (figur 2). På grund av hög viskositet, förbered minst 10 % extra mängd av cell/hydrogelblandningen än vad som behövs.
OBS: Hydrogelens egenskaper har beskrivits tidigare39.
4. Differentieringsvillkor in vitro
- Tillsätt 0,5 ml kondrogeniskt differentieringsmedium till en konstruktion av MSC-sådda HA-hydrogeler. Byt medium var 2-3:e dag.
- Efter 3 veckor, byt till hypertrofiskt differentieringsmedium (0,5 ml per brunn) och odla konstrukten i ytterligare 2 veckor.
5. In vivo implantation av MSC
- Efter totalt 5 veckors in vitro-odling implanteras konstrukten subkutant i ryggen på nakna möss enligt beskrivningen tidigare38,40.
- Väg möss och administrera ett kombinationsanestetikum berett med 0,75 mg/kg kroppsvikt medetomidin, 4,0 mg/kg midazolam och 5,0 mg/kg kroppsvikt butorfanol genom intraperitoneal injektion enligt beskrivningen38.
- Bekräfta adekvat anestesi genom orörlighet för kirurgiska stimuli och övervaka andningsdjupet genom långsamma, regelbundna bröströrelser och korrekt syretillförsel genom färgen på den rosa slemhinnan med jämna mellanrum under operationen. Använd veterinärsalva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
- Placera musen på ett sterilt kirurgiskt draperi i bukläge, sterilisera snittstället med 50 ppm hypoklorsyravatten (pH 5,0; HAW) och placera ett perforerat operationsdraperi över musen.
OBS: Sterilisera alla kirurgiska material i en autoklav, etylenoxidgas eller HAW. Kirurgerna bör tvätta fingrarna och bära operationsrockar och handskar. - Gör två 5 mm långa hudsnitt med 2 cm mellanrum i axel- och höftområdena längs ryggradens mittlinje med hjälp av en sax.
- För in en spatel subkutant genom snittet för att skapa en subkutan ficka.
- Sätt in två till tre konstruktioner (~15 μL vardera, steg 5.1) i varje ficka med en pincett. HA-konstruktioner som implanteras i samma ficka är benägna att fusioneras mycket ofta. För att förhindra fusion infogar du en HA-konstruktion i varje ficka.
- Stäng snitten med 4-0 flätade silkessuturer. Injicera musen med en antagonist till anestesimedel beredd med 0,75 mg/kg kroppsvikt atipamezol enligt beskrivningen38.
- Medan mössen återhämtar sig från narkosen placerar du mössen i sterila uppvakningsburar som innehåller sterilt golvströ utan mat- och vattenflaskor och övervakar kontinuerligt kroppstemperatur, puls och andning.
- Lämna inte mössen utan uppsikt förrän de har återfått tillräckligt med medvetande för att bibehålla sternal liggande. När djuren har återhämtat sig helt och hållet ska de återföras till avelsrummet tillsammans med de andra djuren.
- Övervaka djuren varannan dag under läkningsperioden för eventuella komplikationer. Avliva mössen genom inandning av koldioxid med lite lidande 4 och 8 veckor efter implantation.
- Snitta huden på de transplanterade ställena och ta bort de implanterade konstrukterna med pincett. Fixera konstrukten i 4% paraformaldehyd i 16 timmar och utsätt dem sedan för analys.
6. Statistisk analys
- Rapportera kvantitativa data som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Utföra statistisk analys med hjälp av kommersiell programvara.
- Använd Students t-test eller envägs ANOVA följt av Tukeys test för multipla jämförelser för att fastställa signifikanta skillnader mellan grupper. p<0,05 och p<0,01 indikerar signifikanta skillnader mellan två grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MSC-inkapslade HA-hydrogeler odlades i kondrogent medium kompletterat med TGFβ3, en inducerare av kondrogenes41 (steg 4.1). Vi jämförde egenskaperna hos HA med egenskaperna hos kollagen, som har visat sig vara effektiva för att skapa MSC-baserade konstgjorda brosktransplantat för endokondral benbildning, som beskrivits tidigare38. Odifferentierade MSC inkluderades inte som negativa kontroller i denna studie eftersom det har visats att odifferentierade MSC kräver mineraliserade ytor som ett primingsubstrat för att generera ben genom osteogen differentiering (dvs. intramembranförbening)7.
Storleken på hyaluronanhydrogelerna förändrades inte under in vitro-odlingsperioden, vilket bedömdes baserat på diametrar uppmätta under ett inverterat mikroskop, medan kollagenhydrogelerna som användes för jämförelse började krympa strax efter att odlingen startade. För att minska storleksskillnaden mellan HA- och kollagenkonstruktionerna efter in vitro-odling halverades antalet MSC och volymen av gelen som användes för att skapa HA-hydrogelerna jämfört med de som användes för kollagenhydrogelerna. Våtvikten för HA-konstruktionerna efter 3 veckors broskodling var dock 4 gånger tyngre än för kollagenkonstruktionerna.
Kondrogen och hypertrofisk differentiering in vitro.
Efter kondrogen differentiering (vid vecka 3 av in vitro-odlingen ), sulfaterade glykosaminoglykaner (sGAG)-positiva (Safranin O/snabb grön färgning; Figur 3A) och typ II kollagenpositiv extracellulär matris observerades i båda konstruktionerna, vilket indikerar att både HA och kollagenhydrogeler stödde kondrogenesen. Jämfört med kollagenkonstruktionen var dock fördelningen av sGAG, typ II-kollagen (Col II) och typ X-kollagen (Col X) mer homogen i hela vävnaden i HA-konstruktionerna. Skillnader mellan de två konstruktörerna var också uppenbara i cellmorfologin: celler med en kondrocytliknande rundad morfologi var fördelade över vävnaden i HA-konstruktionerna. I kollagenkonstruktionerna uppvisade dock celler i periferin en heterogen morfologi, som sträckte sig från oregelbunden/utsträckt till rundad morfologi. I överensstämmelse med detta var den genomsnittliga rundheten hos cellerna i HA-konstruktionerna högre än i kollagenkonstruktionerna, både i periferin och de centrala regionerna (34 % mot 77,6 % (p<0,01) respektive 78,3 % mot 100 % (p<0,05); Figur 3B). Vid 5 veckors odling detekterades kalciumavsättning vid ytterkanterna i båda konstrukten (alizarinrött; Figur 3C). Dessutom detekterades uttryck av kondrogena (Sox-9, aggrecan (ACAN), Col II), hypertrofiska (Col X, matrixmetallopeptidas 13 (MMP-13)) och osteogena (typ I-kollagen (Col I), bensialoprotein (BSP), osteokalcin (OCN)) markörer14 med kvantitativ realtids-RT-PCR, vilket bekräftade progressionen av kondrogen och hypertrofisk differentiering under in vitro-odling (Figur 4).
Endokondral benbildning av subkutant implanterade konstrukt in vivo.
Subkutana fickor skapades på ryggen av nakna möss, och två till tre konstrukter implanterades i varje ficka efter hypertrofisk differentiering (vid vecka 5 av in vitro-odlingen). 4 eller 8 veckor efter implantationen var alla HA-konstruktioner fästa vid varandra i de implanterade fickorna (tabell 1). I kollagenkonstruktionerna observerades vidhäftning i 60 % av fickorna, medan transplantaten i de återstående fickorna var oberoende av varandra. Färgning av hematoxylin och eosin (H&E) visade att i båda konstrukterna 8 veckor efter implantation bildades osteoidvävnad med lamellmorfologi i de yttre regionerna av konstrukten (Figur 5Aa,f). sGAG-färgning försvann i HA-konstruktionerna, vilket indikerar förlusten av deras broskfenotyp (Figur 5Ah). I båda konstrukten bildades en benmärgskomponent innehållande hematopoetiska celler och fettvävnad mellan det inre brosket och de yttre osteoidvävnaderna. I alla HA-konstruktioner var benvävnaderna i de sammansmälta konstrukterna anslutna och omgivna av gemensam fibrös vävnad och benmärg som utvecklats längs utrymmet mellan de två vidhäftande konstruktionerna, vilket indikerar att flera HA-konstruktioner tenderar att bilda integrerad benvävnad (Figur 5Ag). De vidhäftade kollagenkonstruktionerna integrerades på liknande sätt i två av de tre sammansmälta fallen, men i det tredje fallet var benvävnaden i de två konstruktörerna inte sammankopplade (tabell 1 och figur 5Ab). I båda konstrukten observerades kärl identifierade av CD31-positiva endotelceller42 i benmärgen (figur 5Ad,i), och de inre broskregionerna var omgivna av TRAP-positiva multinukleära celler från osteoklastlinjen, vilket indikerar att broskvävnad var föremål för ombyggnad (figur 5Ae,j).
Mineral deponerades i den yttre osteoidregionen i både HA- och kollagenkonstruktioner (Figur 5B). Medan den totala mineraltätheten i det nya benet var likartad mellan HA- och kollagenkonstruktioner, var mineralvolymen signifikant högre i HA-konstruktionerna än i kollagenkonstruktionerna, vilket kan återspegla det faktum att HA-hydrogeler inte krympte under in vitro-odling , vilket resulterade i större konstrukt än kollagenhydrogeler (Figur 5C, D).
Figur 1: Experimentell design. Det första steget i detta protokoll är att kapsla in expanderade MSC i HA-hydrogeler för att främja kondrogen och hypertrofisk differentiering in vitro. Konstrukten odlas under kondrogena differentieringsförhållanden i 3 veckor, följt av ytterligare 2 veckor under hypertrofiska differentieringsförhållanden. Det andra steget i detta protokoll är att subkutant implantera konstrukten i nakna möss vid vecka 5 av in vitro-odlingen för att genomgå endokondral förbening in vivo i 8 veckor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Beredning av MSC-sådda hydrogeler. Droppa modifierad HA/tvärbindarlösning som innehåller MSC på en paraffinbelagd 24-hålsplatta och låt stelna vid 37 °C i 30 minuter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Histologisk och immunhistokemisk analys av HA- och kollagenkonstruktioner efter in vitro-odling 22. (A) Konstrukt vid 3 veckors (3W) in vitro-odling färgades för sGAG (safranin O/fast green), typ II-kollagen (Col II) och typ X-kollagen (Col X). B) Cellernas genomsnittliga cirkularitetsvärden efter 3 veckors in vitro-odling (n = 5). Öppna och grå staplar indikerar kollagen- respektive HA-konstruktioner. Grupper utan gemensam bokstav är statistiskt olika (a kontra b, p<0,01; b kontra c, p<0,05). (C) Konstrukt vid 5 veckors (5 W) in vitro-odling färgades med avseende på kalcium (alizarinrött). Alla bilder togs med samma förstoring (skalstreck: 200 μm). En översikt med låg förstoring av hela vävnaderna visas i infällningarna (skalstreck: 1 mm). Felstaplar representerar medelvärdet ± standardavvikelsen (SD). Envägs ANOVA följt av Tukeys multipla jämförelsetest användes för att bestämma signifikanta skillnader mellan grupper. Denna siffra har ändrats från38. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Analys av genuttryck av HA och kollagenkonstruktioner vid 3 och 5 veckors in vitro-odling. (A) Kondrogena och hypertrofiska markörer. (B) Osteogena markörer. Värdena presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (SD) (n = 3). Odifferentierade MSC uttryckte höga nivåer av Col I och MMP-13 och låga nivåer av Sox-9 och Col X; de uttryckte inte (#) ACAN, Col II, BSP och OCN. Felstaplar representerar medelvärdet ± standardavvikelsen (SD). Denna siffra har ändrats från38. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Immunohistokemisk analys och förkalkning av HA- och kollagenkonstrukt efter implantation vid 8 veckor. (A) Konstrukt färgades för hematoxylin och eosin (H&E, a, b, f och g), safranin O/Fast Green (c och h), endotelceller (Cluster of Differentiation 31, CD31) (d och i) och tartratresistent syrafosfatas (TRAP, e och j). (a och f) Översikt över hela vävnaderna (skalstapel = 500 μm). H&E, safranin O, CD31: skalstapel = 200 μm; TRAP: skalstreck = 50 μm. Pilar indikerar CD31-positiva endotelceller. Förkortningar: c = inre broskvävnad; o = yttre osteoidvävnad. (B) MicroCT (μCT) avbildning av kollagen och HA-konstruktioner (huvud- och infällda skalstreck = 2 mm). (C,D) Den totala mineraldensiteten (C) och volymen (D) för HA- och kollagenkonstruktioner (n = 4). ** indikerar signifikanta skillnader; p <0,01. Fyra konstrukt analyserades per grupp med hjälp av μCT. Felstaplar representerar medelvärdet ± standardavvikelsen (SD). Studenternas t-test användes för att fastställa signifikanta skillnader mellan grupperna. Denna siffra har ändrats från38. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Strategi för att underlätta för ekonationer att använda HA-baserat artificiellt brosk. Schematisk bild av benbildning och benmärgsutveckling utan och med fragmentering (μ-pellets) av implanterade HA-konstruktioner. (A) HA-hydrogeler har en utmärkt fusionstendens att bilda ett integrerat ben med vaskularisering och benmärgsutveckling mellan sammansmälta transplantat in vivo. Den resulterande implanterade vävnaden förblev dock huvudsakligen i brosktillstånd även 8 veckor efter implantationen. (B) Med tanke på tendensen hos HA-konstruktioner att smälta samman för att bilda integrerat ben, kan bearbetning av HA-konstruktioner till μ-pellets påskynda ombyggnadshastigheten för transplanterad vävnad och främja benbildning. Mikronisering av konstrukten ökar ytan, vilket kan främja resorptionen av broskvävnad och bildandet av benvävnad och kan också främja angiogenes och benmärgsutveckling på grund av det ökade utrymmet för värdcellsinfiltration. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Hydrogel | Experiment | Vidhäftad | Förenad | % Förenade |
| Kollagen | 5 | 3 | 2 | 40 |
| HA | 5 | 5 | 5 | 100 |
Tabell 1: Föreningsgrad när flera konstruktioner implanterades i en enda ficka. Två eller tre konstrukter implanterades subkutant i en enda ficka. Konstrukterna skördades 4 eller 8 veckor efter implantationen och undersöktes histologiskt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att använda lämpliga byggnadsmaterial som främjar övergången från hypertrofiskt brosk till ben är ett lovande tillvägagångssätt för att skala upp MSC-baserade konstruerade hypertrofiska brosktransplantat och behandla bendefekter av kliniskt signifikant storlek. Här visar vi att HA är ett utmärkt byggnadsmaterial för att stödja differentieringen av MSC-baserad hypertrofisk broskvävnad in vitro och för att främja endokondral benbildning in vivo38. Dessutom, in vivo, visade sig HA-konstruktioner underlätta sammansmältningen av flera konstrukt implanterade i samma ficka för att bilda ett enda integrerat ben. Eftersom interaktionen mellan MSC och ställningsmaterial avsevärt påverkar brosk och hypertrofisk kondrogenes, är det viktigt att välja lämpligt ställningsmaterial för ECOs för att generera kliniskt effektiva vävnadskonstruerade brosktransplantat. Celler inbäddade i HA-hydrogeler uppvisar likformigt en rundad morfologi som är karakteristisk för kondrocyter från mitten till periferin, vilket indikerar att hyaluronan ger en miljö som bidrar till enhetlig broskbildning i hela hydrogelen21,30. Till skillnad från HA interagerar kollagen med MSC via integrinbindningssekvenser (RGD); Persistensen av denna interaktion hindrar dock MSC från att ytterligare differentiera sig i den kondrogena vägen43, vilket kan förklara den icke-typiska kondrocytcellmorfologin som är framträdande i periferin av kollagenkonstruktioner.
Om flera transplantat förenas för att bilda ett enda ben kan detta ECO-medierade tillvägagångssätt utvidgas till mer kliniskt relevanta bendefekter. När flera MSC-baserade och ställningsfria hypertrofiska brosk applicerades på en enda bendefekt rapporterades att brosktransplantaten integrerades med bendefekten. Intilliggande transplantat integrerades dock inte med varandra22. Det tillvägagångssätt som presenteras här kan erbjuda en möjlig lösning för att övervinna denna begränsning. Jämfört med kollagenkonstruktioner hade flera transplantat av HA-konstrukt en större tendens att smälta samman för att bilda ett enda ben. Vidare bildades benmärg mellan sammansmälta HA-konstruktioner, vilket kan relateras till det faktum att HA stöder enhetlig broskdifferentiering genom hela hydrogelen eftersom hypertrofisk brosk utsöndrar VEGF och ger en miljö för den hematopoetiska stamcellsnischen i benmärgsutvecklingen 44.
Nyckeln till ett lyckat experiment med detta protokoll är kvaliteten på MSC. Det rekommenderas att man i förväg bekräftar att de MSC:er som ska användas har tillräckligt hög kondrogen differentieringspotential. För det andra bör storleken på varje konstruktion inte vara för stor. Enligt vår erfarenhet är volymen av en enda konstruktion begränsad till 10-15 μL. Större konstrukt kan resultera i otillräcklig syre- och näringspenetration i konstruktörerna, vilket leder till nekros och dålig differentiering i konstruktens centrum. Därför måste geltjockleken minskas för att förbättra syre- och näringsinträngningen. För att minska geltjockleken kan det vara till hjälp att skapa tunna geler på det porösa membranet på Transwell-insatser14,45. Alternativt, eftersom HA-konstruktioner tenderar att smälta samman och bilda integrerat ben, kan det vara tillräckligt att implantera många mindre konstruktioner snarare än en enda stor konstruktion, som diskuteras nedan.
Begränsningar med denna studie inkluderar behovet av att påskynda ombyggnadshastigheten för de implanterade vävnaderna för att underlätta benbildning. Den implanterade konstruerade vävnaden förblev huvudsakligen i ett hypertrofiskt förkalkat brosktillstånd även 8 veckor efter implantation. Vid benbildning via ECO-vägen spelar värdhärledda celler en avgörande roll för att främja ECO16,46. Att tillhandahålla ytterligare kanaler i hypertrofiska brosktransplantat har rapporterats främja vaskulär invasion och transplantatmineralisering in vivo20. Sådana kanaler fungerar som kanaler för infiltration av värdceller, inklusive osteoblaster, osteoklaster och hematopoetiska prekursorer, för att bilda ny vävnad i konstruktionen. Alternativt har det rapporterats att flera små fibrininkapslade pellets (μ-pellets) som består av kondrogendifferentierade MSC kan implanteras för att bilda integrerat ben47. Bearbetning av HA-konstruktioner till μ-pellets kan öka ytan omgiven av TRAP-positiva osteoklaster, vilket främjar ombyggnadshastigheten av broskvävnad och förbättrar osteogenesen (Figur 6)21,48. Dessutom skulle implantation av μ-pellets öka infiltrationsutrymmet för värdceller, vilket underlättar angiogenes och benmärgsutveckling och genererar integrerad benbildning med riklig vaskularisering. Således, med tanke på tendensen hos HA-konstruktioner att smälta samman och skapa integrerat ben, kan denna μ-konstruerade benregenereringsstrategi påskynda ECO-processen för hypertrofiska brosktransplantat med hjälp av HA-hydrogeler.
Sammanfattningsvis är HA-hydrogeler effektiva för att skala upp vävnadskonstruerade transplantat med färre celler och geler än kollagenhydrogeler. Dessutom har HA-hydrogeler utmärkt fusionskänslighet och producerar integrerat ben med vaskularisering och märgutveckling mellan sammansmälta transplantat. Därför kan modifiering av HA-konstruktioner för att främja värdcellsinfiltration och transplantatremodellering leda till utveckling av implanterbara material som ytterligare kan främja vaskularisering och benmärgsutveckling. Med ytterligare optimering kan detta tillvägagångssätt vara ett lovande alternativ till nuvarande benterapier inom käk- och ortopedisk kirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har förklarat att det inte finns några motstridiga intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag för vetenskaplig forskning (KAKENHI) från Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (anslagsnummer). JP19K10259 och 22K10032 till MAI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
| Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
| Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
| basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
| bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
| Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
| dexamethasone | Merck | D8893 | |
| Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| Dormicum | Astellas Pharma | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
| Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
| Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
| HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
| IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
| ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
| L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
| L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
| L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
| MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
| paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
| PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
| TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
| Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
| Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
| β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |
References
- Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
- Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
- Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
- Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A.
- Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
- Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D.
- Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
- Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
- Kronenberg, H. M.
- Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
- Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
- Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
- Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
- Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
- Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
- van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
- Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
- Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
- Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
- Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
- Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
- Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
- Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
- Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
- Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
- Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton's jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
- Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
- Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
- Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
- La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
- Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O'Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
- Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
- Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
- Zarembinski, T., Skardal, A. Hydrogels - Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
- Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
- Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
- Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
- Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
- Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
- Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).
