Summary
Knogleterapi via endokondral ossifikation ved implantering af kunstigt bruskvæv fremstillet af mesenkymale stamceller har potentialet til at omgå ulemperne ved konventionelle terapier. Hyaluronsyrehydrogeler er effektive til opskalering af ensartet differentierede brusktransplantater samt skabelse af integreret knogle med vaskularisering mellem smeltede transplantater in vivo.
Abstract
Konventionel knogleregenereringsterapi ved hjælp af mesenkymale stamceller (MSC'er) er vanskelig at anvende på knogledefekter, der er større end den kritiske størrelse, fordi den ikke har en mekanisme til at inducere angiogenese. Implantering af kunstigt bruskvæv fremstillet af MSC'er inducerer angiogenese og knogledannelse in vivo via endokondral ossifikation (ECO). Derfor kan denne ECO-medierede tilgang være en lovende knogleregenereringsterapi i fremtiden. Et vigtigt aspekt af den kliniske anvendelse af denne ECO-medierede tilgang er at etablere en protokol til forberedelse af nok brusk til at blive implanteret til at reparere knogledefekten. Det er især ikke praktisk at designe en enkelt masse podet brusk af en størrelse, der er i overensstemmelse med formen på den faktiske knogledefekt. Derfor skal brusk, der skal transplanteres, have egenskaben til at danne knogle integreret, når flere stykker implanteres. Hydrogeler kan være et attraktivt værktøj til opskalering af vævsmanipulerede transplantater til endokondral ossifikation for at opfylde kliniske krav. Selvom mange naturligt afledte hydrogeler understøtter MSC-bruskdannelse in vitro og ECO in vivo, er det optimale stilladsmateriale til at opfylde behovene ved kliniske anvendelser endnu ikke fastlagt. Hyaluronsyre (HA) er en afgørende bestanddel af bruskens ekstracellulære matrix og er et biologisk nedbrydeligt og biokompatibelt polysaccharid. Her viser vi, at HA-hydrogeler har fremragende egenskaber til at understøtte in vitro-differentiering af MSC-baseret bruskvæv og fremme endokondral knogledannelse in vivo.
Introduction
Autolog knogle er stadig guldstandarden til reparation af knogledefekter på grund af traumer, medfødte defekter og kirurgisk resektion. Autogen knogletransplantation har imidlertid betydelige begrænsninger, herunder donorsmerter, risiko for infektion og begrænset knoglevolumen, der kan isoleres fra patienterne 1,2,3,4. Talrige biomaterialer er blevet udviklet som knoglesubstitutter, der kombinerer naturlige eller syntetiske polymerer med mineraliserede materialer såsom calciumphosphat eller hydroxyapatit 5,6. Knogledannelse i disse konstruerede materialer opnås normalt ved anvendelse af det mineraliserede materiale som primingmateriale for at tillade stamceller at differentiere direkte til osteoblaster gennem den intramembrane ossifikation (IMO) proces7. Denne proces mangler det angiogene trin, hvilket resulterer i utilstrækkelig in vivo vaskularisering af transplantatet efter implantation 8,9,10, og derfor er tilgange, der anvender en sådan proces, muligvis ikke optimale til behandling af store knogledefekter 11.
Strategier, der anvendes til at rekapitulere den endokondrale ossifikationsproces (ECO), en medfødt mekanisme i skeletogenese under udvikling, har vist sig at overvinde betydelige problemer forbundet med traditionelle IMO-baserede tilgange. I ECO frigiver chondrocytter i bruskskabelonen vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), som fremmer vaskulær infiltration og ombygning af bruskskabelonen til knogle12. Den ECO-medierede tilgang til osteogenese via bruskremodellering og angiogenese, som også aktiveres under reparation af brud, bruger kunstigt skabt bruskvæv afledt af MSC'er som primingmateriale. Chondrocytter kan tolerere hypoxi i knogledefekter, fremkalde angiogenese og omdanne et vaskulært brusktransplantat til angiogent væv. Talrige undersøgelser har rapporteret, at MSC-baserede brusktransplantater genererer knogle in vivo ved at implementere et sådant ECO-program 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Et væsentligt krav til den kliniske anvendelse af denne ECO-medierede tilgang er, hvordan man forbereder den ønskede mængde brusktransplantat i kliniske omgivelser. Forberedelse af klinisk brusk af en størrelse, der passer til den faktiske knogledefekt, er ikke praktisk. Derfor skal graftbrusk danne knogle integreret, når flere fragmenter implanteres22. Hydrogeler kan være et attraktivt værktøj til opskalering af vævsmanipulerede transplantater til endokondral ossifikation. Mange naturligt afledte hydrogeler understøtter MSC-bruskdannelse in vitro og ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Det optimale støttemateriale til at opfylde de kliniske applikationskrav er dog forblevet ubestemt. Hyaluronsyre (HA) er et biologisk nedbrydeligt og biokompatibelt polysaccharid, der findes i bruskens ekstracellulære matrix33. HA interagerer med MSC'er via overfladereceptorer såsom CD44 for at understøtte kondrogen differentiering 25,26,28,30,31,32,34. Derudover fremmer HA-stilladser IMO-medieret osteogen differentiering af humane tandmassestamceller35, og stilladser kombineret med kollagen fremmer ECO-medieret osteogenese36,37.
Her præsenterer vi en metode til fremstilling af HA-hydrogeler ved hjælp af knoglemarvsafledte voksne humane MSC'er og deres anvendelse til hypertrofisk kondrogenese in vitro og efterfølgende endokondral ossifikation in vivo38. Vi sammenlignede egenskaberne ved HA med kollagen, et materiale, der i vid udstrækning anvendes inden for knoglevævsteknik med MSC'er og et nyttigt materiale til opskalering af kunstige transplantater til endokondral ossifikation17. I en immunkompromitteret musemodel blev HA- og kollagenkonstruktioner podet med humane MSC'er evalueret for in vivo ECO-potentiale ved subkutan implantation. Resultaterne viser, at HA-hydrogeler er fremragende som stillads for MSC'er til at skabe kunstige brusktransplantater, der tillader knogledannelse gennem ECO.
Protokollen er opdelt i to trin. For det første fremstilles konstruktioner af humane MSC'er podet på hyaluronanhydrogel og differentieres til hypertrofisk brusk in vitro. Dernæst implanteres de differentierede konstruktioner subkutant i en nøgen model for at inducere endokondral ossifikation in vivo (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol bruger 4 uger gamle nøgne hanmus. Opstald fire mus i et bur under en 12 timers lys/mørk cyklus ved 22-24 °C og 50-70% relativ luftfugtighed. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Tokyo Medical and Dental University (godkendelses-id: A2019-204C, A2020-116A og A2021-121A).
1. Fremstilling af buffere og reagenser
- Forbered mesenkymal stamcellevækstmedium (MSC-vækstmedium) ved at tilføje MSC-vækstmediets tillægssæt til MSC's basalmedier og opbevar det ved 4 °C.
- Forbered Dulbeccos modificerede ørnemedium og skinkens F12 (DMEM / F-12) medium ved at tilføje 10% føtalt bovint serum (FBS), 50 μg / ml gentamicin, 200 μM L-alanyl-L-glutamin og 1 ng / ml basisk fibroblastisk vækstfaktor til mediet og opbevar det ved 4 ° C.
- Forbered kondrogent medium ved at tilføje 1% ITS-G supplement, 0,12% bovin serumalbumin, 50 μg / ml gentamicin, 0,35 mM L-prolin, 100 nM dexamethason og 10 ng / ml TGF-β3 til DMEM lige før brug.
- Forbered hypertrofisk medium ved at tilsætte 10 mM β-glycerophosphat, 0,12% bovint serumalbumin, 10 nM dexamethason, 200 μM ascorbat-2-phosphat, 50 nM L-thyroxin, 50 μg / ml gentamycin og 50 pg / ml IL-1β til DMEM lige før brug.
- Overtræk en kulturskål med 24 brønde med 200 μL smeltet paraffin, der er forvarmet til 60 °C. Lad stå ved stuetemperatur, indtil paraffinen er indstillet.
2. Udvidelse af humane MSC'er
BEMÆRK: Før forsøgene påbegyndes, bør MSC'er med et stort potentiale for MSC-kondrogenese vælges i mikromassekultur som beskrevet i17.
- Ifølge producentens anvisninger dyrkes primære MSC'er afledt af human knoglemarv (passage 2) med MSC-vækstmedium i en 10 cm skål med en densitet på 5 x 103 celler/cm2 ved 37 °C i 5 % CO2 og 95 % befugtet luftinkubator.
- Skift mediet hver 2-3 dage. Når cellerne når 80% -90% sammenløb, aspireres mediet fra cellekulturskålen ved hjælp af en vakuumpumpe, vaskes med 5 ml PBS og aspireres derefter opløsningen med en vakuumpumpe.
- Tilsæt 1 ml 0,05% trypsin / 0,02% EDTA-opløsning til skålen. Kuber fadet i 5-10 minutter ved 37 °C.
- Tilsæt 1 ml MSC-vækstmedium for at stoppe den enzymatiske reaktion. Overfør cellesuspensionen til et 50 ml rør.
- Kombiner cellesuspensionen fra andre skåle i 50 ml røret og opbevar den på is.
- Brug celletælleren til at tælle cellerne ved at blande 10 μL af cellesuspensionen med 10 μL 0,4% trypanblå plet.
- Den resterende cellesuspension centrifugeres ved 220 x g i 3 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, og der tilsættes kryopræserveringsopløsning i en koncentration på 1,0 x 106 celler pr. ml.
- Dispenser 1 ml af cellesuspensionen i hvert kryorør og opbevar ved -80 °C i 12 timer, før den overføres til flydende nitrogen. De deraf følgende frosne lagre (passage 3) anvendes til denne protokol.
- Til forsøgene sås de lagerførte MSC'er i en 10 cm skål med en densitet på 5 x 103 celler/cm2. Kulturceller indtil 80% -90% sammenflydende (passage 4) i DMEM / F-12 medium.
3. Fremstilling af MSC-indkapslede hydrogeler
- Trypsiniser cellerne og forbered cellesuspension som beskrevet i trin 2.3 - 2.6.
- For at lave 10 konstruktioner (2,5 x 10 5 celler pr. konstruktion) alikvoten cellesuspensionen indeholdende 2,5 x 106 celler i et1,5 ml mikrorør.
- Suspensionen centrifugeres ved 220 x g i 3 min, supernatanten fjernes med en vakuumpumpe, og den opbevares på is.
- Bring thiolmodificeret hyaluronsyre (HA), thiol-reaktiv tværbinding, polyethylenglycoldiacrylat og afgassede vandflasker til stuetemperatur.
- Under sterile forhold tilsættes 1,0 ml afgasset vand til den HA-holdige flaske (se producentens anvisninger) ved hjælp af en sprøjte med en nål.
- Vortex opvarmes lejlighedsvis til 37 °C, indtil opløsningen bliver klar, og anbringes derefter på is. Det tager mindre end 30 minutter for de faste stoffer at opløses fuldstændigt.
- Under sterile forhold tilsættes 0,5 ml afgasset vand til tværbindingsflasken ved hjælp af en sprøjte med en nål. Opløs ved at vende flere gange, og læg derefter på is.
- Der tilsættes 120 μL opløst HA-opløsning til aliquoteret cellepellet (2,5 x 106 celler). Resuspender cellepillen ved at pipettere frem og tilbage.
- Der tilsættes 30 μL opløst tværbindingsopløsning til røret indeholdende HA og celler (trin 3.8), og kombiner ved at banke på røret, og drej derefter kortvarigt ned. Kombiner HA-løsningen og tværbindingsløsningen i forholdet 4:1.
- 15 μL af den kombinerede opløsning indeholdende MSC'er (2,5 x 105 celler) anbringes på den paraffinbelagte plade med 24 huller, og den størkner ved 37 °C i 30 minutter (figur 2). På grund af høj viskositet skal der fremstilles mindst 10 % ekstra mængde af celle/hydrogel-blandingen end nødvendigt.
BEMÆRK: Hydrogelens egenskaber er beskrevet tidligere39.
4. In vitro-differentieringsbetingelser
- Der tilsættes 0,5 ml kondrogent differentieringsmedium til en konstruktion af MSC-seedede HA-hydrogeler. Skift mediet hver 2-3 dage.
- Efter 3 uger skiftes til hypertrofisk differentieringsmedium (0,5 ml pr. Brønd) og dyrkes konstruktionerne i yderligere 2 uger.
5. In vivo-implantation af MSC'er
- Efter i alt 5 ugers in vitro-dyrkning implanteres konstruktionerne subkutant i ryggen på nøgne mus som beskrevet tidligere38,40.
- Der vejes mus, og der indgives et kombinationsbedøvelsesmiddel tilberedt med 0,75 mg/kg legemsvægt medetomidin, 4,0 mg/kg legemsvægt midazolam og 5,0 mg/kg legemsvægt, butorphanol ved intraperitoneal injektion som beskrevet38.
- Bekræft tilstrækkelig anæstesi ved immobilitet til kirurgiske stimuli og overvåg åndedrætsdybden ved langsomme, regelmæssige brystbevægelser og korrekt iltforsyning med farven på den lyserøde slimhinde periodisk under operationen. Brug veterinærsalve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi.
- Placer musen på et sterilt kirurgisk drapering i en udsat position, steriliser snitstedet med 50 ppm hypochlorsyrevand (pH 5,0; HAW), og læg et perforeret kirurgisk drapering over musen.
BEMÆRK: Steriliser alle kirurgiske materialer i en autoklave, ethylenoxidgas eller HAW. Kirurgerne skal vaske fingrene og bære kirurgiske kjoler og handsker. - Lav to 5 mm lange hudsnit 2 cm fra hinanden i skulder- og hofteområderne langs rygsøjlens midterlinje ved hjælp af en saks.
- Indsæt en spatel subkutant gennem snittet for at skabe en subkutan lomme.
- Indsæt to til tre konstruktioner (~ 15 μL hver, trin 5.1) i hver lomme med pincet. HA-konstruktioner implanteret i samme lomme er tilbøjelige til fusion meget ofte. For at forhindre fusion skal du indsætte en HA-konstruktion i hver lomme.
- Luk snittene med 4-0 flettede silkesuturer. Injicer musen med en antagonist til bedøvelsesmidler fremstillet med 0,75 mg/kg legemsvægt atipamezol som beskrevet38.
- Mens musene kommer sig efter anæstesi, skal du placere musene i sterile genopretningsbure, der indeholder sterilt gulvstrøelse uden mad og vandflasker og kontinuerligt overvåge kropstemperatur, puls og åndedræt.
- Efterlad ikke musene uden opsyn, før de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende. Efter fuldstændig genopretning skal dyrene returneres til avlsrummet med de andre dyr.
- Overvåg dyrene hvert par dage i helingsperioden for eventuelle komplikationer. Aflive musene ved kuldioxidindånding med lidt lidelse 4- og 8-ugers efter implantation.
- Skær huden på de podede steder og fjern de implanterede konstruktioner med tang. Fastgør konstruktionerne i 4% paraformaldehyd i 16 timer, og underkast dem derefter til analyse.
6. Statistisk analyse
- Indberet kvantitative data som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Udfør statistisk analyse ved hjælp af kommerciel software.
- Brug elevens t-test eller envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest til at bestemme signifikante forskelle mellem grupper. p<0,05 og p<0,01 angiver signifikante forskelle mellem to grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MSC-indkapslede HA-hydrogeler blev dyrket i kondrogent medium suppleret med TGFβ3, en inducer af kondrogenese41 (trin 4.1). Vi sammenlignede egenskaberne af HA med kollagen, som har vist sig at være effektive til at skabe MSC-baserede kunstige brusktransplantater til endokondral ossifikation, som beskrevet tidligere38. Udifferentierede MSC'er blev ikke inkluderet som negative kontroller i denne undersøgelse, fordi det er blevet påvist, at udifferentierede MSC'er kræver mineraliserede overflader som primingsubstrat for at generere knogle ved osteogen differentiering (dvs. intramembranossifikation)7.
Størrelsen af hyaluronanhydrogelerne ændrede sig ikke i hele in vitro-dyrkningsperioden, som bedømt ud fra diametre målt under et omvendt mikroskop, mens kollagenhydrogelerne, der blev brugt til sammenligning, begyndte at krympe kort efter kulturens start. For at reducere størrelsesforskellen mellem HA- og kollagenkonstruktionerne efter in vitro-dyrkning blev antallet af MSC'er og volumenet af gelen, der blev brugt til at skabe HA-hydrogelerne, halveret sammenlignet med dem, der blev brugt til kollagenhydrogelerne. Imidlertid var den våde vægt af HA-konstruktionerne efter 3 ugers bruskkultur 4x tungere end kollagenkonstruktionerne.
Chondro og hypertrofisk differentiering in vitro.
Efter kondrogen differentiering (i uge 3 af in vitro-kultur ), sulfaterede glycosaminoglycaner (sGAG)-positive (Safranin O/hurtig grøn farvning; Figur 3A) og type II kollagen-positiv ekstracellulær matrix blev observeret i begge konstruktioner, hvilket indikerer, at både HA og kollagenhydrogeler understøttede kondrogenese. Sammenlignet med kollagenkonstruktionen var fordelingen af sGAG, type II kollagen (Col II) og type X kollagen (Col X) imidlertid mere homogen i hele vævet i HA-konstruktionerne. Forskelle mellem de to konstruktioner var også tydelige i cellemorfologi: celler med en kondrocytlignende afrundet morfologi blev fordelt i hele vævet i HA-konstruktionerne. I kollagenkonstruktionerne viste celler i periferien imidlertid en heterogen morfologi, der spænder fra uregelmæssig / strakt til afrundet morfologi. I overensstemmelse hermed var den gennemsnitlige rundhed af celler i HA-konstruktionerne højere end i kollagenkonstruktionerne, både i periferien og de centrale regioner (henholdsvis 34% versus 77,6% (p<0,01) og 78,3% vs. 100% (p<0,05); Figur 3B). Efter 5 ugers dyrkning blev calciumaflejring påvist ved yderkanterne i begge konstruktioner (alizarinrød; Figur 3C). Desuden blev ekspression af kondrogene (Sox-9, aggrecan (ACAN), Col II), hypertrofe (Col X, matrixmetallopeptidase 13 (MMP-13)) og osteogene (type I kollagen (Col I), knoglesialoprotein (BSP), osteocalcin (OCN)) markører14 påvist ved kvantitativ realtids RT-PCR, hvilket bekræfter progressionen af kondrogen og hypertrofisk differentiering under in vitro-kultur (figur 4).
Endokondral ossifikation af subkutant implanterede konstruktioner in vivo.
Subkutane lommer blev skabt på bagsiden af nøgne mus, og to til tre konstruktioner blev implanteret i hver lomme efter hypertrofisk differentiering (i uge 5 i in vitro-kultur). 4 eller 8 uger efter implantationen blev alle HA-konstruktioner fastgjort til hinanden i de implanterede lommer (tabel 1). I kollagenkonstruktionerne blev vedhæftning observeret i 60% af lommerne, mens transplantaterne i de resterende lommer var uafhængige af hinanden. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning afslørede, at der i begge konstruktioner 8 uger efter implantation blev dannet osteoidvæv med lamellær morfologi i de ydre områder af konstruktionerne (figur 5Aa,f). sGAG-farvning forsvandt i HA-konstruktionerne, hvilket indikerer tabet af deres bruskfænotype (figur 5Ah). I begge konstruktioner blev der dannet en knoglemarvskomponent indeholdende hæmatopoietiske celler og fedtvæv mellem det indre brusk og det ydre osteoidvæv. I alle HA-konstruktioner var knoglevævene i de smeltede konstruktioner forbundet og omgivet af ledfibrøst væv og knoglemarv udviklet langs rummet mellem de to vedhængende konstruktioner, hvilket indikerer, at flere HA-konstruktioner har tendens til at danne integreret knoglevæv (figur 5Ag). De klæbende kollagenkonstruktioner blev ligeledes integreret i to af de tre sammensmeltede tilfælde, men i det tredje tilfælde var knoglevævet i de to konstruktioner ikke forbundet (tabel 1 og figur 5Ab). I begge konstruktioner blev kar identificeret ved CD31-positive endotelceller42 observeret i knoglemarven (figur 5Ad,i), og de indre bruskområder var omgivet af TRAP-positive flernukleerede celler af osteoklastafstamningen, hvilket indikerer, at bruskvæv var genstand for ombygning (figur 5Ae,j).
Mineral blev deponeret i det ydre osteoidområde i både HA- og kollagenkonstruktioner (figur 5B). Mens den samlede mineraltæthed af den nye knogle var ens mellem HA- og kollagenkonstruktioner, var mineralvolumenet signifikant højere i HA-konstruktionerne end i kollagenkonstruktionerne, hvilket kan afspejle det faktum, at HA-hydrogeler ikke krympede under in vitro-dyrkning , hvilket resulterede i større konstruktioner end kollagenhydrogeler (figur 5C, D).
Figur 1: Eksperimentelt design. Det første trin i denne protokol er at indkapsle ekspanderede MSC'er i HA-hydrogeler for at fremme kondrogen og hypertrofisk differentiering in vitro. Konstruktioner dyrkes under kondrogene differentieringsbetingelser i 3 uger efterfulgt af yderligere 2 uger under hypertrofiske differentieringsbetingelser. Det andet trin i denne protokol er subkutant at implantere konstruktionerne i nøgne mus i uge 5 i in vitro-kultur for at gennemgå endokondral ossifikation in vivo i 8 uger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fremstilling af MSC-seedede hydrogeler. Drop modificeret HA/crosslinker-opløsning indeholdende MSC'er på en paraffinbelagt plade med 24 brønde, og lad den størkne ved 37 °C i 30 minutter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Histologisk og immunhistokemisk analyse af HA- og kollagenkonstruktioner efter in vitro-dyrkning 22. (A) Konstruktioner ved 3 ugers (3W) in vitro-dyrkning blev farvet for sGAG (safranin O/fast green), type II kollagen (Col II) og type X kollagen (Col X). B) Cellernes gennemsnitlige cirkularitetsværdier ved 3 ugers in vitro-dyrkning (n = 5). Åbne og grå søjler angiver henholdsvis kollagen- og HA-konstruktioner. Grupper uden et fælles bogstav er statistisk forskellige (a versus b, p<0,01; b versus c, p<0,05). (C) Konstruktioner ved 5 ugers (5W) in vitro-dyrkning blev farvet for calcium (alizarinrødt). Alle billeder blev taget med samme forstørrelse (skalabjælke: 200 μm). En oversigt over lav forstørrelse af hele vævene vises i indsatserne (skalabjælke: 1 mm). Fejlbjælker repræsenterer gennemsnitlig ± standardafvigelse (SD). Den envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest blev brugt til at bestemme signifikante forskelle mellem grupper. Dette tal er ændret fra38. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Genekspressionsanalyse af HA- og kollagenkonstruktioner ved 3 og 5 ugers in vitro-dyrkning. (A) Chondrogene og hypertrofiske markører. B) Osteogene markører. Værdier præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) (n = 3). Udifferentierede MSC'er udtrykte høje niveauer af Col I og MMP-13 og lave niveauer af Sox-9 og Col X; de udtrykte ikke (#) ACAN, Col II, BSP og OCN. Fejlbjælker repræsenterer gennemsnitlig ± standardafvigelse (SD). Dette tal er ændret fra38. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Immunohistokemisk analyse og forkalkning af HA- og kollagenkonstruktioner efter implantation efter 8 uger. (A) Konstruktioner blev farvet for hæmatoxylin og Eosin (H&E, a, b, f og g), safranin O/Fast Green (c og h), endotelceller (Cluster of Differentiation 31, CD31) (d og i) og Tartratresistent syrephosphatase (TRAP, e og j). a og f) Oversigt over hele vævet (skalastang = 500 μm). H&E, safranin O, CD31: skalastang = 200 μm; TRAP: skalabjælke= 50 μm. Pile angiver CD31-positive endotelceller. Forkortelser: c = indre bruskvæv; o = ydre osteoidvæv. (B) MicroCT (μCT) billeddannelse af kollagen- og HA-konstruktioner (hoved- og indsatte billedskalabjælker = 2 mm). (C,D) Den totale mineraltæthed (C) og volumen (D) af HA- og kollagenkonstruktioner (n = 4). ** angiver betydelige forskelle p <0,01. Fire konstruktioner blev analyseret pr. Gruppe ved hjælp af μCT. Fejlbjælker repræsenterer middelværdien ± standardafvigelsen (SD). Elevens t-test blev brugt til at bestemme signifikante forskelle mellem grupper. Dette tal er ændret fra38. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Strategi for at lette ECOs ved hjælp af HA-baseret kunstig brusk. Skematisk diagram over ossifikation og knoglemarvsudvikling uden og med fragmentering (μ-pellets) af implanterede HA-konstruktioner. (A) HA-hydrogeler har en fremragende fusionstendens til at danne en integreret knogle med vaskularisering og marvudvikling mellem smeltede transplantater in vivo. Det resulterende implanterede væv forblev imidlertid overvejende i brusktilstand selv 8 uger efter implantation. (B) I betragtning af HA-konstruktioners tendens til at smelte sammen til at danne integreret knogle, kan forarbejdning af HA-konstruktioner til μ-pellets fremskynde ombygningshastigheden af transplanteret væv og fremme knogledannelse. Mikronisering af konstruktionerne øger overfladearealet, hvilket kan fremme resorptionen af bruskvæv og dannelsen af knoglevæv og kan også fremme angiogenese og knoglemarvsudvikling på grund af den øgede plads til værtscelleinfiltration. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Hydrogel | Eksperimenter | Levet op | Forenede | % forenet |
| Kollagen | 5 | 3 | 2 | 40 |
| HA | 5 | 5 | 5 | 100 |
Tabel 1: Foreningsgrad, når flere konstruktioner blev implanteret i en enkelt lomme. To eller tre konstruktioner blev subkutant implanteret i en enkelt lomme. Konstruktioner blev høstet 4- eller 8-ugers efter implantation og histologisk undersøgt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brug af passende stilladsmaterialer, der fremmer overgangen fra hypertrofisk brusk til knogle, er en lovende tilgang til at opskalere MSC-baserede konstruerede hypertrofiske brusktransplantater og behandle knogledefekter af klinisk signifikant størrelse. Her viser vi, at HA er et fremragende stilladsmateriale til at understøtte differentieringen af MSC-baseret hypertrofisk bruskvæv in vitro og til at fremme endokondral knogledannelse in vivo38. Desuden viste det sig in vivo, at HA-konstruktioner letter fusionen af flere konstruktioner implanteret i samme lomme for at danne en enkelt integreret knogle. Fordi interaktionen mellem MSC'er og stilladsmaterialer påvirker brusk og hypertrofisk kondrogenese betydeligt, er det vigtigt at vælge passende stilladsmateriale til ECO'er for at generere klinisk effektive vævsmanipulerede brusktransplantater. Celler indlejret i HA-hydrogeler udviser ensartet en afrundet morfologi, der er karakteristisk for chondrocytter fra centrum til periferien, hvilket indikerer, at hyaluronan giver et miljø, der fremmer ensartet bruskdannelse i hele hydrogelen21,30. I modsætning til HA interagerer kollagen med MSC'er via integrinbindingssekvenser (RGD'er); Imidlertid forhindrer vedholdenheden af denne interaktion MSC'er i yderligere at differentiere i den kondrogene vej43, hvilket kan forklare den ikke-typiske kondrocytcellemorfologi, der er fremtrædende i periferien af kollagenkonstruktioner.
Hvis flere transplantater forenes for at danne en enkelt knogle, kan denne ECO-medierede tilgang udvides til mere klinisk relevante knogledefekter. Når flere MSC-baserede og stilladsfrie hypertrofiske brusk blev anvendt på en enkelt knogledefekt, blev det rapporteret, at brusktransplantaterne var integreret med knogledefekten. Imidlertid integrerede tilstødende transplantater ikke med hinanden22. Den tilgang, der præsenteres her, kan tilbyde en mulig løsning til at overvinde denne begrænsning. Sammenlignet med kollagenkonstruktioner havde flere transplantater af HA-konstruktioner en større tendens til at smelte sammen til dannelse af en enkelt knogle. Desuden blev knoglemarv dannet mellem sammensmeltede HA-konstruktioner, hvilket kan være relateret til det faktum, at HA understøtter ensartet bruskdifferentiering i hele hydrogelen, fordi hypertrofisk brusk udskiller VEGF og giver et miljø for den hæmatopoietiske stamcelleniche i knoglemarvsudvikling 44.
Nøglen til et vellykket eksperiment ved hjælp af denne protokol er kvaliteten af MSC'er. Det anbefales på forhånd at bekræfte, at de MSC'er, der skal anvendes, har et tilstrækkeligt højt kondrogent differentieringspotentiale. For det andet bør størrelsen af hver konstruktion ikke være for stor. Efter vores erfaring er volumenet af en enkelt konstruktion begrænset til 10-15 μL. Større konstruktioner kan resultere i utilstrækkelig ilt- og næringsstofindtrængning i konstruktionerne, hvilket fører til nekrose og dårlig differentiering i midten af konstruktionerne. Derfor skal geltykkelsen reduceres for at forbedre ilt- og næringsstofindtrængning. For at reducere geltykkelsen kan det være nyttigt at skabe tynde geler på den porøse membran i Transwell-indsatser14,45. Alternativt, fordi HA-konstruktioner har tendens til at smelte sammen og danne integreret knogle, kan det være tilstrækkeligt at implantere mange mindre konstruktioner snarere end en enkelt stor konstruktion, som diskuteret nedenfor.
Begrænsninger i denne undersøgelse omfatter behovet for at fremskynde ombygningshastigheden af det implanterede væv for at lette knogledannelsen. Det implanterede manipulerede væv forblev primært i en hypertrofisk forkalket brusktilstand selv 8 uger efter implantation. Ved knogledannelse via ECO-vejen spiller værtsafledte celler en kritisk rolle i at fremme ECO16,46. Tilvejebringelse af yderligere kanaler i hypertrofiske brusktransplantater er blevet rapporteret at fremme vaskulær invasion og transplantatmineralisering in vivo20. Sådanne kanaler tjener som kanaler til infiltration af værtsceller, herunder osteoblaster, osteoklaster og hæmatopoietiske forstadier, til dannelse af nyt væv i konstruktionen. Alternativt er det blevet rapporteret, at flere små fibrinindkapslede pellets (μ-pellets) sammensat af kondrogene differentierede MSC'er kan implanteres til dannelse af integreret knogle47. Behandling af HA-konstruktioner til μ-pellets kan øge overfladearealet omgivet af TRAP-positive osteoklaster og dermed fremme ombygningshastigheden af bruskvæv og forbedre osteogenese (figur 6)21,48. Desuden ville implantation af μ-pellets øge værtscellernes infiltrationsrum og derved lette angiogenese og knoglemarvsudvikling og generere integreret knogledannelse med rigelig vaskularisering. I betragtning af HA-konstruktioners tendens til at smelte sammen og skabe integreret knogle kan denne μ-konstruerede knogleregenereringsstrategi fremskynde ECO-processen med hypertrofiske brusktransplantater ved hjælp af HA-hydrogeler.
Afslutningsvis er HA-hydrogeler effektive til opskalering af vævsmanipulerede transplantater med færre celler og geler end kollagenhydrogeler. Derudover har HA-hydrogeler fremragende fusionsfølsomhed og producerer integreret knogle med vaskularisering og marvudvikling mellem smeltede transplantater. Derfor kan modifikation af HA-konstruktioner for at fremme værtscelleinfiltration og transplantatremodellering føre til udvikling af implanterbare materialer, der yderligere kan fremme vaskularisering og knoglemarvsudvikling. Med yderligere optimering kan denne tilgang være et lovende alternativ til nuværende knogleterapier inden for maxillofacial og ortopædkirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et tilskud til videnskabelig forskning (KAKENHI) fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (bevilling nr. JP19K10259 og 22K10032 til MAI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
| Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
| Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
| basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
| bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
| Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
| dexamethasone | Merck | D8893 | |
| Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| Dormicum | Astellas Pharma | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
| Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
| Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
| HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
| IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
| ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
| L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
| L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
| L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
| MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
| paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
| PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
| TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
| Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
| Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
| β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |
References
- Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
- Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
- Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
- Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A.
- Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
- Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D.
- Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
- Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
- Kronenberg, H. M.
- Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
- Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
- Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
- Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
- Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
- Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
- van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
- Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
- Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
- Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
- Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
- Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
- Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
- Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
- Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
- Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
- Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton's jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
- Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
- Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
- Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
- La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
- Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O'Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
- Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
- Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
- Zarembinski, T., Skardal, A. Hydrogels - Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
- Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
- Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
- Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
- Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
- Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
- Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).
