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Biology

मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके विवो एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन के माध्यम से एकीकृत हड्डी का गठन

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65573
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,3
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Summary

मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से उत्पादित कृत्रिम उपास्थि ऊतक को प्रत्यारोपित करके एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन के माध्यम से अस्थि चिकित्सा में पारंपरिक उपचारों की कमियों को दरकिनार करने की क्षमता है। हाइलूरोनिक एसिड हाइड्रोजेल समान रूप से विभेदित कार्टिलेज ग्राफ्ट को बढ़ाने के साथ-साथ विवो में फ्यूज्ड ग्राफ्ट के बीच वैस्कुलराइजेशन के साथ एकीकृत हड्डी बनाने में प्रभावी हैं।

Abstract

मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) का उपयोग करके पारंपरिक हड्डी पुनर्जनन चिकित्सा महत्वपूर्ण आकार से बड़े हड्डी दोषों पर लागू करना मुश्किल है क्योंकि इसमें एंजियोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए एक तंत्र नहीं है। एमएससी से निर्मित कृत्रिम उपास्थि ऊतक को प्रत्यारोपित करना एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन (ईसीओ) के माध्यम से विवो में एंजियोजेनेसिस और हड्डी के गठन को प्रेरित करता है। इसलिए, यह ईसीओ-मध्यस्थता दृष्टिकोण भविष्य में एक आशाजनक हड्डी पुनर्जनन चिकित्सा हो सकती है। इस ईसीओ-मध्यस्थता दृष्टिकोण के नैदानिक अनुप्रयोग का एक महत्वपूर्ण पहलू हड्डी दोष की मरम्मत के लिए प्रत्यारोपित किए जाने वाले पर्याप्त उपास्थि तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित कर रहा है। यह विशेष रूप से एक आकार के ग्राफ्टेड उपास्थि के एकल द्रव्यमान को डिजाइन करने के लिए व्यावहारिक नहीं है जो वास्तविक हड्डी दोष के आकार के अनुरूप है। इसलिए, प्रत्यारोपित किए जाने वाले उपास्थि में हड्डी को अभिन्न रूप से बनाने का गुण होना चाहिए जब कई टुकड़े प्रत्यारोपित किए जाते हैं। हाइड्रोजेल नैदानिक आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन के लिए ऊतक-इंजीनियर ग्राफ्ट को बढ़ाने के लिए एक आकर्षक उपकरण हो सकता है। हालांकि कई स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न हाइड्रोगेल विट्रो में एमएससी उपास्थि गठन और विवो में ईसीओ का समर्थन करते हैं, नैदानिक अनुप्रयोगों की जरूरतों को पूरा करने के लिए इष्टतम मचान सामग्री अभी तक निर्धारित नहीं की गई है। हाइलूरोनिक एसिड (एचए) उपास्थि बाह्य मैट्रिक्स का एक महत्वपूर्ण घटक है और एक बायोडिग्रेडेबल और बायोकंपैटिबल पॉलीसेकेराइड है। यहां, हम दिखाते हैं कि एचए हाइड्रोगेल में एमएससी-आधारित उपास्थि ऊतक के इन विट्रो भेदभाव का समर्थन करने और विवो में एंडोकॉन्ड्रल हड्डी के गठन को बढ़ावा देने के लिए उत्कृष्ट गुण हैं।

Introduction

आघात, जन्मजात दोषों और शल्य चिकित्सा शोधन के कारण हड्डी के दोषों की मरम्मत के लिए ऑटोलॉगस हड्डी अभी भी स्वर्ण मानक है। हालांकि, ऑटोजेनस हड्डी ग्राफ्टिंग में महत्वपूर्ण सीमाएं हैं, जिनमें दाता दर्द, संक्रमण का जोखिम और सीमित हड्डी की मात्रा शामिल है जिसे रोगियों से अलग किया जा सकता है 1,2,3,4. कई बायोमैटेरियल्स को हड्डी के विकल्प के रूप में विकसित किया गया है, जो कैल्शियम फॉस्फेट या हाइड्रॉक्सीपैटाइट 5,6 जैसे खनिज सामग्री के साथ प्राकृतिक या सिंथेटिक पॉलिमर का संयोजन करते हैं। इन इंजीनियर सामग्रियों में हड्डी का गठन आमतौर पर एक प्राइमिंग सामग्री के रूप में खनिज सामग्री का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है ताकि स्टेम कोशिकाओं को इंट्रामेम्ब्रेन ओसिफिकेशन (आईएमओ) प्रक्रिया7 के माध्यम से सीधे ओस्टियोब्लास्ट में अंतर करने की अनुमति मिल सके। इस प्रक्रिया में एंजियोजेनिक चरण का अभाव होता है, जिसके परिणामस्वरूप आरोपण 8,9,10 के बाद ग्राफ्ट के विवो वैस्कुलराइजेशन में अपर्याप्त होता है, और इसलिए, इस तरह की प्रक्रिया का उपयोग करने वाले दृष्टिकोण बड़े हड्डी दोषों के इलाज के लिए इष्टतम नहीं होसकते हैं।

एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन (ईसीओ) प्रक्रिया को पुन: उत्पन्न करने के लिए लागू रणनीतियों, विकास के दौरान स्केलेटोजेनेसिस में एक सहज तंत्र, पारंपरिक आईएमओ-आधारित दृष्टिकोणों से जुड़ी महत्वपूर्ण समस्याओं को दूर करने के लिए दिखाया गया है। ईसीओ में, उपास्थि टेम्पलेट में चोंड्रोसाइट्स संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) जारी करते हैं, जो संवहनी घुसपैठ और हड्डी12 में उपास्थि टेम्पलेट के रीमॉडेलिंग को बढ़ावा देता है। कार्टिलेज रीमॉडेलिंग और एंजियोजेनेसिस के माध्यम से ओस्टियोजेनेसिस के लिए ईसीओ-मध्यस्थता दृष्टिकोण, जो फ्रैक्चर की मरम्मत के दौरान भी सक्रिय होता है, एक प्राइमिंग सामग्री के रूप में एमएससी से प्राप्त कृत्रिम रूप से बनाए गए उपास्थि ऊतक का उपयोग करता है। चोंड्रोसाइट्स हड्डी के दोषों में हाइपोक्सिया को सहन कर सकते हैं, एंजियोजेनेसिस को प्रेरित कर सकते हैं, और एक संवहनी-मुक्त उपास्थि ग्राफ्ट को एंजियोजेनिक ऊतक में परिवर्तित कर सकते हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि एमएससी-आधारित कार्टिलेज ग्राफ्ट इस तरह के ईसीओ कार्यक्रम 13,14,15,16,17,18,19,20,21 को लागू करके विवो में हड्डी उत्पन्न करते हैं।

इस ईसीओ-मध्यस्थता दृष्टिकोण के नैदानिक अनुप्रयोग के लिए एक आवश्यक आवश्यकता यह है कि नैदानिक सेटिंग में कार्टिलेज ग्राफ्ट की वांछित मात्रा कैसे तैयार की जाए। वास्तविक हड्डी दोष को फिट करने वाले आकार के नैदानिक उपास्थि तैयार करना व्यावहारिक नहीं है। इसलिए, ग्राफ्ट कार्टिलेज को हड्डी का अभिन्न रूप से निर्माण करना चाहिए जब कईटुकड़े प्रत्यारोपित किए जाते हैं। हाइड्रोगेल एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन के लिए ऊतक-इंजीनियर ग्राफ्ट को बढ़ाने के लिए एक आकर्षक उपकरण हो सकता है। कई स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न हाइड्रोगेल विवो 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 में विट्रो और ईसीओ में एमएससी उपास्थि गठन का समर्थन करते हैं; हालांकि, नैदानिक अनुप्रयोग आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए इष्टतम समर्थन सामग्री अनिर्धारित रही है। हाइलूरोनिक एसिड (एचए) एक बायोडिग्रेडेबल और बायोकंपैटिबल पॉलीसेकेराइड है जो कार्टिलेज33 के बाह्य मैट्रिक्स में मौजूद है। एचए चोंड्रोजेनिक भेदभाव 25,26,28,30,31,32,34 का समर्थन करने के लिए सीडी 44 जैसे सतह रिसेप्टर्स के माध्यम से एमएससी के साथ बातचीत करता है। इसके अलावा, एचए स्काफोल्ड्स मानव दंत लुगदी स्टेम कोशिकाओं35 के आईएमओ-मध्यस्थता वाले ओस्टोजेनिक भेदभाव को बढ़ावा देते हैं, और कोलेजन के साथ संयुक्त मचान ईसीओ-मध्यस्थता ओस्टियोजेनेसिस36,37 को बढ़ावा देते हैं।

यहां, हम अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न वयस्क मानव एमएससी का उपयोग करके एचए हाइड्रोगेल तैयार करने और विट्रो में हाइपरट्रॉफिक चोंड्रोजेनेसिस के लिए उनके उपयोग और विवो38 में बाद में एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। हमने कोलेजन के साथ एचए की विशेषताओं की तुलना की, एमएससी के साथ हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग में व्यापक रूप से लागू एक सामग्री और एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन17 के लिए कृत्रिम ग्राफ्ट को स्केल करने के लिए एक उपयोगी सामग्री। एक इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्ड माउस मॉडल में, मानव एमएससी के साथ बीजित एचए और कोलेजन संरचनाओं का मूल्यांकन चमड़े के नीचे के आरोपण द्वारा विवो ईसीओ क्षमता में किया गया था। परिणाम बताते हैं कि एचए हाइड्रोगेल कृत्रिम उपास्थि ग्राफ्ट बनाने के लिए एमएससी के लिए एक मचान के रूप में उत्कृष्ट हैं जो ईसीओ के माध्यम से हड्डी के गठन की अनुमति देते हैं।

प्रोटोकॉल को दो चरणों में विभाजित किया गया है। सबसे पहले, हाइलूरोनन हाइड्रोगेल पर बीजित मानव एमएससी के निर्माण तैयार किए जाते हैं और विट्रो में हाइपरट्रॉफिक उपास्थि में विभेदित होते हैं। इसके बाद, विवो में एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन को प्रेरित करने के लिए एक नग्न मॉडल में विभेदित संरचनाओं को चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया जाता है (चित्रा 1)।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल 4 सप्ताह के पुरुष नग्न चूहों का उपयोग करता है। 22-24 डिग्री सेल्सियस और 50% -70% सापेक्ष आर्द्रता पर 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र के तहत एक पिंजरे में चार चूहों को रखें। सभी पशु प्रयोग टोक्यो मेडिकल एंड डेंटल यूनिवर्सिटी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (अनुमोदन आईडी: ए 2019-204 सी, ए 2020-116 ए, और ए 2021-121 ए) द्वारा अनुमोदित दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए थे।

1. बफर और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. एमएससी बेसल मीडिया में एमएससी विकास माध्यम की पूरक किट जोड़कर मेसेनकाइमल स्टेम सेल विकास माध्यम (एमएससी विकास माध्यम) तैयार करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. डलबेकको के संशोधित ईगल मीडियम और हैम के एफ 12 (डीएमईएम / एफ -12) माध्यम को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 50 μg / mL जेंटामाइसिन, 200 μM L-alanyl-L-ग्लूटामाइन, और 1 ng / mL मूल फाइब्रोब्लास्टिक विकास कारक को माध्यम में जोड़कर तैयार करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. उपयोग से ठीक पहले डीएमईएम में 1% आईटीएस-जी पूरक, 0.12% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, 50 μg / mL जेंटामाइसिन, 0.35 mM L-प्रोलाइन, 100 nM डेक्सामेथासोन, और 10 ng / mL TGF-3 जोड़कर चोंड्रोजेनिक माध्यम तैयार करें।
  4. उपयोग से ठीक पहले डीएमईएम में 10 एमएम β-ग्लिसरोफॉस्फेट, 0.12% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, 10 एनएम डेक्सामेथासोन, 200 μM एस्कॉर्बेट -2-फॉस्फेट, 50 एनएम एल-थायरोक्सिन, 50 μg / mL जेंटामाइसिन और 50 pg / mL IL-1 को जोड़कर हाइपरट्रॉफिक माध्यम तैयार करें।
  5. 200 μL पिघला हुआ पैराफिन के साथ एक 24-वेल कल्चर डिश कोट करें जिसे 60 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गर्म किया जाता है। पैराफिन सेट होने तक कमरे के तापमान पर खड़े रहने की अनुमति दें।

2. मानव एमएससी का विस्तार

नोट: प्रयोगों को शुरू करने से पहले, एमएससी चोंड्रोजेनेसिस के लिए उच्च क्षमता वाले एमएससी को माइक्रो मास कल्चर में चुना जाना चाहिए जैसा कि17 में वर्णित है।

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, कल्चर प्राथमिक मानव अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एमएससी (मार्ग 2) 10 सेमी डिश में एमएससी विकास माध्यम के साथ 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्रीसेल्सियस पर 5% सीओ2 और 95% ह्यूमिडिफायर एयर इनक्यूबेटर।
  2. हर 2-3 दिनों में माध्यम बदलें। एक बार जब कोशिकाएं 80% -90% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो वैक्यूम पंप का उपयोग करके सेल कल्चर डिश से माध्यम को अलग करें, 5 एमएल पीबीएस से धोएं, और फिर वैक्यूम पंप के साथ घोल को एस्पिरेट करें।
  3. डिश में 0.05% ट्रिप्सिन / 0.02% ईडीटीए समाधान का 1 एमएल जोड़ें। पकवान को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को रोकने के लिए एमएससी विकास माध्यम के 1 एमएल जोड़ें। सेल सस्पेंशन को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. 50 एमएल ट्यूब में अन्य व्यंजनों से सेल निलंबन को मिलाएं और इसे बर्फ पर रखें।
  6. सेल सस्पेंशन के 10 μL को 0.4% ट्राइपैन ब्लू स्टेन के 10 μL के साथ मिलाकर कोशिकाओं को गिनने के लिए सेल काउंटर का उपयोग करें।
  7. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 220 x g पर शेष सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 1.0 x 106 कोशिकाओं प्रति एमएल की एकाग्रता पर क्रायोप्रिजर्वेशन समाधान जोड़ें।
  8. प्रत्येक क्रायोट्यूब में सेल निलंबन के 1 एमएल वितरित करें और तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करने से पहले 12 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। परिणामी जमे हुए स्टॉक (मार्ग 3) का उपयोग इस प्रोटोकॉल के लिए किया जाता है।
  9. प्रयोगों के लिए, स्टॉक किए गए एमएससी को 5 x 103 कोशिकाओं / सेमी2 के घनत्व पर 10 सेमी डिश में बीज दें। एफ -12 माध्यम में 80% -90% कंफ्लुएंट (मार्ग 4) तक कल्चर सेल।

3. एमएससी-एनकैप्सुलेटेड हाइड्रोगेल की तैयारी

  1. कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें और चरण 2.3 - 2.6 में वर्णित सेल निलंबन तैयार करें।
  2. 10 संरचनाओं (2.5 x 10 5 कोशिकाओं प्रति निर्माण) बनाने के लिए, 2.5 x 106 कोशिकाओं वाले सेल निलंबन को1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में विभाजित करें।
  3. 3 मिनट के लिए 220 x g पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, वैक्यूम पंप के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और इसे बर्फ पर रखें।
  4. थिओल-संशोधित हाइलूरोनिक एसिड (एचए), थिओल-रिएक्टिव क्रॉसलिंकर, पॉलीथीन ग्लाइकॉल डायक्रिलेट, और डिगैस्ड पानी की बोतलों को कमरे के तापमान पर लाएं।
  5. बाँझ परिस्थितियों में, सुई के साथ सिरिंज का उपयोग करके एचए युक्त बोतल (निर्माता के निर्देश देखें) में 1.0 मिलीलीटर डिगैस्ड पानी जोड़ें।
  6. भंवर कभी-कभी 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म होता है जब तक कि समाधान स्पष्ट नहीं हो जाता, फिर बर्फ पर रखें। ठोस पदार्थों को पूरी तरह से घुलने में 30 मिनट से भी कम समय लगता है।
  7. बाँझ परिस्थितियों में, सुई के साथ सिरिंज का उपयोग करके क्रॉसलिंकर बोतल में 0.5 एमएल डिगैस्ड पानी जोड़ें। कई बार उलटकर घुल ें, फिर बर्फ पर रखें।
  8. एलिकोट सेल पेलेट (2.5 x 106 कोशिकाओं) में घुलित एचए समाधान के 120 μL जोड़ें। आगे और पीछे पाइप करके सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  9. एचए और कोशिकाओं (चरण 3.8) वाली ट्यूब में घुलित क्रॉसलिंकर समाधान के 30 μL जोड़ें और ट्यूब को टैप करके मिलाएं, और फिर संक्षेप में स्पिन करें। एचए समाधान और क्रॉसलिंकर समाधान को 4: 1 अनुपात में मिलाएं।
  10. पैराफिन-लेपित 24-वेल प्लेट पर एमएससी (2.5 x 105 कोशिकाओं) वाले संयुक्त घोल के 15 μL गिराएं और इसे 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर जमने दें (चित्रा 2)। उच्च चिपचिपाहट के कारण, आवश्यकता से कम से कम 10% अतिरिक्त मात्रा में सेल / हाइड्रोगेल मिश्रण तैयार करें।
    नोट: हाइड्रोजेल की विशेषताओं को पहले39 वर्णित किया गया है।

4. इन विट्रो भेदभाव की स्थिति

  1. एमएससी-बीज वाले एचए हाइड्रोगेल के निर्माण में 0.5 एमएल चोंड्रोजेनिक भेदभाव माध्यम जोड़ें। हर 2-3 दिनों में माध्यम बदलें।
  2. 3 सप्ताह के बाद, हाइपरट्रॉफिक भेदभाव माध्यम (0.5 एमएल प्रति कुएं) पर स्विच करें और अतिरिक्त 2 सप्ताह के लिए निर्माण को कल्चर करें।

5. एमएससी के विवो आरोपण में

  1. इन विट्रो कल्चर के कुल 5 सप्ताह के बाद, संरचनाओं को नग्न चूहों के पीछे चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित करें जैसा कि पहलेवर्णित 38,40 था।
  2. चूहों का वजन करें और 0.75 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन (बीडब्ल्यू) मेडेटोमिडाइन, 4.0 मिलीग्राम / किग्रा बीडब्ल्यू मिडाज़ोलम, और 5.0 मिलीग्राम / किग्रा बीडब्ल्यू ब्यूट्रोफानॉल के साथ तैयार एक संयोजन एनेस्थेटिक को इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा प्रशासित करें जैसा किवर्णित है।
  3. सर्जिकल उत्तेजनाओं के लिए गतिहीनता द्वारा पर्याप्त संज्ञाहरण की पुष्टि करें और ऑपरेशन के दौरान समय-समय पर गुलाबी श्लेष्म के रंग से धीमी, नियमित छाती की गति और उचित ऑक्सीजन की आपूर्ति द्वारा श्वसन गहराई की निगरानी करें। संज्ञाहरण के दौरान सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सा मरहम का उपयोग करें।
  4. माउस को एक प्रवण स्थिति में एक बाँझ सर्जिकल ड्रेप पर रखें, चीरा साइट को 50 पीपीएम हाइपोक्लोरस एसिड पानी (पीएच 5.0) के साथ निष्फल करें। एचएडब्ल्यू), और माउस के ऊपर एक छिद्रित सर्जिकल ड्रेप रखें।
    नोट: एक आटोक्लेव, एथिलीन ऑक्साइड गैस, या एचएडब्ल्यू में सभी सर्जिकल सामग्रियों को निष्फल करें। सर्जनों को अपनी उंगलियों को धोना चाहिए और सर्जिकल गाउन और दस्ताने पहनना चाहिए।
  5. कैंची का उपयोग करके रीढ़ की केंद्र रेखा के साथ कंधे और कूल्हे के क्षेत्रों में 2 सेमी की दूरी पर दो 5 मिमी लंबे त्वचा चीरे लगाएं।
  6. चमड़े के नीचे की जेब बनाने के लिए चीरे के माध्यम से एक स्पैटुला डालें।
  7. बल के साथ प्रत्येक जेब में दो से तीन संरचनाओं (~ 15 μL प्रत्येक, चरण 5.1) डालें। एक ही जेब में प्रत्यारोपित एचए संरचनाएं बहुत बार संलयन के लिए प्रवण होती हैं। संलयन को रोकने के लिए, प्रत्येक जेब में एक एचए निर्माण डालें।
  8. चीरों को 4-0 चोटी वाले रेशम के सीवन से बंद करें। 38 के अनुसार 0.75 मिलीग्राम / किग्रा बीडब्ल्यू एटिपामेज़ोल के साथ तैयार एनेस्थेटिक्स के लिए एक विरोधी के साथ माउस इंजेक्ट करें।
  9. जबकि चूहे संज्ञाहरण से ठीक हो जाते हैं, चूहों को भोजन और पानी की बोतलों के बिना बाँझ फर्श बिस्तर वाले बाँझ वसूली पिंजरों में रखें और लगातार शरीर के तापमान, नाड़ी और श्वसन की निगरानी करें।
  10. चूहों को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वह उरोस्थि की पुनरावृत्ति को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले। पूरी तरह से ठीक होने के बाद, जानवरों को अन्य जानवरों के साथ प्रजनन कक्ष में वापस कर दें।
  11. किसी भी संभावित जटिलताओं के लिए उपचार अवधि के दौरान हर कुछ दिनों में जानवरों की निगरानी करें। प्रत्यारोपण के बाद 4- और 8 सप्ताह में थोड़ी पीड़ा के साथ कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु करें।
  12. ग्राफ्टेड साइटों पर त्वचा को इंजेक्ट करें और प्रत्यारोपित संरचनाओं को बल के साथ हटा दें। 16 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में संरचनाओं को ठीक करें और फिर उन्हें विश्लेषण के अधीन करें।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. मानक विचलन (एसडी) ± औसत के रूप में मात्रात्मक डेटा की रिपोर्ट करें। वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
  2. समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करने के लिए छात्र के टी-टेस्ट या वन-वे एनोवा का उपयोग करें, जिसके बाद टुकी के कई तुलना परीक्षण किए जाएं। p<0.05 और p<0.01 दो समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करते हैं।

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Representative Results

एमएससी-एनकैप्सुलेटेड एचए हाइड्रोगेल को चोंड्रोजेनिक माध्यम में संवर्धित किया गया था, जो टीजीएफ 3 के साथ पूरक था, जो चोंड्रोजेनेसिस41 (चरण 4.1) का एक प्रेरक था। हमने कोलेजन के साथ एचए के गुणों की तुलना की, जिसे एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन के लिए एमएससी-आधारित कृत्रिम उपास्थि ग्राफ्ट बनाने में प्रभावी दिखाया गया है, जैसा कि पहलेवर्णित है। इस अध्ययन में अविभाजित एमएससी को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल नहीं किया गया था क्योंकि यह प्रदर्शित किया गया है कि उदासीन एमएससी को ओस्टोजेनिक भेदभाव (यानी, इंट्रामेम्ब्रेन ओसिफिकेशन) द्वारा हड्डी उत्पन्न करने के लिए एक प्राइमिंग सब्सट्रेट के रूप में खनिज सतहों की आवश्यकता होती है।

हाइलूरोनान हाइड्रोगेल का आकार इन विट्रो कल्चर अवधि के दौरान नहीं बदला, जैसा कि उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत मापा गया व्यास के आधार पर आंका गया था, जबकि तुलना के लिए उपयोग किए जाने वाले कोलेजन हाइड्रोगेल संस्कृति शुरू होने के तुरंत बाद सिकुड़ने लगे। इन विट्रो कल्चर के बाद एचए और कोलेजन संरचनाओं के बीच आकार के अंतर को कम करने के लिए, एमएससी की संख्या और एचए हाइड्रोगेल बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले जेल की मात्रा कोलेजन हाइड्रोगेल के लिए उपयोग किए जाने वाले लोगों की तुलना में आधी हो गई थी। हालांकि, उपास्थि संस्कृति के 3 सप्ताह के बाद एचए संरचनाओं का गीला वजन कोलेजन संरचनाओं की तुलना में 4 गुना भारी था।

विट्रो में चोंड्रोजेनिक और हाइपरट्रॉफिक भेदभाव।
चोंड्रोजेनिक भेदभाव ( इन विट्रो कल्चर के सप्ताह 3 पर) के बाद, सल्फेटेड ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स (एसजीएजी) -पॉजिटिव (सैफरानिन ओ / फास्ट ग्रीन स्टेनिंग; चित्र 3ए)। और टाइप II कोलेजन-पॉजिटिव बाह्य मैट्रिक्स दोनों संरचनाओं में देखा गया था, यह दर्शाता है कि एचए और कोलेजन हाइड्रोगेल दोनों ने चोंड्रोजेनेसिस का समर्थन किया। हालांकि, कोलेजन निर्माण की तुलना में, एचए संरचनाओं में पूरे ऊतक में एसजीएजी, टाइप II कोलेजन (कोल II), और टाइप एक्स कोलेजन (कोल एक्स) का वितरण अधिक सजातीय था। सेल आकृति विज्ञान में दो संरचनाओं के बीच अंतर भी स्पष्ट थे: एक चोंड्रोसाइट्स जैसी गोल आकृति विज्ञान वाली कोशिकाओं को एचए संरचनाओं में पूरे ऊतक में वितरित किया गया था। कोलेजन संरचनाओं में, हालांकि, परिधि में कोशिकाओं ने एक विषम आकृति विज्ञान दिखाया, जो अनियमित / विस्तारित से लेकर गोल आकृति विज्ञान तक था। इसके अनुरूप, एचए संरचनाओं में कोशिकाओं की औसत गोलाई कोलेजन संरचनाओं की तुलना में अधिक थी, दोनों परिधि और केंद्रीय क्षेत्रों में (34% बनाम 77.6% (पी < 0.01) और 78.3% बनाम 100% (पी < 0.05), क्रमशः; चित्रा 3 बी)। संस्कृति के 5 सप्ताह में, दोनों संरचनाओं में बाहरी किनारों पर कैल्शियम के जमाव का पता चला (एलिज़रीन लाल; चित्रा 3 सी)। इसके अलावा, मात्रात्मक वास्तविक समय आरटी-पीसीआर द्वारा चोंड्रोजेनिक (एसओएक्स -9, एग्ग्रेकन (एसीएएन), कोल द्वितीय), हाइपरट्रॉफिक (कोल एक्स, मैट्रिक्स मेटालोपेप्टिडेस 13 (एमएमपी -13)), और ओस्टोजेनिक (टाइप 1 कोलेजन (कोल आई), बोन सियालोप्रोटीन (बीएसपी), ओस्टियोकैल्सिन (ओसीएन)) मार्कर14 की अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था, जो इन विट्रो कल्चर के दौरान चोंड्रोजेनिक और हाइपरट्रॉफिक भेदभाव की प्रगति की पुष्टि करता है (चित्रा 4)।

विवो में चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित संरचनाओं का एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन।
नग्न चूहों की पीठ पर चमड़े के नीचे की जेब बनाई गई थी, और हाइपरट्रॉफिक भेदभाव (इन विट्रो कल्चर के सप्ताह 5 पर) के बाद प्रत्येक जेब में दो से तीन संरचनाओं को प्रत्यारोपित किया गया था। प्रत्यारोपण के 4 या 8 सप्ताह बाद, सभी एचए संरचनाएं प्रत्यारोपित जेब में एक दूसरे से जुड़ी हुई थीं (तालिका 1)। कोलेजन संरचनाओं में, 60% जेबों में आसंजन देखा गया था, जबकि शेष जेबों में, ग्राफ्ट एक दूसरे से स्वतंत्र थे। हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला होने से पता चला कि प्रत्यारोपण के 8 सप्ताह बाद दोनों संरचनाओं में, संरचनाओं के बाहरी क्षेत्रों में लैमेलर आकृति विज्ञान के साथ ऑस्टियोइड ऊतक का गठन किया गया था (चित्रा 5एए, एफ)। एचए संरचनाओं में एसजीएजी धुंधला गायब हो गया, जो उनके उपास्थि फेनोटाइप (चित्रा 5 एएच) के नुकसान का संकेत देता है। दोनों संरचनाओं में, एक अस्थि मज्जा घटक जिसमें हेमटोपोइएटिक कोशिकाएं और वसा ऊतक होते हैं, आंतरिक उपास्थि और बाहरी ऑस्टियोइड ऊतकों के बीच बनते हैं। सभी एचए संरचनाओं में, फ्यूज्ड संरचनाओं के हड्डी के ऊतकों को जोड़ा गया था और दो अनुयायी संरचनाओं के बीच की जगह के साथ विकसित संयुक्त रेशेदार ऊतक और अस्थि मज्जा से घिरा हुआ था, यह दर्शाता है कि कई एचए निर्माण एकीकृत हड्डी ऊतक (चित्रा 5एजी) बनाते हैं। पालन किए गए कोलेजन संरचनाओं को तीन फ्यूज्ड मामलों में से दो में समान रूप से एकीकृत किया गया था, लेकिन तीसरे मामले में, दो संरचनाओं के हड्डी के ऊतक जुड़े नहीं थे (तालिका 1 और चित्रा 5 एबी)। दोनों संरचनाओं में, सीडी 31-पॉजिटिव एंडोथेलियल कोशिकाओं42 द्वारा पहचाने गए वाहिकाओं को अस्थि मज्जा (आंकड़े 5एडी, आई) में देखा गया था, और आंतरिक उपास्थि क्षेत्र ओस्टियोक्लास्ट वंश के ट्रैप-पॉजिटिव मल्टीन्यूक्लियेटेड कोशिकाओं से घिरे हुए थे, यह दर्शाता है कि उपास्थि ऊतक रीमॉडेलिंग के अधीन था (आंकड़े 5एई, जे)।

खनिज को एचए और कोलेजन निर्माण (चित्रा 5 बी) दोनों में बाहरी ऑस्टियोइड क्षेत्र में जमा किया गया था। जबकि नई हड्डी का कुल खनिज घनत्व एचए और कोलेजन संरचनाओं के बीच समान था, कोलेजन संरचनाओं की तुलना में एचए संरचनाओं में खनिज की मात्रा काफी अधिक थी, जो इस तथ्य को प्रतिबिंबित कर सकती है कि एचए हाइड्रोगेल इन विट्रो कल्चर के दौरान सिकुड़ नहीं गए, जिसके परिणामस्वरूप कोलेजन हाइड्रोगेल की तुलना में बड़े निर्माण हुए (चित्रा 5 सी, डी)।

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक डिजाइन। इस प्रोटोकॉल का पहला कदम विट्रो में चोंड्रोजेनिक और हाइपरट्रॉफिक भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए एचए हाइड्रोगेल में विस्तारित एमएससी को समाहित करना है। संरचनाओं को 3 सप्ताह के लिए चोंड्रोजेनिक भेदभाव स्थितियों में सुसंस्कृत किया जाता है, इसके बाद हाइपरट्रॉफिक भेदभाव स्थितियों में अतिरिक्त 2 सप्ताह होते हैं। इस प्रोटोकॉल का दूसरा चरण 8 सप्ताह के लिए विवो में एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन से गुजरने के लिए इन विट्रो कल्चर के सप्ताह 5 में नग्न चूहों में संरचनाओं को चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित करना है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एमएससी-बीज हाइड्रोगेल की तैयारी। क्रॉसलिंकर समाधान जिसमें एमएससी होते हैं, को पैराफिन-लेपित 24-वेल प्लेट पर गिराएं और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर जमने दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: इन विट्रो कल्चर22 के बाद एचए और कोलेजन संरचनाओं का हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण। (ए) इन विट्रो कल्चर के 3 सप्ताह (3 डब्ल्यू) में निर्माण एसजीएजी (सफ्रानिन ओ / फास्ट ग्रीन), टाइप II कोलेजन (कोल II), और टाइप एक्स कोलेजन (कोल एक्स) के लिए दाग दिया गया था। (बी) इन विट्रो कल्चर (एन = 5) के 3 सप्ताह में कोशिकाओं के औसत परिपत्र मूल्य। खुली और ग्रे सलाखों क्रमशः कोलेजन और एचए संरचनाओं का संकेत देती हैं। एक सामान्य अक्षर के बिना समूह सांख्यिकीय रूप से भिन्न होते हैं (ए बनाम बी, पी < 0.01; बी बनाम सी, पी < 0.05)। (सी) इन विट्रो कल्चर के 5 सप्ताह (5 डब्ल्यू) में निर्माण कैल्शियम (एलिज़रीन लाल) के लिए दागदार थे। सभी चित्रों को एक ही आवर्धन (स्केल बार: 200 μm) के साथ कैप्चर किया गया था। पूरे ऊतकों का एक कम-आवर्धन अवलोकन इनसेट (स्केल बार: 1 मिमी) में दिखाया गया है। त्रुटि पट्टियाँ माध्य ± मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं. समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करने के लिए टुकी के कई तुलना परीक्षण के बाद एक-तरफा एनोवा का उपयोग किया गया था। इस आंकड़े को38 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: इन विट्रो कल्चर के 3 और 5 सप्ताह में एचए और कोलेजन संरचनाओं का जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण । (ए) चोंड्रोजेनिक और हाइपरट्रॉफिक मार्कर। (बी) ओस्टोजेनिक मार्कर। मानों को मानक विचलन (एसडी) (एन = 3) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। उदासीन एमएससी ने कोल आई और एमएमपी -13 के उच्च स्तर और एसओएक्स -9 और कोल एक्स के निम्न स्तर व्यक्त किए; उन्होंने (#) एसीएएन, कर्नल द्वितीय, बीएसपी और ओसीएन को व्यक्त नहीं किया। त्रुटि पट्टियाँ माध्य ± मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं. इस आंकड़े को38 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण और एचए और कोलेजन का कैल्सीफिकेशन 8 सप्ताह में प्रत्यारोपण के बाद बनता है। (ए) संरचनाओं को हेमटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई, ए, बी, एफ, और जी), सफ्रानिन ओ / फास्ट ग्रीन (सी और एच), एंडोथेलियल कोशिकाओं (भेदभाव का क्लस्टर 31, सीडी 31) (डी और आई), और टार्टरेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (ट्रैप, ई और जे) के लिए दाग दिया गया था। (a और f) पूरे ऊतकों का अवलोकन (स्केल बार = 500 μm)। एच एंड ई, सफ्रानिन ओ, सीडी 31: स्केल बार = 200 μm; ट्रैप: स्केल बार = 50 μm। तीर सीडी 31-पॉजिटिव एंडोथेलियल कोशिकाओं का संकेत देते हैं। संक्षेप: सी = आंतरिक उपास्थि ऊतक; ओ = बाहरी ऑस्टियोइड ऊतक। (बी) कोलेजन और एचए संरचनाओं की माइक्रोसीटी (μCT) इमेजिंग (मुख्य और इनसेट छवि स्केल बार = 2 मिमी)। (C, D) एचए और कोलेजन संरचनाओं (एन = 4) का कुल खनिज घनत्व (सी) और मात्रा (डी)। ** महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है; पी <0.01. μCT का उपयोग करके प्रति समूह चार संरचनाओं का विश्लेषण किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ औसत ± मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं। समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करने के लिए छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। इस आंकड़े को38 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एचए-आधारित कृत्रिम उपास्थि का उपयोग करके ईसीओ की सुविधा के लिए रणनीति। प्रत्यारोपित एचए संरचनाओं के विखंडन (μ-छर्रों) के बिना और उसके साथ अस्थि मज्जा के विकास और अस्थि मज्जा विकास का योजनाबद्ध आरेख। (ए) एचए हाइड्रोगेल में विवो में फ्यूज्ड ग्राफ्ट के बीच वैस्कुलराइजेशन और मज्जा विकास के साथ एक एकीकृत हड्डी बनाने की उत्कृष्ट संलयन प्रवृत्ति है। परिणामी प्रत्यारोपित ऊतक, हालांकि, प्रत्यारोपण के 8 सप्ताह बाद भी मुख्य रूप से उपास्थि अवस्था में रहा। (ख) एकीकृत हड्डी बनाने के लिए एचए संरचनाओं के फ्यूज होने की प्रवृत्ति को देखते हुए, एचए संरचनाओं को μ-छर्रों में संसाधित करने से प्रत्यारोपित ऊतक की रीमॉडेलिंग दर में तेजी आ सकती है और हड्डी के गठन को बढ़ावा मिल सकता है। संरचनाओं को माइक्रोनाइज़ करने से सतह क्षेत्र बढ़ जाता है, जो उपास्थि ऊतक के पुनरुत्थान और हड्डी के ऊतकों के गठन को बढ़ावा दे सकता है और मेजबान सेल घुसपैठ के लिए बढ़ी हुई जगह के कारण एंजियोजेनेसिस और अस्थि मज्जा के विकास को भी बढ़ावा दे सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हाइड्रोजेल प्रयोगों का पालन संयुक्त % यूनाइटेड
कोलैजन 5 3 2 40
हेक्‍टेअर 5 5 5 100

तालिका 1: एकीकरण दर जब एक ही जेब में कई संरचनाओं को प्रत्यारोपित किया गया था। एक ही जेब में दो या तीन संरचनाओं को चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया गया था। संरचनाओं को प्रत्यारोपण के 4- या 8-सप्ताह बाद काटा गया और हिस्टोलॉजिकल रूप से जांच की गई।

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Discussion

हाइपरट्रॉफिक कार्टिलेज से हड्डी में संक्रमण को बढ़ावा देने वाली उचित पाड़ सामग्री का उपयोग करना एमएससी-आधारित इंजीनियर हाइपरट्रॉफिक कार्टिलेज ग्राफ्ट को बढ़ाने और नैदानिक रूप से महत्वपूर्ण आकार के हड्डी दोषों का इलाज करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है। यहां, हम दिखाते हैं कि एचए विट्रो में एमएससी-आधारित हाइपरट्रॉफिक उपास्थि ऊतक के भेदभाव का समर्थन करने और विवो38 में एंडोकॉन्ड्रल हड्डी के गठन को बढ़ावा देने के लिए एक उत्कृष्ट मचान सामग्री है। इसके अलावा, विवो में, एचए संरचनाओं को एक एकीकृत हड्डी बनाने के लिए एक ही जेब में प्रत्यारोपित कई संरचनाओं के संलयन की सुविधा के लिए दिखाया गया था। चूंकि पाड़ सामग्री के साथ एमएससी की बातचीत उपास्थि और हाइपरट्रॉफिक चोंड्रोजेनेसिस को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करती है, इसलिए ईसीओ के लिए उपयुक्त पाड़ सामग्री का चयन नैदानिक रूप से प्रभावी ऊतक-इंजीनियर उपास्थि ग्राफ्ट उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है। एचए हाइड्रोगेल में एम्बेडेड कोशिकाएं समान रूप से केंद्र से परिधि तक चोंड्रोसाइट्स की एक गोल आकृति विज्ञान विशेषता प्रदर्शित करती हैं, यह दर्शाता है कि हाइलूरोनन हाइड्रोगेल21,30 में समान उपास्थि गठन के लिए अनुकूल वातावरण प्रदान करता है। एचए के विपरीत, कोलेजन इंटीग्रिन बाइंडिंग सीक्वेंस (आरजीडी) के माध्यम से एमएससी के साथ बातचीत करता है; हालांकि, इस बातचीत की दृढ़ता एमएससी को चोंड्रोजेनिक मार्ग43 में और अंतर करने से रोकती है, जो गैर-विशिष्ट चोंड्रोसाइट्स सेल आकृति विज्ञान के लिए जिम्मेदार हो सकती है जो कोलेजन निर्माण की परिधि में प्रमुख है।

यदि एक हड्डी बनाने के लिए कई ग्राफ्ट एकजुट होते हैं, तो इस ईसीओ-मध्यस्थता दृष्टिकोण को अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक हड्डी दोषों तक बढ़ाया जा सकता है। जब कई एमएससी-आधारित और पाड़-मुक्त हाइपरट्रॉफिक कार्टिलेज को एक हड्डी दोष पर लागू किया गया था, तो यह बताया गया था कि उपास्थि ग्राफ्ट हड्डी दोष के साथ एकीकृत थे। हालांकि, आसन्न ग्राफ्टएक-दूसरे के साथ एकीकृत नहीं हुए। यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण इस सीमा को दूर करने के लिए एक संभावित समाधान प्रदान कर सकता है। कोलेजन संरचनाओं की तुलना में, एचए संरचनाओं के कई ग्राफ्ट में एक हड्डी बनाने के लिए फ्यूज करने की अधिक प्रवृत्ति थी। इसके अलावा, फ्यूज्ड एचए संरचनाओं के बीच अस्थि मज्जा का गठन किया गया था, जो इस तथ्य से संबंधित हो सकता है कि एचए पूरे हाइड्रोगेल में समान उपास्थि भेदभाव का समर्थन करता है क्योंकि हाइपरट्रॉफिक कार्टिलेज वीईजीएफ का स्राव करता है और अस्थि मज्जा विकास में हेमटोपोइएटिक स्टेम-सेल आला के लिए एक वातावरण प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक सफल प्रयोग की कुंजी एमएससी की गुणवत्ता है। यह पुष्टि करना कि उपयोग किए जाने वाले एमएससी में पहले से पर्याप्त रूप से उच्च चोंड्रोजेनिक भेदभाव क्षमता है, की सिफारिश की जाती है। दूसरा, प्रत्येक निर्माण का आकार बहुत बड़ा नहीं होना चाहिए। हमारे अनुभव में, एक एकल निर्माण की मात्रा 10-15 μL तक सीमित है। बड़े निर्माणों के परिणामस्वरूप संरचनाओं में अपर्याप्त ऑक्सीजन और पोषक तत्व प्रवेश हो सकता है, जिससे परिगलन और संरचनाओं के केंद्र में खराब भेदभाव हो सकता है। इसलिए, ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के प्रवेश में सुधार के लिए जेल मोटाई को कम करने की आवश्यकता है। जेल मोटाई को कम करने के लिए, ट्रांसवेल इंसर्ट14,45 के छिद्रपूर्ण झिल्ली पर पतले जैल बनाने में सहायक हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, क्योंकि एचए संरचनाएं फ्यूज और एकीकृत हड्डी बनाती हैं, यह एक बड़े निर्माण के बजाय कई छोटे निर्माणों को प्रत्यारोपित करने के लिए पर्याप्त हो सकता है, जैसा कि नीचे चर्चा की गई है।

इस अध्ययन की सीमाओं में हड्डी के गठन की सुविधा के लिए प्रत्यारोपित ऊतकों की रीमॉडेलिंग दर में तेजी लाने की आवश्यकता शामिल है। प्रत्यारोपित इंजीनियर ऊतक मुख्य रूप से प्रत्यारोपण के 8 सप्ताह बाद भी हाइपरट्रॉफिक कैल्सीफाइड उपास्थि अवस्था में रहा। ईसीओ मार्ग के माध्यम से हड्डी के गठन में, मेजबान-व्युत्पन्न कोशिकाएं ईसीओ16,46 को बढ़ावा देने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। विवो20 में संवहनी आक्रमण और ग्राफ्ट खनिजीकरण को बढ़ावा देने के लिए हाइपरट्रॉफिक कार्टिलेज ग्राफ्ट में अतिरिक्त चैनल प्रदान करने की सूचना मिली है। इस तरह के चैनल मेजबान कोशिकाओं की घुसपैठ के लिए नाली के रूप में काम करते हैं, जिसमें ओस्टियोब्लास्ट, ओस्टियोक्लास्ट और हेमटोपोइएटिक अग्रदूत शामिल हैं, ताकि निर्माण के भीतर नए ऊतक बनाए जा सकें। वैकल्पिक रूप से, यह बताया गया है कि चोंड्रोजेनिक विभेदित एमएससी से बने कई छोटे फाइब्रिन-एनकैप्सुलेटेड छर्रों (μ-छर्रों) को एकीकृत हड्डी47 बनाने के लिए प्रत्यारोपित किया जा सकता है। एचए संरचनाओं को μ-छर्रों में संसाधित करने से ट्रैप-पॉजिटिव ओस्टियोक्लास्ट से घिरे सतह क्षेत्र में वृद्धि हो सकती है, इस प्रकार उपास्थि ऊतक की रीमॉडेलिंग दर को बढ़ावा मिलता है और ओस्टियोजेनेसिस को बढ़ाया जाता है (चित्रा 6)21,48)। इसके अलावा, μ-छर्रों के आरोपण से मेजबान कोशिकाओं के घुसपैठ स्थान में वृद्धि होगी, जिससे एंजियोजेनेसिस और अस्थि मज्जा के विकास की सुविधा होगी और प्रचुर मात्रा में वैस्कुलराइजेशन के साथ अभिन्न हड्डी का गठन होगा। इस प्रकार, एकीकृत हड्डी बनाने और फ्यूज करने के लिए एचए संरचनाओं की प्रवृत्ति को ध्यान में रखते हुए, यह μ-निर्मित हड्डी पुनर्जनन रणनीति एचए हाइड्रोगेल का उपयोग करके हाइपरट्रॉफिक कार्टिलेज ग्राफ्ट की ईसीओ प्रक्रिया को तेज कर सकती है।

अंत में, एचए हाइड्रोगेल कोलेजन हाइड्रोगेल की तुलना में कम कोशिकाओं और जैल के साथ ऊतक-इंजीनियर ग्राफ्ट को बढ़ाने में प्रभावी हैं। इसके अलावा, एचए हाइड्रोगेल में उत्कृष्ट संलयन संवेदनशीलता होती है और फ्यूज्ड ग्राफ्ट के बीच वैस्कुलराइजेशन और मज्जा विकास के साथ एकीकृत हड्डी का उत्पादन होता है। इसलिए, मेजबान सेल घुसपैठ और ग्राफ्ट रीमॉडेलिंग को बढ़ावा देने के लिए एचए संरचनाओं के संशोधन से प्रत्यारोपण योग्य सामग्रियों का विकास हो सकता है जो आगे वैस्कुलराइजेशन और अस्थि मज्जा विकास को बढ़ावा दे सकते हैं। आगे अनुकूलन के साथ, यह दृष्टिकोण मैक्सिलोफेशियल और आर्थोपेडिक सर्जरी में वर्तमान हड्डी चिकित्सा के लिए एक आशाजनक विकल्प हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि कोई प्रतिस्पर्धी हित मौजूद नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) (अनुदान संख्या) से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता अनुदान (केकेईएनएचआई) द्वारा समर्थित किया गया था। JP19K10259 और 22K10032 MAI)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical  209-16941
Antisedan Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate Nacalai Tesque 13571-14
Bambanker GC Lymphotec CS-02-001
basic fibroblastic growth factor Reprocell RCHEOT002 
bovine serum albumin FUJIFILM Wako Pure Chemical  012-23881 7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10283
dexamethasone Merck D8893
Domitor Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium Merck D6429 high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Merck D6421
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
Gentamicin sulfate FUJIFILM Wako Pure Chemical  1676045  10 mg/mL
Haccpper Generator TechnoMax CH-400-5QB 50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit Merck HYS020
IL-1ß PeproTech AF-200-01B
ITS-G supplement FUJIFILM Wako Pure Chemical  090-06741 ×100
L-Alanyl-L-Glutamine FUJIFILM Wako Pure Chemical  016-21841 200mmol/L (×100)
L-proline Nacalai Tesque 29001-42
L-Thyroxine Merck T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		 Lonza PT-3001
paraffin FUJIFILM Wako Pure Chemical  165-13375
PBS / pH7.4 100ml Medicago 09-2051-100
TGF-β3  Proteintech HZ-1090
Vetorphale Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate FUJIFILM Wako Pure Chemical  048-34332

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Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., Ikeda, M. A. Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (197), e65573, doi:10.3791/65573 (2023).

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