Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Integrert bendannelse gjennom in vivo endokondral ossifikasjon ved bruk av mesenkymale stamceller

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65573
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,3
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Summary

Benterapi via endokondral ossifikasjon ved implantering av kunstig bruskvev produsert fra mesenkymale stamceller har potensial til å omgå ulempene ved konvensjonelle terapier. Hyaluronsyrehydrogeler er effektive for å skalere opp jevnt differensierte brusktransplantater, samt skape integrert bein med vaskularisering mellom smeltede transplantater in vivo.

Abstract

Konvensjonell benregenereringsterapi ved bruk av mesenkymale stamceller (MSC) er vanskelig å anvende på beindefekter større enn den kritiske størrelsen fordi den ikke har en mekanisme for å indusere angiogenese. Implantering av kunstig bruskvev fremstilt fra MSC induserer angiogenese og beindannelse in vivo via endokondral ossifikasjon (ECO). Derfor kan denne økomedierte tilnærmingen være en lovende benregenereringsterapi i fremtiden. Et viktig aspekt ved den kliniske anvendelsen av denne økomedierte tilnærmingen er å etablere en protokoll for å forberede nok brusk til å bli implantert for å reparere beindefekten. Det er spesielt ikke praktisk å designe en enkelt masse podet brusk av en størrelse som samsvarer med formen på den faktiske beindefekten. Derfor må brusken som skal transplanteres ha egenskapen til å danne bein integrert når flere stykker er implantert. Hydrogeler kan være et attraktivt verktøy for å skalere opp vevskonstruerte transplantater for endokondral ossifikasjon for å møte kliniske krav. Selv om mange naturlig avledede hydrogeler støtter MSC-bruskdannelse in vitro og ECO in vivo, er det optimale stillasmaterialet for å møte behovene til kliniske applikasjoner ennå ikke bestemt. Hyaluronsyre (HA) er en avgjørende komponent i den ekstracellulære bruskmatriksen og er et biologisk nedbrytbart og biokompatibelt polysakkarid. Her viser vi at HA-hydrogeler har utmerkede egenskaper for å støtte in vitro differensiering av MSC-basert bruskvev og fremme endokondral beindannelse in vivo.

Introduction

Autolog bein er fortsatt gullstandarden for å reparere beindefekter på grunn av traumer, medfødte defekter og kirurgisk reseksjon. Imidlertid har autogen bentransplantasjon betydelige begrensninger, inkludert donorsmerter, risiko for infeksjon og begrenset benvolum som kan isoleres fra pasientene 1,2,3,4. Tallrike biomaterialer har blitt utviklet som bensubstitutter, som kombinerer naturlige eller syntetiske polymerer med mineraliserte materialer som kalsiumfosfat eller hydroksyapatitt 5,6. Bendannelse i disse konstruerte materialene oppnås vanligvis ved å bruke det mineraliserte materialet som et primingmateriale for å tillate stamceller å differensiere direkte til osteoblaster gjennom intramembran ossification (IMO) prosess7. Denne prosessen mangler det angiogene trinnet, noe som resulterer i utilstrekkelig in vivo vaskularisering av transplantatet etter implantasjon 8,9,10, og derfor kan tilnærminger som bruker en slik prosess ikke være optimale for behandling av store beindefekter 11.

Strategier anvendt for å rekapitulere endokondral ossifikasjon (ECO) prosess, en medfødt mekanisme i skjelettogenese under utvikling, har vist seg å overvinne betydelige problemer forbundet med tradisjonelle IMO-baserte tilnærminger. I ECO frigjør kondrocytter i bruskmalen vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), som fremmer vaskulær infiltrasjon og remodellering av bruskmalen til bein12. Den ECO-medierte tilnærmingen til osteogenese via bruskremodellering og angiogenese, som også aktiveres under bruddreparasjon, bruker kunstig opprettet bruskvev avledet fra MSC som et primingmateriale. Kondrocytter kan tolerere hypoksi i beindefekter, indusere angiogenese og konvertere et vaskulært brusktransplantat til angiogent vev. Tallrike studier har rapportert at MSC-baserte brusktransplantater genererer bein in vivo ved å implementere et slikt ECO-program 13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Et viktig krav for den kliniske anvendelsen av denne øko-medierte tilnærmingen er hvordan man forbereder ønsket mengde brusktransplantat i en klinisk setting. Fremstilling av klinisk brusk av en størrelse som passer til selve beindefekten er ikke praktisk. Derfor må graftbrusk danne bein integrert når flere fragmenter implanteres22. Hydrogeler kan være et attraktivt verktøy for å skalere opp vevskonstruerte transplantater for endokondral ossifisering. Mange naturlig utvunnede hydrogeler støtter MSC-bruskdannelse in vitro og ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Det optimale støttematerialet for å oppfylle kravene til klinisk anvendelse er imidlertid ikke bestemt. Hyaluronsyre (HA) er et biologisk nedbrytbart og biokompatibelt polysakkarid tilstede i den ekstracellulære matrisen av brusk33. HA interagerer med MSC via overflatereseptorer som CD44 for å støtte kondrogen differensiering 25,26,28,30,31,32,34. I tillegg fremmer HA-stillas IMO-mediert osteogen differensiering av humane pulpstamceller35, og stillas kombinert med kollagen fremmer ECO-mediert osteogenese36,37.

Her presenterer vi en metode for fremstilling av HA-hydrogeler ved bruk av benmargsderiverte voksne humane MSC og deres bruk for hypertrofisk kondrogenese in vitro og påfølgende endokondral ossifikasjon in vivo38. Vi sammenlignet egenskapene til HA med kollagen, et materiale som er mye brukt i beinvevsteknikk med MSC og et nyttig materiale for å skalere opp kunstige transplantater for endokondral ossifikasjon17. I en immunkompromittert musemodell ble HA- og kollagenkonstruksjoner sådd med humane MSC evaluert for in vivo ECO-potensiale ved subkutan implantasjon. Resultatene viser at HA-hydrogeler er utmerket som stillas for MSC for å lage kunstige brusktransplantater som tillater beindannelse gjennom ECO.

Protokollen er delt inn i to trinn. Først fremstilles konstruksjoner av humane MSC-er sådd på hyaluronhydrogel og differensieres til hypertrofisk brusk in vitro. Deretter implanteres de differensierte konstruksjonene subkutant i en nakenmodell for å indusere endokondral ossifikasjon in vivo (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen bruker 4 uker gamle mannlige nakne mus. Hus fire mus i et bur under en 12 timers lys / mørk syklus ved 22-24 ° C og 50% -70% relativ fuktighet. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med retningslinjene godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Tokyo Medical and Dental University (godkjennings-ID: A2019-204C, A2020-116A og A2021-121A).

1. Fremstilling av buffere og reagenser

  1. Klargjør mesenkymalt stamcellevekstmedium (MSC vekstmedium) ved å tilsette tilskuddssettet til MSC-vekstmedium til MSC-basalmedier og oppbevar det ved 4 °C.
  2. Forbered Dulbeccos modifiserte ørnemedium og skinkens F12 (DMEM / F-12) medium ved å tilsette 10% føtal bovint serum (FBS), 50 μg / ml gentamicin, 200 μM L-alanyl-L-glutamin og 1 ng / ml basisk fibroblastisk vekstfaktor til mediet og lagre det ved 4 ° C.
  3. Forbered kondrogent medium ved å tilsette 1% ITS-G-supplement, 0,12% bovint serumalbumin, 50 μg / ml gentamicin, 0,35 mM L-prolin, 100 nM deksametason og 10 ng / ml TGF-β3 til DMEM like før bruk.
  4. Forbered hypertrofisk medium ved å tilsette 10 mM β-glycerofosfat, 0,12% bovint serumalbumin, 10 nM deksametason, 200 μM askorbat-2-fosfat, 50 nM L-tyroksin, 50 μg / ml gentamycin og 50 pg / ml IL-1β til DMEM like før bruk.
  5. Dekk en 24-brønns kulturskål med 200 μL smeltet parafin forvarmet ved 60 °C. La stå i romtemperatur til parafinen er stivnet.

2. Utvidelse av MSC-er for mennesker

MERK: Før eksperimentene starter, bør MSC-er med høyt potensial for MSC-kondrogenese velges i mikromassekultur som beskrevet i17.

  1. I henhold til produsentens instruksjoner, dyrkning av primære humane benmargsavledede MSC (passasje 2) med MSC-vekstmedium i en 10 cm tallerken med en tetthet på 5 x 103 celler/cm 2 ved 37 °C i 5% CO2 og 95% fuktet luftinkubator.
  2. Bytt medium hver 2-3 dag. Når cellene når 80% -90% sammenløp, aspirer mediet fra cellekulturskålen ved hjelp av en vakuumpumpe, vask med 5 ml PBS, og aspirer deretter løsningen med en vakuumpumpe.
  3. Tilsett 1 ml 0,05% trypsin/0,02% EDTA-oppløsning til retten. Inkuber fatet i 5-10 min ved 37 °C.
  4. Tilsett 1 ml MSC-vekstmedium for å stoppe den enzymatiske reaksjonen. Overfør cellesuspensjonen til et 50 ml rør.
  5. Kombiner cellesuspensjonen fra andre retter i 50 ml røret og hold den på is.
  6. Bruk celletelleren til å telle cellene ved å blande 10 μL av cellesuspensjonen med 10 μL av 0,4% trypanblå flekk.
  7. Sentrifuger den gjenværende cellesuspensjonen ved 220 x g i 3 minutter ved romtemperatur. Fjern supernatanten og tilsett kryopreserveringsløsningen i en konsentrasjon på 1,0 x 106 celler per ml.
  8. 1 ml av cellesuspensjonen dispenseres i hvert kryorør og oppbevares ved -80 °C i 12 timer før overføring til flytende nitrogen. De resulterende frosne bestandene (passasje 3) brukes til denne protokollen.
  9. For forsøkene, frø de lagrede MSC-ene i en 10 cm tallerken med en tetthet på 5 x 103 celler / cm2. Dyrkningsceller inntil 80%-90% konfluent (passasje 4) i DMEM/F-12 medium.

3. Fremstilling av MSC-innkapslede hydrogeler

  1. Trypsiniser cellene og klargjør cellesuspensjonen som beskrevet i trinn 2.3 - 2.6.
  2. For å lage 10 konstruksjoner (2,5 x 10 5 celler per konstruksjon), alikot cellesuspensjonen som inneholder 2,5 x 106 celler til et1,5 ml mikrorør.
  3. Sentrifuger suspensjonen på 220 x g i 3 minutter, fjern supernatanten med en vakuumpumpe og oppbevar den på is.
  4. Bring tiolmodifisert hyaluronsyre (HA), tiolreaktiv tverrbinder, polyetylenglykoldiakrylat og avgassede vannflasker til romtemperatur.
  5. Under sterile forhold tilsettes 1,0 ml avgasset vann til den HA-holdige flasken (se produsentens instruksjoner) ved hjelp av en sprøyte med en nål.
  6. Virvel varmes av og til opp til 37 °C til oppløsningen blir klar, og legges deretter på is. Det tar mindre enn 30 min for de faste stoffene å oppløse helt.
  7. Under sterile forhold, tilsett 0,5 ml avgasset vann til tverrbindingsflasken ved hjelp av en sprøyte med en nål. Løs opp ved å invertere flere ganger, og legg deretter på is.
  8. Tilsett 120 μl av den oppløste hyaluronsyreoppløsningen til aliquoted cellepellet (2,5 x 106 celler). Irriter cellepelleten på nytt ved å pipettere frem og tilbake.
  9. Tilsett 30 μL av den oppløste tverrbindingsløsningen til røret som inneholder hyaluronsyre og celler (trinn 3.8) og kombiner ved å banke på røret, og spinn deretter kort ned. Kombiner HA-løsningen og crosslinker-løsningen i forholdet 4:1.
  10. Slipp 15 μL av den kombinerte oppløsningen som inneholder MSC (2,5 x 105 celler) på den parafinbelagte 24-brønnsplaten og la den størkne ved 37 °C i 30 minutter (figur 2). På grunn av høy viskositet må du tilberede minst 10 % ekstra mengde av cellen/hydrogelblandingen enn nødvendig.
    MERK: Egenskapene til hydrogelen er beskrevet tidligere39.

4. In vitro differensieringsbetingelser

  1. Tilsett 0,5 ml kondrogent differensieringsmedium til en konstruksjon av MSC-frøede HA-hydrogeler. Bytt medium hver 2-3 dag.
  2. Etter 3 uker, bytt til hypertrofisk differensieringsmedium (0,5 ml per brønn) og dyrk konstruksjonene i ytterligere 2 uker.

5. In vivo implantasjon av MSC

  1. Etter totalt 5 uker med in vitro kultur, implanter konstruksjonene subkutant på baksiden av nakne mus som beskrevet tidligere38,40.
  2. Vei mus og administrer et kombinasjonsbedøvelsesmiddel tilberedt med 0,75 mg/kg kroppsvekt (b.w.) medetomidin, 4,0 mg/kg b.w. midazolam og 5,0 mg/kg b.w. butorfanol ved intraperitoneal injeksjon som beskrevet38.
  3. Bekreft tilstrekkelig anestesi ved immobilitet til kirurgiske stimuli og overvåke respiratorisk dybde ved langsomme, regelmessige brystbevegelser og riktig oksygenforsyning av fargen på den rosa slimhinnen periodisk under operasjonen. Bruk veterinærsalve på øynene for å forhindre tørrhet under anestesi.
  4. Plasser musen på en steril kirurgisk drapering i utsatt stilling, steriliser snittstedet med 50 ppm hypoklorsyrevann (pH 5,0; HAW), og legg en perforert kirurgisk drapering over musen.
    MERK: Steriliser alle kirurgiske materialer i en autoklav, etylenoksidgass eller HAW. Kirurgene bør vaske fingrene og bruke kirurgiske kjoler og hansker.
  5. Lag to 5 mm lange hudsnitt med 2 cm mellomrom i skulder- og hofteområdene langs ryggradens midtlinje ved hjelp av saks.
  6. Sett en slikkepott subkutant gjennom snittet for å lage en underhudslomme.
  7. Sett inn to til tre konstruksjoner (~15 μL hver, trinn 5.1) i hver lomme med tang. HA-konstruksjoner implantert i samme lomme er utsatt for fusjon svært ofte. For å unngå fusjon setter du inn en HA-konstruksjon i hver lomme.
  8. Lukk snittene med 4-0 flettede silkesuturer. Injiser musen med en antagonist til anestetika tilberedt med 0,75 mg/kg b.w. atipamezol som beskrevet38.
  9. Mens musene gjenoppretter fra anestesi, plasser musene i sterile gjenopprettingsbur som inneholder sterilt gulvsengetøy uten mat- og vannflasker og kontinuerlig overvåke kroppstemperatur, puls og respirasjon.
  10. Ikke la musene være uten tilsyn før den har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal hvile. Etter full gjenoppretting, returner dyrene til avlsrommet med de andre dyrene.
  11. Overvåk dyrene hvert par dager i helbredelsesperioden for eventuelle komplikasjoner. Avlive musene ved innånding av karbondioksid med liten lidelse ved 4- og 8-ukers postimplantasjon.
  12. Snitt huden på de podede stedene og fjern de implanterte konstruksjonene med tang. Fest konstruksjonene i 4% paraformaldehyd i 16 timer og utsett dem deretter for analyse.

6. Statistisk analyse

  1. Rapportere kvantitative data som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Utfør statistisk analyse ved hjelp av kommersiell programvare.
  2. Bruk Student t-test eller enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys flere sammenligningstest for å bestemme signifikante forskjeller mellom grupper. s<0,05 og p<0,01 indikerer signifikante forskjeller mellom to grupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MSC-innkapslede HA-hydrogeler ble dyrket i kondrogent medium supplert med TGFβ3, en induktor av kondrogenese41 (trinn 4.1). Vi sammenlignet egenskapene til hyaluronsyre med kollagen, som har vist seg å være effektive for å skape MSC-baserte kunstige brusktransplantater for endokondral ossifikasjon, som beskrevet tidligere38. Udifferensierte MSC-er ble ikke inkludert som negative kontroller i denne studien fordi det har vist seg at udifferensierte MSC-er krever mineraliserte overflater som primingsubstrat for å generere bein ved osteogen differensiering (dvs. intramembran ossifikasjon)7.

Størrelsen på hyaluronanhydrogelene endret seg ikke gjennom in vitro-kulturperioden , som bedømt basert på diametre målt under et invertert mikroskop, mens kollagenhydrogelene som ble brukt til sammenligning begynte å krympe kort tid etter at kulturen startet. For å redusere størrelsesforskjellen mellom HA- og kollagenkonstruksjonene etter in vitro-dyrkning , ble antallet MSC og volumet av gelen som ble brukt til å lage HA-hydrogelene halvert sammenlignet med de som ble brukt til kollagenhydrogelene. Imidlertid var våtvekten av HA-konstruksjonene etter 3 uker med bruskkultur 4x tyngre enn kollagenkonstruksjonene.

Kondrogen og hypertrofisk differensiering in vitro.
Etter kondrogen differensiering (ved uke 3 av in vitro kultur), sulfaterte glykosaminoglykaner (sGAG)-positive (Safranin O / rask grønn farging; Figur 3A) og type II kollagen-positiv ekstracellulær matriks ble observert i begge konstruksjoner, noe som indikerer at både HA og kollagenhydrogeler støttet kondrogenese. Imidlertid, sammenlignet med kollagenkonstruksjonen, var fordelingen av sGAG, type II kollagen (Col II) og type X kollagen (Col X) mer homogen gjennom vevet i HA-konstruksjonene. Forskjeller mellom de to konstruksjonene var også tydelige i cellemorfologi: celler med en kondrocyttlignende avrundet morfologi ble fordelt gjennom vevet i HA-konstruksjonene. I kollagenkonstruksjonene viste imidlertid celler i periferien en heterogen morfologi, som varierte fra uregelmessig/strukket til avrundet morfologi. I samsvar med dette var gjennomsnittlig rundhet av celler i HA-konstruksjonene høyere enn i kollagenkonstruksjonene, både i periferien og sentrale regioner (henholdsvis 34% versus 77,6% (p<0,01) og 78,3% vs. 100% (s<0,05); Figur 3B). Ved 5 ukers kultur ble det påvist kalsiumavleiring i ytterkantene i begge konstruksjoner (alizarinrød; Figur 3C). Videre ble ekspresjon av kondrogene (Sox-9, aggrecan (ACAN), Col II), hypertrofiske (Col X, matriksmetallopeptidase 13 (MMP-13)) og osteogene (type I kollagen (Col I), bensialoprotein (BSP), osteocalcin (OCN)) markører14 detektert ved kvantitativ sanntids RT-PCR, noe som bekreftet progresjonen av kondrogen og hypertrofisk differensiering under in vitro-kultur (figur 4).

Endokondral ossifisering av subkutant implanterte konstruksjoner in vivo.
Subkutane lommer ble laget på baksiden av nakne mus, og to til tre konstruksjoner ble implantert i hver lomme etter hypertrofisk differensiering (ved uke 5 av in vitro-kultur). 4 eller 8 uker etter implantasjonen ble alle hyaluronsyrekonstruksjoner festet til hverandre i de implanterte lommene (tabell 1). I kollagenkonstruksjonene ble det observert vedheft i 60 % av lommene, mens i de resterende lommene var transplantatene uavhengige av hverandre. Farging av hematoksylin og eosin (H&E) viste at det i begge konstruksjonene 8 uker etter implantasjon ble dannet osteoidvev med lamellmorfologi i de ytre delene av konstruksjonene (figur 5Aa,f). sGAG-farging forsvant i HA-konstruksjonene, noe som indikerer tap av bruskfenotypen (figur 5Ah). I begge konstruksjonene ble det dannet en benmargskomponent inneholdende hematopoietiske celler og fettvev mellom den indre brusk og det ytre osteoide vevet. I alle HA-konstruksjoner var beinvevet i de smeltede konstruksjonene forbundet og omgitt av felles fibrøst vev og benmarg utviklet langs rommet mellom de to adherente konstruksjonene, noe som indikerer at flere HA-konstruksjoner har en tendens til å danne integrert beinvev (figur 5Ag). De festede kollagenkonstruksjonene ble på samme måte integrert i to av de tre smeltede tilfellene, men i det tredje tilfellet var beinvevet til de to konstruksjonene ikke forbundet (tabell 1 og figur 5Ab). I begge konstruksjonene ble kar identifisert av CD31-positive endotelceller42 observert i beinmargen (figur 5Ad,i), og de indre bruskområdene var omgitt av TRAP-positive multinukleerte celler i osteoklastlinjen, noe som indikerer at bruskvev var gjenstand for remodellering (figur 5Ae,j).

Mineral ble avsatt i det ytre osteoide området i både HA- og kollagenkonstruksjoner (figur 5B). Mens den totale mineraltettheten til det nye benet var lik mellom HA- og kollagenkonstruksjoner, var mineralvolumet signifikant høyere i HA-konstruksjonene enn i kollagenkonstruksjonene, noe som kan gjenspeile det faktum at HA-hydrogeler ikke krympet under in vitro-kultur , noe som resulterte i større konstruksjoner enn kollagenhydrogeler (figur 5C, D).

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelt design. Det første trinnet i denne protokollen er å kapsle inn utvidede MSC i HA-hydrogeler for å fremme kondrogen og hypertrofisk differensiering in vitro. Konstruksjoner dyrkes i kondrogene differensieringsbetingelser i 3 uker, etterfulgt av ytterligere 2 uker ved hypertrofiske differensieringsbetingelser. Det andre trinnet i denne protokollen er å subkutant implantere konstruksjonene i nakne mus i uke 5 av in vitro-kultur for å gjennomgå endokondral ossifikasjon in vivo i 8 uker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fremstilling av MSC-frøede hydrogeler. Slipp modifisert HA/crosslinker-løsning inneholdende MSC på en parafinbelagt 24-brønnsplate og la den størkne ved 37 °C i 30 minutter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Histologisk og immunhistokjemisk analyse av hyaluronsyre og kollagenkonstruksjoner etter in vitro dyrkning22. (A) Konstruksjoner ved 3 uker (3W) in vitro kultur ble farget for sGAG (safranin O / rask grønn), type II kollagen (Col II) og type X kollagen (Col X). (B) Gjennomsnittlig sirkularitetsverdi for celler ved 3 uker med in vitro-kultur (n = 5). Åpne og grå stolper indikerer henholdsvis kollagen- og HA-konstruksjoner. Grupper uten felles bokstav er statistisk forskjellige (a versus b, p<0.01; b versus c, p<0.05). (C) Konstruksjoner ved 5 uker (5 W) in vitro dyrkning ble farget for kalsium (alizarinrød). Alle bildene ble tatt med samme forstørrelse (Skala bar: 200 μm). En oversikt over lav forstørrelse av hele vevet er vist i innfeltene (Skala bar: 1 mm). Feilfelt representerer gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Den enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys flere sammenligningstest ble brukt til å bestemme signifikante forskjeller mellom grupper. Dette tallet er endret fra38. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Genekspresjonsanalyse av HA og kollagenkonstruksjoner ved 3 og 5 ukers in vitro-kultur. (A) Kondrogene og hypertrofiske markører. (B) Osteogene markører. Verdier er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) (n = 3). Udifferensierte MSC-er uttrykte høye nivåer av Col I og MMP-13 og lave nivåer av Sox-9 og Col X; de uttrykte ikke (#) ACAN, Col II, BSP og OCN. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Dette tallet er endret fra38. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Immunhistokjemisk analyse og forkalkning av hyaluronsyre og kollagenkonstruksjoner etter implantasjon etter 8 uker. (A) Konstruksjoner ble farget for hematoksylin og eosin (H&E, a, b, f og g), safranin O/Fast Green (c og h), endotelceller (differensieringsklynge 31, CD31) (d og i) og tartratresistent syrefosfatase (TRAP, e og j). (a og f) Oversikt over hele vevet (skala bar = 500 μm). H&E, safranin O, CD31: skalastang = 200 μm; TRAP: skala bar = 50 μm. Pilene indikerer CD31-positive endotelceller. Forkortelser: c = indre bruskvev; o = ytre osteoidvev. (B) MicroCT (μCT) avbildning av kollagen og HA-konstruksjoner (hoved- og innfelte bildeskalastenger = 2 mm). (C,D) Den totale mineraltettheten (C) og volumet (D) av HA og kollagenkonstruksjoner (n = 4). ** indikerer signifikante forskjeller; p <0,01. Fire konstruksjoner ble analysert per gruppe ved hjelp av μCT. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Student t-test ble brukt for å bestemme signifikante forskjeller mellom grupper. Dette tallet er endret fra38. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Strategi for tilrettelegging av ECOs ved bruk av HA-basert kunstig brusk. Skjematisk diagram over ossifikasjon og beinmargsutvikling uten og med fragmentering (μ-pellets) av implanterte HA-konstruksjoner. (A) HA-hydrogeler har en utmerket fusjonstendens til å danne et integrert ben med vaskularisering og margutvikling mellom smeltede transplantater in vivo. Det resulterende implanterte vevet forble imidlertid hovedsakelig i brusktilstand selv 8 uker etter implantasjonen. (B) Gitt tendensen til HA-konstruksjoner til å smelte sammen for å danne integrert bein, kan behandling av HA-konstruksjoner i μ-pellets akselerere remodelleringshastigheten til transplantert vev og fremme beindannelse. Mikronisering av konstruksjonene øker overflatearealet, noe som kan fremme resorpsjonen av bruskvev og dannelsen av beinvev og kan også fremme angiogenese og benmargsutvikling på grunn av økt plass for vertscelleinfiltrasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Hydrogel Eksperimenter Overholdt Forent % Forente
Kollagen 5 3 2 40
HA 5 5 5 100

Tabell 1: Foreningshastighet når flere konstruksjoner ble implantert i en enkelt lomme. To eller tre konstruksjoner ble subkutant implantert i en enkelt lomme. Konstruksjoner ble høstet 4 eller 8 uker etter implantasjon og histologisk undersøkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bruk av passende stillasmaterialer som fremmer overgangen fra hypertrofisk brusk til bein, er en lovende tilnærming til å skalere opp MSC-baserte konstruerte hypertrofiske brusktransplantater og behandle beindefekter av klinisk signifikant størrelse. Her viser vi at HA er et utmerket stillasmateriale for å støtte differensiering av MSC-basert hypertrofisk bruskvev in vitro og for å fremme endokondral beindannelse in vivo38. Videre ble in vivo HA-konstruksjoner vist å lette fusjonen av flere konstruksjoner implantert i samme lomme for å danne et enkelt integrert bein. Fordi samspillet mellom MSC og stillasmaterialer påvirker brusk og hypertrofisk kondrogenese betydelig, er valg av egnet stillasmateriale for øko viktig for å generere klinisk effektive vevskonstruerte brusktransplantater. Celler innebygd i HA-hydrogeler viser ensartet en avrundet morfologi som er karakteristisk for kondrocytter fra sentrum til periferien, noe som indikerer at hyaluronan gir et miljø som bidrar til jevn bruskdannelse gjennom hydrogelen21,30. I motsetning til HA interagerer kollagen med MSC via integrinbindingssekvenser (RGD); Imidlertid forhindrer utholdenheten av denne interaksjonen MSC fra ytterligere differensiering i den kondrogene banen43, noe som kan forklare den ikke-typiske kondrocytcellemorfologien som er fremtredende i periferien av kollagenkonstruksjoner.

Hvis flere transplantater forenes for å danne et enkelt bein, kan denne øko-medierte tilnærmingen utvides til mer klinisk relevante bendefekter. Når flere MSC-baserte og stillasfrie hypertrofiske brusk ble påført en enkelt beindefekt, ble det rapportert at brusktransplantatene integrerte seg med beindefekten. Tilstøtende transplantater ble imidlertid ikke integrert med hverandre22. Tilnærmingen som presenteres her, kan tilby en mulig løsning for å overvinne denne begrensningen. Sammenlignet med kollagenkonstruksjoner hadde flere transplantater av HA-konstruksjoner en større tendens til å smelte sammen for å danne et enkelt bein. Videre ble benmarg dannet mellom sammenvokste HA-konstruksjoner, noe som kan være relatert til det faktum at HA støtter ensartet bruskdifferensiering gjennom hydrogelen fordi hypertrofisk brusk skiller ut VEGF og gir et miljø for hematopoietisk stamcellenisje i benmargsutvikling 44.

Nøkkelen til et vellykket eksperiment med denne protokollen er kvaliteten på MSC-ene. Det anbefales å bekrefte at MSC-ene som skal brukes har tilstrekkelig høyt kondrogent differensieringspotensial på forhånd. For det andre bør størrelsen på hver konstruksjon ikke være for stor. Etter vår erfaring er volumet av en enkelt konstruksjon begrenset til 10-15 μL. Større konstruksjoner kan resultere i utilstrekkelig oksygen- og næringsinntrengning i konstruksjonene, noe som fører til nekrose og dårlig differensiering i midten av konstruksjonene. Derfor må geltykkelsen reduseres for å forbedre oksygen- og næringspenetrasjonen. For å redusere geltykkelsen kan det være nyttig å lage tynne geler på den porøse membranen til Transwell-innsatser14,45. Alternativt, fordi HA-konstruksjoner har en tendens til å smelte sammen og danne integrert bein, kan det være tilstrekkelig å implantere mange mindre konstruksjoner i stedet for en enkelt stor konstruksjon, som diskutert nedenfor.

Begrensninger i denne studien inkluderer behovet for å akselerere remodelingshastigheten til det implanterte vevet for å lette beindannelsen. Det implanterte konstruerte vevet forble hovedsakelig i en hypertrofisk forkalket brusktilstand selv 8 uker etter implantasjon. I beindannelse via ECO-banen spiller vertsavledede celler en kritisk rolle i å fremme ECO16,46. Å gi ytterligere kanaler i hypertrofiske brusktransplantater har blitt rapportert å fremme vaskulær invasjon og graftmineralisering in vivo20. Slike kanaler tjener som kanaler for infiltrasjon av vertsceller, inkludert osteoblaster, osteoklaster og hematopoietiske forløpere, for å danne nytt vev i konstruksjonen. Alternativt har det blitt rapportert at flere små fibrininnkapslede pellets (μ-pellets) sammensatt av kondrogene differensierte MSCer kan implanteres for å danne integrert bein47. Behandling av HA-konstruksjoner i μ-pellets kan øke overflaten omgitt av TRAP-positive osteoklaster, og dermed fremme remodelleringshastigheten av bruskvev og øke osteogenesen (figur 6) 21,48. Videre vil implantasjon av μ-pellets øke infiltrasjonsrommet til vertsceller, og dermed lette angiogenese og benmargsutvikling og generere integrert beindannelse med rikelig vaskularisering. Med tanke på tendensen til HA-konstruksjoner til å smelte sammen og skape integrert bein, kan denne μ-konstruerte beinregenereringsstrategien akselerere ECO-prosessen med hypertrofiske brusktransplantater ved bruk av HA-hydrogeler.

Konklusjonen er at HA-hydrogeler er effektive for å skalere opp vevskonstruerte transplantater med færre celler og geler enn kollagenhydrogeler. I tillegg har HA-hydrogeler utmerket fusjonsfølsomhet og produserer integrert ben med vaskularisering og margutvikling mellom smeltede transplantater. Derfor kan modifisering av HA-konstruksjoner for å fremme vertscelleinfiltrasjon og remodellering av transplantat føre til utvikling av implanterbare materialer som ytterligere kan fremme vaskularisering og benmargsutvikling. Med ytterligere optimalisering kan denne tilnærmingen være et lovende alternativ til dagens beinbehandlinger i maxillofacial og ortopedisk kirurgi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (grant nos. JP19K10259 og 22K10032 til MAI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical  209-16941
Antisedan Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate Nacalai Tesque 13571-14
Bambanker GC Lymphotec CS-02-001
basic fibroblastic growth factor Reprocell RCHEOT002 
bovine serum albumin FUJIFILM Wako Pure Chemical  012-23881 7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10283
dexamethasone Merck D8893
Domitor Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium Merck D6429 high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Merck D6421
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
Gentamicin sulfate FUJIFILM Wako Pure Chemical  1676045  10 mg/mL
Haccpper Generator TechnoMax CH-400-5QB 50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit Merck HYS020
IL-1ß PeproTech AF-200-01B
ITS-G supplement FUJIFILM Wako Pure Chemical  090-06741 ×100
L-Alanyl-L-Glutamine FUJIFILM Wako Pure Chemical  016-21841 200mmol/L (×100)
L-proline Nacalai Tesque 29001-42
L-Thyroxine Merck T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		 Lonza PT-3001
paraffin FUJIFILM Wako Pure Chemical  165-13375
PBS / pH7.4 100ml Medicago 09-2051-100
TGF-β3  Proteintech HZ-1090
Vetorphale Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate FUJIFILM Wako Pure Chemical  048-34332

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  3. Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
  4. Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
  5. Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  6. Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
  7. Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A. Cell-based bone tissue engineering. PLOS Medicine. 4 (2), e9 (2007).
  8. Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
  9. Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D. Engineering thick tissues--the vascularisation problem. European Cells and Materials. 14, 1-19 (2007).
  10. Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
  11. Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
  12. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
  13. Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
  14. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  15. Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
  16. Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
  17. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  18. Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
  19. van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
  20. Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
  21. Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
  22. Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
  23. Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
  24. Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
  25. Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
  26. Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
  27. Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
  28. Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
  29. Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
  30. Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
  31. Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton's jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
  32. Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
  33. Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
  34. Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
  35. La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
  36. Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O'Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
  37. Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
  38. Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
  39. Zarembinski, T., Skardal, A. Hydrogels - Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
  40. Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
  41. Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
  42. Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
  43. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  44. Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
  45. Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
  46. Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
  47. Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
  48. Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).

Tags

Mesenkymale stamceller benregenereringsterapi angiogenese endokondral ossifikasjon kunstig bruskvev beindefekt klinisk anvendelse protokoll hydrogeler vevskonstruerte transplantater hyaluronsyre (HA)
Integrert bendannelse gjennom <em>in vivo</em> endokondral ossifikasjon ved bruk av mesenkymale stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., … More

Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., Ikeda, M. A. Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (197), e65573, doi:10.3791/65573 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter