Summary
A terapia óssea via ossificação endocondral através da implantação de tecido cartilaginoso artificial produzido a partir de células-tronco mesenquimais tem o potencial de contornar os inconvenientes das terapias convencionais. Os hidrogéis de ácido hialurônico são eficazes na ampliação de enxertos de cartilagem uniformemente diferenciados, bem como na criação de osso integrado com vascularização entre enxertos fundidos in vivo.
Abstract
A terapia convencional de regeneração óssea utilizando células-tronco mesenquimais (CTMs) é de difícil aplicação em defeitos ósseos maiores que o tamanho crítico por não possuir um mecanismo para induzir angiogênese. A implantação de tecido cartilaginoso artificial fabricado a partir de CTMs induz angiogênese e formação óssea in vivo via ossificação endocondral (ECO). Portanto, esta abordagem mediada pela ECO pode ser uma terapia promissora de regeneração óssea no futuro. Um aspecto importante da aplicação clínica desta abordagem mediada pela ECO é o estabelecimento de um protocolo para preparar cartilagem suficiente para ser implantada para reparar o defeito ósseo. Especialmente não é prático projetar uma única massa de cartilagem enxertada de um tamanho que esteja de acordo com a forma do defeito ósseo real. Portanto, a cartilagem a ser transplantada deve ter a propriedade de formar osso integralmente quando múltiplos pedaços são implantados. Os hidrogéis podem ser uma ferramenta atraente para a ampliação de enxertos projetados para ossificação endocondral para atender às necessidades clínicas. Embora muitos hidrogéis naturalmente derivados suportem a formação de cartilagem MSC in vitro e ECO in vivo, o material de arcabouço ideal para atender às necessidades de aplicações clínicas ainda não foi determinado. O ácido hialurônico (AH) é um componente crucial da matriz extracelular cartilaginosa e é um polissacarídeo biodegradável e biocompatível. Aqui, mostramos que os hidrogéis de AH têm excelentes propriedades para apoiar a diferenciação in vitro do tecido cartilaginoso à base de CTM e promover a formação óssea endocondral in vivo.
Introduction
O osso autólogo ainda é o padrão-ouro para reparação de defeitos ósseos decorrentes de trauma, defeitos congênitos e ressecção cirúrgica. No entanto, o enxerto ósseo autógeno tem limitações significativas, incluindo dor do doador, risco de infecção e volume ósseo limitado que pode ser isolado dos pacientes 1,2,3,4. Inúmeros biomateriais têm sido desenvolvidos como substitutos ósseos, combinando polímeros naturais ou sintéticos com materiais mineralizados, como fosfato de cálcio ou hidroxiapatita 5,6. A formação óssea nesses materiais de engenharia é geralmente obtida usando o material mineralizado como material de priming para permitir que as células-tronco se diferenciem diretamente em osteoblastos através do processo de ossificação intramembrana (IMO)7. Esse processo carece do passo angiogênico, resultando em vascularização insuficiente in vivo do enxerto após o implante8,9,10 e, portanto, abordagens utilizando esse processo podem não ser ideais para o tratamento de grandes defeitos ósseos11.
Estratégias aplicadas para recapitular o processo de ossificação endocondral (ECO), um mecanismo inato na esquelética durante o desenvolvimento, têm demonstrado superar problemas significativos associados às abordagens tradicionais baseadas na IMO. Na ECO, os condrócitos do molde cartilaginoso liberam fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que promove infiltração vascular e remodelamento do molde cartilaginoso emosso12. A abordagem ECO-mediada para osteogênese via remodelamento cartilaginoso e angiogênese, que também é ativada durante o reparo de fraturas, usa tecido cartilaginoso criado artificialmente derivado de CTMs como material de priming. Os condrócitos podem tolerar hipóxia em defeitos ósseos, induzir angiogênese e converter um enxerto de cartilagem livre de vasculares em tecido angiogênico. Numerosos estudos têm relatado que enxertos de cartilagem à base de CTM geram osso in vivo com a implementação de tal programa ECO13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Um requisito essencial para a aplicação clínica desta abordagem mediada pela ECO é como preparar a quantidade desejada de enxerto de cartilagem em um ambiente clínico. Preparar cartilagem clínica de um tamanho que se adapte ao defeito ósseo real não é prático. Portanto, a cartilagem do enxerto deve formar osso integralmente quando múltiplos fragmentos são implantados22. Os hidrogéis podem ser uma ferramenta atraente para a ampliação de enxertos manipulados por tecidos para ossificação endocondral. Muitos hidrogéis de origem natural suportam a formação de cartilagem MSC in vitro e ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; no entanto, o material de suporte ideal para atender aos requisitos de aplicação clínica permaneceu indeterminado. O ácido hialurônico (AH) é um polissacarídeo biodegradável e biocompatível presente na matriz extracelular da cartilagem33. O AH interage com as CTMs via receptores de superfície, como o CD44, para auxiliar a diferenciação condrogênica 25,26,28,30,31,32,34. Além disso, os scaffolds de AH promovem diferenciação osteogênica mediada pela IMO de células-tronco da polpa dentária humana35, e scaffolds combinados com colágeno promovem osteogênese mediada por ECO36,37.
Aqui, apresentamos um método para o preparo de hidrogéis de AH utilizando CTMs humanas adultas derivadas da medula óssea e seu uso para condrogênese hipertrófica in vitro e posterior ossificação endocondral in vivo38. Comparamos as características do AH com as do colágeno, um material amplamente aplicado na engenharia do tecido ósseo com CTMs e um material útil para a ampliação de enxertos artificiais para ossificação endocondral17. Em um modelo de camundongo imunocomprometido, construções de AH e colágeno semeadas com CTMs humanas foram avaliadas quanto ao potencial ECO in vivo por implante subcutâneo. Os resultados mostram que os hidrogéis de AH são excelentes como arcabouço para CTMs criarem enxertos de cartilagem artificial que permitem a formação óssea através de ECO.
O protocolo é dividido em duas etapas. Primeiro, construções de CTMs humanas semeadas com hidrogel de hialuronano são preparadas e diferenciadas em cartilagem hipertrófica in vitro. Em seguida, os construtos diferenciados são implantados subcutaneamente em um modelo nude para induzir a ossificação endocondral in vivo (Figura 1).
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Protocol
Este protocolo usa camundongos machos nus de 4 semanas de idade. Aloja quatro ratos em uma gaiola sob um ciclo claro/escuro de 12 h a 22−24 °C e 50%−70% de umidade relativa. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica e Odontológica de Tóquio (ID de aprovação: A2019-204C, A2020-116A e A2021-121A).
1. Preparação de tampões e reagentes
- Preparar o meio de crescimento de células-tronco mesenquimais (meio de crescimento MSC) adicionando o kit de suplemento de meio de crescimento MSC ao meio basal MSC e armazená-lo a 4 °C.
- Preparar o meio Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham's F12 (DMEM/F-12) adicionando 10% de soro fetal bovino (FBS), 50 μg/mL de gentamicina, 200 μM L-alanil-L-glutamina e 1 ng/mL de fator de crescimento fibroblástico básico ao meio e armazená-lo a 4 °C.
- Preparar o meio condrogênico adicionando 1% de suplemento de ITS-G, 0,12% de albumina de soro bovino, 50 μg/mL de gentamicina, 0,35 mM L-prolina, 100 nM de dexametasona e 10 ng/mL de TGF-β3 ao DMEM imediatamente antes do uso.
- Preparar o meio hipertrófico adicionando 10 mM de β-glicerofosfato, 0,12% de albumina de soro bovino, 10 nM de dexametasona, 200 μM de ascorbato-2-fosfato, 50 nM de L-tiroxina, 50 μg/mL de gentamicina e 50 pg/mL de IL-1β ao DMEM imediatamente antes do uso.
- Revestir uma placa de cultura de 24 poços com 200 μL de parafina derretida pré-aquecida a 60 °C. Deixe repousar à temperatura ambiente até que a parafina esteja ajustada.
2. Expansão das CTMs humanas
NOTA: Antes de iniciar os experimentos, CTMs com alto potencial para condrogênese de CTM devem ser selecionadas em microcultura de massa, conforme descrito em17.
- De acordo com as instruções do fabricante, cultivar CTMs primárias derivadas da medula óssea humana (passagem 2) com meio de crescimento CTM em uma placa de 10 cm a uma densidade de 5 x 103 células/cm 2 a 37 °C em incubadora de ar umidificada a 5% CO2 e 95%.
- Troque o meio a cada 2-3 dias. Quando as células atingirem 80%-90% de confluência, aspirar o meio da placa de cultura celular usando uma bomba de vácuo, lavar com 5 mL de PBS e, em seguida, aspirar a solução com uma bomba de vácuo.
- Adicionar 1 mL de solução de tripsina a 0,05%/EDTA a 0,02% ao prato. Incubar o prato durante 5-10 min a 37 °C.
- Adicionar 1 mL de meio de cultura MSC para interromper a reação enzimática. Transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mL.
- Combine a suspensão celular de outras placas no tubo de 50 mL e mantenha-a no gelo.
- Use o contador de células para contar as células misturando 10 μL da suspensão celular com 10 μL de coloração azul de tripano a 0,4%.
- Centrifugar a suspensão celular restante a 220 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente. Retirar o sobrenadante e adicionar solução de criopreservação na concentração de 1,0 x 106 células por mL.
- Distribuir 1 ml da suspensão celular em cada criotubo e conservar a -80 °C durante 12 h antes de transferir para azoto líquido. As existências congeladas resultantes (passagem 3) são utilizadas para este protocolo.
- Para os experimentos, semear as CTMs estocadas em uma placa de 10 cm a uma densidade de 5 x 103 células/cm2. Cultivo de células até 80%-90% confluentes (passagem 4) em meio DMEM/F-12.
3. Preparação de hidrogéis encapsulados em MSC
- Tripsinizar as células e preparar a suspensão celular conforme descrito nos passos 2.3 - 2.6.
- Para fazer 10 construções (2,5 x 105 células por construto), aliquota a suspensão celular contendo 2,5 x 106 células em um microtubo de 1,5 mL.
- Centrifugar a suspensão a 220 x g por 3 min, remover o sobrenadante com uma bomba de vácuo e mantê-lo no gelo.
- Levar o ácido hialurônico modificado por tiol (AH), reticulante reativo a tiol, diacrilato de polietilenoglicol e garrafas de água desgaseificada à temperatura ambiente.
- Em condições estéreis, adicione 1,0 ml de água desgaseificada ao frasco contendo AH (ver instruções do fabricante) utilizando uma seringa com uma agulha.
- Vórtice ocasionalmente aquecendo a 37 °C até que a solução fique clara, em seguida, coloque no gelo. Leva menos de 30 minutos para que os sólidos se dissolvam completamente.
- Em condições estéreis, adicionar 0,5 mL de água desgaseificada ao frasco reticulante usando uma seringa com uma agulha. Dissolva invertendo várias vezes e coloque no gelo.
- Adicionar 120 μL da solução de AH dissolvido à pastilha de células alíquotas (2,5 x 106 células). Ressuspenda o pellet celular pipetando para frente e para trás.
- Adicionar 30 μL da solução de reticulante dissolvido ao tubo que contém o AH e as células (passo 3.8) e combinar batendo no tubo e, em seguida, girar brevemente para baixo. Combinar a solução de AH e a solução de reticulador numa proporção de 4:1.
- Lançar 15 μL da solução combinada contendo CTMs (2,5 x 105 células) sobre a placa de 24 poços revestida com parafina e deixá-la solidificar a 37 °C por 30 min (Figura 2). Devido à alta viscosidade, prepare pelo menos 10% a mais da mistura célula/hidrogel do que o necessário.
NOTA: As características do hidrogel foram descritas anteriormente39.
4. Condições de diferenciação in vitro
- Adicionar 0,5 mL de meio de diferenciação condrogênica a uma construção de hidrogéis de AH com sementes de CTM. Troque o meio a cada 2-3 dias.
- Após 3 semanas, mudar para meio de diferenciação hipertrófica (0,5 mL por poço) e cultivar os construtos por mais 2 semanas.
5. Implantação in vivo de CTMs
- Após um total de 5 semanas de cultura in vitro, implantar-se os construtos por via subcutânea no dorso de camundongos nus, conforme descrito anteriormente38,40.
- Pesar camundongos e administrar um anestésico combinado preparado com 0,75 mg/kg de peso corporal (p.c.) medetomidina, 4,0 mg/kg de p.c. midazolam e 5,0 mg/kg de p.c. butorfanol por injeção intraperitoneal, conforme descrito38.
- Confirmar anestesia adequada por imobilidade aos estímulos cirúrgicos e monitorar a profundidade respiratória por movimentos torácicos lentos e regulares e suprimento adequado de oxigênio pela cor da mucosa rósea periodicamente durante a operação. Use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
- Colocar o camundongo em um pano cirúrgico estéril em decúbito ventral, esterilizar o local da incisão com 50 ppm de água ácido hipoclorosa (pH 5,0; HAW), e coloque um pano cirúrgico perfurado sobre o rato.
OBS: Esterilizar todos os materiais cirúrgicos em autoclave, gás óxido de etileno ou HAW. Os cirurgiões devem lavar os dedos e usar aventais e luvas cirúrgicas. - Faça duas incisões de pele de 5 mm de comprimento com 2 cm de distância nas áreas do ombro e quadril ao longo da linha central da coluna usando uma tesoura.
- Insira uma espátula subcutânea através da incisão para criar uma bolsa subcutânea.
- Insira duas a três construções (~15 μL cada, passo 5.1) em cada bolso com pinças. Construções de AH implantadas na mesma loja são propensas à fusão com muita frequência. Para evitar a fusão, insira uma construção de AH em cada bolsa.
- Fechar as incisões com pontos de seda trançados 4-0. Injetar no camundongo um antagonista dos anestésicos preparados com atipamezol 0,75 mg/kg de p.c., conforme descrito38.
- Enquanto os camundongos se recuperam da anestesia, coloque os camundongos em gaiolas de recuperação estéreis contendo roupas de cama de chão estéreis sem garrafas de comida e água e monitore continuamente a temperatura corporal, o pulso e a respiração.
- Não deixe os ratos sozinhos até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Após a recuperação total, retorne os animais ao criadouro com os demais animais.
- Monitorar os animais a cada dois dias durante o período de cicatrização para quaisquer possíveis complicações. Eutanasiar os camundongos por inalação de dióxido de carbono com pouco sofrimento nas 4 e 8 semanas pós-implantação.
- Incisar a pele nos locais enxertados e remover as construções implantadas com pinças. Fixar os construtos em paraformaldeído a 4% por 16 h e submetê-los à análise.
6. Análise estatística
- Relate dados quantitativos como média ± desvio padrão (DP). Realizar análise estatística utilizando software comercial.
- Use o teste t de Student ou ANOVA one-way seguido do teste de comparações múltiplas de Tukey para determinar diferenças significativas entre os grupos. p<0,05 e p<0,01 indicam diferenças significativas entre os dois grupos.
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Representative Results
Hidrogéis de AH encapsulados em CTM foram cultivados em meio condrogênico suplementado com TGFβ3, um indutor da condrogênese41 (passo 4.1). Comparamos as propriedades do AH com as do colágeno, que tem se mostrado eficaz na criação de enxertos de cartilagem artificial à base de CTM para ossificação endocondral, como descrito anteriormente38. As CTMs indiferenciadas não foram incluídas como controles negativos neste estudo, pois foi demonstrado que as CTMs indiferenciadas necessitam de superfícies mineralizadas como substrato de priming para gerar osso por diferenciação osteogênica (isto é, ossificação intramembrana)7.
O tamanho dos hidrogéis de hialuronano não se alterou ao longo do período de cultivo in vitro , avaliado com base nos diâmetros medidos ao microscópio invertido, enquanto os hidrogéis de colágeno usados para comparação começaram a encolher logo após o início da cultura. Para reduzir a diferença de tamanho entre os construtos de AH e colágeno após cultivo in vitro , o número de CTMs e o volume do gel usado para criar os hidrogéis de AH foram reduzidos pela metade em comparação com aqueles usados para os hidrogéis de colágeno. No entanto, o peso úmido das construções de AH após 3 semanas de cultura de cartilagem foi 4x mais pesado do que o das construções de colágeno.
Diferenciação condrogênica e hipertrófica in vitro.
Após diferenciação condrogênica (na semana 3 de cultivo in vitro ), glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) positivos (Safranin O/coloração verde rápida; Figura 3A) e matriz extracelular positiva para colágeno tipo II foi observada em ambos os construtos, indicando que tanto o AH quanto os hidrogéis de colágeno suportaram a condrogênese. No entanto, em comparação com o construto colágeno, a distribuição de sGAG, colágeno tipo II (Col II) e colágeno tipo X (Col X) foram mais homogêneas em todo o tecido nos construtos de AH. Diferenças entre os dois construtos também foram aparentes na morfologia celular: células com morfologia arredondada semelhante a condrócitos estavam distribuídas por todo o tecido nos construtos de AH. Nas construções do colágeno, entretanto, as células da periferia apresentaram morfologia heterogênea, variando de morfologia irregular/estirada a arredondada. Consistente com isso, a arredondamento média das células nos construtos do AH foi maior do que nos construtos do colágeno, tanto na periferia quanto na região central (34% versus 77,6% (p<0,01) e 78,3% vs. 100% (p<0,05), respectivamente; Figura 3B). Com 5 semanas de cultura, deposição de cálcio foi detectada nas bordas externas em ambos os construtos (vermelho de alizarina; Figura 3C). Além disso, a expressão de marcadores condrogênicos (Sox-9, agrecan (ACAN), Col II), hipertróficos (Col X, metalopeptidase da matriz 13 (MMP-13)) e osteogênicos (colágeno tipo I (Col I), sialoproteína óssea (BSP), osteocalcina (OCN))14 foi detectada por RT-PCR quantitativo em tempo real, confirmando a progressão da diferenciação condrogênica e hipertrófica durante o cultivo in vitro (Figura 4).
Ossificação endocondral de construtos implantados no subcutâneo in vivo.
Bolsas subcutâneas foram criadas no dorso de camundongos nus, e dois a três construtos foram implantados em cada bolsa após a diferenciação hipertrófica (na semana 5 de cultura in vitro). À 4 ou 8 semanas após o implante, todos os construtos de AH foram fixados uns aos outros nas bolsas implantadas (Tabela 1). Nas construções de colágeno, observou-se aderência em 60% das bolsas, enquanto nas demais bolsas os enxertos eram independentes entre si. A coloração pela hematoxilina e eosina (H&E) revelou que, em ambos os construtos, 8 semanas após o implante, tecido osteóide com morfologia lamelar foi formado nas regiões externas dos construtos (Figura 5Aa,f). A coloração por GAG desapareceu nos construtos do AH, indicando perda do fenótipo da cartilagem (Figura 5Ah). Em ambos os construtos, um componente da medula óssea contendo células hematopoéticas e tecido adiposo foi formado entre a cartilagem interna e os tecidos osteóides externos. Em todos os construtos do AH, os tecidos ósseos dos construtos fusionados estavam conectados e circundados por tecido fibroso articular e medula óssea desenvolvidos ao longo do espaço entre os dois construtos aderentes, indicando que múltiplos construtos de AH tendem a formar tecido ósseo integrado (Figura 5Ag). Os constructos colágeno aderidos foram integrados de forma semelhante em dois dos três casos fundidos, mas no terceiro caso, o tecido ósseo dos dois constructos não estava conectado (Tabela 1 e Figura 5Ab). Em ambos os construtos, vasos identificados por células endoteliais CD31-positivas42 foram observados na medula óssea (Figuras 5Ad,i), e as regiões da cartilagem interna foram circundadas por células multinucleadas positivas para TRAP da linhagem osteoclastos, indicando que o tecido cartilaginoso estava sujeito a remodelação (Figuras 5Ae,j).
O mineral foi depositado na região externa do osteóide nos construtos AH e colágeno (Figura 5B). Embora a densidade mineral total do novo osso tenha sido semelhante entre os construtos de AH e colágeno, o volume mineral foi significativamente maior nos construtos de AH do que nos construtos de colágeno, o que pode refletir o fato de que os hidrogéis de AH não encolheram durante o cultivo in vitro , resultando em construções maiores do que os hidrogéis de colágeno (Figura 5C, D).
Figura 1: Delineamento experimental. O primeiro passo deste protocolo é encapsular CTMs expandidas em hidrogéis de AH para promover diferenciação condrogênica e hipertrófica in vitro. Os construtos são cultivados em condições de diferenciação condrogênica por 3 semanas, seguidas por mais 2 semanas em condições de diferenciação hipertrófica. O segundo passo deste protocolo é implantar subcutaneamente os construtos em camundongos nus na semana 5 de cultura in vitro para serem submetidos à ossificação endocondral in vivo por 8 semanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação de hidrogéis com sementes de CTMs. Soltar uma solução de HA/reticulante modificada contendo CTMs em uma placa de 24 poços revestida com parafina e deixar solidificar a 37 °C por 30 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise histológica e imunoistoquímica dos construtos de AH e colágeno após cultivo in vitro 22. (A) Construtos com 3 semanas (3W) de cultura in vitro foram corados para sGAG (safranina O/verde rápido), colágeno tipo II (Col II) e colágeno tipo X (Col X). (B) Os valores médios de circularidade das células em 3 semanas de cultivo in vitro (n = 5). Barras abertas e cinzas indicam construções de colágeno e AH, respectivamente. Os grupos sem letra comum são estatisticamente diferentes (a versus b, p<0,01; b versus c, p<0,05). (C) Construtos com 5 semanas (5W) de cultura in vitro foram corados para cálcio (vermelho de alizarina). Todas as fotos foram capturadas com o mesmo aumento (barra de escala: 200 μm). Uma visão geral de baixa ampliação de todos os tecidos é mostrada nas inserções (Barra de escala: 1 mm). As barras de erro representam a média ± o desvio padrão (DP). A ANOVA one-way seguida do teste de comparações múltiplas de Tukey foi utilizada para determinar diferenças significativas entre os grupos. Este número foi modificado de38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise da expressão gênica dos construtos de AH e colágeno em 3 e 5 semanas de cultivo in vitro. (A) Marcadores condrogênicos e hipertróficos. (B) Marcadores osteogênicos. Os valores são apresentados como média ± desvio padrão (DP) (n = 3). CTMs indiferenciadas expressaram altos níveis de Col I e MMP-13 e baixos níveis de Sox-9 e Col X; eles não expressaram (#) ACAN, Col II, BSP e OCN. As barras de erro representam a média ± o desvio padrão (DP). Este número foi modificado de38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise imunoistoquímica e calcificação dos construtos de AH e colágeno pós-implante com 8 semanas. (A) Foram corados os construtos para Hematoxilina e Eosina (H&E, a, b, f e g), safranina O/Fast Green (c e h), células endoteliais (Cluster of Differentiation 31, CD31) (d e i) e fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP, e e j). (a e f) Visão geral de todos os tecidos (barra de escala = 500 μm). H&E, safranina O, CD31: barra de escala = 200 μm; ARMADILHA: barra de escala = 50 μm. As setas indicam células endoteliais CD31-positivas. Abreviações: c = tecido cartilaginoso interno; o = tecido osteóide externo. (B) MicroTC (μCT) dos construtos colágeno e AH (barras da escala de imagem principal e inset = 2 mm). (C,D) A densidade mineral total (C) e o volume (D) dos construtos AH e colágeno (n = 4). ** indica diferenças significativas; p <0,01. Quatro construtos foram analisados por grupo usando μCT. As barras de erro representam a média ± o desvio padrão (DP). O teste t de Student foi utilizado para determinar diferenças significativas entre os grupos. Este número foi modificado de38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Estratégia para facilitar ECOs usando cartilagem artificial à base de AH. Diagrama esquemático de ossificação e desenvolvimento da medula óssea sem e com fragmentação (μ-pellets) de construções de AH implantadas. (A) Os hidrogéis de AH têm excelente tendência à fusão para formar um osso integrado com vascularização e desenvolvimento medular entre enxertos fundidos in vivo. O tecido implantado resultante, no entanto, permaneceu predominantemente em estado cartilaginoso mesmo 8 semanas após o implante. (B) Dada a tendência das construções de AH de se fundirem para formar osso integrado, o processamento de construções de AH em μ-pellets pode acelerar a taxa de remodelação do tecido transplantado e promover a formação óssea. Micronizar os construtos aumenta a área de superfície, o que pode promover a reabsorção do tecido cartilaginoso e a formação de tecido ósseo, além de promover angiogênese e desenvolvimento da medula óssea, devido ao aumento do espaço para infiltração da célula hospedeira. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Hidrogel | Experiências | Aderiu | Unido | % Unidos |
| Colagénio | 5 | 3 | 2 | 40 |
| HA | 5 | 5 | 5 | 100 |
Tabela 1: Taxa de unificação quando múltiplos construtos foram implantados em uma única bolsa. Dois ou três construtos foram implantados subcutaneamente em uma única bolsa. Os construtos foram colhidos 4 ou 8 semanas após o implante e examinados histologicamente.
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Discussion
O uso de materiais apropriados que promovam a transição da cartilagem hipertrófica para o osso é uma abordagem promissora para ampliar enxertos de cartilagem hipertrófica projetados baseados em CTM e tratar defeitos ósseos de tamanho clinicamente significativo. Aqui, mostramos que o AH é um excelente material de arcabouço para auxiliar na diferenciação do tecido cartilaginoso hipertrófico baseado em CTM in vitro e promover a formação óssea endocondral in vivo38. Além disso, in vivo, construtos de AH foram mostrados para facilitar a fusão de múltiplos construtos implantados na mesma loja para formar um único osso integrado. Como a interação das CTMs com materiais de arcabouço afeta significativamente a cartilagem e a condrogênese hipertrófica, a seleção de material de arcabouço adequado para ECOs é importante para gerar enxertos de cartilagem clinicamente eficazes e manipulados por tecidos. As células embebidas em hidrogéis de AH exibem uniformemente uma morfologia arredondada característica dos condrócitos do centro para a periferia, indicando que o hialuronano fornece um ambiente propício à formação uniforme de cartilagem em todo o hidrogel21,30. Ao contrário do AH, o colágeno interage com as CTMs via sequências de ligação de integrinas (RGDs); no entanto, a persistência dessa interação impede que as CTMs se diferenciem ainda mais na via condrogênica43, o que pode explicar a morfologia não típica das células dos condrócitos, que é proeminente na periferia dos construtos colágeno.
Se vários enxertos se unem para formar um único osso, essa abordagem mediada pela ECO pode ser estendida a defeitos ósseos clinicamente mais relevantes. Quando múltiplas cartilagens hipertróficas baseadas e livres de scaffold foram aplicadas a um único defeito ósseo, foi relatado que os enxertos de cartilagem se integraram ao defeito ósseo. Entretanto, os enxertos adjacentes não se integraram entre si22. A abordagem aqui apresentada pode oferecer uma possível solução para superar essa limitação. Comparados aos construtos colágeno, os múltiplos enxertos de construções de AH tiveram maior tendência a se fundirem para formar um único osso. Além disso, a medula óssea foi formada entre construções de AH fundidas, o que pode estar relacionado ao fato de que o AH suporta diferenciação uniforme da cartilagem ao longo do hidrogel, pois a cartilagem hipertrófica secreta VEGF e fornece um ambiente para o nicho de células-tronco hematopoéticas no desenvolvimento da medula óssea44.
A chave para um experimento bem-sucedido usando este protocolo é a qualidade das CTMs. Recomenda-se confirmar antecipadamente que as CTMs a serem usadas têm potencial de diferenciação condrogênica suficientemente alto. Em segundo lugar, o tamanho de cada construção não deve ser muito grande. Em nossa experiência, o volume de um único construto é limitado a 10-15 μL. Construções maiores podem resultar em penetração insuficiente de oxigênio e nutrientes nos construtos, levando a necrose e pouca diferenciação no centro dos construtos. Portanto, a espessura do gel precisa ser reduzida para melhorar a penetração de oxigênio e nutrientes. Para reduzir a espessura do gel, pode ser útil criar géis finos na membrana porosa das inserções Transwell14,45. Alternativamente, como os construtos do AH tendem a se fundir e formar osso integrado, pode ser adequado implantar muitos construtos menores em vez de um único construto grande, como discutido abaixo.
As limitações deste estudo incluem a necessidade de acelerar a taxa de remodelação dos tecidos implantados para facilitar a formação óssea. O tecido manipulado implantado permaneceu primariamente em estado de cartilagem hipertrófica calcificada mesmo 8 semanas após o implante. Na formação óssea via ECO, as células derivadas do hospedeiro desempenham um papel crítico na promoção da ECO16,46. O fornecimento de canais adicionais em enxertos de cartilagem hipertrófica tem sido relatado como promotor de invasão vascular e mineralização do enxerto invivo20. Tais canais servem como condutos para a infiltração de células hospedeiras, incluindo osteoblastos, osteoclastos e precursores hematopoiéticos, para formar novos tecidos dentro da construção. Alternativamente, tem sido relatado que múltiplos pequenos pellets encapsulados em fibrina (μ-pellets) compostos por CTMs diferenciadas condrogênicas podem ser implantados para formar ossointegrado47. O processamento de construções de AH em μ-pellets poderia aumentar a área de superfície circundada por osteoclastos TRAP-positivos, promovendo assim a taxa de remodelação do tecido cartilaginoso e aumentando a osteogênese (Figura 6)21,48. Além disso, a implantação de μ-pellets aumentaria o espaço de infiltração das células hospedeiras, facilitando a angiogênese e o desenvolvimento da medula óssea e gerando formação óssea integral com vascularização abundante. Assim, considerando a tendência dos construtos de AH de fundir e criar osso integrado, esta estratégia de regeneração óssea μ pode acelerar o processo ECO de enxertos de cartilagem hipertrófica usando hidrogéis de AH.
Em conclusão, os hidrogéis de AH são eficazes na ampliação de enxertos manipulados por tecidos com menos células e géis do que os hidrogéis de colágeno. Além disso, os hidrogéis de AH têm excelente sensibilidade à fusão e produzem osso integrado com vascularização e desenvolvimento medular entre os enxertos fundidos. Portanto, a modificação dos construtos do AH para promover a infiltração da célula hospedeira e o remodelamento do enxerto pode levar ao desenvolvimento de materiais implantáveis que podem promover ainda mais a vascularização e o desenvolvimento da medula óssea. Com maior otimização, esta abordagem poderá ser uma alternativa promissora às terapias ósseas atuais em cirurgia maxilofacial e ortopédica.
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Disclosures
Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) da Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (grant nos. JP19K10259 e 22K10032 ao MAI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
| Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
| Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
| basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
| bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
| Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
| dexamethasone | Merck | D8893 | |
| Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| Dormicum | Astellas Pharma | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
| Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
| Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
| HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
| IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
| ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
| L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
| L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
| L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
| MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
| paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
| PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
| TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
| Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
| Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
| β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |
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