Summary
Mezenkimal kök hücrelerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesiyle endokondral kemikleşme yoluyla kemik tedavisi, geleneksel tedavilerin dezavantajlarını aşma potansiyeline sahiptir. Hyaluronik asit hidrojelleri, in vivo kaynaşmış greftler arasında vaskülarizasyon ile entegre kemik oluşturmanın yanı sıra homojen olarak farklılaşmış kıkırdak greftlerinin ölçeklendirilmesinde etkilidir.
Abstract
Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) kullanılarak yapılan konvansiyonel kemik rejenerasyon tedavisinin, anjiyogenezi indükleyecek bir mekanizmaya sahip olmadığı için kritik boyuttan daha büyük kemik defektlerine uygulanması zordur. MSC'lerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesi, endokondral ossifikasyon (ECO) yoluyla in vivo anjiyogenez ve kemik oluşumunu indükler. Bu nedenle, bu EKO aracılı yaklaşım gelecekte umut verici bir kemik rejenerasyon tedavisi olabilir. Bu EKO aracılı yaklaşımın klinik uygulamasının önemli bir yönü, kemik defektini onarmak için implante edilecek yeterli kıkırdağın hazırlanması için bir protokol oluşturmaktır. Gerçek kemik defektinin şekline uyan boyutta tek bir greftli kıkırdak kütlesi tasarlamak özellikle pratik değildir. Bu nedenle, nakledilecek kıkırdak, birden fazla parça implante edildiğinde bütünleşik olarak kemik oluşturma özelliğine sahip olmalıdır. Hidrojeller, klinik gereksinimleri karşılamak için endokondral kemikleşme için doku mühendisliği greftlerini büyütmek için çekici bir araç olabilir. Doğal olarak türetilen birçok hidrojel, in vitro olarak MSC kıkırdak oluşumunu ve in vivo olarak ECO'yu desteklese de, klinik uygulamaların ihtiyaçlarını karşılamak için en uygun iskele malzemesi henüz belirlenmemiştir. Hyaluronik asit (HA), kıkırdak hücre dışı matrisinin çok önemli bir bileşenidir ve biyolojik olarak parçalanabilen ve biyouyumlu bir polisakkarittir. Burada, HA hidrojellerinin, MSC bazlı kıkırdak dokusunun in vitro farklılaşmasını desteklemek ve in vivo endokondral kemik oluşumunu teşvik etmek için mükemmel özelliklere sahip olduğunu gösteriyoruz.
Introduction
Otolog kemik, travma, konjenital defektler ve cerrahi rezeksiyona bağlı kemik defektlerinin onarımında hala altın standarttır. Bununla birlikte, otojen kemik greftinin donör ağrısı, enfeksiyon riski ve hastalardan izole edilebilecek sınırlı kemik hacmi gibi önemli sınırlamaları vardır 1,2,3,4. Doğal veya sentetik polimerleri kalsiyum fosfat veya hidroksiapatit 5,6 gibi mineralize malzemelerle birleştiren kemik ikameleri olarak çok sayıda biyomalzeme geliştirilmiştir. Bu mühendislik malzemelerinde kemik oluşumu, kök hücrelerin zar içi kemikleşme (IMO) işlemi yoluyla doğrudan osteoblastlara farklılaşmasına izin vermek için genellikle mineralize malzeme bir astar malzemesi olarak kullanılarak elde edilir7. Bu işlem anjiyojenik adımdan yoksundur, bu da implantasyondan sonra greftin yetersiz in vivo vaskülarizasyonuna neden olur 8,9,10 ve bu nedenle, böyle bir işlemi kullanan yaklaşımlar büyük kemik kusurlarını tedavi etmek için optimal olmayabilir 11.
Gelişim sırasında iskeletogenezde doğuştan gelen bir mekanizma olan endokondral ossifikasyon (ECO) sürecini özetlemek için uygulanan stratejilerin, geleneksel IMO tabanlı yaklaşımlarla ilişkili önemli sorunların üstesinden geldiği gösterilmiştir. EKO'da, kıkırdak şablonundaki kondrositler, vasküler infiltrasyonu ve kıkırdak şablonunun kemiğe yeniden şekillenmesini destekleyen vasküler endotelyal büyüme faktörünü (VEGF) serbest bırakır12. Kırık onarımı sırasında da aktive olan kıkırdak yeniden şekillenmesi ve anjiyogenez yoluyla osteogeneze ECO aracılı yaklaşım, MSC'lerden türetilen yapay olarak oluşturulmuş kıkırdak dokusunu bir astar materyali olarak kullanır. Kondrositler kemik defektlerinde hipoksiyi tolere edebilir, anjiyogenezi indükleyebilir ve vasküler serbest kıkırdak greftini anjiyojenik dokuya dönüştürebilir. Çok sayıda çalışma, MSC bazlı kıkırdak greftlerinin böyle bir ECO programı uygulayarak in vivo kemik ürettiğini bildirmiştir 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Bu EKO aracılı yaklaşımın klinik uygulaması için temel bir gereklilik, klinik ortamda istenen miktarda kıkırdak greftinin nasıl hazırlanacağıdır. Gerçek kemik defektine uyan boyutta klinik kıkırdak hazırlamak pratik değildir. Bu nedenle, greft kıkırdağı, birden fazla parça implante edildiğinde bütünleşik olarak kemik oluşturmalıdır22. Hidrojeller, endokondral kemikleşme için doku mühendisliği yapılmış greftlerin ölçeklendirilmesi için çekici bir araç olabilir. Doğal olarak türetilen birçok hidrojel, in vitro MSC kıkırdak oluşumunu ve in vivo ECO 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Bununla birlikte, klinik uygulama gereksinimlerini karşılamak için en uygun destek materyali belirlenememiştir. Hyaluronik asit (HA), kıkırdak33'ün hücre dışı matrisinde bulunan biyolojik olarak parçalanabilen ve biyouyumlu bir polisakkarittir. HA, kondrojenik farklılaşmayı desteklemek için CD44 gibi yüzey reseptörleri aracılığıyla MSC'lerle etkileşime girer 25,26,28,30,31,32,34. Ek olarak, HA iskeleleri, insan diş pulpası kök hücrelerinin35 IMO aracılı osteojenik farklılaşmasını teşvik eder ve kollajen ile birleştirilen iskeleler, ECO aracılı osteogenezi36,37 destekler.
Burada, kemik iliğinden türetilmiş yetişkin insan MSC'leri kullanılarak HA hidrojellerinin hazırlanması ve bunların in vitro hipertrofik kondrogenez ve ardından endokondral ossifikasyon için kullanımı için bir yöntem sunuyoruz in vivo38. HA'nın özelliklerini, kemik dokusu mühendisliğinde MSC'lerle yaygın olarak uygulanan bir malzeme olan ve endokondral ossifikasyon için yapay greftlerin ölçeklendirilmesi için yararlı bir malzeme olan kollajen ile karşılaştırdık17. İmmün sistemi baskılanmış bir fare modelinde, insan MSC'leri ile tohumlanan HA ve kollajen yapıları, deri altı implantasyon ile in vivo ECO potansiyeli açısından değerlendirildi. Sonuçlar, HA hidrojellerinin, MSC'lerin ECO yoluyla kemik oluşumuna izin veren yapay kıkırdak greftleri oluşturması için bir iskele olarak mükemmel olduğunu göstermektedir.
Protokol iki adıma ayrılmıştır. İlk olarak, hyaluronan hidrojel üzerine tohumlanan insan MSC'lerinin yapıları hazırlanır ve in vitro olarak hipertrofik kıkırdağa farklılaştırılır. Daha sonra, farklılaşmış yapılar, in vivo endokondral ossifikasyonu indüklemek için çıplak bir modelde deri altına implante edilir (Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde 4 haftalık çıplak erkek fareler kullanılır. Dört fareyi 22−24 °C ve %50−%70 bağıl nemde 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü altında bir kafeste barındırın. Tüm hayvan deneyleri, Tokyo Tıp ve Diş Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir (onay kimliği: A2019-204C, A2020-116A ve A2021-121A).
1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
- MSC büyüme ortamının ek kitini MSC bazal ortamına ekleyerek mezenkimal kök hücre büyüme ortamını (MSC büyüme ortamı) hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın.
- Ortama %10 fetal sığır serumu (FBS), 50 μg/mL gentamisin, 200 μM L-alanil-L-glutamin ve 1 ng/mL bazik fibroblastik büyüme faktörü ekleyerek Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium ve Ham's F12 (DMEM/F-12) ortamını hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
- Kullanmadan hemen önce DMEM'e %1 ITS-G takviyesi, %0.12 sığır serum albümini, 50 μg/mL gentamisin, 0.35 mM L-prolin, 100 nM deksametazon ve 10 ng/mL TGF-β3 ekleyerek kondrojenik ortam hazırlayın.
- Kullanmadan hemen önce DMEM'e 10 mM β-gliserofosfat, %0.12 sığır serum albümini, 10 nM deksametazon, 200 μM askorbat-2-fosfat, 50 nM L-tiroksin, 50 μg/mL gentamisin ve 50 pg/mL IL-1β ekleyerek hipertrofik ortam hazırlayın.
- 24 oyuklu bir kültür kabını, 60 °C'de önceden ısıtılmış 200 μL erimiş parafin ile kaplayın. Parafin ayarlanana kadar oda sıcaklığında bekletin.
2. İnsan MSC'lerinin genişletilmesi
NOT: Deneylere başlamadan önce, MSC kondrogenezi için yüksek potansiyele sahip MSC'ler,17'de tarif edildiği gibi mikro kitle kültüründe seçilmelidir.
- Üreticinin talimatlarına göre, birincil insan kemiği iliği türevi MSC'leri (pasaj 2), %5 CO2 ve %95 nemlendirilmiş hava inkübatöründe 37 ° C'de 5 x 103 hücre/cm2 yoğunlukta 10 cm'lik bir tabakta MSC büyüme ortamı ile kültürleyin.
- Ortamı 2-3 günde bir değiştirin. Hücreler %80-90 birleşmeye ulaştığında, ortamı bir vakum pompası kullanarak hücre kültürü kabından aspire edin, 5 mL PBS ile yıkayın ve ardından çözeltiyi bir vakum pompası ile aspire edin.
- Yemeğe 1 mL %0.05 tripsin /% 0.02 EDTA çözeltisi ekleyin. Çanağı 37 °C'de 5-10 dakika inkübe edin.
- Enzimatik reaksiyonu durdurmak için 1 mL MSC büyüme ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik tüpteki diğer bulaşıklardan birleştirin ve buz üzerinde tutun.
- 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL %0.4 tripan mavisi lekesi ile karıştırarak hücreleri saymak için hücre sayacını kullanın.
- Kalan hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 220 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve mL başına 1.0 x 106 hücre konsantrasyonda kriyoprezervasyon solüsyonu ekleyin.
- Her bir kriyotüpe 1 mL hücre süspansiyonu dağıtın ve sıvı nitrojene aktarmadan önce -80 °C'de 12 saat saklayın. Elde edilen donmuş stoklar (pasaj 3) bu protokol için kullanılır.
- Deneyler için, stoklanmış MSC'leri 10 cm'lik bir tabakta 5 x 103 hücre/cm2 yoğunlukta tohumlayın. DMEM / F-12 ortamında% 80 -% 90 birleşene kadar (pasaj 4) kültür hücreleri.
3. MSC kapsüllü hidrojellerin hazırlanması
- Hücreleri tripsinize edin ve 2.3 - 2.6 adımlarında açıklandığı gibi hücre süspansiyonunu hazırlayın.
- 10 yapı yapmak için (yapı başına 2.5 x 10 5 hücre), 2.5 x 106 hücre içeren hücre süspansiyonunu1.5 mL'lik bir mikrotüpe ayırın.
- Süspansiyonu 220 x g'de 3 dakika santrifüjleyin, süpernatanı bir vakum pompasıyla çıkarın ve buz üzerinde tutun.
- Tiyol ile modifiye edilmiş hyaluronik asit (HA), tiyol reaktif çapraz bağlayıcı, polietilen glikol diakrilat ve gazı alınmış su şişelerini oda sıcaklığına getirin.
- Steril koşullar altında, iğneli bir şırınga kullanarak HA içeren şişeye 1.0 mL gazı alınmış su ekleyin (üreticinin talimatlarına bakın).
- Vorteks, çözelti berraklaşana kadar ara sıra 37 ° C'ye kadar ısınır, ardından buzun üzerine yerleştirilir. Katıların tamamen çözünmesi 30 dakikadan az sürer.
- Steril koşullar altında, iğneli bir şırınga kullanarak çapraz bağlayıcı şişesine 0,5 mL gazdan arındırılmış su ekleyin. Birkaç kez ters çevirerek eritin, ardından buzun üzerine yerleştirin.
- Aliquoted hücre peletine (2.5 x 106 hücre) 120 μL çözünmüş HA çözeltisi ekleyin. İleri geri pipetleyerek hücre peletini yeniden süspanse edin.
- HA ve hücreleri içeren tüpe 30 μL çözünmüş çapraz bağlayıcı çözeltisi ekleyin (adım 3.8) ve tüpe dokunarak birleştirin ve ardından kısaca döndürün. HA çözeltisini ve çapraz bağlayıcı çözümünü 4:1 oranında birleştirin.
- MSC'ler (2.5 x 105 hücre) içeren kombine çözeltinin 15 μL'sini parafin kaplı 24 oyuklu plakaya damlatın ve 37 °C'de 30 dakika katılaşmasına izin verin (Şekil 2). Yüksek viskozite nedeniyle, gerekenden en az %10 daha fazla hücre/hidrojel karışımı hazırlayın.
NOT: Hidrojelin özellikleri daha önce açıklanmıştır39.
4. İn vitro farklılaşma koşulları
- MSC tohumlu HA hidrojellerin bir yapısına 0.5 mL kondrojenik farklılaşma ortamı ekleyin. Ortamı 2-3 günde bir değiştirin.
- 3 hafta sonra, hipertrofik farklılaşma ortamına (oyuk başına 0.5 mL) geçin ve yapıları 2 hafta daha kültürleyin.
5. MSC'lerin in vivo implantasyonu
- Toplam 5 haftalık in vitro kültürden sonra, yapıları daha önce tarif edildiği gibi çıplak farelerin arkasına deri altından implante edin38,40.
- Fareleri tartın ve 0.75 mg / kg vücut ağırlığı (b.w.) medetomidin, 4.0 mg / kg b.w. midazolam ve 5.0 mg / kg b.w. tarif edildiği gibi intraperitoneal enjeksiyon ile butorphanol38.
- Cerrahi uyaranlara hareketsiz kalarak yeterli anesteziyi doğrulayın ve ameliyat sırasında periyodik olarak yavaş, düzenli göğüs hareketleri ve pembe mukozanın rengine göre uygun oksijen kaynağı ile solunum derinliğini izleyin. Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için gözlerde veteriner merhemi kullanın.
- Fareyi yüzüstü pozisyonda steril bir cerrahi örtü üzerine yerleştirin, insizyon bölgesini 50 ppm hipokloröz asitli su (pH 5.0; HAW) ve farenin üzerine delikli bir cerrahi örtü yerleştirin.
NOT: Tüm cerrahi malzemeleri bir otoklav, etilen oksit gazı veya HAW içinde sterilize edin. Cerrahlar parmaklarını yıkamalı ve cerrahi önlük ve eldiven giymelidir. - Makas kullanarak omurganın orta çizgisi boyunca omuz ve kalça bölgelerinde 2 cm aralıklarla 5 mm uzunluğunda iki cilt kesisi yapın.
- Deri altı bir cep oluşturmak için insizyondan deri altından bir spatula yerleştirin.
- Forseps ile her cebe iki ila üç yapı (her biri ~ 15 μL, adım 5.1) yerleştirin. Aynı cebe implante edilen HA yapıları çok sık füzyona eğilimlidir. Füzyonu önlemek için, her cebe bir HA yapısı yerleştirin.
- Kesiler 4-0 örgülü ipek dikişlerle kapatılır. Fareye 0.75 mg / kg b.w. atipamezol tarif edildiği gibi38.
- Fareler anesteziden kurtulurken, fareleri yiyecek ve su şişeleri olmadan steril zemin yatakları içeren steril kurtarma kafeslerine yerleştirin ve vücut ısısını, nabzı ve solunumu sürekli olarak izleyin.
- Sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareleri gözetimsiz bırakmayın. Tamamen iyileştikten sonra, hayvanları diğer hayvanlarla birlikte üreme odasına geri koyun.
- Olası komplikasyonlar için iyileşme döneminde hayvanları birkaç günde bir izleyin. İmplantasyondan 4 ve 8 hafta sonra çok az acı çekerek fareleri karbondioksit soluyarak ötenazi yapın.
- Aşılı bölgelerdeki cildi kesin ve implante edilen yapıları forseps ile çıkarın. Yapıları 16 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve ardından analize tabi tutun.
6. İstatistiksel analiz
- Nicel verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak raporlayın. Ticari yazılım kullanarak istatistiksel analiz gerçekleştirin.
- Gruplar arasındaki anlamlı farklılıkları belirlemek için Student t-testi veya tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey'in çoklu karşılaştırma testi kullanılmıştır. p<0.05 ve p<0.01 iki grup arasında anlamlı farklılıklar olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MSC kapsüllü HA hidrojeller, kondrogenez41'in bir indükleyicisi olan TGFβ3 ile takviye edilmiş kondrojenik ortamda kültürlendi (adım 4.1). HA'nın özelliklerini, daha önce tarif edildiği gibi, endokondral kemikleşme için MSC bazlı yapay kıkırdak greftleri oluşturmada etkili olduğu gösterilen kollajen özellikleriyle karşılaştırdık38. Farklılaşmamış MSC'ler bu çalışmaya negatif kontroller olarak dahil edilmemiştir, çünkü farklılaşmamış MSC'lerin osteojenik farklılaşma (yani membran içi kemikleşme) yoluyla kemik oluşturmak için astar substratı olarak mineralize yüzeylere ihtiyaç duyduğu gösterilmiştir7.
Hyaluronan hidrojellerin boyutu, ters mikroskop altında ölçülen çaplara göre değerlendirildiği gibi, in vitro kültür periyodu boyunca değişmedi, oysa karşılaştırma için kullanılan kollajen hidrojeller, kültür başladıktan kısa bir süre sonra küçülmeye başladı. İn vitro kültürden sonra HA ve kollajen yapıları arasındaki boyut farkını azaltmak için, MSC'lerin sayısı ve HA hidrojellerini oluşturmak için kullanılan jelin hacmi, kollajen hidrojelleri için kullanılanlara kıyasla yarı yarıya azaltıldı. Bununla birlikte, 3 haftalık kıkırdak kültüründen sonra HA yapılarının ıslak ağırlığı, kollajen yapılarınınkinden 4 kat daha ağırdı.
Kondrojenik ve hipertrofik diferansiyasyon in vitro.
Kondrojenik farklılaşmadan sonra ( in vitro kültürün 3. haftasında), sülfatlanmış glikozaminoglikanlar (sGAG) -pozitif (Safranin O / hızlı yeşil boyama; Şekil 3A) ve her iki yapıda da tip II kollajen pozitif hücre dışı matris gözlendi, bu da hem HA hem de kollajen hidrojellerin kondrogenezi desteklediğini gösterdi. Bununla birlikte, kollajen yapısıyla karşılaştırıldığında, sGAG, tip II kollajen (Col II) ve tip X kollajenin (Col X) dağılımı, HA yapılarında doku boyunca daha homojendi. İki yapı arasındaki farklılıklar hücre morfolojisinde de belirgindi: kondrosit benzeri yuvarlak morfolojiye sahip hücreler, HA yapılarındaki doku boyunca dağıldı. Bununla birlikte, kollajen yapılarında, periferdeki hücreler, düzensiz / gergin morfolojiden yuvarlak morfolojiye kadar değişen heterojen bir morfoloji gösterdi. Bununla tutarlı olarak, HA yapılarındaki hücrelerin ortalama yuvarlaklığı, hem çevre hem de orta bölgelerdeki kollajen yapılarından daha yüksekti (sırasıyla% 34'e karşı% 77.6 (p<0.01) ve% 78.3'e karşı. % 100 (p<0.05); Şekil 3B). 5 haftalık kültürde, her iki yapıda da dış kenarlarda kalsiyum birikimi tespit edildi (alizarin kırmızısı; Şekil 3C). Ayrıca, kondrojenik (Sox-9, agrekan (ACAN), Col II), hipertrofik (Col X, matriks metallopeptidaz 13 (MMP-13)) ve osteojenik (tip I kollajen (Col I), kemik sialoprotein (BSP), osteokalsin (OCN)) belirteçlerinin14 ekspresyonu kantitatif gerçek zamanlı RT-PCR ile tespit edildi ve in vitro kültür sırasında kondrojenik ve hipertrofik farklılaşmanın ilerlemesini doğruladı (Şekil 4).
Deri altına implante edilen yapıların endokondral ossifikasyonu in vivo.
Çıplak farelerin arkasında deri altı cepler oluşturuldu ve hipertrofik farklılaşmadan sonra (in vitro kültürün 5. haftasında) her cebe iki ila üç yapı implante edildi. İmplantasyondan 4 veya 8 hafta sonra, tüm HA yapıları implante edilen ceplerde birbirine tutturulmuştur (Tablo 1). Kollajen yapılarda ceplerin %60'ında adezyon gözlenirken, geri kalan ceplerde greftler birbirinden bağımsızdı. Hematoksilen ve eozin (H&E) boyamaları, her iki yapıda da implantasyondan 8 hafta sonra, yapıların dış bölgelerinde lameller morfolojiye sahip osteoid dokusunun oluştuğunu ortaya koydu (Şekil 5Aa,f). sGAG boyaması HA yapılarında kayboldu ve kıkırdak fenotiplerinin kaybını gösterdi (Şekil 5Ah). Her iki yapıda da iç kıkırdak ile dış osteoid dokular arasında hematopoetik hücreler ve yağ dokusu içeren bir kemik iliği bileşeni oluşturulmuştur. Tüm HA yapılarında, kaynaşmış yapıların kemik dokuları, iki yapışık yapı arasındaki boşluk boyunca gelişen eklem fibröz dokusu ve kemik iliği ile bağlanmış ve çevrelenmiştir, bu da çoklu HA yapılarının entegre kemik dokusu oluşturma eğiliminde olduğunu göstermektedir (Şekil 5Ag). Yapışan kollajen yapıları, kaynaşmış üç vakanın ikisinde benzer şekilde entegre edildi, ancak üçüncü durumda, iki yapının kemik dokusu birbirine bağlı değildi (Tablo 1 ve Şekil 5Ab). Her iki yapıda da kemik iliğinde CD31 pozitif endotel hücreleri42 ile tanımlanan damarlar gözlenmiştir (Şekil 5Ad,i) ve iç kıkırdak bölgeleri, kıkırdak dokusunun yeniden şekillenmeye maruz kaldığını gösteren osteoklast soyunun TRAP pozitif çok çekirdekli hücreleri ile çevrilidir (Şekil 5Ae,j).
Mineral, dış osteoid bölgesinde hem HA hem de kollajen yapılarında birikmiştir (Şekil 5B). Yeni kemiğin toplam mineral yoğunluğu HA ve kollajen yapıları arasında benzer iken, HA yapılarında mineral hacmi kollajen yapılarındakinden önemli ölçüde daha yüksekti, bu da HA hidrojellerinin in vitro kültür sırasında küçülmediği gerçeğini yansıtabilir, bu da kollajen hidrojellerinden daha büyük yapılara neden olur (Şekil 5C, D).
Şekil 1: Deneysel tasarım. Bu protokolün ilk adımı, in vitro kondrojenik ve hipertrofik farklılaşmayı teşvik etmek için genişletilmiş MSC'leri HA hidrojellerinde kapsüllemektir. Yapılar 3 hafta boyunca kondrojenik farklılaşma koşullarında kültürlenir, ardından hipertrofik farklılaşma koşullarında 2 hafta daha kültürlenir. Bu protokolün ikinci adımı, 8 hafta boyunca in vivo endokondral kemikleşmeye maruz kalmak için in vitro kültürün 5. haftasında yapıları çıplak farelere deri altından implante etmektir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MSC tohumlu hidrojellerin hazırlanması. MSC'leri içeren modifiye HA / çapraz bağlayıcı çözeltisini parafin kaplı 24 oyuklu bir plakaya bırakın ve 37 ° C'de 30 dakika katılaşmasına izin verin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İn vitro kültür sonrası HA ve kollajen yapılarının histolojik ve immünohistokimyasal analizi22. (A) 3 haftalık (3W) in vitro kültürdeki yapılar sGAG (safranin O / hızlı yeşil), tip II kollajen (Col II) ve tip X kollajen (Col X) için boyandı. (B) 3 haftalık in vitro kültürde hücrelerin ortalama dairesellik değerleri (n = 5). Açık ve gri çubuklar sırasıyla kollajen ve HA yapılarını gösterir. Ortak harfi olmayan gruplar istatistiksel olarak farklıdır (a vs b, p<0.01; b vs c, p<0.05). (C) 5 haftalık (5W) in vitro kültürdeki yapılar kalsiyum (alizarin kırmızısı) için boyandı. Tüm resimler aynı büyütme oranıyla çekilmiştir (Ölçek çubuğu: 200 μm). Tüm dokuların düşük büyütmeli bir özeti iç kısımlarda gösterilmiştir (Ölçek çubuğu: 1 mm). Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı (SD) temsil eder. Gruplar arasındaki anlamlı farklılıkları belirlemek için tek yönlü varyans analizi ve ardından Tukey'in çoklu karşılaştırma testi kullanıldı. Bu rakam38'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 3 ve 5 haftalık in vitro kültürde HA ve kollajen yapılarının gen ekspresyon analizi . (A) Kondrojenik ve hipertrofik belirteçler. (B) Osteojenik belirteçler. Değerler ortalama ± standart sapma (SD) (n = 3) olarak sunulur. Farklılaşmamış MSC'ler yüksek seviyelerde Col I ve MMP-13 ve düşük seviyelerde Sox-9 ve Col X ifade etti; (#) ACAN, Col II, BSP ve OCN'yi ifade etmediler. Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı (SD) temsil eder. Bu rakam38'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İmplantasyon sonrası 8. haftada HA ve kollajen yapılarının immünohistokimyasal analizi ve kalsifikasyonu . (A) Yapılar Hematoksilen ve Eozin (H & E, a, b, f ve g), safranin O / Fast Green (c ve h), endotel hücreleri (Farklılaşma Kümesi 31, CD31) (d ve i) ve Tartrat dirençli asit fosfataz (TRAP, e ve j) için boyandı. (a ve f) Tüm dokulara genel bakış (ölçek çubuğu = 500 μm). H&E, safranin O, CD31: ölçek çubuğu = 200 μm; TRAP: ölçek çubuğu= 50 μm. Oklar CD31 pozitif endotel hücrelerini gösterir. Kısaltmalar: c = iç kıkırdak dokusu; O = dış osteoid doku. (B) Kollajen ve HA yapılarının MikroCT (μCT) görüntülemesi (ana ve iç görüntü ölçek çubukları = 2 mm). (C,D) HA ve kollajen yapılarının toplam mineral yoğunluğu (C) ve hacmi (D) (n = 4). ** önemli farklılıkları gösterir; p <0.01. Grup başına dört yapı μCT kullanılarak analiz edildi. Hata çubukları ortalama ± standart sapmayı (SD) temsil eder. Gruplar arasındaki anlamlı farklılıkları belirlemek için student's t-testi kullanıldı. Bu rakam38'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: HA bazlı yapay kıkırdak kullanarak ECO'ları kolaylaştırma stratejisi. İmplante edilmiş HA yapılarının parçalanması (μ-peletleri) olmadan ve parçalanması olmadan kemikleşme ve kemik iliği gelişiminin şematik diyagramı. (A) HA hidrojelleri, in vivo kaynaşmış greftler arasında vaskülarizasyon ve kemik iliği gelişimi ile entegre bir kemik oluşturmak için mükemmel bir füzyon eğilimine sahiptir. Bununla birlikte, ortaya çıkan implante edilen doku, implantasyondan 8 hafta sonra bile ağırlıklı olarak kıkırdak durumunda kaldı. (B) HA yapılarının entegre kemik oluşturmak için kaynaşma eğilimi göz önüne alındığında, HA yapılarının μ peletler halinde işlenmesi, nakledilen dokunun yeniden şekillenme oranını hızlandırabilir ve kemik oluşumunu teşvik edebilir. Yapıların mikronize edilmesi, kıkırdak dokusunun emilimini ve kemik dokusunun oluşumunu teşvik edebilen yüzey alanını arttırır ve ayrıca konakçı hücre infiltrasyonu için artan alan nedeniyle anjiyogenez ve kemik iliği gelişimini teşvik edebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Hidrojölesi | Deney | Yapıştırılır | Birleşik | % Birleşik |
| Kollajen | 5 | 3 | 2 | 40 |
| HA (İngilizce) | 5 | 5 | 5 | 100 |
Tablo 1: Tek bir cebe birden fazla yapı implante edildiğinde birleşme oranı. İki veya üç yapı deri altından tek bir cebe yerleştirildi. Yapılar implantasyondan 4 veya 8 hafta sonra toplandı ve histolojik olarak incelendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hipertrofik kıkırdaktan kemiğe geçişi destekleyen uygun iskele materyallerinin kullanılması, MSC bazlı tasarlanmış hipertrofik kıkırdak greftlerini büyütmek ve klinik olarak anlamlı boyuttaki kemik kusurlarını tedavi etmek için umut verici bir yaklaşımdır. Burada, HA'nın in vitro olarak MSC bazlı hipertrofik kıkırdak dokusunun farklılaşmasını desteklemek ve in vivo endokondral kemik oluşumunu teşvik etmek için mükemmel bir iskele materyali olduğunu gösteriyoruz 38. Ayrıca, in vivo, HA yapılarının, tek bir entegre kemik oluşturmak için aynı cebe implante edilen birden fazla yapının füzyonunu kolaylaştırdığı gösterilmiştir. MSC'lerin iskele materyalleri ile etkileşimi kıkırdak ve hipertrofik kondrogenezi önemli ölçüde etkilediğinden, ECO'lar için uygun iskele materyalinin seçilmesi, klinik olarak etkili doku mühendisliği kıkırdak greftleri oluşturmak için önemlidir. HA hidrojellerine gömülü hücreler, merkezden çevreye kondrositlerin yuvarlak bir morfoloji karakteristiğini düzgün bir şekilde sergiler, bu da hyaluronanın hidrojel boyunca tek tip kıkırdak oluşumuna elverişli bir ortam sağladığını gösterir21,30. HA'dan farklı olarak, kollajen, integrin bağlanma dizileri (RGD'ler) aracılığıyla MSC'lerle etkileşime girer; bununla birlikte, bu etkileşimin kalıcılığı, MSC'lerin, kollajen yapılarının çevresinde belirgin olan tipik olmayan kondrosit hücre morfolojisini açıklayabilen kondrojenik yol43'te daha fazla farklılaşmasını önler.
Birden fazla greft tek bir kemik oluşturmak için birleşirse, bu EKO aracılı yaklaşım klinik olarak daha ilgili kemik defektlerine genişletilebilir. Tek bir kemik defektine multipl MSC bazlı ve iskelesiz hipertrofik kıkırdak uygulandığında, kıkırdak greftlerinin kemik defekti ile bütünleştiği bildirilmiştir. Ancak komşu greftler birbirleri ile bütünleşmemiştir22. Burada sunulan yaklaşım, bu sınırlamanın üstesinden gelmek için olası bir çözüm sunabilir. Kollajen yapılarıyla karşılaştırıldığında, HA yapılarının çoklu greftleri, tek bir kemik oluşturmak için kaynaşma eğilimine sahipti. Ayrıca, hipertrofik kıkırdak VEGF salgıladığı ve kemik iliği gelişiminde hematopoietik kök hücre nişi için bir ortam sağladığı için HA'nın hidrojel boyunca tek tip kıkırdak farklılaşmasını desteklemesi ile ilişkili olabilecek kaynaşmış HA yapıları arasında kemik iliği oluşmuştur 44.
Bu protokolü kullanarak başarılı bir deneyin anahtarı, MSC'lerin kalitesidir. Kullanılacak MSC'lerin yeterince yüksek kondrojenik farklılaşma potansiyeline sahip olduğunun önceden doğrulanması önerilir. İkincisi, her yapının boyutu çok büyük olmamalıdır. Deneyimlerimize göre, tek bir yapının hacmi 10-15 μL ile sınırlıdır. Daha büyük yapılar, yapılara yetersiz oksijen ve besin penetrasyonuna neden olabilir, bu da yapıların merkezinde nekroza ve zayıf farklılaşmaya yol açabilir. Bu nedenle, oksijen ve besin penetrasyonunu iyileştirmek için jel kalınlığının azaltılması gerekir. Jel kalınlığını azaltmak için, Transwell eklerinin14,45 gözenekli membranı üzerinde ince jeller oluşturmak faydalı olabilir. Alternatif olarak, HA yapıları kaynaşma ve entegre kemik oluşturma eğiliminde olduğundan, aşağıda tartışıldığı gibi tek bir büyük yapı yerine birçok küçük yapıyı implante etmek yeterli olabilir.
Bu çalışmanın sınırlılıkları, kemik oluşumunu kolaylaştırmak için implante edilen dokuların yeniden şekillenme hızını hızlandırma ihtiyacını içerir. İmplante edilen mühendislik dokusu, implantasyondan 8 hafta sonra bile esas olarak hipertrofik kalsifiye kıkırdak durumunda kaldı. ECO yolu yoluyla kemik oluşumunda, konakçı kaynaklı hücreler ECO16,46'yı teşvik etmede kritik bir rol oynar. Hipertrofik kıkırdak greftlerinde ek kanallar sağlanmasının in vivo20'de vasküler invazyonu ve greft mineralizasyonunu teşvik ettiği bildirilmiştir. Bu tür kanallar, yapı içinde yeni doku oluşturmak için osteoblastlar, osteoklastlar ve hematopoietik öncüler dahil olmak üzere konakçı hücrelerin infiltrasyonu için kanal görevi görür. Alternatif olarak, kondrojenik diferansiye MSC'lerden oluşan çok sayıda küçük fibrin kapsüllü peletin (μ-peletler) entegre kemik47 oluşturmak üzere implante edilebileceği bildirilmiştir. HA yapılarının μ-peletler halinde işlenmesi, TRAP pozitif osteoklastlarla çevrili yüzey alanını artırabilir, böylece kıkırdak dokusunun yeniden şekillenme oranını teşvik edebilir ve osteogenezi artırabilir (Şekil 6)21,48. Ayrıca, μ-peletlerin implantasyonu, konakçı hücrelerin infiltrasyon alanını artıracak, böylece anjiyogenezi ve kemik iliği gelişimini kolaylaştıracak ve bol miktarda vaskülarizasyon ile integral kemik oluşumu oluşturacaktır. Bu nedenle, HA yapılarının kaynaşma ve entegre kemik oluşturma eğilimi göz önüne alındığında, bu μ yapılı kemik rejenerasyon stratejisi, HA hidrojelleri kullanılarak hipertrofik kıkırdak greftlerinin ECO sürecini hızlandırabilir.
Sonuç olarak, HA hidrojeller, kollajen hidrojellerden daha az hücre ve jel içeren doku mühendisliği yapılmış greftlerin ölçeklendirilmesinde etkilidir. Ek olarak, HA hidrojelleri mükemmel füzyon duyarlılığına sahiptir ve kaynaşmış greftler arasında vaskülarizasyon ve kemik iliği gelişimi ile entegre kemik üretir. Bu nedenle, konakçı hücre infiltrasyonunu ve greft yeniden şekillenmesini teşvik etmek için HA yapılarının modifikasyonu, vaskülarizasyonu ve kemik iliği gelişimini daha da teşvik edebilen implante edilebilir materyallerin geliştirilmesine yol açabilir. Daha fazla optimizasyon ile bu yaklaşım, maksillofasiyal ve ortopedik cerrahide mevcut kemik tedavilerine umut verici bir alternatif olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nden (JSPS) Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi (KAKENHI) ile desteklenmiştir. JP19K10259 ve 22K10032'den MAI'ye).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
| Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
| Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
| basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
| bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
| Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
| dexamethasone | Merck | D8893 | |
| Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| Dormicum | Astellas Pharma | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
| Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
| Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
| HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
| IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
| ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
| L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
| L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
| L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
| MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
| paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
| PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
| TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
| Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
| Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
| β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |
References
- Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
- Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
- Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
- Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A.
- Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
- Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D.
- Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
- Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
- Kronenberg, H. M.
- Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
- Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
- Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
- Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
- Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
- Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
- van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
- Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
- Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
- Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
- Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
- Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
- Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
- Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
- Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
- Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
- Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton's jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
- Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
- Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
- Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
- La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
- Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O'Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
- Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
- Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
- Zarembinski, T., Skardal, A. Hydrogels - Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
- Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
- Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
- Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
- Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
- Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
- Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).
