Summary
Denne protokol beskriver en metode, der bruger en patch-clamp til at studere de elektriske reaktioner fra motorneuroner til rygmarvsstimulering (SCS) med høj rumlig tidsmæssig opløsning, hvilket kan hjælpe forskere med at forbedre deres færdigheder i at adskille rygmarven og opretholde cellelevedygtighed samtidigt.
Abstract
Rygmarvsstimulering (SCS) kan effektivt genoprette lokomotorisk funktion efter rygmarvsskade (SCI). Fordi motorneuronerne er den sidste enhed til at udføre sensorimotorisk adfærd, kan direkte undersøgelse af de elektriske reaktioner fra motorneuroner med SCS hjælpe os med at forstå den underliggende logik i spinalmotormodulation. For samtidig at registrere forskellige stimulusegenskaber og cellulære reaktioner er en patch-clamp en god metode til at studere de elektrofysiologiske egenskaber på en enkeltcelleskala. Der er dog stadig nogle komplekse vanskeligheder med at nå dette mål, herunder opretholdelse af cellelevedygtighed, hurtig adskillelse af rygmarven fra knoglestrukturen og brug af SCS til succesfuldt at fremkalde handlingspotentialer. Her præsenterer vi en detaljeret protokol ved hjælp af patch-clamp til at studere de elektriske reaktioner fra motorneuroner til SCS med høj rumlig tidsmæssig opløsning, hvilket kan hjælpe forskere med at forbedre deres færdigheder i at adskille rygmarven og opretholde cellelevedygtigheden på samme tid for jævnt at studere SCS's elektriske mekanisme på motorneuron og undgå unødvendige forsøg og fejl.
Introduction
Rygmarvsstimulering (SCS) kan effektivt genoprette lokomotorisk funktion efter rygmarvsskade (SCI). Andreas Rowald et al. rapporterede, at SCS muliggør lokomotorisk og kropslig funktion i underekstremiteterne inden for en enkelt dag1. Udforskning af SCS' biologiske mekanisme til lokomotorisk genopretning er et kritisk og trendende forskningsfelt for udvikling af en mere præcis SCS-strategi. For eksempel demonstrerede Grégoire Courtines team, at excitatoriske Vsx2-interneuron og Hoxa10-neuroner i rygmarven er nøgleneuronerne til respons på SCS, og cellespecifik neuromodulation er mulig for at genoprette rottegangsevnen efter SCI2. Imidlertid fokuserer få undersøgelser på den elektriske mekanisme i SCS på en enkeltcelleskala. Selvom det er velkendt, at suprathreshold jævnstrømsstimulus kan fremkalde handlingspotentialerne (AP'er) i det klassiske blæksprutteeksperiment 3,4,5, er det stadig uklart, hvordan den pulserende vekslende elektriske stimulering, såsom SCS, påvirker motorsignalgenereringen.
I betragtning af kompleksiteten af intraspinale neurale kredsløb er passende selektion for cellepopulation vigtig for at undersøge SCS's elektriske mekanisme. Selvom SCS genopretter motorfunktionen ved at aktivere den proprioceptive vej6, er motorneuronerne den sidste enhed til at udføre motorkommandoen, afledt af integration af proprioceptionsinformation afferent input7. Derfor kan direkte undersøgelse af de elektriske egenskaber ved motorneuroner med SCS hjælpe os med at forstå den underliggende logik i spinalmotormodulation.
Som vi ved, er patch-clamp den gyldne standardmetode til cellulær elektrofysiologisk optagelse med ekstremt høj spatiotemporal opløsning8. Derfor beskriver denne undersøgelse en metode, der bruger en patchklemme til at studere motorneuronernes elektriske reaktioner på SCS. Sammenlignet med hjerneplaster9 er rygmarvsplasterklemmen vanskeligere af følgende årsager: (1) Rygmarven er beskyttet af rygsøjlen med lille volumen, hvilket kræver meget fin mikromanipulation og streng iskold vedligeholdelse for at opnå bedre cellelevedygtighed. (2) Da rygmarven er for slank til at blive fastgjort på skærebakken, bør den nedsænkes i agarose med lavt smeltepunkt og trimmes efter størkning.
Derfor giver denne metode tekniske detaljer ved dissekering af rygmarven og opretholdelse af cellelevedygtigheden på samme tid for jævnt at studere SCS's elektriske mekanisme på motorneuroner og undgå unødvendige forsøg og fejl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutional Animal Care and Use Committee godkendte alle dyreforsøg, og undersøgelserne blev udført i overensstemmelse med relevante dyrevelfærdsbestemmelser.
1. Tilberedning af dyr
- Dyr
- Boliginformation: Hushanrotter fra Sprague-Dawley (Postnatal 10-14 dage, P10-P14) i et specifikt patogenfrit miljø.
BEMÆRK: Rumforholdene blev opretholdt ved 20 °C ± 2 °C, fugtighed: 50% -60%, med en 12-timers lys / mørk cyklus. Dyrene havde fri adgang til mad og vand. - Mærk motorneuronerne retrograd: Injicer fluor-guld (FG) i den bilaterale tibialis anterior og gastrocnemius muskel (2% i sterilt saltvand, 50 μL pr. Muskel) for retrograd at mærke motorneuronerne 2 dage før offeret.
- Boliginformation: Hushanrotter fra Sprague-Dawley (Postnatal 10-14 dage, P10-P14) i et specifikt patogenfrit miljø.
- Løsninger
- Forbered skæreopløsning: Bland 120 mM cholinchlorid, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1,25 mM NaH 2 PO4, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl2, 1,3 mM ascorbinsyre, 15 mM glucose. Forboble opløsningen med 95%O2 og 5% CO2 (juster til pH 7,4 med KOH) i 30 minutter før dissektion og udskæring. Afkøl opløsningen med knust is.
- Forbered kunstig cerebrospinalvæske (ACSF): Bland 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4; 1,3 mM MgCl2, 2,4 mMCaCl2, 26 mM NaHCO3 og 10 mM glucose. Forboble opløsningen med 95%O2 og 5% CO2 i 30 minutter før inkubationen.
- Forbered intracellulær opløsning: Bland 126 mM K-gluconat, 2 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na 2 ATP, 0,4 mM Na2GTP, 10 mM K-phosphocreatin og 0,5% neurobiotin (pH 7,25 og 305 mOsm / kg). Afkøl opløsningen med knust is.
- Forbered lavsmeltende agarosegel: Opløs 4 g agarose i 100 ml skæreopløsning, og brug en magnetisk omrøringsrotor til at opløse den helt. 30 minutter før indlejring opvarmes agarosen med lavt smeltepunkt i mikrobølgeovnen med høj effekt i 1 min. og overføres derefter til et 39 °C vandbad for at opretholde flydende tilstand.
- Forberedelse af instrumenter
- Anbring knust is på perfusionsbakken (supplerende figur 1A) 10 minutter før perfusion. Den anatomiske bakke (supplerende figur 1B) og skærebakken (supplerende figur 1C) anbringes med et vandbånd ved -80 °C natten over i forvejen.
- Inkubationskammeret med nylonnet anbringes i ovnen ved 45 °C natten over i forvejen.
- Brug agarose med lavt smeltepunkt til at præfabrikere en 35° hældning og en 2 mm tyk platform (supplerende figur 1D). Efter gelstørkning skal du placere dem i midten af en 35 mm petriskål for at understøtte rygmarven i de næste kommende procedurer.
- Intrakardial perfusion
- Bedøv rotterne med 2,5% tribromethanol (160 μL/10 g) via intraperitoneal injektion. Sørg for, at rotterne bedøves fuldt ud ved at verificere manglen på respons på eksterne stimuli, såsom en blid knivspids af tåen.
- Når den korrekte bedøvelse er bekræftet, skal du placere rotterne liggende og immobilisere dem i petriskålen fyldt med silicagel.
- Skær et 5 mm langsgående hudsnit kausalt til xiphoidprocessen, og udvid derefter det subkutane rum fuldstændigt. Skær et 2 cm langsgående hudsnit langs den ventrale midterlinje for fuldt ud at udsætte den ydre brystvæg, begyndende med ovennævnte snit og slutter med toppen af brystet.
- Brug tandpincet til at løfte xiphoiden (supplerende figur 2A), og brug derefter en fin saks til at klippe membranen. Skær brystbenet langs begge sider af xiphoidprocessen for at åbne brystet og udsætte hjertet (supplerende figur 2B).
BEMÆRK: Vær omhyggelig med at bevare de indre thoraxkar på begge sider; Ellers kan det forårsage massiv blødning. - Brug tandløs pincet til at løfte venstre ventrikel. Indsæt en 22 G nål i venstre ventrikelspids langs længdeaksen i venstre ventrikel (supplerende figur 2C). I mellemtiden skal du observere den rytmiske blodpulsering i perfusionsrøret, eller nålen kan punktere i højre ventrikel, hvilket kan føre til en dårlig perfusionseffekt.
BEMÆRK: Tandpincet bør ikke bruges; Ellers kan det forårsage ekstra blodlækage fra pincetten. - Brug en finsaks til at klippe det højre atrium (supplerende figur 2C), og injicer derefter manuelt 100 ml iskold perfuseringsvæske med en hastighed på ca. 2 ml / s inden for 1 min.
BEMÆRK: Når rotters lever og poter bliver blege, og der ikke strømmer blod ud fra højre atrium, kan der opnås god perfusion.
- Rygmarv dissektion (figur 1)
- Placer rotten i den udsatte position, og skær rygsøjlen ved henholdsvis den forreste overordnede iliac rygsøjle (ca. L4 vertebrale niveau) og krumningsforskydningspunktet for brystsøjlen (ca. T6 vertebrale niveau) (figur 1A). Derefter anbringes straks den isolerede rygsøjle i den iltede iskolde perfuserende opløsning for at vaske det resterende blod og fedtvæv af; Denne procedure er gavnlig for at holde det operative felt rent i de efterfølgende procedurer.
BEMÆRK: Paraspinalmusklerne skal reserveres, hvilket er befordrende for den efterfølgende fiksering af rygsøjlen ved hjælp af en insektstift. - Overfør straks den isolerede rygsøjle til den anatomiske bakke (figur 1B) med rygsiden opad og rostralenden tæt på operatøren. Fyld den anatomiske bakke med 50 ml kontinuerligt iltet iskold skæreopløsning (figur 1B).
- Brug fire insektstifter til at fiksere rygsøjlen ved at trænge ind i paraspinalmusklerne (figur 1B).
- Under dissektionsmikroskopet skæres vertebrale pedikler på begge sider fra den rostrale ende med mikrosaksen, som kan betegnes "laminektomi" (figur 1C). Vær opmærksom på ikke at beskadige rygmarven. I mellemtiden skal du bruge den mikrotandede pincet til at løfte den afskårne rygsøjle.
- Efter laminektomi må du ikke straks adskille rygmarven fra rygmarven. Brug i stedet en mikrosaks til at skære dura mater langs den dorsale midterlinje, hvilket er befordrende for næringsstofoptagelse mellem celler og iltet ACSF (figur 1D).
BEMÆRK: Riv aldrig dura mater. Det er kun tilladt at klippe dura mater med en mikrosaks; Ellers vil nerveroten og spinal parenchymen blive alvorligt beskadiget! - Løft den rostrale del af rygmarven, og skær derefter forsigtigt nerveroden med ca. 1 mm reserveret (figur 1E). Efter adskillelse af rygmarven fra rygsøjlen skal du bruge 2 insektstifter til at fastgøre rygmarven med den ventrale side opad (figur 1F).
- Brug en mikrosaks til at skære dura mater langs den ventrale midterlinje (figur 1F). Afskær de overflødige nerverødder med ca. 1 mm reserveret.
BEMÆRK: Nerven er meget mere vedholdende end rygmarven. Hvis den reserverede nerverod er for lang (>1 mm), kan vibratomet ikke afskære nerveroden, hvilket kan føre til en alvorlig rift i rygmarvsparenchymen. - Brug en mikrosaks til at adskille lændeforstørrelsen til en længde på 6-7 mm (figur 1G).
- Placer rotten i den udsatte position, og skær rygsøjlen ved henholdsvis den forreste overordnede iliac rygsøjle (ca. L4 vertebrale niveau) og krumningsforskydningspunktet for brystsøjlen (ca. T6 vertebrale niveau) (figur 1A). Derefter anbringes straks den isolerede rygsøjle i den iltede iskolde perfuserende opløsning for at vaske det resterende blod og fedtvæv af; Denne procedure er gavnlig for at holde det operative felt rent i de efterfølgende procedurer.
- Indlejring i den lavsmeltende agarose
- Placer lændeforstørrelsen på 35 ° hældningen (figur 1H) med rygsiden opad og kaudale ende nedad. Brug et absorberende filterpapir til at fjerne rigeligt vand på vævsoverfladen (figur 1H).
- Hæld langsomt den smeltede agarosegel i petriskålen, der indeholder lændeforstørrelsen, (figur 1I).
BEMÆRK: Hæld ikke for hurtigt, ellers ophobes bobler i gelen. - Placer ovennævnte petriskål i isvandsblandingen for at afkøle gelen så hurtigt som muligt, hvilket bidrager til at opretholde cellernes aktivitet.
- Trim gelen i en terning på 15 mm x 10 mm x 10 mm, og monter den på prøveskiven med superlim (figur 1J).
- Udskæring
- Prøveskiven anbringes i den forfrosne skærebakke, og hæld derefter den iskolde skæreopløsning (figur 1K). Bobles kontinuerligt med 95% CO 2 og 5% O2 i skærebakken.
- Indstil vibratomparametrene: tykkelse: 350 μm; hastighed: 0,14-0,16 mm / s, amplitude: 1,0 mm og vibrationsfrekvens: 85 Hz.
- Høst 2-3 egnede skiver pr. Dyr. Optag 1-2 sunde FG + motorneuroner pr. Skive med et interval på 5-6 celler pr. Dyr.
- Inkubation
- Brug dækglidepincet til at klippe en skive (figur 1L) og placere den i inkubationskammeret fyldt med kontinuerligt iltet ACSF. Inkubationskammeret anbringes i vandbad ved 32 °C i 30 minutter, og inkuberes derefter ved stuetemperatur (RT) i yderligere 30 minutter før optagelsen.
BEMÆRK: Ovenstående procedurer, fra anæstesi til opnåelse af den første skive, skal afsluttes inden for 20-30 minutter for at bevare cellernes levedygtighed så meget som muligt. Motorneuronerne i hver skive kan opretholde deres levedygtighed i ca. 6-7 timer.
- Brug dækglidepincet til at klippe en skive (figur 1L) og placere den i inkubationskammeret fyldt med kontinuerligt iltet ACSF. Inkubationskammeret anbringes i vandbad ved 32 °C i 30 minutter, og inkuberes derefter ved stuetemperatur (RT) i yderligere 30 minutter før optagelsen.
2. Patch-clamp-optagelse med SCS (figur 2)
- Præparater
- Perfus optagekammeret med kontinuerligt boblet ACSF med en hastighed på ca. 1-2 ml / min. Juster flowhastigheden individuelt via kontrolpanelet på den peristaltiske pumpe.
- Anbring et udsnit i optagekammeret. Brug den U-formede platintråd med nylontråde til at stabilisere skiven fast på plads.
- Brug et infrarødt differenskontrastmikroskop (IR-DIC) til at observere udsnittet. Under 4x objektivlinsen skal du bekræfte, at længden af dorsalroten er ca. 1 mm. Find det område, hvor dorsalroten kommer ind i parenchymen, og flyt derefter det centrale synsfelt til dette område.
- Tilslut pulsgeneratoren med specialfremstillede elektroder (figur 2A).
- SCS-konfiguration
- SCS-anoden placeres nær den dorsale midterlinje via mikromanipulationssystemet (figur 2B).
- Placer katoden af SCS nær dorsalrodsindgangszonen (DREZ) via mikromanipulationssystemet (figur 2B).
- Målretning og billeddannelse af celler
- Brug IR-DIC med en 10x objektivlinse groft finde det dorsolaterale område af motorsøjlen, hvor de fleste motorneuroner er placeret. Flyt derefter det centrale synsfelt til dette område.
- Skift til en 60x objektivlinse for at finde en sund neuron med en glat og lys overflade og usynlige kerner (figur 2C, F).
- Skru lidt ned for IR-intensiteten, og tænd fluorescenslyskilden. Skift lysfilteret til bredbåndsfilteret for ultraviolet excitation (figur 2D, G) for at vælge et passende FG-positivt (FG +) motorneuron (figur 2E, H).
- Brug sugeelektroder til at anvende 1x motorisk tærskelstimulering på dorsalroden. Hvis der opdages et fremkaldt handlingspotentiale i motorneuronerne (supplerende figur 3), bekræfter det, at dorsalrotens aktivitet er intakt. Hvis ikke, skal denne skive kasseres.
- Patch-clamp optagelse
- Fyld mikropipetten med den intracellulære opløsning, og sæt den i elektrodeholderen. Brug mikromanipulationssystemet til at sænke pipetten ned i ACSF-badet. Pipettens modstand varierer fra 5-8 MΩ.
- Påfør en lille mængde positivt tryk på pipetten for at blæse støv og cellerester væk.
- Sænk elektroden for at nærme sig cellen. Når pipetten berører overfladen af FG+ neuron, bliver en lille fordybning af membranen synlig på spidsniveauet. Slip det positive tryk.
- Påfør derefter en lille mængde undertryk på pipetten ved hjælp af en sprøjte. Dette skaber en lille mængde sug, der trækker cellemembranen i kontakt med glaspipetten. Vær altid opmærksom på den samlede modstand på softwaregrænsefladen, indtil modstandsværdien stiger til gigaohms (>1 GΩ). Derefter dannes gigasealen.
- Klem membranpotentialet ved -70 mV, og tryk derefter på knappen til hurtig kapacitanskompensation på forstærkerens softwaregrænseflade. Påfør forsigtigt et forbigående undertryk for at sprænge cellemembranen, og tryk derefter på knappen til langsom kapacitanskompensation på forstærkerens softwaregrænseflade. På dette tidspunkt opnås en god helcellekonfiguration.
- Skift til strømklemmetilstand ved at klikke på IC-knappen på softwaregrænsefladen, og registrer hvilemembranpotentialet (RMP).
- Påfør SCS i 1-2 s med amplituden på 1-10 mA, mens pulsbredden og frekvensen er fastsat til henholdsvis 210 μs og 40 Hz. Bestem motortærsklen ved langsomt at øge stimuleringsamplituden, indtil den første AP observeres.
- Skelne mellem forsinkede og øjeblikkelige affyringsmotorneuroner ved hjælp af en 5 s depolariserende strøminjektion omkring rheobase i strømklemmetilstand10,11,12. Øjeblikkelig fyring motorneuroner: Lav reobase kan fremkalde øjeblikkelig og gentagen fyring med stabil fyringsfrekvens; Forsinket fyring af motorneuroner: Høj reobase kan fremkalde en forsinket begyndelse for gentagen fyring med en accelererende affyringshastighed (figur 3).
- Når SCS er slukket, skal du fortsætte med at registrere membranpotentialet til at fange den spontane AP-affyring.
- Udfør spændingsklemmeoptagelser spændingsklemmeoptagelser til excitatorisk postsynaptisk strøm (EPSC), når SCS er tændt og slukket. Stimuleringsparameteren er 1x motortærskel, 210 μs, 2 Hz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Takket være den strenge vedligeholdelse ved lave temperaturer under den fine operation (supplerende figur 1, supplerende figur 2 og figur 1) var cellelevedygtigheden god nok til at udføre efterfølgende elektrofysiologiske registreringer. For at simulere det kliniske scenarie så meget som muligt brugte vi mikromanipulation til at placere SCS-katoden og anoden nær henholdsvis dorsal midterlinje og DREZ (figur 2), som kunne initiere neuralt signal i dorsalhornet for at forplante sig til motorneuronerne i den dorsolaterale region af motorsøjlen. I denne undersøgelse brugte vi FG til at lokalisere motorneuronerne med en diameter på 20-50 μm. Som vist i figur 2D, G bekræftede vi med sikkerhed en sund FG + neuron som en motorneuron - terminalen i rygmarvskredsløbet. Denne mærkningsmetode banede vejen for at studere, hvordan SCS påvirker fyringsmønsteret. De elektrofysiologiske egenskaber ved forsinket og øjeblikkelig affyring af motorneuroner er anført i supplerende tabel 1 og supplerende tabel 2. Metoderne til beregning af de aktive og passive egenskaber findes i supplerende fil 1.
Da SCS leverede et pulserende vekslende elektrisk felt til rygskiven, brugte vi først strømklemmetilstand til at registrere membranpotentialets respons (figur 4). Da vi gradvist øgede stimuleringsamplituden med et trin på 1/3 motorisk tærskel (figur 4B, C), steg membranpotentialet også med det, men kun 1x motorisk tærskel kunne fremkalde Aps (figur 4D). Figur 4D viser, at omkring hver 10-20 impulser kan fremkalde en AP, hvilket indikerer, at der kan eksistere en bestemt AP-responsregelmæssighed til SCS-amplitude.
Efter SCS blev slukket, fortsatte vi med at registrere membranpotentiale. Figur 5 viste, at membranpotentialet steg lidt til -60 mV, og neuronen fyrede en række spontane AP'er. Disse spontane AP'er varer i en kort periode (30-40 s), hvorefter membranpotentialet vender tilbage til -65 mV, hvilket indikerer, at SCS midlertidigt kan øge celleexcitabiliteten.
Derefter brugte vi spændingsklemmeoptagelser til EPSC, når SCS var tændt og slukket (figur 6). Efter hver SCS-puls kunne en fremkaldt EPSC detekteres. Latenstiden mellem stimulusartefakten og EPSC var 2,64 ± 0,38 ms (supplerende figur 4). Amplituden af fremkaldte EPSC'er var 35,14 ± 12,73 pA (supplerende figur 4). Hyppigheden af fremkaldte EPSC'er er i overensstemmelse med SCS-frekvensen. Efter at have trukket den passive ladningsbalancering fra, kan den fremkaldte EPSC observeres i en levedygtig motorneuron efter 1x motortærskelstimulering (supplerende figur 5A). Stimuleringspolariteten blev vendt efter at have stoppet perfusionen i 2 timer i den samme celle. Stimuleringen inducerede ikke nogen EPSC, hvilket bekræftede, at den fremkaldte EPSC ikke var en artefakt (supplerende figur 5B).
Figur 1: Rygmarvsdissektion og udskæring. (A) Skær rygsøjlen ved henholdsvis den forreste overordnede iliac rygsøjle (ca. L4 vertebral niveau) og krumningsforskydningspunktet for brystsøjlen (ca. T6 vertebral niveau). (B) Overfør straks den isolerede rygsøjle til den anatomiske bakke med ryggen opad og rostralenden tæt på operatøren. Fyld den anatomiske bakke med den kontinuerligt iltede iskolde skæreopløsning. (C) Udfør laminektomi på begge sider fra den rostrale ende. (D) Skær dorsal dura mater, som er befordrende for næringsstofoptagelse mellem celler og iltet kunstig cerebrospinalvæske (ACSF). (E) Skær forsigtigt nerveroden. (F) Skær den ventrale dura mater. g) Lændeforstørrelsen adskilles i en længde på 6-7 mm. (H) Placer lændeforstørrelsen på 35 ° hældningen med rygsiden opad og haleenden nedad. Brug et absorberende filterpapir til at fjerne rigeligt vand på vævsoverfladen. (I) Hæld langsomt den smeltede agarosegel i petriskålen. (J) Trim gelen i en terning og monter den på prøveskiven med superlim. (K) Anbring prøveskiven i skærebakken, og hæld derefter den iskolde skæreopløsning. (L) Et eksempel på en rygmarvsskive ved lændeforstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Spinal cord stimulation (SCS) konfiguration og motor neuron billeddannelse. (A) Pulsgeneratoren med specialfremstillede elektroder kan separat justere amplitude, pulsbredde og frekvens. Indløb viste, at den dimensionelle specifikation af en elektrodekontakt er 800 μm x 500 μm x 300 μm. (B) Placer anoden og katoden nær henholdsvis den dorsale midterlinje og dorsalrodsindgangszonen (DREZ) via mikromanipulationssystemet. Placer optagepipetten i det dorsolaterale område af motorsøjlen for at fastspænde de fluor-guldpositive (FG +) motorneuroner. (C) En sund øjeblikkelig fyring motor neuron med infrarød differentiel interferens kontrastmikroskop (IR-DIC) billeddannelse (60x). (D) Den samme neuron med kun fluorescensbilleddannelse (60x), skinnende fluor-guld (FG) partikler repræsenterer, at denne neuron er en motorneuron. (E) Fusioneret billede af IR-DIC og fluorescens i FG + motorneuron. (F-H) En sund forsinket fyring motor neuron med IR-DIC billeddannelse (60x). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skel mellem forsinkede og øjeblikkelige affyringsmotorneuroner ved hjælp af en 5 s depolariserende strøminjektion. (A) Øjeblikkelig affyring af motorneuroner: Lav reobase kan fremkalde øjeblikkelig og gentagen fyring med stabil fyringsfrekvens; (B) Forsinket fyring af motorneuroner: Høj reobase kan fremkalde en forsinket begyndelse for gentagen fyring med en accelererende affyringshastighed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Rygmarvsstimulering (SCS) fremkaldte handlingspotentialer (AP'er) fyring i motorneuroner . (A) Når der ikke blev anvendt stimulering, var hvilemembranpotentialet (RMP) -65 mV. (B) 1/3x motorisk tærskelstimulus kan ikke fremkalde AP'er. (C) 2/3x motorisk tærskelstimulus kan ikke fremkalde AP'er. (D) 1x motorisk tærskelstimulus kan fremkalde AP'er, og hver 10-20 impulser kan fremkalde en AP. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Spontane handlingspotentialer (AP'er) fyring efter rygmarvsstimulering (SCS). Efter at SCS blev slukket, fyrede neuronen en række spontane AP'er i en kort periode (30-40 s), hvorefter hvilemembranpotentialet (RMP) vendte tilbage til -65 mV. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Illustration af rygmarvsstimulering (SCS) parameter og fremkaldt excitatorisk postsynaptisk strøm (EPSC). (A) Illustration af SCS-parameter; (B,C) Efter en enkelt stimuleringspuls (1x motorisk tærskelstimulering) kan den fremkaldte EPSC observeres; (D) Efter fradrag af den passive ladningsbalancering kan EPSC's latenstid og amplitude beregnes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Forberedelse af instrumenter. (A) Perfusionsbakke: 10 minutter før perfusionen anbringes knust is på 10 cm petriskålen fyldt med silicagel. B) Anatomisk bakke: Natten før ofringen anbringes den selvfremstillede anatomiske bakke fyldt med silicagel i køleskabet -80 °C. C) Skærebakke: Natten før ofringen anbringes skærepladen med vandbånd i køleskabet -80 °C. (D) Agarose-støbehældning: 30 minutter før perfusionen placeres en 35° agarosehældning med bundplader i midten af en 35 mm petriskål. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Intrakardial perfusion. (A) Løft xiphoid-processen. (B) Skær brystbenet langs begge sider af xiphoid-processen for at åbne brystet og udsætte hjertet. Pas på ikke at beskadige de indre thoraxkar, ellers vil massiv blødning fylde hele operationsfeltet og hæmme operatøren i at identificere ventrikelspidsen eller højre atrium. (C) Indsæt en 22 G nål i venstre ventrikelspids til perfusion og skær højre atrium til væskeudgang. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Bekræftelse af dorsalrodsaktiviteten. Brug sugeelektroder til at anvende 1x motorisk tærskelstimulering på dorsalroden. Hvis der opdages et fremkaldt handlingspotentiale i motorneuronerne, kan vi bekræfte, at dorsalrotens aktivitet er intakt. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4: Latenstid og amplitude af fremkaldte EPSC'er, når SCS var aktiveret. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 5: Påvisning af gyldigheden af det fremkaldte EPSC. (A) Efter 1x motorisk tærskelstimulering efter fratrækning af passivladningsbalanceringen kan den fremkaldte EPSC observeres i en levedygtig motorneuron; (B) Efter at have stoppet perfusionen i 2 timer i den samme celle blev stimuleringspolariteten vendt, 1x motortærskelstimulering inducerede ikke nogen EPSC, hvilket bekræftede, at den fremkaldte EPSC ikke var en artefakt. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: Beregningsmetoder for de aktive og passive egenskaber. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Passive egenskaber af motorneuroner. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 2: Aktive egenskaber af motorneuroner Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bevægelsesinformationen moduleret af SCS konvergeres endelig til motorneuronerne. Derfor kan det at tage motorneuronerne som forskningsmål forenkle undersøgelsesdesignet og afsløre neuromodulationsmekanismen for SCS mere direkte. For samtidig at registrere forskellige stimulusegenskaber og cellulære reaktioner er en patch-clamp en god metode til at studere de elektrofysiologiske egenskaber på en enkeltcelleskala. Der er dog stadig nogle vanskeligheder, herunder hvordan man opretholder cellelevedygtighed, hvordan man hurtigt adskiller rygmarven fra knoglestrukturen, og hvordan man bruger SCS til at inducere AP'er med succes. Derfor har denne undersøgelse til formål at hjælpe forskere med hurtigt at forstå væsentlige operative færdigheder, undgå nogle mulige faldgruber og fokusere på undersøgelsesdesignet snarere end metoden så tidligt som muligt.
For at opnå god cellelevedygtighed skal man altid være opmærksom på følgende detaljer: (1) Det er meget vigtigt at holde rygmarven ved iskold temperatur, fordi lav temperatur kan hæmme celledød og bremse stofskiftet, hvilket kan beskytte neuronen mod mekanisk skade under perfusion, dissektion og udskæring13; (2) Forsigtigt fjernelse af dura mater med mikrosaks kan forbedre optagelsen af neuronale næringsstoffer fra omgivende opløsninger. Skræl aldrig dura mater direkte af; Ellers vil rygmarven blive alvorligt beskadiget. Derudover, hvis du glemmer at rydde dura mater, kan den efterfølgende udskæringsproces være vanskelig, fordi bladet muligvis ikke helt afskærer dura mater og derefter river den resterende rygmarv ud af agarose, hvilket kan føre til svigt i udskæring. (3) Sammenlignet med konventionel tværgående skive øger skrå skiver arealet af gråt stof, og du kan finde flere FG + motorneuroner i en enkelt skive9. (4) Fordi rygmarven alene ikke kan fastgøres fast på prøveskiven som hjernen, er indlejring i agarosegel effektiv til at løse dette problem uden at mindske cellelevedygtigheden. Vi anbefaler at bruge lavsmeltende agarose (gelpunkt 26-30 °C) i stedet for konventionel agarose (gelpunkt 38-43 °C), da høj temperatur kan skade cellens levedygtighed. (5) Vi anbefaler, at afstanden mellem to nylontråde af U-formet platintråd skal være 1 til 1,5 mm, fordi løse tråde ikke kan immobilisere rygmarven fast, og tætte tråde kan klemme cellen.
Sammenlignet med de konventionelle stimuleringsanordninger, såsom bipolære krogelektroder, der i vid udstrækning anvendes i grundforskning, stammer SCS-elektroden i denne undersøgelse fra vores tidligere kliniske arbejde14 og grundforskning15. SCS leverer pulserende vekslende elektrisk stimulering, hvilket giver forskellige parameterjusteringsdimensioner. Denne SCS-enhed har også en ladningsbalancefunktion for at undgå vævselektrolyse og kommer ikke direkte i kontakt med det neurale væv; derfor har denne SCS god sikkerhed til in vivo-applikationer .
Efter SCS-behandling kan de spontane AP'er af motorneuroner tilskrives følgende årsager: (1) SCS inducerer ladningen til at akkumulere i cellelegemet og axonal colliculus af neuroner, hvilket fører til stigningen i RMP16. Dette fænomen indikerer, at SCS kan forbedre excitabiliteten af neuron, hvilket kan være relateret til ændringen af ledningsevne af ionkanaler efter SCS, såsom Na v 1.117, K v 2.1 18 eller Ca v 2.3 19. (2) SCS kan aktivere dorsale GABAerge neuroner for at lette proprioceptiv feedback til motorneuroner. Vi foreslår, at neural transmission kontinuerligt kan eksistere mellem de sensoriske neuroner og motorneuroner, hvilket fører til spontane AP'er i motorneuroner efter SCS. Spontane AP'er kan opretholde en iboende tilstand af beredskab til at udføre sensorimotorisk adfærd20. Derfor kan aktivering eller hæmning af spontane AP'er være gavnligt til behandling af rygmarvsneurologiske sygdomme.
Som vi ved, er in vivo elektrofysiologisk optagelse bedre til påvisning af elektrofysiologisk respons under den naturlige fordeling af det elektriske felt og placeringen af elektroder. Desuden muliggør in vivo motoneuronoptagelser identifikation af motoneuronidentitet. Dette kan gøres gennem antidromisk identifikation af motoraxoner kombineret med muskelfiberkraftmåling21. Men in vivo rygmarvsoptagelser har også følgende ulemper: (1) Motorneuron ligger 2-3 mm væk fra rygmarvens dorsale overflade, selv ved hjælp af den mest avancerede to-foton konfokale billeddannelse, er observationsdybden kun 500-800 μm, så det er vanskeligt at optisk observere dem in vivo ved hjælp af de eksisterende metoder. Derfor, hvis vi nøjagtigt vil klemme en enkelt motorneuron in vivo, skal glaspipetten passere gennem rygsøjlen for at nå det usynlige motorneuron; In vivo patch-clamp kan kun udføres på en "blind" måde, hvilket resulterer i betydelig usikkerhed og fejlrate. (2) Bortset fra in vivo patch-clamp kan siliciumelektrodeoptagelser være den alternative metode, såsom Utah array eller Neuropixels elektrode. Imidlertid er signalerne registreret af siliciumelektroder for det meste sammensat aktionspotentiale snarere end enkeltaktionspotentiale. Selvom aktiviteten af enkelte neuroner er blevet løst ved hjælp af spike-sorteringsalgoritmer, skal nøjagtigheden og pålideligheden af sorteringsalgoritmer stadig forbedres.
Sammenlignet med in vivo-optagelserne er den største fordel ved in vitro mod in vivo brugen af spændingsklemme, som giver en unik forståelse af de synaptiske veje, der aktiveres af SCS. Desuden vil det også gøre det muligt at anvende værktøjer til levende billedbehandling. Vi spekulerer i, at SCS inducerer frigivelsen af neurotransmittere som GABA og glutamat fra neuroner på øverste niveau på motorneuronerne, hvilket resulterer i et samlet excitatorisk EPSC-respons7. Derfor vil vi i vores kommende forskning inkorporere påvisning af IPSC, mini EPSC (mEPSC) og fremkaldt EPSC induceret af SCS for at afklare mønstrene for hæmmende og excitatorisk neurotransmitterfrigivelse fra præmotoriske neuroner eller interneuroner. Vi anerkendte fuldt ud, at in vitro-stimulering også har nogle begrænsninger: (1) Langtrækkende langsgående kredsløb i rygmarven forstyrres, hvilket resulterer i tab af indgående information fra motorcortex eller underekstremitet; (2) Fordelingen af elektriske felter under in vitro-stimulering kan afvige fra fordelingen ved in vivo-stimulering. I denne undersøgelse var aktiveringstærsklen (ca. i milliampere) for AP'er meget højere end for in vivo-eksperimentet (ca. i mikroampere)15; dette skyldtes, at volumenkapaciteten af ACSF-opløsningen i optagekammeret var meget højere end cerebrospinalvæsken i naturlig tilstand, og matematisk teori understøtter, at elektrisk felt dæmpes hurtigere i materialer med høj ledningsevne22. Derfor blev det meste af strømmen absorberet af badopløsningen, og vi spekulerer på, at kun en lille del af det elektriske felt kan diffundere til nerverødderne.
I betragtning af fordele og ulemper ved in vivo-stimulering og in vitro-stimulation kan det derfor konkluderes, at in vitro patch-clamp er en fordelagtig metode til at studere SCS' synaptiske natur og/eller cellulære virkninger hos neonatale gnavere.
I klinisk praksis trækker elektroden ikke direkte overfladen af rygmarven eller nerveroden23. I stedet er den afhængig af den elektriske feltstråling, der genereres af elektroden, for indirekte at påvirke nervernes aktivitet1. Flere undersøgelser 1,23,24 har bekræftet, at katodekontakten af SCS skal placeres så tæt som muligt på dorsalroten eller indgangszonen (DREZ) for at opnå optimal selektivitet til stimulering af en bestemt muskel. Forøgelse af afstanden mellem elektroden og nerveroten vil svække stimuleringens specificitet. Derfor placerer vi katoden direkte nær DREZ i stedet for direkte at kontakte nerveroden eller rygmarven.
De afferente fibre i dorsalroten projicerer først til de sensoriske neuroner, derefter til interneuronerne og motorneuronerne. Udover de tværgående projicerende kredsløb er der også kredsløb, der projicerer mod den rostrale og kaudale ende. For eksempel kan motorneuroner svarende til tibialis forreste muskel findes på flere niveauer25. Derfor, selvom skrå forberedelse kan afbryde de tværgående projicerende kredsløb, vil det stadig bevare ikke-tværgående fremspringende fibre, hvilket muliggør undersøgelse af det præmotoriske sensoriske kredsløb. Ud over skrå og tværgående forberedelse giver langsgående forberedelse forskellige fordele for bedre at bevare kredsløbene fra dorsalroten til motorneuronerne og muliggøre effektiv tilbageholdelse af rygmarvskredsløb på tværs af flere segmenter26, hvilket giver en tættere repræsentation af de virkelige fysiologiske forhold.
Ifølge simuleringsforskningen 6,27,28 aktiverer SCS hovedsageligt proprioceptive afferente fibre for at genoprette underekstremitetsbevægelsen, herunder de ia-, ib- og II-afferente fibre. I denne undersøgelse kan vi dog ikke med sikkerhed bekræfte, hvilke typer fibre der specifikt blev aktiveret af SCS. Vi spekulerer på, at et lignende mønster også kan eksistere i in vitro-plasterklemmen. Vi vil løse dette problem ved at udføre matematisk modellering og simulering og indarbejde det i vores igangværende arbejde.
Afslutningsvis kan denne protokol hjælpe forskere med at forbedre deres operative færdigheder og forstå det væsentlige ved at kombinere patch-clamp-optagelser og SCS for at undersøge den elektriske mekanisme i SCS på en enkeltcelleskala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev finansieret af National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 og 82301657) og China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
