Summary
该协议描述了一种使用膜片钳研究运动神经元对脊髓刺激（SCS）的电反应的方法，具有高时空分辨率，这可以帮助研究人员提高分离脊髓和同时维持细胞活力的技能。
Abstract
脊髓刺激（SCS）可有效恢复脊髓损伤（SCI）后的运动功能。由于运动神经元是执行感觉运动行为的最终单位，因此直接研究SCS运动神经元的电反应可以帮助我们理解脊髓运动调节的底层逻辑。为了同时记录不同的刺激特征和细胞反应，膜片钳是在单细胞尺度上研究电生理特征的好方法。然而，实现这一目标仍然存在一些复杂的困难，包括维持细胞活力、快速将脊髓与骨结构分离，以及利用SCS成功诱导动作电位。在这里，我们提出了一个详细的方案，使用膜片钳以高时空分辨率研究运动神经元对SCS的电反应，这可以帮助研究人员提高分离脊髓和维持细胞活力的技能，以顺利研究SCS对运动神经元的电机制，避免不必要的试验和错误。
Introduction
脊髓刺激（SCS）可有效恢复脊髓损伤（SCI）后的运动功能。Andreas Rowald 等人报告说，SCS 在一天内实现了下肢运动和躯干功能1.探索SCS对运动恢复的生物学机制是制定更精确的SCS策略的关键和趋势研究领域。例如，Grégoire Courtine的团队证明，脊髓中的兴奋性Vsx2中间神经元和Hoxa10神经元是响应SCS的关键神经元，细胞特异性神经调控在SCI2后恢复大鼠行走能力是可行的。然而，很少有研究关注单细胞尺度上SCS的电机制。尽管众所周知，超阈值直流电刺激可以引发经典鱿鱼实验3,4,5中的动作电位（AP），但脉冲交变电刺激（如SCS）如何影响运动信号的产生仍不清楚。
鉴于脊髓内神经回路的复杂性，适当选择细胞群对于研究SCS的电机制非常重要。尽管 SCS 通过激活本体感受通路6 来恢复运动功能，但运动神经元是执行运动命令的最终单元，该命令来自整合本体感受信息传入输入7。因此，直接用SCS研究运动神经元的电特性可以帮助我们理解脊髓运动调节的底层逻辑。
众所周知，膜片钳是细胞电生理记录的金标准方法，具有极高的时空分辨率8。因此，本研究描述了一种使用膜片钳研究运动神经元对SCS的电反应的方法。与脑膜片钳9相比，脊髓膜片钳的难度更大，原因如下：（1）脊髓由体积小的椎管保护，需要非常精细的显微操作和严格的冰冷维护才能获得更好的细胞活力。（2）由于脊髓太细，无法固定在切割盘上，应将其浸入低熔点琼脂糖中，固化后进行修整。
因此，该方法在解剖脊髓和保持细胞活力的同时提供了技术细节，从而顺利地研究SCS对运动神经元的电机制，避免不必要的试验和错误。
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Protocol
机构动物护理和使用委员会批准了所有动物实验，研究是按照相关的动物福利法规进行的。
1. 动物准备
- 动物
- 饲养信息：在特定的无病原体环境中饲养雄性Sprague-Dawley大鼠（出生后10-14天，P10-P14）。
注意：室温保持在20°C±2°C，湿度：50%-60%，光/暗循环12小时。动物可以自由获得食物和水。 - 逆行标记运动神经元：将氟金（FG）注射到双侧胫骨前肌和腓肠肌中（在无菌盐水中2%，每块肌肉50μL）以在处死前2天逆行标记运动神经元。
- 饲养信息：在特定的无病原体环境中饲养雄性Sprague-Dawley大鼠（出生后10-14天，P10-P14）。
- 解决 方案
- 制备切割溶液：混合 120 mM 氯化胆碱、2.6 mM KCl、26 mM NaHCO 3、1.25 mM NaH 2 PO4、0.5 mM CaCl 2、7 mM MgCl2、1.3 mM 抗坏血酸、15 mM 葡萄糖。在解剖和切片之前，用95%O 2和5%CO2（用KOH调节至pH 7.4）预起泡溶液30分钟。用碎冰冷却溶液。
- 制备人工脑脊液（ACSF）：混合126mM NaCl，3mM KCl，1.2mM NaH2PO 4;1.3 mM MgCl 2、2.4 mM CaCl2、26 mM NaHCO3 和 10 mM 葡萄糖。在孵育前用95%O 2和5%CO2预起泡溶液30分钟。
- 制备细胞内溶液：混合 126 mM K-葡萄糖酸盐、2 mM KCl、2 mM MgCl 2、0.2 mM EGTA、10 mM HEPES、4 mM Na 2 ATP、0.4 mM Na2GTP、10 mM K-磷酸肌酸和 0.5% 神经生物素（pH 7.25 和 305 mOsm/kg）。用碎冰冷却溶液。
- 制备低熔点琼脂糖凝胶：将4 g琼脂糖溶于100 mL切割液中，用磁力搅拌转子使其充分溶解。在包埋前30分钟，将低熔点琼脂糖在微波炉中以高功率加热1分钟，然后将其转移到39°C水浴中以保持液态。
- 仪器准备
- 在灌注前10分钟将碎冰放在灌注盘上（补充图1A）。提前将解剖托盘（补充图1B）和切割托盘（补充图1C）与水带一起在-80°C下过夜。
- 提前将带有尼龙网的培养室置于45°C的烘箱中过夜。
- 使用低熔点琼脂糖预制35°斜坡和2毫米厚的平台（补充图1D）。凝胶凝固后，将它们放在 35 毫米培养皿的中心，以在下一个即将到来的手术中支撑脊髓。
- 心内灌注
- 通过腹膜内注射用2.5%三溴乙醇（160μL/ 10g）麻醉大鼠。通过验证对外部刺激（例如轻轻捏脚趾）缺乏反应，确保大鼠完全麻醉。
- 确认适当的麻醉后，将大鼠仰卧并将它们固定在装有硅胶的培养皿中。
- 在剑突尾部切开一个 5 毫米的纵向皮肤切口，然后完全扩大皮下空间。沿腹侧中线切开一个2厘米的纵向皮肤切口，充分暴露外胸壁，从上述切口开始，到胸部顶部结束。
- 用齿形镊子提起剑突 （补充图2A），然后用细剪刀剪断隔膜。沿剑突两侧切开胸骨，打开胸部并暴露心脏（补充图2B）。
注意： 注意保留两侧的胸内血管;否则，可能会导致大量出血。 - 使用无齿镊子提升左心室。沿左心室纵轴将一根 22 G 针插入左心室顶点（补充图 2C）。同时，观察灌注管内有节律的血液搏动，否则针头可能刺入右心室，可能导致灌注效果不佳。
注意： 不应使用齿形镊子;否则可能会导致镊子固定部位渗出额外的血液。 - 使用细剪刀剪开右心房（补充图2C），然后在1分钟内以约2mL / s的速度手动注入100mL冰冷的灌注液。
注意：当大鼠的肝脏和爪子变得苍白，并且没有血液从右心房流出时，可以达到良好的灌注。
- 脊髓夹层（图1）
- 将大鼠置于俯卧位，分别在髂前上棘（约L4椎体水平）和胸柱曲率移动点（约T6椎体水平）处切割脊柱（图1A）。然后，立即将离体脊柱置于含氧冰冷灌注液中，洗去残留的血液和脂肪组织;该程序有利于在后续程序中保持手术区域清洁。
注意：应保留脊柱旁肌肉，有利于后续使用昆虫针固定脊柱。 - 立即将分离的脊柱转移到解剖托盘（图1B），背侧朝上，喙端靠近操作员。用50mL连续氧化的冰冷切割溶液填充解剖托盘（图1B）。
- 使用四个昆虫针通过穿透脊柱旁肌肉来固定脊柱（图1B）。
- 在解剖显微镜下，用微型剪刀从喙端切开两侧的椎弓根，这可以称为“椎板切除术”（图1C）。注意不要损伤脊髓。同时，使用微齿镊子将切开的椎体抬起。
- 椎板切除术后，不要立即将脊髓与椎管分离。取而代之的是，使用微型剪刀沿背中线切割硬脑膜，这有利于细胞和含氧ACSF之间的营养吸收（图1D）。
注意： 切勿撕裂硬脑膜。只允许用微型剪刀切割硬脑膜;否则，神经根和脊髓实质将受到严重损害！ - 抬起脊髓的喙部，然后小心地切割约1毫米的神经根（图1E）。将脊髓与椎管分离后，使用2个昆虫针将脊髓腹侧朝上固定（图1F）。
- 使用微型剪刀沿腹侧中线切割硬脑膜（图1F）。切断多余的神经根，保留约1毫米。
注意：神经比脊髓坚韧得多。如果保留的神经根太长（>1毫米），振动切片机不能切断神经根，这可能导致脊髓实质严重撕裂。 - 使用微型剪刀将腰椎扩大分离到6-7毫米的长度（图1G）。
- 将大鼠置于俯卧位，分别在髂前上棘（约L4椎体水平）和胸柱曲率移动点（约T6椎体水平）处切割脊柱（图1A）。然后，立即将离体脊柱置于含氧冰冷灌注液中，洗去残留的血液和脂肪组织;该程序有利于在后续程序中保持手术区域清洁。
- 包埋在低熔点琼脂糖中
- 将腰椎扩大放在35°斜坡上（图1H），背侧朝上，尾端朝下。使用吸收性滤纸除去组织表面的大量水分（图1H）。
- 将熔融的琼脂糖凝胶缓慢倒入含有腰椎扩大的培养皿中（图1I）。
注意： 不要倒得太快，否则气泡会积聚在凝胶中。 - 将上述培养皿置于冰水混合物中，尽快冷却凝胶，有利于维持细胞的活性。
- 将凝胶修剪成15mm x 10 mm x 10 mm立方体，并用强力胶将其安装在标本盘上（图1J）。
- 切片
- 将试样盘放入预冷冻的切割托盘中，然后倒入冰冷的切割溶液（图1K）。将 95% CO 2 和 5% O2 连续鼓泡到切割托盘中。
- 设置振动切片机参数：厚度：350μm;速度：0.14-0.16 mm/s，振幅：1.0 mm，振动频率：85 Hz。
- 每只动物收获 2-3 片合适的切片。每片记录 1-2 个健康的 FG+ 运动神经元，每只动物的范围为 5-6 个细胞。
- 孵化
- 使用盖玻片镊子夹住切片（图1L）并将其放入充满连续氧化ACSF的孵育室中。将孵育室置于32°C的水浴中30分钟，然后在记录前继续在室温（RT）下孵育30分钟。
注意：上述程序，从麻醉到获得第一层，应在20-30分钟内完成，以尽可能保留细胞的活力。每个切片中的运动神经元可以维持其活力约6-7小时。
- 使用盖玻片镊子夹住切片（图1L）并将其放入充满连续氧化ACSF的孵育室中。将孵育室置于32°C的水浴中30分钟，然后在记录前继续在室温（RT）下孵育30分钟。
2. 使用SCS进行膜片钳记录（图2）
- 准备
- 以约1-2 mL / min的速率用连续起泡的ACSF灌注记录室。通过蠕动泵上的控制面板单独调节流量。
- 将切片放入录音室。使用带有尼龙线的 U 形铂丝将切片牢固地固定到位。
- 使用红外微分干涉对比显微镜（IR-DIC）观察切片。在4倍物镜下，确认背根的长度约为1mm。找到背根进入实质的区域，然后将中央视野移动到该区域。
- 将脉冲发生器与定制的电极连接（图2A）。
- SCS 配置
- 通过显微操作系统将SCS的阳极放置在背中线附近（图2B）。
- 通过显微操作系统将SCS的阴极放置在背根进入区（DREZ）附近（图2B）。
- 细胞靶向和成像
- 使用带有 10 倍物镜的 IR-DIC 大致找到运动柱的背外侧区域，大多数运动神经元都位于该区域。然后，将中央视野移动到该区域。
- 切换到 60 倍物镜以找到具有光滑明亮表面和不可见核的健康神经元（图 2C、F）。
- 稍微调低红外强度并打开荧光光源。将滤光片切换到宽带紫外激发滤光片（图2D，G），以选择合适的FG阳性（FG +）运动神经元（图2E，H）。
- 使用抽吸电极对背根施加 1x 运动阈值刺激。如果在运动神经元中检测到诱发电位（补充图3），则确认背根的活动完好无损。如果没有，则应丢弃此切片。
- 膜片钳记录
- 用细胞内溶液填充微量移液器并将其插入电极支架。使用显微操作系统将移液器降低到ACSF浴中。移液器电阻范围为 5-8 MΩ。
- 对移液器施加少量正压以吹走灰尘和细胞碎片。
- 降低电极以接近电池。当移液器接触FG+神经元的表面时，在尖端水平处可以看到膜的小凹痕。释放正压。
- 然后，使用注射器对移液器施加少量负压。这会产生少量的吸力，使细胞膜与玻璃移液器接触。始终注意软件界面上的总电阻，直到电阻值增加到千兆欧 （>1 GΩ）。然后，形成gigaseal。
- 将膜电位夹在 -70 mV，然后按下放大器软件界面上的快速电容补偿按钮。轻轻施加瞬时负压使细胞膜破裂，然后按下软件界面上的 慢速电容补偿 按钮 amp扩音器。此时，获得了良好的全细胞配置。
- 通过单击软件界面上的 IC 按钮切换到电流钳位模式，并记录静息膜电位 （RMP）。
- 以 1-10 mA 的幅度施加 SCS 1-2 s，同时脉冲宽度和频率分别固定在 210 μs 和 40 Hz。通过缓慢增加刺激幅度来确定运动阈值，直到观察到第一个AP。
- 在电流钳模式10,11,12 中使用流变基周围的 5 秒去极化电流注入来区分延迟和立即放电的运动神经元。即时放电运动神经元：低流变基可以诱导即时和重复放电，放电频率稳定;延迟放电运动神经元：高流变碱基可以诱导延迟发病，以加速放电速率重复放电（图3）。
- 当 SCS 关闭时，继续记录用于捕获自发 AP 发射的膜电位。
- 执行电压钳记录 当 SCS 打开和关闭时，兴奋性突触后电流 （EPSC） 的电压钳记录。刺激参数为 1x 运动阈值，210 μs，2 Hz。
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Representative Results
由于精细操作期间严格的低温维护（补充图1、补充图2和图1），细胞活力足以进行后续的电生理记录。为了尽可能地模拟临床场景，我们使用显微操作将 SCS 阴极和阳极分别放置在背中线和 DREZ 附近（图 2），这可以启动背角中的神经信号传播到运动柱背外侧区域的运动神经元。在这项研究中，我们使用FG定位直径为20-50μm的运动神经元。如图 2D，G 所示，我们自信地确认健康的 FG+ 神经元是运动神经元——脊柱回路的末端。这种标记方法为研究SCS如何影响发射模式铺平了道路。延迟和立即放电运动神经元的电生理特性列于补充表1和补充表2中。计算主动和被动属性的方法在补充文件 1 中提供。
当SCS向脊柱切片传递脉冲交变电场时，我们首先使用电流钳模式来记录膜电位的响应（图4）。当我们以 1/3 运动阈值的步长逐渐增加刺激幅度时（图 4B，C），膜电位也随之上升，但只有 1 倍运动阈值可以引发 APS（图 4D）。图 4D 显示，大约每 10-20 个脉冲可以引发一个 AP，这表明 AP 对 SCS 幅度的响应规律性可能存在。
在SCS关闭后，我们继续记录膜电位。 图 5 显示，膜电位略微增加到 -60 mV，神经元发射了一系列自发的 AP。这些自发的AP持续很短的时间（30-40 s），然后膜电位恢复到-65 mV，表明SCS可以暂时增加细胞的兴奋性。
然后，当SCS打开和关闭时，我们对EPSC使用电压钳记录（图6）。在每次 SCS 脉冲后，可以检测到诱发的 EPSC。刺激伪影和EPSC之间的延迟为2.64±0.38 ms（补充图4）。诱发EPSCs的振幅为35.14±12.73 pA（补充图4）。诱发EPSCs的频率与SCS频率一致。减去被动电荷平衡后，可以在 1 倍运动阈值刺激后的活运动神经元中观察到诱发的 EPSC（补充图 5A）。在同一细胞中停止灌注2小时后，刺激极性逆转。刺激没有诱导任何EPSC，证实诱发的EPSC不是伪影（补充图5B）。
图 1：脊髓解剖和切片 。 （A） 分别在髂前上棘（约 L4 椎体水平）和胸柱曲率移动点（约 T6 椎体水平）处切割脊柱。（B） 立即将孤立的脊柱转移到解剖托盘上，背侧朝上，喙端靠近操作者。用连续充氧的冰冷切割溶液填充解剖托盘。（C） 从喙端对两侧进行椎板切除术。（D）切开硬脑膜背侧，有利于细胞与含氧人工脑脊液（ACSF）之间的营养吸收。（E） 小心地切开神经根。（F） 切开腹侧硬脑膜。（七）（H） 将腰椎扩大放在 35° 斜坡上，背侧朝上，尾端朝下。使用吸水性滤纸去除组织表面的大量水分。（I）将熔融的琼脂糖凝胶缓慢倒入培养皿中。（J） 将凝胶修剪成立方体，并用强力胶将其安装在标本盘上。（千）将试样盘放入切割盘中，然后倒入冰冷的切割溶液。（L）腰椎增大时脊柱切片的一个例子。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：脊髓刺激 （SCS） 配置和运动神经元成像。 （A） 带有定制电极的脉冲发生器可以单独调整幅度、脉冲宽度和频率。入口显示，电极触点的尺寸规格为 800 μm x 500 μm x 300 μm。 （B） 通过显微操作系统分别将阳极和阴极放置在背中线和背根进入区 （DREZ） 附近。将记录移液管放置在电机柱的背外侧区域，以夹紧氟金阳性（FG +）运动神经元。（C） 一个健康的立即放电运动神经元，红外微分干涉对比显微镜 （IR-DIC） 成像 （60x）。（D）只有荧光成像（60x）的同一神经元，闪亮的荧光金（FG）颗粒表示该神经元是运动神经元。（五）FG+运动神经元中IR-DIC和荧光的合并图像。（F-H）具有 IR-DIC 成像 （60x） 的健康延迟放电运动神经元。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：使用 5 秒去极化电流注入区分延迟和立即放电运动神经元。 （A）即时放电运动神经元：低流变基可以诱导即时和重复放电，放电频率稳定;（B） 延迟放电运动神经元：高流变碱基可以诱导延迟发病，以加速放电速度重复放电。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：脊髓刺激 （SCS） 引发运动神经元中的动作 电位 （AP）。 （A）当没有施加刺激时，静息膜电位（RMP）为-65 mV。（B） 1/3 倍运动阈值刺激不能引起 AP。（C） 2/3 倍运动阈值刺激不能引起 AP。（D） 1x 运动阈值刺激可引出 AP，每 10-20 个脉冲可引出 AP。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：脊髓刺激 （SCS） 后自发动作电位 （AP） 放电。 SCS关闭后，神经元在短时间内（30-40 s）发射一系列自发AP，然后静息膜电位（RMP）恢复到-65 mV。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：脊髓刺激 （SCS） 参数和诱发兴奋性突触后电流 （EPSC） 的图示。 （A） SCS参数示意图;（乙，丙）在单个刺激脉冲（1x 运动阈值刺激）之后，可以观察到诱发的 EPSC;（D）减去无源电荷平衡后，可以计算出EPSC的延迟和幅度。请点击这里查看此图的较大版本.
附图1：仪器制备。 （A）灌注盘：在灌注前10分钟，将碎冰放在装满硅胶的10厘米培养皿上。（B）解剖盘：祭祀前一晚，将装满硅胶的自制解剖盘放入-80°C冰箱中。（C）切割盘：在牺牲前一晚，将带水带的切割盘放入-80°C冰箱中。（D）琼脂糖铸造斜率：在灌注前30分钟，将带有底板的35°琼脂糖斜率置于35mm培养皿的中心。 请点击这里下载此文件。
补充图 2：心内灌注。 （A） 提升剑突。（B）沿剑突两侧切开胸骨，打开胸部，露出心脏。注意不要损坏胸腔内血管，否则大量出血会充满整个手术区域，并妨碍操作者识别心室顶点或右心房。（C） 在左心室顶端插入一根 22 G 针进行灌注，并切开右心房以排出液体。 请点击这里下载此文件。
补充图3：确认背根活动。 使用抽吸电极对背根施加 1x 运动阈值刺激。如果在运动神经元中检测到诱发电位，我们可以确认背根的活动是完整的。 请点击这里下载此文件。
补充图 4：SCS 开启时诱发 EPSC 的延迟和幅度。请点击这里下载此文件。
补充图5：诱发EPSC有效性的证明。 （A） 减去被动电荷平衡后，在 1 倍运动阈值刺激后，可以在活的运动神经元中观察到诱发的 EPSC;（B）在同一细胞中停止灌注2 h后，刺激极性反转，1x运动阈值刺激未诱导任何EPSC，这证实了诱发的EPSC不是伪影。 请点击这里下载此文件。
补充文件1：主动和被动属性的计算方法。请点击这里下载此文件。
补充表1：运动神经元的被动特性。请点击这里下载此文件。
补充表2：运动神经元的活性特性 请点击这里下载此文件。
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Discussion
SCS调制的运动信息最终收敛到运动神经元。因此，以运动神经元为研究靶点可以简化研究设计，更直接地揭示SCS的神经调控机制。为了同时记录不同的刺激特征和细胞反应，膜片钳是在单细胞尺度上研究电生理特征的好方法。然而，仍然存在一些困难，包括如何保持细胞活力，如何快速将脊髓与骨结构分离，以及如何利用SCS成功诱导APs。因此，本研究旨在帮助研究人员快速掌握基本的操作技能，避免一些可能的陷阱，并尽早关注研究设计而不是方法。
为了获得良好的细胞活力，应始终注意以下细节：（1）将脊髓保持在冰冷的温度非常重要，因为低温可以抑制细胞死亡并减慢代谢率，这可以保护神经元在灌注、解剖和切片过程中免受机械损伤13;（2）用微剪刀精细地去除硬脑膜，可以增强神经元对周围溶液的营养吸收。切勿直接剥离硬脑膜;否则，脊髓会受到严重损害。此外，如果忘记清除硬脑膜，后续的切片过程可能会很困难，因为刀片可能无法完全切断硬脑膜，然后从琼脂糖中撕出剩余的脊髓，这可能会导致切片失败。（3）与常规横切片相比，斜切片增加了灰质面积，可以在单个切片中发现更多的FG+运动神经元9。（4）由于脊髓本身不能像大脑一样牢固地固定在标本盘上，因此将其包埋在琼脂糖凝胶中可有效解决这个问题，而不会降低细胞活力。我们建议使用低熔点琼脂糖（凝胶点26-30°C）而不是传统的琼脂糖（凝胶点38-43°C），因为高温可能会损害细胞活力。（5）我们建议U型铂丝的两根尼龙线之间的距离应为1至1.5毫米，因为松散的线不能牢固地固定脊髓，而致密的线可能会挤压细胞。
与基础研究中广泛使用的双极钩电极等常规刺激装置相比，本研究中的SCS电极来源于我们之前的临床工作14 和基础研究15。SCS提供脉冲交变电刺激，提供不同的参数调整尺寸。该SCS装置还具有电荷平衡功能，避免组织电解，不直接接触神经组织;因此，该SCS在 体内 应用具有良好的安全性。
SCS处理后，运动神经元自发APs可能归因于以下原因：（1）SCS诱导电荷在神经元的细胞体和轴突丘中积累，导致RMP16升高。这种现象表明SCS可能提高神经元的兴奋性，这可能与SCS后离子通道电导率的变化有关，如Na v 1.117、K v 2.1 18或Ca v 2.3 19。（2）SCS可以激活背侧GABA能神经元，以促进对运动神经元的本体感觉反馈。我们认为，感觉神经元和运动神经元之间可能持续存在神经传递，导致SCS后运动神经元中自发的AP。自发 AP 可以保持执行感觉运动行为的内在准备状态20。因此，激活或抑制自发性APs可能有益于脊柱神经系统疾病的治疗。
众所周知，体内电生理记录更适合检测电场自然分布和电极放置下的电生理反应。此外，体内运动神经元记录允许识别运动神经元身份。这可以通过运动轴突的逆向识别与肌纤维力测量相结合来完成21。但体内脊髓记录也存在以下缺点：（1）运动神经元距离脊髓背面2-3mm，即使使用最先进的双光子共聚焦成像，观察深度也只有500-800μm，因此使用现有方法很难在体内进行光学观察。因此，如果我们想在体内精确夹住单个运动神经元，玻璃移液管必须穿过背柱才能到达看不见的运动神经元;体内膜片钳只能以“盲目”的方式进行，导致显着的不确定性和失败率。（2）除体内膜片钳外，硅电极记录可以是替代方法，如Utah阵列或Neuropixels电极。然而，硅电极记录的信号大多是复合动作电位，而不是单一动作电位。虽然单个神经元的活动已经使用尖峰排序算法进行了解析，但排序算法的准确性和可靠性仍有待提高。
与体内记录相比，体外与体内相比的最大好处是使用电压钳，这允许对SCS激活的突触通路有独特的理解。此外，它还将允许使用实时成像工具。我们推测 SCS 诱导神经递质（如 GABA 和谷氨酸）从上层神经元释放到运动神经元上，导致整体兴奋性 EPSC 反应7。因此，在我们即将到来的研究中，我们将结合 IPSC、迷你 EPSC （mEPSC） 和 SCS 诱导的诱发 EPSC 的检测，以阐明前运动神经元或中间神经元释放抑制性和兴奋性神经递质的模式。我们充分认识到，体外刺激也存在一些局限性：（1）脊髓的长程纵向回路被破坏，导致来自运动皮层或下肢的传入信息丢失;（2）体外刺激过程中的电场分布可能与体内刺激时的电场分布不同。在这项研究中，AP的活化阈值（约以毫安为单位）远高于体内实验（约以微安为单位）15;这是因为记录室中ACSF溶液的体积容量远高于自然状态下的脑脊液，并且数学理论支持高导电性材料中的电场衰减更快22。因此，大部分电流被浴液吸收，我们推测只有一小部分电场可以扩散到神经根。
因此，考虑到 体内 刺激和体 外 刺激的优缺点，可以得出结论， 体外 膜片钳是研究新生啮齿动物SCS突触性质和/或细胞效应的有利方法。
在临床实践中，电极不直接收缩脊髓表面或神经根23。相反，它依靠电极产生的电场辐射来间接影响神经的活动1。多项研究 1,23,24 证实 SCS 的阴极触点应尽可能靠近背根或入口区 （DREZ），以实现刺激特定肌肉的最佳选择性。增加电极和神经根之间的距离会削弱刺激的特异性。因此，我们直接将阴极放置在DREZ附近，而不是直接接触神经根或脊髓。
背根的传入纤维首先投射到感觉神经元，然后投射到中间神经元和运动神经元。除了横向突出的电路外，还有向喙端和尾端突出的电路。例如，与胫骨前肌相对应的运动神经元可以在多个水平上找到25。因此，尽管斜向准备可能会切断横向投射回路，但它仍将保留非横向投射纤维，从而可以研究运动前感觉回路。除了斜向和横向准备外，纵向准备还具有明显的优势，可以更好地保留从背根到运动神经元的回路，并使脊髓回路在多个节段中有效保留26，这提供了更接近真实生理条件的表示。
根据模拟研究6,27,28，SCS主要激活本体感觉传入纤维以恢复下肢运动，包括Ia、Ib和II传入纤维。然而，在这项研究中，我们无法自信地确认哪些类型的纤维被SCS特异性激活。我们推测，体外膜片钳中也可能存在类似的模式。我们将通过进行数学建模和模拟并将其纳入我们正在进行的工作来解决这个问题。
总之，该协议可能有助于研究人员提高他们的操作技能，并掌握结合膜片钳记录和SCS的要点，以在单细胞规模上研究SCS的电机制。
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Disclosures
没有
Acknowledgments
本研究由国家自然科学基金青年基金（52207254和82301657）和中国博士后科学基金（2022M711833）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
