Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, bei der eine Patch-Clamp verwendet wird, um die elektrischen Reaktionen von Motoneuronen auf die Rückenmarkstimulation (SCS) mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung zu untersuchen, was Forschern helfen kann, ihre Fähigkeiten bei der Trennung des Rückenmarks und der gleichzeitigen Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit zu verbessern.
Abstract
Die Rückenmarkstimulation (SCS) kann die Bewegungsfunktion nach einer Rückenmarksverletzung effektiv wiederherstellen. Da die Motoneuronen die letzte Einheit sind, die sensomotorisches Verhalten ausführt, kann uns die direkte Untersuchung der elektrischen Reaktionen von Motoneuronen mit SCS helfen, die zugrunde liegende Logik der spinalen motorischen Modulation zu verstehen. Um gleichzeitig verschiedene Reizeigenschaften und zelluläre Reaktionen zu erfassen, ist eine Patch-Clamp eine gute Methode, um die elektrophysiologischen Eigenschaften auf Einzelzellebene zu untersuchen. Es gibt jedoch noch einige komplexe Schwierigkeiten, um dieses Ziel zu erreichen, einschließlich der Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit, der schnellen Trennung des Rückenmarks von der knöchernen Struktur und der Verwendung des SCS zur erfolgreichen Induktion von Aktionspotenzialen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das Patch-Clamp verwendet, um die elektrischen Reaktionen von Motoneuronen auf SCS mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung zu untersuchen, was Forschern helfen kann, ihre Fähigkeiten bei der Trennung des Rückenmarks zu verbessern und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Zelle aufrechtzuerhalten, um den elektrischen Mechanismus von SCS auf Motoneuronen reibungslos zu untersuchen und unnötige Versuche und Fehler zu vermeiden.
Introduction
Die Rückenmarkstimulation (SCS) kann die Bewegungsfunktion nach einer Rückenmarksverletzung effektiv wiederherstellen. Andreas Rowald et al. berichteten, dass SCS die Funktion des Bewegungsapparates und des Rumpfes der unteren Gliedmaßen innerhalb eines einzigen Tages ermöglicht1. Die Erforschung des biologischen Mechanismus von SCS für die Erholung des Bewegungsapparates ist ein kritisches Forschungsfeld für die Entwicklung einer präziseren SCS-Strategie. Das Team um Grégoire Courtine zeigte beispielsweise, dass exzitatorische Vsx2-Interneuronen und Hoxa10-Neuronen im Rückenmark die Schlüsselneuronen für die Reaktion auf SCS sind, und dass eine zellspezifische Neuromodulation möglich ist, um die Gehfähigkeit der Ratte nach einer Rückenmarksverletzung2 wiederherzustellen. Es gibt jedoch nur wenige Studien, die sich auf den elektrischen Mechanismus von SCS auf Einzelzellebene konzentrieren. Obwohl bekannt ist, dass der überschwellige Gleichstromreiz die Aktionspotentiale (APs) im klassischen Tintenfischexperiment 3,4,5 hervorrufen kann, ist noch unklar, wie sich die gepulste elektrische Wechselstimulation, wie z.B. SCS, auf die motorische Signalerzeugung auswirkt.
Angesichts der Komplexität intraspinaler neuronaler Schaltkreise ist eine geeignete Selektion für die Zellpopulation wichtig, um den elektrischen Mechanismus der SCS zu untersuchen. Obwohl SCS die motorische Funktion durch Aktivierung des propriozeptiven Pfades6 wiederherstellt, sind die Motoneuronen die letzte Einheit, die den motorischen Befehl ausführt, der von der Integration des afferenten Eingangs7 der Propriozeptionsinformation abgeleitet wird. Daher kann uns die direkte Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Motoneuronen mit SCS helfen, die zugrunde liegende Logik der spinalen motorischen Modulation zu verstehen.
Wie wir wissen, ist die Patch-Clamp-Methode die goldene Standardmethode für zellulär elektrophysiologische Aufzeichnungen mit extrem hoher raumzeitlicher Auflösung8. Daher beschreibt diese Studie eine Methode, bei der eine Patch-Klemme verwendet wird, um die elektrischen Reaktionen von Motoneuronen auf SCS zu untersuchen. Im Vergleich zur Gehirn-Patch-Klemme9 ist die Rückenmark-Patch-Klemme aus folgenden Gründen schwieriger: (1) Das Rückenmark wird durch den Wirbelkanal mit winzigem Volumen geschützt, was eine sehr feine Mikromanipulation und eine rigorose eiskalte Wartung erfordert, um eine bessere Zelllebensfähigkeit zu erhalten. (2) Da das Rückenmark zu dünn ist, um auf der Schneideschale befestigt zu werden, sollte es in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt getaucht und nach dem Erstarren gekürzt werden.
Daher liefert diese Methode technische Details bei der Dissektion des Rückenmarks und der gleichzeitigen Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit, um den elektrischen Mechanismus der SCS auf Motoneuronen reibungslos zu untersuchen und unnötige Versuche und Fehler zu vermeiden.
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Protocol
Das Institutional Animal Care and Use Committee genehmigte alle Tierversuche und die Studien wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Tierschutzbestimmungen durchgeführt.
1. Vorbereitung der Tiere
- Tiere
- Haltungsinformationen: Männliche Sprague-Dawley-Ratten (postnatal 10-14 Tage, P10-P14) in einer spezifischen, pathogenfreien Umgebung.
HINWEIS: Die Raumbedingungen wurden bei 20 °C ± 2 °C gehalten, Luftfeuchtigkeit: 50%-60%, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus. Die Tiere hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. - Markierung der Motoneuronen retrograde: Injizieren Sie Fluor-Gold (FG) in den bilateralen Musculus tibialis anterior und den Musculus gastrocnemius (2% in steriler Kochsalzlösung, 50 μl pro Muskel), um die Motoneuronen 2 Tage vor der Opferung retrograd zu markieren.
- Haltungsinformationen: Männliche Sprague-Dawley-Ratten (postnatal 10-14 Tage, P10-P14) in einer spezifischen, pathogenfreien Umgebung.
- Lösungen
- Schneidlösung vorbereiten: Mischen Sie 120 mM Cholinchlorid, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1,25 mM NaH 2 PO4, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl2, 1,3 mM Ascorbinsäure, 15 mM Glukose. Die Lösung wird mit 95 % O2 und 5 %CO2 (mit KOH auf pH 7,4 eingestellt) 30 Minuten lang vor dem Sezieren und Schneiden aufgeblasen. Kühlen Sie die Lösung mit Crushed Ice ab.
- Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) vorbereiten: Mischen Sie 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4; 1,3 mM MgCl2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 und 10 mM Glukose. Die Lösung wird vor der Inkubation 30 min lang mit 95 % O2 und 5 %CO2 vorgebläubt.
- Intrazelluläre Lösung vorbereiten: Mischen Sie 126 mM K-Gluconat, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na2 ATP, 0,4 mMNa2GTP, 10 mM K-Phosphokreatin und 0,5% Neurobiotin (pH7,25 und 305 mOsm/Kg). Kühlen Sie die Lösung mit Crushed Ice ab.
- Niedrigschmelzendes Agarose-Gel vorbereiten: 4 g Agarose in 100 ml Schneidlösung auflösen und mit einem Magnetrührrotor vollständig auflösen. 30 Minuten vor dem Einbetten wird die Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt 1 Minute lang in der Mikrowelle mit hoher Leistung erhitzt und dann in ein 39 °C warmes Wasserbad gegeben, um den flüssigen Zustand zu erhalten.
- Vorbereitung des Instruments
- Legen Sie Crushed Ice 10 Minuten vor der Perfusion auf die Perfusionsschiene (Ergänzende Abbildung 1A). Platzieren Sie die anatomische Schiene (Ergänzende Abbildung 1B) und die Schneideschiene (Ergänzende Abbildung 1C) mit einem Wasserband im Voraus bei -80 °C.
- Stellen Sie die Inkubationskammer mit Nylongewebe über Nacht in den Ofen bei 45 °C.
- Verwenden Sie Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt, um eine 35°-Neigung und eine 2 mm dicke Plattform vorzufertigen (ergänzende Abbildung 1D). Platzieren Sie sie nach der Erstarrung des Gels in der Mitte einer 35-mm-Petrischale, um das Rückenmark bei den nächsten Eingriffen zu unterstützen.
- Intrakardiale Perfusion
- Die Ratten werden mit 2,5 % Tribromethanol (160 μl/10 g) durch intraperitoneale Injektion anästhesiert. Stellen Sie sicher, dass die Ratten vollständig betäubt sind, indem Sie die fehlende Reaktion auf äußere Reize, wie z. B. ein sanftes Kneifen des Zehs, überprüfen.
- Wenn die richtige Anästhesie bestätigt ist, legen Sie die Ratten in Rückenlage und immobilisieren Sie sie in der mit Kieselgel gefüllten Petrischale.
- Schneiden Sie einen 5 mm langen Längsschnitt der Haut kaudal zum Processus xiphoideus und erweitern Sie dann den subkutanen Raum vollständig. Schneiden Sie einen 2 cm langen Hautschnitt entlang der ventralen Mittellinie, um die äußere Brustwand vollständig freizulegen, beginnend mit dem oben genannten Schnitt und endend mit der Oberseite des Brustkorbs.
- Verwenden Sie eine Zahnpinzette, um das Xiphoid anzuheben (Ergänzende Abbildung 2A), und schneiden Sie dann mit einer feinen Schere das Zwerchfell ab. Durchtrennen Sie das Brustbein auf beiden Seiten des Processus xiphoideus, um den Brustkorb zu öffnen und das Herz freizulegen (ergänzende Abbildung 2B).
HINWEIS: Achten Sie darauf, die inneren Brustgefäße auf beiden Seiten zu erhalten. Andernfalls kann es zu massiven Blutungen kommen. - Verwende eine zahnlose Pinzette, um die linke Herzkammer anzuheben. Eine 22-G-Nadel wird entlang der Längsachse des linken Ventrikels in die linksventrikuläre Spitze eingeführt (ergänzende Abbildung 2C). Beobachten Sie in der Zwischenzeit das rhythmische Pulsieren des Blutes im Perfusionsschlauch, da die Nadel sonst in die rechte Herzkammer stechen kann, was zu einer schlechten Perfusionswirkung führen kann.
HINWEIS: Eine gezahnte Pinzette sollte nicht verwendet werden. Andernfalls kann es zu einem zusätzlichen Blutaustritt aus der Pinzettenhaltestelle kommen. - Verwenden Sie eine feine Schere, um den rechten Vorhof zu schneiden (ergänzende Abbildung 2C), und injizieren Sie dann manuell 100 ml eiskalte Perfusionsflüssigkeit mit einer Geschwindigkeit von etwa 2 ml/s innerhalb von 1 Minute.
HINWEIS: Wenn die Leber und die Pfoten von Ratten blass werden und kein Blut aus dem rechten Vorhof fließt, kann eine gute Durchblutung erreicht werden.
- Rückenmarksdissektion (Abbildung 1)
- Platzieren Sie die Ratte in Bauchlage und schneiden Sie die Wirbelsäule an der vorderen oberen Darmbeinwirbelsäule (etwa L4-Wirbelhöhe) bzw. am Krümmungsverschiebungspunkt der Brustsäule (etwa T6-Wirbelhöhe) auf (Abbildung 1A). Legen Sie dann sofort die isolierte Wirbelsäule in die sauerstoffhaltige, eiskalte Perfusionslösung, um das restliche Blut- und Fettgewebe abzuwaschen. Dieses Verfahren ist vorteilhaft, um das Operationsfeld bei den nachfolgenden Eingriffen sauber zu halten.
HINWEIS: Die paraspinale Muskulatur sollte geschont werden, was für die anschließende Fixierung der Wirbelsäule mittels einer Insektennadel förderlich ist. - Übertragen Sie die isolierte Wirbelsäule sofort auf die anatomische Schiene (Abbildung 1B) mit der dorsalen Seite nach oben und dem rostralen Ende in der Nähe des Bedieners. Füllen Sie die anatomische Schale mit 50 ml kontinuierlich sauerstoffhaltiger, eiskalter Schneidlösung (Abbildung 1B).
- Verwenden Sie vier Insektenstifte, um die Wirbelsäule zu fixieren, indem Sie in die paraspinalen Muskeln eindringen (Abbildung 1B).
- Unter dem Präpariermikroskop werden die Wirbelstiele beidseits vom rostralen Ende mit der Mikroschere durchtrennt, was als "Laminektomie" bezeichnet werden kann (Abbildung 1C). Achten Sie darauf, das Rückenmark nicht zu beschädigen. Verwenden Sie in der Zwischenzeit die mikroverzahnte Pinzette, um den durchtrennten Wirbelkörper anzuheben.
- Trennen Sie nach der Laminektomie das Rückenmark nicht sofort vom Spinalkanal. Verwenden Sie stattdessen eine Mikroschere, um die Dura mater entlang der dorsalen Mittellinie zu schneiden, was für die Nährstoffaufnahme zwischen den Zellen und der sauerstoffreichen ACSF förderlich ist (Abbildung 1D).
HINWEIS: Reißen Sie niemals die Dura Mater. Nur das Schneiden der Dura mater mit einer Mikroschere ist erlaubt; Andernfalls werden die Nervenwurzel und das Spinalparenchym ernsthaft geschädigt! - Heben Sie den rostralen Teil des Rückenmarks an und schneiden Sie dann die Nervenwurzel vorsichtig mit ca. 1 mm Reserve ab (Abbildung 1E). Nachdem Sie das Rückenmark vom Wirbelkanal getrennt haben, verwenden Sie 2 Insektenstifte, um das Rückenmark mit der ventralen Seite nach oben zu fixieren (Abbildung 1F).
- Verwenden Sie eine Mikroschere, um die Dura mater entlang der ventralen Mittellinie zu schneiden (Abbildung 1F). Schneiden Sie die überflüssigen Nervenwurzeln mit ca. 1 mm Reserve ab.
HINWEIS: Der Nerv ist viel hartnäckiger als das Rückenmark. Wenn die reservierte Nervenwurzel zu lang ist (>1 mm), kann das Vibratom die Nervenwurzel nicht abtrennen, was zu einem schweren Riss im Spinalparenchym führen kann. - Verwenden Sie eine Mikroschere, um die Lumbalvergrößerung auf eine Länge von 6-7 mm zu trennen (Abbildung 1G).
- Platzieren Sie die Ratte in Bauchlage und schneiden Sie die Wirbelsäule an der vorderen oberen Darmbeinwirbelsäule (etwa L4-Wirbelhöhe) bzw. am Krümmungsverschiebungspunkt der Brustsäule (etwa T6-Wirbelhöhe) auf (Abbildung 1A). Legen Sie dann sofort die isolierte Wirbelsäule in die sauerstoffhaltige, eiskalte Perfusionslösung, um das restliche Blut- und Fettgewebe abzuwaschen. Dieses Verfahren ist vorteilhaft, um das Operationsfeld bei den nachfolgenden Eingriffen sauber zu halten.
- Einbettung in die niedrigschmelzende Agarose
- Platzieren Sie die Lumbalvergrößerung auf der 35°-Neigung (Abbildung 1H) mit der dorsalen Seite nach oben und dem kaudalen Ende nach unten. Verwenden Sie ein saugfähiges Filterpapier, um reichlich Wasser auf der Gewebeoberfläche zu entfernen (Abbildung 1H).
- Gießen Sie das geschmolzene Agarose-Gel langsam in die Petrischale mit der lumbalen Vergrößerung (Abbildung 1I).
HINWEIS: Gießen Sie nicht zu schnell, da sich sonst Blasen im Gel ansammeln. - Stellen Sie die obige Petrischale in die Eis-Wasser-Mischung, um das Gel so schnell wie möglich abzukühlen, was der Aufrechterhaltung der Zellaktivität förderlich ist.
- Schneiden Sie das Gel in einen 15 mm x 10 mm x 10 mm großen Würfel und montieren Sie ihn mit Sekundenkleber auf die Probenscheibe (Abbildung 1J).
- In Scheiben schneidend
- Legen Sie die Probenscheibe in die vorgefrorene Schneidschale und gießen Sie dann die eiskalte Schneidlösung (Abbildung 1K). Kontinuierlich mit 95 % CO2 und 5 %O2 in die Schneidschale blasen.
- Stellen Sie die Parameter des Vibratoms ein: Dicke: 350 μm; Geschwindigkeit: 0,14-0,16 mm/s, Amplitude: 1,0 mm und Schwingungsfrequenz: 85 Hz.
- Ernten Sie 2-3 geeignete Scheiben pro Tier. Zeichnen Sie 1-2 gesunde FG+-Motoneuronen pro Schnitt auf, mit einem Bereich von 5-6 Zellen pro Tier.
- Inkubation
- Verwenden Sie eine Pinzette zum Abdeckschieber, um eine Scheibe abzuschneiden (Abbildung 1L) und legen Sie sie in die Inkubationskammer, die mit kontinuierlich sauerstoffhaltigem ACSF gefüllt ist. Stellen Sie die Inkubationskammer für 30 Minuten in ein Wasserbad bei 32 °C und inkubieren Sie sie dann weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT), bevor Sie sie aufzeichnen.
HINWEIS: Die oben genannten Verfahren, von der Anästhesie bis zur Entnahme der ersten Scheibe, sollten innerhalb von 20-30 Minuten abgeschlossen werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen so weit wie möglich zu erhalten. Die Motoneuronen in jeder Schicht können ihre Lebensfähigkeit für etwa 6-7 Stunden aufrechterhalten.
- Verwenden Sie eine Pinzette zum Abdeckschieber, um eine Scheibe abzuschneiden (Abbildung 1L) und legen Sie sie in die Inkubationskammer, die mit kontinuierlich sauerstoffhaltigem ACSF gefüllt ist. Stellen Sie die Inkubationskammer für 30 Minuten in ein Wasserbad bei 32 °C und inkubieren Sie sie dann weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT), bevor Sie sie aufzeichnen.
2. Patch-Clamp-Aufnahme mit SCS (Abbildung 2)
- Vorbereitungen
- Die Aufzeichnungskammer mit kontinuierlich geblasenem ACSF mit einer Rate von etwa 1-2 ml/min durchbluten. Stellen Sie die Durchflussmenge individuell über das Bedienfeld an der Schlauchpumpe ein.
- Legen Sie eine Scheibe in die Aufnahmekammer. Verwenden Sie den U-förmigen Platindraht mit Nylonfäden, um die Scheibe fest zu stabilisieren.
- Verwenden Sie ein Infrarot-Differenzinterferenzkontrastmikroskop (IR-DIC), um die Schicht zu beobachten. Vergewissern Sie sich unter dem 4-fach-Objektiv, dass die Länge der Rückenwurzel etwa 1 mm beträgt. Finde den Bereich, in dem die dorsale Wurzel in das Parenchym eintritt, und verschiebe dann das zentrale Sichtfeld auf diesen Bereich.
- Verbinden Sie den Impulsgeber mit speziell angefertigten Elektroden (Abbildung 2A).
- SCS-Konfiguration
- Platzieren Sie die SCS-Anode über das Mikromanipulationssystem in der Nähe der dorsalen Mittellinie (Abbildung 2B).
- Platzieren Sie die SCS-Kathode über das Mikromanipulationssystem in der Nähe der dorsalen Wurzeleintrittszone (DREZ) (Abbildung 2B).
- Zell-Targeting und Bildgebung
- Verwenden Sie IR-DIC mit einer 10-fach-Objektivlinse, um den dorsolateralen Bereich der motorischen Säule zu finden, in dem sich die meisten Motoneuronen befinden. Verschieben Sie dann das zentrale Sichtfeld auf diesen Bereich.
- Wechseln Sie zu einem 60-fachen Objektiv, um ein gesundes Neuron mit einer glatten und hellen Oberfläche und unsichtbaren Kernen zu finden (Abbildung 2C,F).
- Verringern Sie die IR-Intensität leicht und schalten Sie die Fluoreszenzlichtquelle ein. Schalten Sie den Lichtfilter auf den Breitband-Ultraviolett-Anregungsfilter um (Abbildung 2D,G), um ein geeignetes FG-positives (FG+) Motoneuron auszuwählen (Abbildung 2E,H).
- Verwenden Sie Saugelektroden, um eine 1-fache motorische Schwellenstimulation auf die dorsale Wurzel anzuwenden. Wird ein evoziertes Aktionspotential in den Motoneuronen detektiert (ergänzende Abbildung 3), bestätigt dies, dass die Aktivität der dorsalen Wurzel intakt ist. Ist dies nicht der Fall, sollte diese Scheibe verworfen werden.
- Patch-Clamp-Aufnahme
- Füllen Sie die Mikropipette mit der intrazellulären Lösung und führen Sie sie in den Elektrodenhalter ein. Verwenden Sie das Mikromanipulationssystem, um die Pipette in das ACSF-Bad zu senken. Der Pipettenwiderstand liegt zwischen 5 und 8 MΩ.
- Üben Sie einen kleinen Überdruck auf die Pipette aus, um den Staub und die Zelltrümmer wegzublasen.
- Senken Sie die Elektrode ab, um sich der Zelle zu nähern. Wenn die Pipette die Oberfläche des FG+-Neurons berührt, wird eine kleine Vertiefung der Membran auf Höhe der Spitze sichtbar. Lassen Sie den Überdruck los.
- Üben Sie dann mit einer Spritze einen kleinen Unterdruck auf die Pipette aus. Dadurch entsteht ein kleiner Sog, der die Zellmembran in Kontakt mit der Glaspipette zieht. Achten Sie immer auf den Gesamtwiderstand auf der Software-Schnittstelle, bis der Widerstandswert auf Gigaohm (>1 GΩ) ansteigt. Dann wird das Gigaseal gebildet.
- Klemmen Sie das Membranpotential auf -70 mV und drücken Sie dann die Taste für die schnelle Kapazitätskompensation auf der Softwareschnittstelle des Verstärkers. Üben Sie vorsichtig einen vorübergehenden Unterdruck aus, um die Zellmembran zu zerreißen, und drücken Sie dann die Taste zur Kompensation der langsamen Kapazität auf der Softwareschnittstelle des Verstärkers. Zu diesem Zeitpunkt erhält man eine gute Ganzzellkonfiguration.
- Wechseln Sie in den Stromzangenmodus, indem Sie auf die IC-Taste auf der Softwareoberfläche klicken, und zeichnen Sie das Ruhemembranpotential (RMP) auf.
- Wenden Sie das SCS 1-2 s lang mit einer Amplitude von 1-10 mA an, während die Pulsbreite und -frequenz auf 210 μs bzw. 40 Hz festgelegt sind. Bestimmen Sie die motorische Schwelle, indem Sie die Stimulationsamplitude langsam erhöhen, bis der erste AP beobachtet wird.
- Unterscheidung von verzögert und sofort feuernden Motoneuronen mit einer 5 s depolarisierenden Strominjektion um die Rheobase im Strom-Zangen-Modus10,11,12. Sofort feuernde Motoneuronen: Eine niedrige Rheobase kann ein sofortiges und wiederholtes Feuern mit stabiler Feuerfrequenz induzieren; Verzögert feuernde Motoneuronen: Eine hohe Rheobase kann einen verzögerten Beginn des wiederholten Feuerns mit einer sich beschleunigenden Feuerrate induzieren (Abbildung 3).
- Wenn SCS ausgeschaltet ist, zeichnen Sie weiterhin das Membranpotenzial auf, um die spontan feuernden APs einzufangen.
- Führen Sie Spannungsklemmenaufzeichnungen für erregenden postsynaptischen Strom (EPSC) durch, wenn SCS ein- und ausgeschaltet ist. Der Stimulationsparameter ist 1x motorische Schwelle, 210 μs, 2 Hz.
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Representative Results
Dank der rigorosen Tieftemperaturhaltung während des Feinbetriebs (ergänzende Abbildung 1, ergänzende Abbildung 2 und Abbildung 1) war die Lebensfähigkeit der Zellen gut genug, um nachfolgende elektrophysiologische Aufzeichnungen durchzuführen. Um das klinische Szenario so weit wie möglich zu simulieren, haben wir die SCS-Kathode und die Anode mittels Mikromanipulation in der Nähe der dorsalen Mittellinie bzw. der DREZ platziert (Abbildung 2), die ein neuronales Signal im Hinterhorn initiieren können, um sich zu den Motoneuronen in der dorsolateralen Region der motorischen Säule auszubreiten. In dieser Studie haben wir FG verwendet, um die Motoneuronen mit einem Durchmesser von 20-50 μm zu lokalisieren. Wie in Abbildung 2D,G gezeigt, konnten wir ein gesundes FG+-Neuron als Motoneuron bestätigen - das Terminal des spinalen Schaltkreises. Diese Markierungsmethode ebnete den Weg, um zu untersuchen, wie SCS das Brennmuster beeinflusst. Die elektrophysiologischen Eigenschaften von verzögert und sofort feuernden Motoneuronen sind in der Zusatztabelle 1 und der Zusatztabelle 2 aufgeführt. Die Methoden zur Berechnung der aktiven und passiven Eigenschaften sind in der Zusatzdatei 1 enthalten.
Als SCS ein gepulstes elektrisches Wechselfeld an die Wirbelsäule abgab, verwendeten wir zunächst den Stromzangenmodus, um die Reaktion des Membranpotentials aufzuzeichnen (Abbildung 4). Als wir die Stimulationsamplitude allmählich mit einem Schritt von 1/3 der motorischen Schwelle erhöhten (Abbildung 4B,C), stieg auch das Membranpotential an, aber nur 1x motorische Schwelle konnte Aps hervorrufen (Abbildung 4D). Abbildung 4D zeigt, dass etwa alle 10-20 Pulse einen AP hervorrufen können, was darauf hindeutet, dass eine bestimmte AP-Antwortregelmäßigkeit gegenüber der SCS-Amplitude existieren könnte.
Nachdem das SCS ausgeschaltet wurde, fuhren wir mit der Aufzeichnung des Membranpotentials fort. Abbildung 5 zeigte, dass das Membranpotential leicht auf -60 mV anstieg und das Neuron eine Reihe von spontanen APs abfeuerte. Diese spontanen APs dauern für einen kurzen Zeitraum (30-40 s), dann kehrt das Membranpotential auf -65 mV zurück, was darauf hindeutet, dass das SCS die Erregbarkeit der Zelle vorübergehend erhöhen kann.
Dann haben wir Spannungsklemmenaufzeichnungen für EPSC verwendet, wenn SCS ein- und ausgeschaltet war (Abbildung 6). Nach jedem SCS-Puls konnte eine evozierte EPSC detektiert werden. Die Latenz zwischen dem Stimulusartefakt und der EPSC betrug 2,64 ± 0,38 ms (ergänzende Abbildung 4). Die Amplitude der evozierten EPSCs betrug 35,14 ± 12,73 pA (ergänzende Abbildung 4). Die Häufigkeit der evozierten EPSCs stimmt mit der SCS-Frequenz überein. Nach Subtraktion des passiven Ladungsausgleichs kann die evozierte EPSC in einem lebensfähigen Motoneuron nach 1-facher motorischer Schwellenstimulation beobachtet werden (Ergänzende Abbildung 5A). Die Stimulationspolarität wurde nach einem 2-stündigen Stopp der Perfusion in derselben Zelle umgekehrt. Die Stimulation induzierte keine EPSC, was bestätigt, dass die evozierte EPSC kein Artefakt war (Ergänzende Abbildung 5B).
Abbildung 1: Rückenmarksdissektion und Slicing . (A) Durchtrennen Sie die Wirbelsäule an der vorderen oberen Darmbeinwirbelsäule (ca. L4-Wirbelhöhe) bzw. am Krümmungsverschiebungspunkt der Brustsäule (ca. T6-Wirbelhöhe). (B) Übertragen Sie die isolierte Wirbelsäule sofort mit der dorsalen Seite nach oben und dem rostralen Ende in der Nähe des Bedieners in die anatomische Schiene. Füllen Sie die anatomische Schiene mit der kontinuierlich mit Sauerstoff angereicherten eiskalten Schneidlösung. (C) Laminektomie beidseitig vom rostralen Ende aus durchführen. (D) Durchtrennen Sie die dorsale Dura mater, die der Nährstoffaufnahme zwischen den Zellen und der sauerstoffreichen künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) förderlich ist. (E) Schneide vorsichtig die Nervenwurzel durch. (F) Schneiden Sie die ventrale Dura mater durch. (G) Trennen Sie die Lumbalvergrößerung auf eine Länge von 6-7 mm. (H) Platzieren Sie die Lumbalvergrößerung auf der 35°-Neigung mit der dorsalen Seite nach oben und dem kaudalen Ende nach unten. Verwenden Sie ein saugfähiges Filterpapier, um reichlich Wasser auf der Gewebeoberfläche zu entfernen. (I) Gießen Sie das geschmolzene Agarose-Gel langsam in die Petrischale. (J) Schneiden Sie das Gel zu einem Würfel und befestigen Sie ihn mit Sekundenkleber auf der Probenscheibe. (K) Legen Sie die Probenscheibe in die Schneidschale und gießen Sie dann die eiskalte Schneidlösung. (L) Ein Beispiel für einen Wirbelsäulenschnitt bei einer Lumbalvergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Konfiguration der Rückenmarkstimulation (SCS) und Bildgebung von Motoneuronen. (A) Der Impulsgenerator mit speziell angefertigten Elektroden kann die Amplitude, die Pulsbreite und die Frequenz separat einstellen. Der Einlass zeigte, dass die Maßspezifikation eines Elektrodenkontakts 800 μm x 500 μm x 300 μm beträgt. (B) Platzieren Sie die Anode und die Kathode in der Nähe der dorsalen Mittellinie bzw. der dorsalen Wurzeleintrittszone (DREZ) über das Mikromanipulationssystem. Platzieren Sie die Aufzeichnungspipette im dorsolateralen Bereich der motorischen Säule, um die Fluor-Gold-positiven (FG+) Motoneuronen einzuklemmen. (C) Ein gesundes, sofort feuerndes Motoneuron mit Infrarot-Differential-Interferenzkontrast-Mikroskop (IR-DIC) (60x). (D) Das gleiche Neuron mit nur Fluoreszenzbildgebung (60x), glänzende Fluor-Gold (FG)-Partikel stellen dar, dass dieses Neuron ein Motoneuron ist. (E) Verschmolzenes Bild von IR-DIC und Fluoreszenz im FG+-Motoneuron. (F-H) Ein gesundes, verzögert feuerndes Motoneuron mit IR-DIC-Bildgebung (60x). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Unterscheidung von verzögert und sofort feuernden Motoneuronen mit einer 5 s depolarisierenden Strominjektion. (A) Sofort feuernde Motoneuronen: Eine niedrige Rheobase kann ein sofortiges und wiederholtes Feuern mit stabiler Feuerfrequenz induzieren; (B) Verzögert feuernde Motoneuronen: Eine hohe Rheobase kann einen verzögerten Beginn des wiederholten Feuerns mit einer sich beschleunigenden Feuerrate induzieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die Rückenmarkstimulation (SCS) löste Aktionspotentiale (APs) aus, die in Motoneuronen feuerten . (A) Wenn keine Stimulation angewendet wurde, betrug das Ruhemembranpotential (RMP) -65 mV. (B) 1/3x motorischer Schwellenstimulus kann keine APs hervorrufen. (C) Ein 2/3-facher motorischer Schwellenreiz kann keine APs hervorrufen. (D) 1x motorischer Schwellenstimulus kann APs hervorrufen, und alle 10-20 Impulse können APs hervorrufen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Spontane Aktionspotentiale (APs), die nach der Rückenmarkstimulation (SCS) feuern. Nachdem das SCS ausgeschaltet wurde, feuerte das Neuron für kurze Zeit (30-40 s) eine Reihe spontaner APs ab, dann kehrte das Ruhemembranpotential (RMP) auf -65 mV zurück. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Illustration des Parameters der Rückenmarkstimulation (SCS) und des evozierten exzitatorischen postsynaptischen Stroms (EPSC). (A) Darstellung des SCS-Parameters; (B,C) Nach einem einzigen Stimulationsimpuls (1x motorische Schwellenstimulation) kann die evozierte EPSC beobachtet werden; (D) Nach Abzug des passiven Ladungsausgleichs können die Latenz und Amplitude des EPSC berechnet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Gerätevorbereitung. (A) Perfusionsschale: 10 Minuten vor der Perfusion zerstoßenes Eis auf die mit Kieselgel gefüllte 10-cm-Petrischale geben. (B) Anatomisches Tablett: In der Nacht vor der Opferung das selbstgemachte anatomische Tablett gefüllt mit Kieselgel in den -80 °C heißen Kühlschrank stellen. (C) Schneideschale: In der Nacht vor der Opferung die Schneideschale mit Wasserband in den Kühlschrank bei -80 °C stellen. (D) Agarose-Gießschräge: 30 Minuten vor der Perfusion eine 35°-Agarose-Neigung mit Bodenplatten in die Mitte einer 35-mm-Petrischale setzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Intrakardiale Perfusion. (A) Heben Sie den Xiphoid-Prozess an. (B) Durchtrennen Sie das Brustbein auf beiden Seiten des Processus xiphoideus, um den Brustkorb zu öffnen und das Herz freizulegen. Achten Sie darauf, die inneren Brustgefäße nicht zu beschädigen, da sonst massive Blutungen das gesamte Operationsfeld ausfüllen und den Bediener daran hindern, die Herzkammerspitze oder den rechten Vorhof zu identifizieren. (C) Führen Sie eine 22-G-Nadel an der linken Herzkammerspitze für die Perfusion ein und schneiden Sie den rechten Vorhof für den Flüssigkeitsaustritt durch. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Bestätigung der dorsalen Wurzelaktivität. Verwenden Sie Saugelektroden, um eine 1-fache motorische Schwellenstimulation auf die dorsale Wurzel anzuwenden. Wenn ein evoziertes Aktionspotential in den Motoneuronen nachgewiesen wird, können wir bestätigen, dass die Aktivität der dorsalen Wurzel intakt ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 4: Latenz und Amplitude der evozierten EPSCs, wenn SCS eingeschaltet war. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 5: Nachweis der Gültigkeit der evozierten EPSC . (A) Nach 1-facher motorischer Schwellenstimulation nach Subtraktion des passiven Ladungsausgleichs kann die evozierte EPSC in einem lebensfähigen Motoneuron beobachtet werden; (B) Nach dem Stoppen der Perfusion für 2 h in derselben Zelle war die Stimulationspolarität umgekehrt, die 1-fache motorische Schwellenstimulation induzierte keine EPSC, was bestätigte, dass die evozierte EPSC kein Artefakt war. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 1: Berechnungsmethoden der aktiven und passiven Eigenschaften. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Passive Eigenschaften von Motoneuronen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 2: Aktive Eigenschaften von Motoneuronen Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die durch SCS modulierten Bewegungsinformationen werden schließlich zu den Motoneuronen konvergiert. Daher könnte die Verwendung der Motoneuronen als Forschungsziel das Studiendesign vereinfachen und den Neuromodulationsmechanismus des SCS direkter aufdecken. Um gleichzeitig verschiedene Reizeigenschaften und zelluläre Reaktionen zu erfassen, ist eine Patch-Clamp eine gute Methode, um die elektrophysiologischen Eigenschaften auf Einzelzellebene zu untersuchen. Es gibt jedoch immer noch einige Schwierigkeiten, einschließlich der Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit, der schnellen Trennung des Rückenmarks von der knöchernen Struktur und der Verwendung des SCS zur erfolgreichen Induktion von APs. Daher zielt diese Studie darauf ab, den Forschern zu helfen, wesentliche operative Fähigkeiten schnell zu erfassen, einige mögliche Fallstricke zu vermeiden und sich so früh wie möglich auf das Studiendesign und nicht auf die Methodik zu konzentrieren.
Um eine gute Zelllebensfähigkeit zu erhalten, sollte man immer auf die folgenden Details achten: (1) Es ist sehr wichtig, das Rückenmark auf eiskalter Temperatur zu halten, da eine niedrige Temperatur den Zelltod hemmen und die Stoffwechselrate verlangsamen kann, was das Neuron vor mechanischen Schäden während der Perfusion, Dissektion und des Schneidens schützen kann13; (2) Das vorsichtige Entfernen der Dura mater mit einer Mikroschere kann die neuronale Nährstoffaufnahme aus umgebenden Lösungen verbessern. Ziehen Sie die Dura mater niemals direkt ab; Andernfalls wird das Rückenmark stark geschädigt. Wenn Sie außerdem vergessen, die Dura Mater zu reinigen, kann der anschließende Schneidvorgang schwierig sein, da die Klinge die Dura Mater möglicherweise nicht vollständig abschneidet und dann das verbleibende Rückenmark aus der Agarose herausreißt, was zum Scheitern des Schneidens führen kann. (3) Im Vergleich zu herkömmlichen transversalen Schichten vergrößern schräge Schichten die Fläche der grauen Substanz, und Sie können mehr FG+-Motoneuronen in einer einzigen Scheibefinden 9. (4) Da das Rückenmark allein nicht wie das Gehirn fest auf der Probenscheibe fixiert werden kann, ist die Einbettung in Agarose-Gel wirksam, um dieses Problem zu lösen, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu verringern. Wir empfehlen die Verwendung von niedrigschmelzender Agarose (Gelpunkt 26-30 °C) anstelle von herkömmlicher Agarose (Gelpunkt 38-43 °C), da hohe Temperaturen die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen können. (5) Wir empfehlen, dass der Abstand zwischen zwei Nylonfäden aus U-förmigem Platindraht 1 bis 1,5 mm betragen sollte, da lose Fäden das Rückenmark nicht fest immobilisieren können und dichte Fäden die Zelle quetschen können.
Im Vergleich zu den konventionellen Stimulationsgeräten, wie z.B. bipolaren Hakenelektroden, die in der Grundlagenforschung weit verbreitet sind, ist die SCS-Elektrode in dieser Studie aus unserer bisherigen klinischen Arbeit14 und Grundlagenforschung15 abgeleitet. SCS liefert eine gepulste elektrische Wechselstimulation, die verschiedene Parameteranpassungsdimensionen bietet. Dieses SCS-Gerät verfügt auch über eine Ladungsausgleichsfunktion, um eine Gewebeelektrolyse zu vermeiden, und kommt nicht direkt mit dem Nervengewebe in Kontakt. Daher hat dieses SCS eine gute Sicherheit für In-vivo-Anwendungen .
Nach der SCS-Behandlung können die spontanen APs von Motoneuronen auf die folgenden Gründe zurückgeführt werden: (1) SCS induziert die Akkumulation der Ladung im Zellkörper und im axonalen Colliculus von Neuronen, was zu einem Anstieg von RMP16 führt. Dieses Phänomen deutet darauf hin, dass SCS die Erregbarkeit von Neuronen verbessern kann, was mit der Änderung der Leitfähigkeit von Ionenkanälen nach SCS zusammenhängen kann, wie z. B. Na v 1,117, K v 2,1 18 oder Ca v 2,3 19. (2) SCS kann dorsale GABAerge Neuronen aktivieren, um propriozeptives Feedback zu Motoneuronen zu erleichtern. Wir vermuten, dass eine neuronale Übertragung zwischen den sensorischen Neuronen und den Motoneuronen kontinuierlich existieren kann, was zu spontanen APs in Motoneuronen nach SCS führt. Spontane APs können einen intrinsischen Zustand der Bereitschaft zur Ausführung sensomotorischer Verhaltensweisenaufrechterhalten 20. Daher kann die Aktivierung oder Hemmung spontaner APs für die Behandlung von spinalen neurologischen Erkrankungen von Vorteil sein.
Wie wir wissen, ist die elektrophysiologische In-vivo-Aufzeichnung besser geeignet, um die elektrophysiologische Reaktion unter der natürlichen Verteilung des elektrischen Feldes und der Platzierung von Elektroden zu erkennen. Darüber hinaus ermöglichen In-vivo-Motoneuron-Aufzeichnungen die Identifizierung der Identität von Motoneuronen. Dies kann durch eine antidrome Identifizierung von motorischen Axonen in Verbindung mit einer Muskelfaserkraftmessung21 erfolgen. In-vivo-Rückenmarksaufnahmen haben aber auch folgende Nachteile: (1) Motoneuronen liegen 2-3 mm von der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks entfernt, selbst mit der fortschrittlichsten konfokalen Zwei-Photonen-Bildgebung beträgt die Beobachtungstiefe nur 500-800 μm, so dass es schwierig ist, sie mit den bestehenden Methoden in vivo optisch zu beobachten. Wenn wir also ein einzelnes Motoneuron in vivo exakt einklemmen wollen, muss die Glaspipette durch die dorsale Säule gehen, um das unsichtbare Motoneuron zu erreichen; Das In-vivo-Patch-Clamp kann nur "blind" durchgeführt werden, was zu einer erheblichen Unsicherheit und Ausfallrate führt. (2) Mit Ausnahme der In-vivo-Patch-Clamp können Silizium-Elektrodenaufzeichnungen die alternative Methode sein, wie z. B. Utah-Array oder Neuropixels-Elektrode. Bei den von Siliziumelektroden aufgezeichneten Signalen handelt es sich jedoch meist um zusammengesetzte Aktionspotentiale und nicht um einzelne Aktionspotentiale. Obwohl die Aktivität einzelner Neuronen mit Hilfe von Spike-Sorting-Algorithmen aufgelöst wurde, muss die Genauigkeit und Zuverlässigkeit von Sortieralgorithmen noch verbessert werden.
Im Vergleich zu den In-vivo-Ableitungen ist der größte Vorteil von In-vitro-Aufnahmen gegenüber In-vivo-Aufnahmen die Verwendung von Spannungsklemmen, die ein einzigartiges Verständnis der durch SCS aktivierten synaptischen Signalwege ermöglichen. Darüber hinaus würde es auch den Einsatz von Live-Imaging-Werkzeugen ermöglichen. Wir spekulieren, dass SCS die Freisetzung von Neurotransmittern wie GABA und Glutamat von Neuronen der oberen Ebene auf die Motoneuronen induziert, was zu einer insgesamt exzitatorischen EPSC-Antwort führt7. Daher werden wir in unserer bevorstehenden Forschung den Nachweis von IPSC, Mini-EPSC (mEPSC) und evoziertem EPSC, die durch SCS induziert werden, einbeziehen, um die Muster der hemmenden und exzitatorischen Neurotransmitterfreisetzung von prämotorischen Neuronen oder Interneuronen zu klären. Wir erkannten voll und ganz an, dass die In-vitro-Stimulation auch einige Einschränkungen hat: (1) Die langreichweitigen longitudinalen Schaltkreise des Rückenmarks sind gestört, was zum Verlust eingehender Informationen aus dem motorischen Kortex oder der unteren Extremität führt; (2) Die Verteilung der elektrischen Felder während der In-vitro-Stimulation kann sich von der der In-vivo-Stimulation unterscheiden. In dieser Studie war die Aktivierungsschwelle (ca. in Milliampere) für APs viel höher als die des In-vivo-Experiments (ca. in Mikroampere)15; Dies lag daran, dass die Volumenkapazität der ACSF-Lösung in der Aufzeichnungskammer viel höher war als die der Zerebrospinalflüssigkeit im natürlichen Zustand, und die mathematische Theorie stützt, dass das elektrische Feld in hochleitfähigen Materialien schneller abgeschwächt wird22. Daher wurde der größte Teil des Stroms von der Badelösung absorbiert, und wir spekulieren, dass nur ein kleiner Teil des elektrischen Feldes zu den Nervenwurzeln diffundieren kann.
Unter Berücksichtigung der Vor- und Nachteile der In-vivo-Stimulation und der In-vitro-Stimulation kann daher der Schluss gezogen werden, dass die In-vitro-Patch-Clamp eine vorteilhafte Methode ist, um die synaptische Natur und/oder die zellulären Wirkungen von SCS bei neonatalen Nagetieren zu untersuchen.
In der klinischen Praxis kontrahiert die Elektrode nicht direkt die Oberfläche des Rückenmarks oder der Nervenwurzel23. Stattdessen verlässt es sich auf die von der Elektrode erzeugte elektrische Feldstrahlung, um die Aktivität der Nerven1 indirekt zu beeinflussen. Mehrere Studien 1,23,24 haben bestätigt, dass der Kathodenkontakt von SCS so nah wie möglich an der dorsalen Wurzel oder der Eintrittszone (DREZ) platziert werden sollte, um eine optimale Selektivität für die Stimulation eines bestimmten Muskels zu erreichen. Eine Vergrößerung des Abstands zwischen der Elektrode und der Nervenwurzel schwächt die Spezifität der Stimulation. Daher platzieren wir die Kathode direkt in der Nähe der DREZ, anstatt direkt mit der Nervenwurzel oder dem Rückenmark in Kontakt zu kommen.
Die afferenten Fasern der dorsalen Wurzel projizieren zuerst zu den sensorischen Neuronen, dann zu den Interneuronen und den Motoneuronen. Neben den quer projizierenden Kreisen gibt es auch Kreisläufe, die zum rostralen und kaudalen Ende hin projizieren. Zum Beispiel können Motoneuronen, die dem Musculus tibialis anterior entsprechen, auf mehreren Ebenen gefundenwerden 25. Obwohl die schräge Präparation die transversalen projizierenden Schaltkreise durchtrennen kann, werden daher immer noch nicht-transversale projizierende Fasern erhalten, was die Untersuchung der prämotorischen sensorischen Schaltkreise ermöglicht. Zusätzlich zur schrägen und transversalen Präparation bietet die longitudinale Präparation deutliche Vorteile, um die Schaltkreise von der dorsalen Wurzel zu den Motoneuronen besser zu erhalten und die effektive Beibehaltung von Rückenmarkschaltkreisen über mehrere Segmente26 hinweg zu ermöglichen, was eine genauere Darstellung der tatsächlichen physiologischen Bedingungen ermöglicht.
Laut der Simulationsforschung 6,27,28 aktiviert SCS hauptsächlich propriozeptive afferente Fasern, um die Bewegung der unteren Gliedmaßen wiederherzustellen, einschließlich der afferenten Fasern Ia, Ib und II. In dieser Studie können wir jedoch nicht mit Sicherheit bestätigen, welche Arten von Ballaststoffen spezifisch durch SCS aktiviert wurden. Wir spekulieren, dass ein ähnliches Muster auch in der In-vitro-Patch-Klemme existieren könnte. Wir werden dieses Problem angehen, indem wir mathematische Modellierungen und Simulationen durchführen und in unsere laufende Arbeit integrieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll Forschern helfen kann, ihre operativen Fähigkeiten zu verbessern und die Grundlagen der Kombination von Patch-Clamp-Aufzeichnungen und SCS zu verstehen, um den elektrischen Mechanismus von SCS auf Einzelzellebene zu untersuchen.
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Disclosures
Nichts
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 und 82301657) und dem China Postdoctoral Science Fund (2022M711833) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
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